- Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu bảo tồn, khai thác một cách hợp lý nguồn gen một số loài lan thuộc chi Anoectochilus và Lusidia, 9 vùng DNA barcode: rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS được sử dụng để phân tích di truyền 06 mẫu giống lan. - Kết quả phân tích DNA của các mẫu giống cho tỷ lệ khuếch đại thành công từ 50-100% cho các DNA barcode khác nhau. - Vùng ITS1 và ITS2 cho tỷ lệ khuếch đại đạt 100%, vùng ITS 83,3%, vùng rbcL 50%, vùng matK từ vùng rpoB và rpoC đạt 83,3%. - Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống dựa trên trình tự DNA của một số vùng DNA barcode như ITS1 và ITS2 cho thấy có thể phân biệt giữa các loài gần nhau. - Cây phân nhóm dựa trên vùng ITS2 chia Anoectochilus và Lusidia làm 2 nhóm chính, trong nhóm Anoectochilus chia làm hai nhóm phụ thuộc hai loài Anoectochilus formosanus và Anoectochilus roxburghii. - Tuy nhiên, các loài lan rất đa. - Các mối quan hệ phát sinh loài của các loài chính trong họ lan đã được phân tích dựa trên các marker phân tử DNA barcode khác nhau như: rbcL (Cameron et al., 1999), psaB, atpB (Cameron, 2006) và matK (Freudenstein and Chase, 2015). - Hiện nay, một số nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật DNA barcode để phân tích mối quan hệ di truyền và xác định loài của một số loài thuộc chi Anoectochilus, Lusidia (Chen and Shiau, 2015;. - Trong nghiên cứu này, bước đầu sử dụng vùng DNA barcode rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số loài lan Kim tuyến đã được định danh từ đó làm cơ sở cho việc phân tích di truyền và nhận diện loài.. - 2.1 Vật liệu nghiên cứu. - Bảng 1: Danh sách các loài thuộc chi Anoectochilus và Lusidia thu thập. - AF1 Anoectochilus formosanus Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh AF2 Anoectochilus formosanus Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh. - Mẫu lá của các mẫu lan Kim tuyến được thu thập ở các vùng địa lý khác nhau (đã được xác định hoặc chưa xác định loài) và các mẫu có đặc điểm hình thái tương tự để tiến hành phân tích.. - Bảng 2: Vùng gen DNA barcode và primer được sử dụng để sàng lọc vùng gen thích hợp trong phân tích một số loài thuộc chi Anoectochilus, Lusidia. - Vùng gen Primer Trình tự primer (5’-3’) T a ( o C). - Các phản ứng PCR được thực hiện nhằm khuếch đại vùng ITS, ITS1, ITS2, rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2 với các cặp primer tương ứng (Bảng 2). - Kết quả PCR được phân tích đánh giá trên gel agarose 1,2%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30-45 phút, nhuộm với ethidium bromide và chụp hình trên máy chụp gel (GelDoc-It®2315 imager UVP-Mỹ).. - 2.4 Giải trình tự và phân tích mối quan hệ di truyền. - Trên cơ sở phân tích khả năng khuếch đại thành công của các cặp primer với các vùng gen tương ứng cho tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất cho tất cả các mẫu sẽ được chọn để giải trình tự DNA. - Sản phẩm PCR được giải trình tự tại công ty Macrogen. - Các trình tự được hiệu chỉnh bằng phần mềm ATGC và kiểm tra các sai lệch. - Đánh giá mức độ tương đồng và độ bao phủ của các trình tự DNA với các trình tự có sẵn trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - DNA tổng số của các loài phân tích được tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch. - Kết quả PCR dựa trên DNA tổng số của 06 mẫu lan nghiên cứu cho thấy các băng xuất hiện rõ. - Tỷ lệ khuếch đại của các vùng DNA barcode khác nhau với primer chuyên biệt cho từng barcode cho tỷ lệ khuếch đại khác nhau (Bảng 3).. - Bảng 3: Tỷ lệ khuếch đại các vùng DNA barcode của 06 mẫu lan nghiên cứu. - AF1 Anoectochilus formosanus TT CNSH x x x. - AF2 Anoectochilus formosanus TT CNSH x x x x. - Tỷ lệ khuếch đại. - AF1 Anoectochilus formosanus TT CNSH x x. - AF2 Anoectochilus formosanus TT CNSH - x. - AF1 Anoectochilus formosanus TT CNSH x x x x. - Chú thích: 1/Khuếch đại vùng ITS1 với cặp primer ITS1-F và ITS1-R, 2/Khuếch