Đa dạng di truyền các giống sầu riêng (Durio zibethinus) dựa trên trình tự dna mã vạch và chỉ thị phân tử ISSR

- ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG SẦU RIÊNG (Durio zibethinus) DỰA TRÊN TRÌNH TỰ DNA MÃ VẠCH VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR.
- DNA mã vạch, ISSR, ITS, matK, rpoC1, sầu riêng Keywords:.
- Sầu riêng (Durio zibethinus) là một trong những giống cây ăn quả đặc sản của Việt Nam được thị trường ưa chuộng.
- Hiện nay có nhiều giống sầu riêng được trồng tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và khó phân biệt được qua hình thái.
- Trình tự DNA của ba locus DNA mã vạch gồm ITS, matK, rpoC1 của chín giống (Ri-6, Monthong, Khổ Qua Xanh, Chín Hóa, Sữa Hạt Lép, Chuồng Bò, Bí, Musang King và Sáu Hữu) được thu từ Cần Thơ, Tiền Giang, Bến Tre và Vĩnh Long đã được giải trình tự và phân tích.
- Đối với vùng trình tự matK tìm được 9 SNPs phân biệt được các cá thể Ri- 6 (Cần Thơ và Viện Cây ăn quả miền Nam), Chín Hóa-Bến Tre, Sữa Hạt Lép-Bến Tre và Sáu Hữu-Tiền Giang.
- Vùng trình tự rpoC1 có độ bảo tồn cao giữa các giống trong nghiên cứu.
- Cây phân loại dựa trên các dấu phân tử ISSR đã tách các giống sầu riêng thành 5 nhóm và cho thấy sự khác biệt rõ của giống sầu riêng nhập ngoại Musang King-Vĩnh Long và cá thể sầu riêng Monthong-Tiền Giang..
- Sầu riêng (Durio zibethinus) là một trong những loại cây ăn quả đặc sản và có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam.
- Xuất xứ từ vùng đất nhiệt đới ẩm ở Đông Nam Á, sầu riêng được trồng nhiều ở Indonesia, Malaysia, Philippines, Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia.
- Sầu riêng được coi là một loại cây ăn trái quan trọng do có thời gian thu hoạch kéo dài và cho giá trị kinh tế cao (Nguyễn Danh Vàn, 2008).
- Tại Việt Nam, sầu riêng được trồng nhiều ở các tỉnh như: Đắc Lắc, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ.
- Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2013) đã định hướng phát triển sầu riêng là một trong 12 chủng loại cây ăn quả chủ lực trồng tập trung ở Nam Bộ với diện tích là 15.000 ha và được bố trí diện tích trồng rải vụ 5.250 ha đến năm 2020..
- Sầu riêng đông lạnh được thị trường nhiều nước ưa chuộng là mặt hàng xuất khẩu có giá trị rất cao..
- Trong tập đoàn cây ăn quả nhiệt đới của nước ta, sầu riêng có tiềm năng phát triển rất lớn góp phần tăng giá trị xuất khẩu..
- Tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) hiện đang được trồng rất nhiều giống sầu riêng khác nhau như: sầu riêng Khổ Qua Xanh, sầu riêng Ri 6, sầu riêng Chuồng Bò, sầu riêng Chín Hoá, sầu riêng Monthong (nhập ngoại.
- Tuy nhiên cho đến nay, có rất ít thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các giống sầu riêng bao gồm các giống sầu riêng phổ biến có nguồn gốc từ các quốc gia Châu Á (Husin et al., 2018).
- DNA mã vạch là một phương pháp định danh và giám định loài dựa trên các trình tự DNA ngắn ở những vùng chuẩn hóa của DNA hệ gene (Hebert et al., 2003).
- Nghiên cứu đa dạng di truyền và bảo vệ nguồn gene của các giống sầu riêng tại ĐBSCL có ý nghĩa rất quan trọng trong việc bảo tồn tính đa dạng sinh học sử dụng có hiệu quả các nguồn gene và phục vụ cho công tác chọn tạo giống.
