Khảo sát khả năng ức chế virus viêm gan C của các hợp chất cô lập từ loài địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

- KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VIRUS VIÊM GAN C CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP TỪ LOÀI ĐỊA Y Parmotrema tinctorum (NYL.) HALE.
- Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh các hợp chất cô lập từ cây cỏ có khả năng kháng virus viêm gan C (HCV), tuy nhiên có rất ít nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất này từ địa y.
- Mục tiêu của nghiên cứu này là cô lập và xác định cấu trúc của các hợp chất tinh khiết từ địa y Parmotrema tinctorum mọc phổ biến ở Lâm Đồng;.
- thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV trên các hợp chất cô lập được.
- Các phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, kết tinh lại được sử dụng để cô lập hợp chất tinh khiết.
- Cấu trúc các hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm như khối phổ độ phân giải cao ESI-HRMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.
- Hoạt tính ức chế HCV của các hợp chất cô lập được đánh giá bằng thử nghiệm Renilla Luciferase.
- Kết quả đã cô lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất gồm (1) methyl β-orcinolcarboxylate, (2) orsellinic acid, (3) lecanorol, (4) atranorin và (5) salazinic acid.
- Hợp chất (4) ức chế mạnh HCV với IC 50 22,3 µM.
- Khảo sát khả năng ức chế virus viêm gan C của các hợp chất cô lập từ loài địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale.
- Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh các hợp chất cô lập từ cây cỏ có thể kháng virus viêm gan C như silymarin từ Silybum marianum, quercetin từ Embelia ribes, honokiol từ Magnolia officinalis… (Calland et al., 2012.
- Hattori et al., 2013), tuy nhiên có rất ít nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính này từ địa y.
- Hơn 1035 hợp chất chuyển hóa thứ cấp được công bố trong địa y và còn rất nhiều hợp chất khác vẫn chưa được xác định cấu trúc.
- Hầu hết các hợp chất cô lập thuộc nhóm phenol đơn vòng thơm, dibenzofuran, depside, depsidone, quinone, và các dẫn xuất pulvinic acid (Boustie and Grube, 2005.
- Hoạt tính kháng virus cũng được phát hiện với một số ít hợp chất chuyển hóa thứ cấp của địa y như (+)-usnic acid, sekikaic acid và anthraquinon (Zambare and Christopher, 2012.
- Từ kết quả nghiên cứu về loài địa y Stereocaulon evolutum thu hái tại Pháp cho thấy các hợp chất cô lập được từ loài này có khả năng ức chế HCV với liều IC 50 trong khoảng từ 10 đến 70 µM (Vu et al., 2015).
- đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế virus viêm gan C của địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale”.
- Thứ nhất là cô lập và xác định cấu trúc của các hợp chất tinh khiết từ địa y P.
- thứ hai là thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV trên các hợp chất cô lập được..
- 2.2.2 Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất tinh khiết.
- Cô lập các hợp chất tinh khiết.
- Xác định cấu trúc các hợp chất cô lập được Cấu trúc các chất tinh khiết được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm hiện đại như khối phổ độ phân giải cao ESI-HRMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR..
- 2.2.3 Thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV Mẫu thử: năm hợp chất tinh khiết cô lập được từ địa y P.tinctorum (1, methyl β- orcinolcarboxylate.
- Các hợp chất đem thử nghiệm và chất chứng dương được hòa tan trong DMSO (nồng độ DMSO không được vượt quá 0,1.
- Tế bào được ủ với các liều khác nhau của các hợp chất thử nghiệm trong 1 giờ.
- Các giá trị IC 50 của mỗi hợp chất được xác định từ dãy gồm 7 đến 12 nồng độ dựa trên phân tích hồi qui với phần mềm GraphPad Prism 5,00..
- 3.1 Cô lập và xác định cấu trúc của các hợp chất tinh khiết.
- tinctorum thu hái tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, năm hợp chất tinh khiết đã được cô lập..
- Hợp chất 1: tinh thể hình kim màu trắng, phổ 1D và 2D-NMR: xem Bảng 2..
- Hợp chất 2: tinh thể hình kim màu trắng, phổ 1 H và 13 C-NMR: xem Bảng 2..
- Hợp chất 3: tinh thể hình kim màu đỏ, ESI- HRMS: m/z M+H.
- Hợp chất 4: tinh thể hình kim màu trắng, ESI- HRMS m/z 397,0896 [M+Na.
- Hợp chất 5: tinh thể hình kim màu trắng, ESI- HRMS: m/z M+H.
- Cấu trúc của các hợp chất này được xác định lần lượt bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại..
- 3.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV Thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV của năm hợp chất cô lập được từ địa y P.