đại vùng ITS2 với cặp primer ITS2-F và ITS2-S3R, 3/Khuếch đại vùng ITS với cặp primer ITS1-F và ITS4-R, 4/Khuếch đại vùng rbcL với cặp primer rbcLa-F- và rbcLa-R, 5/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK1-Fvà matK1-R, 6/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK390-F và matK1326-R, 7/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK2.1-F và matK5-R, 8/Khuếch đại vùng rpoB1 với cặp primer rpoB1-F và rpoB1-R, 9/Khuếch đại vùng rpoB2 với cặp primer rpoB2-F và rpoB2-R, 10/Khuếch đại vùng rpoC1 với cặp primer rpoC1-F và rpoC1R, 11/Khuếch đại vùng rpoC2 với cặp primer rpoC2-F và rpoC2-R.. - TT CNSH: Trung tâm công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh Vùng ITS1, ITS2 cho tỷ lệ khuếch đại trên 06. - Vùng gen ITS cho tỷ lệ khuếch đại đạt 83,3% và cho 2 băng sản phẩm đối với mẫu A3 và A4. - Đối với các vùng DNA barcode khác cho tỷ lệ khuếch đại thấp hơn từ 50-83,3% (Bảng 3) với kích thước từng vùng gen matK (900-1000bp), rbcL (1500-1600bp), rpoB1 và rpoB2 (550-600bp), rpoC1 và rpoC2 (500-600bp). - Các vạch xuất hiện rõ khi phân tích trên gel agarose 1,2%. - Đối với vùng gen matK khi sử dụng cặp primer matK2.1F và matK5R để khuếch đại không cho sản phẩm. - Tuy nhiên, trong nghiên cứu trước đây khi sử dụng cặp primer trên để phân tích các loài lan thuộc chi Dendrobium cho tỷ lệ khuếch đại từ 90-100% (Nhóm tác giả, 2018). - barcode ở các mức độ khác nhau để tiến hành chọn lựa vùng DNA barcode và primer để tiến hành giải trình tự. - Vùng ITS2 được khuếch đại với primer ITS2-F và ITS2-S3R được chọn lựa để giải trình tự do có tỷ lệ khuếch đại đạt 100% và vùng ITS2 được sử dụng nhiều trong việc nhận dạng một số loài lan Kim tuyến.. - 3.2 Đánh giá, định danh, phân tích mối quan hệ di truyền của giống lan Kim Tuyến. - Kết quả PCR cho thấy vùng ITS1 có kích thước khoảng 450-500 bp, vùng ITS2 có kích thước 550- 600 bp được giải trình tự tại công ty Macrogen (10F, 254 Beotkkot-ro geumcheon-gu, Soul 08511, Rep.. - Hiệu chỉnh trình tự bằng phần mềm ATGC. - Các trình tự sau khi hiệu chỉnh được BLAST. - barcode nghiên cứu và trình tự trên NCBI của 06 mẫu lan nghiên cứu là vùng ITS . - Điều này cho thấy các trình tự vùng ITS1, ITS2 khuếch đại của 6 giống nghiên cứu mức độ tương đồng cao so với các trình tự đã được công bố trên NCBI. - Phân tích hai loài Anoectochilus sp (A3) có sự tương đồng với. - Anoectochilus formosanus (GQ396668.1 và GQ328777.1) với tỷ lệ 99-100% và Anoectochilus sp. - Các loài đã được xác định dựa trên hình thái có sự tương đồng cao so với các trình tự đã công bố (Bảng 4).. - Bảng 4: Đánh giá mức độ tương đồng và bao phủ của trình tự DNA các vùng ITS1, ITS2 của các mẫu nghiên cứu với trình tự tương ứng trên NCBI. - gen Trình tự tham chiếu Độ bao phủ. - GQ396668.1 Anoectochilus formosanus 99 99. - AF2 GQ328777.1 Anoectochilus formosanus 100 100. - A3 GQ396668.1 Anoectochilus formosanus 100 100. - GQ328777.1 Anoectochilus formosanus 76 99. - AF2 GQ328777.1 Anoectochilus formosanus 76 99. - A3 GQ328777.1 Anoectochilus formosanus 79 99. - Bảng 5: Vị trí sai khác của các loài lan Kim tuyến dựa trên trình tự DNA vùng ITS1. - Phân tích trình tự DNA của vùng gen ITS1, ITS2 sau khi được hiệu chỉnh có kích thước tương ứng là 393 bp và 477 bp, thực hiện phân tích bằng phần mềm MEGA 6.0 cho kết quả vùng bảo tồn của trình tự ITS1 là 365/393, ITS 2 là 438/477 vị trí, vùng biến đổi của trình tự ITS1 là 27/393 trong đó 1 vị trí. - khác biệt trên trình tự DNA của 1 loài so với các loài còn lại và 25 vị trí có sự khác biệt từ 2 loài trở lên so với các loài còn lại, ITS2 là 35/477 vị trí trong đó 6 vị trí khác biệt trên trình tự DNA của 1 loài so với các loài còn lại và 29 vị trí có sự khác biệt từ 2 loài trở lên so với các loài còn lại (Bảng 5,6).. - Bảng 6: Vị trí sai khác của các loài lan Kim tuyến dựa trên trình tự DNA vùng ITS2. - Kết quả phân tích trên trình tự DNA của vùng ITS1, ITS2 cho thấy có sự khác