- Chính vì thế việc thực hiện đề tài “Nhận diện giống sầu riêng Ri 6 bằng DNA mã vạch” nhằm phân loại và xác định giống sầu riêng Ri 6 và các giống sầu riêng được trồng phổ biến dựa trên vật liệu di truyền là rất cần thiết.
- Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu phân tích được đặc điểm trình tự nucleotide, so sánh khả năng phân định và nhận diện giống sầu riêng Ri 6 với các giống sầu riêng khác dựa trên trình tự vùng trình tự ITS, matK, rpoC1 và chỉ thị phân tử ISSR..
- Các giống sầu riêng như: Ri 6, Monthong, Khổ qua xanh, Chuồng bò, Sữa hạt lép, Chín Hóa, Sáu Hữu, Musang King và sầu riêng Bí được thu tại các trại giống và các nhà vườn có diện tích trồng lớn ở các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Vĩnh Long và Cần Thơ, mẫu được bảo quản trong túi nilon và ghi đầy đủ thông tin mẫu..
- Khuếch đại và giải trình tự DNA mã vạch.
- Các sản phẩm PCR đạt chất lượng được giải trình tự tại Công ty Nextgen..
- Trình tự nucleotide và chu kỳ nhiệt của 3 cặp mồi khuếch đại vùng trình tự rpoC1, matK và ITS.
- Tên mồi Trình tự (5’-3’) Chu kỳ nhiệt Nguồn.
- Bảy mồi ISSR được sử dụng để khảo sát sự đa hình của các trình tự lặp trong bộ gene sầu riêng..
- Trình tự các đoạn mồi và chu kỳ nhiệt được mô tả ở Bảng 2.
- Trình tự mồi ISSR và chu kỳ nhiệt sử dụng trong nghiên cứu.
- Tên mồi Trình tự Chu kỳ nhiệt.
- Các trình tự DNA được kiểm tra bằng chương trình Bioedit.
- Sau đó, các trình tự này được so sánh sự tương đồng với dữ liệu đã được công bố trên GenBank bằng công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
- Các trình tự được xác định độ chính xác bằng cách so sánh độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI.
- Các trình tự DNA được dàn hàng (alignment) và xác định các SNPs bằng chương trình Bioedit..
- Sản phẩm khuếch đại của các dấu phân tử ISSR của các giống sầu riêng được phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc2.1 (Numberical.
- Trình tự ITS.
- Phổ điện di với đoạn mồi ITS của 15 giống sầu riêng trên gel agarose 2%.
- Kết quả so sánh đã xác định được sự khác biệt ở giữa các trình tự gộp (consensus) và các giống thể hiện qua Bảng 3.
- Qua so sánh các trình tự, tìm được 6 SNPs giữa các trình tự và được kiểm tra peak lại trên chromatogram như sau: trong trình tự của các giống Ri 6, xuất hiện điểm sai khác tại vị trí 583 của trình tự sầu riêng Ri 6_Bến Tre, sau khi kiểm tra tín hiệu peak vị trí 603 nhận thấy tín hiệu chưa tốt ở vị trí này.
- Ở vị trí này của trình tự sầu riêng Chuồng bò_Tiền Giang cũng xuất hiện nucleotide A, sau khi kiểm tra peak vị trí 606 nhận thấy tín hiệu không phân biệt rõ giữa nucleotide A và G..
- Trong trình tự của các giống Monthong, trình tự Mongthong_Tiền Giang xuất hiện nucleotide G tại vị trí 717, các trình tự còn lại là nucleotide C sau khi kiểm tra peak ở trình tự này tại vị trí 734 cho thấy có sự chồng đỉnh giữa nucleotide G và C, nhưng peak của nucleotide G cao hơn, có thể do bị nhiễm hoặc đột biến dị hợp vị trí này.
- Vị trí thứ 8 xuất hiện nucleotide G trên trình tự của giống sầu riêng Sáu Hữu_Tiền Giang, các trình tự còn lại là nucleotide C, sau khi kiểm tra lại peak trên chromatogram tại vị trí 21 cho thấy nucleotide G bị chèn thêm, nên khả năng tại vị trí này do đột biến mất điểm..
- Vị trí SNPs trong trình tự nucleotide dựa trên vùng ITS của các giống sầu riêng.