- Kết quả cho thấy các hợp chất thử nghiệm không gây độc tế bào với phần trăm tế bào sống sau 48 giờ đạt trung bình trên 90%.
- Trong các hợp chất khảo sát, hợp chất 4 ức chế tốt nhất virus với liều IC 50 22,3 µM, đối các hợp chất còn lại giá trị này dao động từ 45 đến 67 µM..
- Bảng 1: Kết quả thử nghiệm ức chế HCV Hợp chất Khả năng ức chế.
- 4.1 Cô lập và xác định cấu trúc của các hợp chất tinh khiết.
- Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện hai tín hiệu của nhóm methyl tại δ H 2,10 (3H, s) và 2,46 (3H, s), một nhóm methoxy tại δ H 3,92 (3H, s), một proton methin của nhân thơm tại δ H 6,21 (1H, s), hai –OH phenol tại δ H 5,09 (1H, s) và 12,05 (1H, s).
- đã có (Nguyen et al., 2016), hợp chất 1 được xác định là methyl β-orcinolcarboxylate..
- Hình 1: Cấu trúc của các hợp chất cô lập được từ P.
- tinctorum Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2 cho thấy tín hiệu.
- 1 carbon nhóm methyl, 1 carbon carbonyl và 6 carbon nhân thơm tương tự hợp chất 1.
- Từ kết quả phổ nghiệm NMR và so sánh với tài liệu tham khảo (Thiago et al., 2008) cho phép xác định cấu trúc của hợp chất 2 là orsellinic acid..
- Hợp chất 1 (300 MHz, CDCl 3.
- Hợp chất 2 (300 MHz, CD 3 OD).
- Hợp chất 3 thu được ở dạng tinh thể hình kim màu đỏ.
- Kết hợp với dữ liệu phổ 2D-NMR (Bảng 3) và so sánh với tài liệu tham khảo (Iqbal and Meher, 2011), hợp chất 3 được xác định là lecanorol..
- Hợp chất 4 thu được ở dạng tinh thể hình kim màu trắng.
- 13 C-NMR cho thấy hợp chất 4 có khung depside tương tự hợp chất 3, trong đó xuất hiện thêm tín hiệu của 1 nhóm aldehyde -CHO, 1 carbon carboxyl, 1 nhóm methoxy, 1 nhóm methyl gắn trên vòng thơm..
- Dựa trên các thông tin đã có, so sánh đối chiếu với tài liệu tham khảo (Vu et al., 2015) hợp chất 4 được xác định là atranorin..
- Hợp chất 5 thu được ở dạng tinh thể hình kim màu trắng có công thức phân tử là C 18 H 12 O 10 được xác định bằng ESI-HRMS.
- Kết hợp phổ HSQC và HMBC (Bảng 3) cùng với so sánh dữ liệu phổ đã có (Nguyen et al., 2016) hợp chất 5 được xác định là salazinic acid..
- Kết quả thu được từ các hợp chất chứng dương hoàn toàn phù hợp với giá trị đã công bố (Vu et al., 2015) chứng tỏ tính chính xác của phương pháp..
- Hợp chất 3 (300 MHz, CD 3 OD).
- Hợp chất 4 (500 MHz, CDCl 3.
- Hợp chất 5 (300 MHz, DMSO-d 6.
- Liều tối đa của mỗi hợp chất thử nghiệm là 100 µM, do ở liều cao hơn hầu hết các hợp chất này sẽ không tan.
- Kết quả giá trị IC 50 của các hợp chất cô lập từ địa y dao động trong khoảng từ 20 -70 µM, giá trị này tương tự đối với các hợp chất thiên nhiên cô lập từ nguồn khác (Vu et al., 2015).
- Các depside thường ức chế HCV tốt hơn các phenol đơn vòng thơm, cụ thể trong nghiên cứu này, hợp chất 4, một depside phổ biến trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema, có hoạt tính cao hơn các hợp chất phenol đơn vòng thơm 1 và 2.
- tinctorum thu hái tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng đã cô lập và xác định cấu trúc của năm hợp chất tinh khiết gồm methyl β-orcinolcarboxylate 1, orsellinic acid 2, lecanorol 3, atranorin 4 và salazinic acid 5.
- Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế HCV cho thấy cả 5 hợp chất đều không độc tính với dòng tế bào Huh-7.5.1, hợp chất 4 có khả năng ức chế HCV mạnh nhất với IC 50 22,3 µM.
- Kết quả nghiên cứu bước đầu đã cho thấy các hợp chất cô lập từ địa y P.tinctorum mọc tại Việt Nam có khả năng kháng virus viêm gan C đáng quan tâm để phát triển các nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng vào thực tiễn.