biệt giữa hai chi Anoectochilus và Lusidia. - Khi dựa trên trình tự DNA vùng gen ITS1 để phân tích cho thấy giữa các loài thuộc chi Anoectochilus chỉ có hai vị trí khác. - thuộc chi Anoectochilus dựa trên trình tự DNA vùng gen ITS2 cho thấy vị trí biến đổi cao hơn là 20 vị trí.. - Kết quả này chứng tỏ có thể. - Hình 3: Cây phát sinh loài của 6 mẫu Anoectochilus sp (2), Anoectochilus formosanus (2), Lusidia discolor (2) dựa trên trình tự vùng gen ITS1, ITS2, ITS1+ITS2 và các trình tự tham chiếu đã công bố. - trên genbank Kết quả phân tích dựa trên trình tự DNA vùng. - Khi phân tích các loài Anoectochilus roxburhii, Anoectochilus formosanus. - Mẫu A3, loài Anoectochilus formosanus và các trình tự tham chiếu trên genbank thuộc loài này nằm trong cùng một nhánh. - Từ kết quả trên cho thấy mẫu A4 chưa xác định loài thuộc loài Anoectochilus roxburhii và mẫu A3 thuộc loài Anoectochilus formosanus.. - Kết quả phân tích dựa trên trình tự DNA vùng ITS2 cho thấy sự phân nhánh cây di truyền tương tự như vùng ITS1 nhưng có sự phân tách rõ ràng hơn.. - Đối với loài Anoectochilus formosanus (AF) nằm riêng một nhánh so với loài này và loài Anoectochilus roxburhii. - Dựa trên trình tự nucleotide của loài này so với các trình tự cùng loài có 4 vị trí sai khác. - Khi so sánh với các trình tự trên genbank cho thấy Anoectochilus sp. - (A3) thuộc loài Anoectochilus formosanus với mức độ tương đồng 100%. - Điều này cho thấy trình tự DNA vùng ITS2 bước đầu có thể phân xiệt được các loài nghiên cứu thuộc chi Anoectochilus.. - Kết quả phân tích dựa trên sự kết hợp hai vùng gen ITS1 và ITS2 để phân tích nhằm đánh giá mức độ xác định so với việc đánh giá từng gen riêng lẻ.. - Kết quả cho thấy loài Anoectochilus formosanus nằm trong một nhóm và Anoectochilus roxburhii nằm riêng một nhánh.. - Kết quả khảo sát các vùng gen ITS1, ITS2, ITS, rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2 trên 06 mẫu lan thuộc chi Anoectochilus, Lusidia cho tỷ lệ khuếch đại thành công từ 50 - 100%. - Trong nghiên cứu này đã đánh giá và chọn lọc được vùng gen ITS1, ITS2 thích hợp cho việc phân tích và xác định loài của một số loài lan thuộc hai chi này. - Dựa trên kết quả khuếch đại của các vùng gen DNA barcode, sản phẩm PCR vùng gen ITS1 và gen ITS2 được giải trình tự để phân tích mối quan hệ di truyền, xác định được loài. - Kết quả phân tích trình tự DNA của vùng gen ITS1 và ITS2 có thể dùng để định danh được hai mẫu chưa xác định được loài. - Dựa trên kết quả BLAST trên genbank và cây phát sinh chủng loài của hai vùng ITS1, ITS2 và ITS1+ITS2 cho thấy mẫu A3 thuộc loài Anoectochilus formosanus và mẫu A4 thuộc loài Anoectochilus roxburhii. - Các kết quả trên, chứng tỏ có thể sử dụng vùng ITS1 và ITS2 để đánh giá mối quan hệ di truyền và xác định một số loài thuộc chi Anoectochilus cụ thể là Anoectochilus formosanus và Anoectochilus roxburhii.. - "Identification of medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matK and rbcL sequences.". - "A comparison and combination of plastid atpB and rbcL gene sequences for inferring phylogenetic relationships within Orchidaceae.". - "A phylogenetic analysis of the Orchidaceae: evidence from rbcL nucleotide sequences.". - "Application of internal transcribed spacers and maturase K markers for identifying Anoectochilus, Lusidia, and Ludochilus.". - "Phân tích quan hệ di truyền của một số loài lan tại Việt Nam". - "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.". - "Hepatoprotective and antihyperliposis activities of in vitro cultured Anoectochilus formosanus.". - "Further studies on the hepatoprotective effects of Anoectochilus formosanus.". - diversification.". - "A DNA barcode for land plants.". - "DNA barcoding of Orchidaceae in Korea.". - "Illustrated flora of Korean orchids.". - "DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants.". - "Collector's item: Erythrodes, Goodyera, Haemaria and Macodes, with Anoectochilus."