- Qua kết quả phân tích và so sánh 14 trình tự dựa trên vùng ITS, trình tự có độ dài dao động từ 600 - 700 bp sau khi được hiệu chỉnh.
- Phát hiện 6 SNPs giữa các trình tự trong cùng một giống (Ri 6 và Monthong) và các trình tự ở các giống có một mẫu (Chuồng bò_Tiền Giang, Sữa hạt lép_Cần Thơ và Sáu Hữu_Tiền Giang).
- Trong đó, các vị trí này không đặc trưng cho giống sầu riêng Ri 6 nên chưa thể nhận diện được giống sầu riêng Ri 6 với các giống sầu riêng được sử dụng trong nghiên cứu.
- Tuy nhiên, từ các SNPs có sự khác biệt từ các cá thể sầu riêng Chuồng Bò_Tiền Giang, Sữa Hạt Lép_Cần Thơ và Sáu Hữu_Tiền Giang.
- Khi so sánh trình tự vùng ITS giữa các cá thể được sử dụng trong nghiên.
- cứu thể hiện được sự đa dạng đối với các trình tự trong cùng giống và giữa các giống khác nhau..
- Trình tự matK.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi khuếch đại một phần trình tự matK được kiểm tra trên gel agarose 2% với thang chuẩn 1 kb (Hình 2) cho thấy các băng DNA được khuếch đại cho kết quả rõ nét, kích thước đồng đều giữa các mẫu, không xuất hiện băng phụ chứng tỏ mồi được thiết kế có tính đặc hiệu để DNA bắt được và nhân bản với các trình tự của sầu riêng.
- Phổ điện di với đoạn mồi vùng trình tự matK của 10 giống sầu riêng trên gel agarose 2%.
- Trình tự của 17 mẫu được kiểm tra và hiệu chỉnh trên phần mềm BioEdit bằng cách đối chiếu các peak trên Chromatogram.
- Sau khi dàn hàng các trình tự trong cùng một giống bằng phần mềm BioEdit thì thu được trình tự chung của các giống sầu riêng Ri 6 (Ri 6_Consensus), Monthong (Monthong _Consensus), Khổ qua xanh (Khổ qua xanh_Consensus), Chín Hóa (Chín Hóa_Consensus), Sữa hạt lép (Sữa hạt lép_Consensus), Chuồng bò (Chuồng bò_Consensus)..
- Các trình tự Consensus của vùng trình tự matK được so sánh bằng công cụ BLAST trên NCBI để kiểm tra sự tương đồng với cơ sở dữ liệu của Ngân hàng gene và kết quả thu được có độ tương đồng từ với loài Durio zibethinus, độ bao phủ của trình tự Ri 6_Consensus so với các trình tự này dao động trong khoảng 91-100%..
- Kết quả các vị trí sai khác trong trình tự vùng trình tự matK được thể hiện qua Bảng 6.
- Kết quả cho thấy có 9 SNPs và được kiểm tra peak trên chromatogram: trong các trình tự của giống Ri 6, có 6 vị trí khác biệt ở giống này.
- Vị trí 662 của trình tự Ri 6_Viện Cây ăn quả miền Nam, sau khi kiểm tra peak cho thấy nucleotide G có tín hiệu thấp.
- Vị trí 739 và 740 của trình tự Ri 6_Cần Thơ, sau khi xem tín hiệu peak ở vị trí 760, 761 trên chromatogram cho thấy chỉ xuất hiện đỉnh cho một nucleotideA nên hai vị trí này có thể do đột biến.
- Vị trí 759 cũng ở trình tự Ri 6_Cần Thơ là nucleotide G các trình tự khác là nucleotide T, sau khi kiểm tra cho thấy tín hiệu nucleotide G chưa tốt và bị nhiễu.
- Vị trí 780 xuất hiện nucleotide C trên trình tự Ri 6_Cần Thơ các trình tự còn lại là nucleotide G, kiểm tra peak cho thấy tín hiệu nucleotide C thấp nhưng không có tín hiệu nhiễu bên dưới.
- Trong trình tự các giống Chín Hóa, hai điểm không xuất hiện nucleotide là.
- 750 và 763, sau khi kiểm tra peak (đoạn trình tự tín hiệu khá tốt các peak có đỉnh cao và phân biệt được các nucleotide, nên đây có thể là hai vị trí đột biến cho thấy được khác biệt của giống Chín Hóa với các giống còn lại.
- Trình tự các giống Sữa hạt lép cho thấy có 2 vị trí khác biệt.
- Vị trí 798 xuất hiện sai khác giữa nucleotide G và T, nên trình tự Consensus_SHL nên được thay thế bằng ký tự K..
- Trình tự Sáu Hữu_Tiền Giang xuất hiện sai khác tại vị trí 793 là nucleotide G các trình tự còn lại là nucleotide C, kiểm tra cho thấy tín hiệu nucleotide G thấp nhưng có tín hiệu của nucleotide A bên dưới mà không phải là nucleotide C.
- đối chứng giữa 17 trình tự vùng trình tự matK có độ dài khoảng 800 bp đã tìm được một số vị trí sai khác giữa các trình tự trong cùng giống Ri 6, giống Sữa hạt lép_Bến Tre và cá hai thể của giống Chín Hóa_Bến Tre và giống Sáu Hữu_Tiền Giang.
- Trong các điểm sai khác chưa tìm được vị trí đặc trưng cho giống sầu riêng Ri 6 nên vẫn chưa thể nhận diện được giống sầu riêng Ri 6 với các giống sầu riêng được sử dụng trong nghiên cứu.
- Kết quả phân tích cho thấy sự đa dạng trong trình tự vùng trình tự matK giữa các cá thể sầu riêng với nhau..
- Vị trí SNPs trong trình tự nucleotide dựa trên trình tự matK của các giống sầu riêng.
- Trình tự rpoC1.
- Kết quả PCR các mẫu với mồi khuếch đại vùng trình tự rpoC1 được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 2% (Hình 3) cho thấy các băng DNA xuất hiện rõ nét, không có băng phụ chứng tỏ mồi được dùng để khuếch đại đặc hiệu.
- So sánh với kích thước băng trên thang chuẩn cho thấy đoạn trình tự khuếch đại được có kích thước khoảng 500 bp..
- Trình tự rpoC1 của 20 mẫu sầu riêng có kích thước 455 bp sau khi được kiểm tra và hiệu chỉnh trên phần mềm BioEdit bằng cách loại bỏ đoạn trình tự nhiễu ở hai đầu và kiểm tra peak trên chromatogram.
- Sau đó, các trình tự đã được dàn hàng và kết quả cho thấy không có biến đổi nucleotide trong trình tự đoạn gen rpoC1 và hoàn toàn giống nhau giữa các giống được sử dụng trong nghiên cứu này.
- Kết quả này cho thấy vùng gen rpoC1 có tính bảo tồn cao đối với các giống sầu riêng trong nghiên cứu này.
- (2018) trên 40 giống sầu riêng của Thái Lan, kết quả không thể phân biệt được các giống sầu riêng và trình tự nucleotide của gen rpoC1 có tính bảo toàn cao chưa phải là mã vạch tiềm năng để nhận dạng tốt các giống sầu riêng.
- Ngược lại, đối với nghiên cứu các loài Trám đen (Canarium nigrum) ở một số tỉnh phía Bắc nước ta, vùng trình tự rpoC1 lại cho kết quả nhận dạng tốt với các trình tự trong cùng chi Canarium (Đinh Thị Phòng và ctv., 2018).
- Như vậy, có thể nhận định rằng ở vùng trình tự rpoC1 có những đặc trưng riêng và hiệu quả phân biệt ở các loài khác nhau là không giống nhau..
- Qua phân tích trình tự nucleotide của 3 trình tự ITS, matK và rpoC1, mối quan hệ di truyền gần gũi giữa các giống sầu riêng trong nghiên cứu thể hiện qua số SNPs đặc trưng cho từng giống còn khá khiêm tốn.
- (2020) chỉ xác định được 9 SNPs khi phân tích trình tự bộ gene lục lạp hoàn chỉnh ở 24 cá thể sầu riêng thuộc giống Thái và Musang King..
- ISSR trong phản ứng PCR trên DNA của bộ gen thu được từ các mẫu lá sầu riêng.
- Còn lại phổ diện điện di của 5 mồi (ISSR03, ISSR13, ISSR22, ISSRK1 và ISSRK2) được tiếp tục sử dụng để phân tích mối quan hệ di truyền của 20 mẫu sầu riêng..
- Kết quả này cao hơn trong một nghiên cứu tương tự trên sầu riêng của Vanijajiva (2012), với 5 chỉ thị ISSR đã khuếch đại được 50 phân đoạn, có kích thước từ 50-2.000 bp và có 19 phân đoạn đa hình chiếm 38%.
- So sánh với quần thể 55 giống sầu riêng được nghiên cứu ở Indonesia của Angeliena et al.
- Kết quả 5 mồi được phân tích sự đa dạng giữa 20 giống sầu riêng.
- Sự khác biệt của 20 giống sầu riêng được ghi nhận dựa trên sự đa hình về kiểu gene được khuếch đại bởi 5 mồi ISSR có hệ số tương đồng dao động trong khoảng Hình 4).
- Các mẫu của giống sầu riêng Ri 6 nằm ở 3 nhánh khác nhau, trong đó có 3 cá thể nằm cùng nhánh là Ri 6 (Vĩnh Long, Tiền Giang và Bến Tre) thuộc nhóm I, còn 2 cá thể của giống này nằm ỏ nhóm II.A (Ri 6_Cần Thơ) và II.B (Ri 6_Viện CAQMN).
- Các mẫu của hai giống sầu riêng Sữa hạt lép (Bến Tre và Cần Thơ) và Chín Hóa (Bến Tre và Cần Thơ) không đi cùng một nhóm, qua đó ta có thể nhận định hai giống này không có cùng nguồn gốc..
- Hai mẫu sầu riêng Chuồng Bò (Tiền Giang và Bến Tre) và sầu riêng Bí (Bến Tre) nằm cùng nhánh III.B cho thấy rằng hai giống này có mối quan hệ họ hàng gần gũi.
- Đặc biệt qua phổ diện điện di có thể phân biệt được mẫu Musang King, giống này nằm riêng một nhánh trong cây phân loại và đây là giống sầu riêng nhập ngoại từ Malaysia.
- Kết quả phân tích dựa vào dấu phân tử ISSR đã phân chia 20 giống sầu riêng thu được ở bốn tỉnh của vùng ĐBSCL chia thành các 5 nhóm có hệ số tương đồng dao động khá xa trong khoảng 0,61.
- Cũng giống như một nghiên cứu về mối quan hệ di truyền của 14 giống sầu riêng ở Thái Lan có hệ số tương đồng dao động trong khoảng Vanijajiva, 2012).
- Một số nghiên cứu trên các giống cây ăn quả khác dựa vào dấu phân tử ISSR cũng cho kết quả tương tự.
- Mối quan hệ di truyền của 20 mẫu giống sầu riệng dựa trên 5 đoạn mồi ISSR R1.
- Vùng trình tự ITS phát hiện 6 SNPs giữa các cá thể Ri 6_Bến Tre, Monthong_Tiền Giang, Chuồng bò_Tiền Giang, Sữa hạt lép_Cần Thơ và Sáu Hữu_Tiền Giang.
- Đối với vùng trình tự matK tìm được 9 SNPs phân biệt được các cá thể Ri 6 (Cần Thơ và Viện Cây ăn quả miền Nam), Chín Hóa_Bến Tre, Sữa hạt lép_Bến Tre và Sáu Hữu_Tiền Giang, nhưng chưa thể nhận diện được giống sầu riêng Ri 6 với các giống sầu riêng được sử dụng trong nghiên cứu.
- Nghiên cứu đã góp phần xây dựng bộ dữ liệu DNA mã vạch làm nền tảng định hướng cho các bước nghiên cứu tiếp theo trên sầu riêng ở ĐBSCL..
- Kĩ thuật canh tác cây ăn trái - Cây sầu riêng.
- Đa dạng di truyền các giống/dòng Măng cụt (Garcinia mangostana L.) dựa trên dấu phân tử ISSR ở Bình Dương