- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. - HỒ BÍCH DUYÊN Đề tài: TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (LAS - LINEAR ANKYLBENZO SULFONATE) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. - NGUYỄN LAN HƯƠNG HÀ NỘI - 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi. - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu tính toán được hoàn thành chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. - LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sỹ này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới TS. - Nguyễn Lan Hương – Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện. - Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đang công tác tại phòng thí nghiệm Viện CNSH và CNTP đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng. - Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện luận văn này. - Hà Nội, tháng 09 năm 2011 Học viên Hồ Bích Duyên Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên i Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU . - GIỚI THIỆU VỀ CHẤT TẨY RỬA Chất tẩy rửa là gì Cơ chế tẩy rửa Một số chất tẩy rửa thường gặp . - CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT VÀ LAS Chất hoạt động bề mặt Lịch sử ra đời Định nghĩa Cấu tạo Phân loại . - Cơ chế tẩy rửa . - Giới thiệu về LAS Cấu trúc, thành phần Tính độc của LAS Tình hình tiêu thụ LAS trên thế giới KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS MỘT SỐ VI SINH VẬT PHÂN HỦY LAS PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHỨA LAS TRÊN THẾ GIỚI . - THỰC TRẠNG Ô NHIỄM NƯỚC DO CHẤT TẨY RỬA TẠI VIỆT NAM..22 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP VẬT LIỆU Mẫu thí nghiệm Hóa chất Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên ii Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 2.1.3 Thiết bị Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu Môi trường hoạt hóa Nutrient borth (NB Môi trường khoáng thử hoạt tính (MK Môi trường nhân giống PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy LAS Xác định đường cong sinh trưởng theo độ đục Phân loại tế bào bằng cách nhuộm Gram Phương pháp định tính thử khả năng phân hủy LAS Phương pháp cấy chấm điểm Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Phương pháp xác định hàm lượng LAS Phương pháp Methylene Blue Active Substance (MBAS Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân hủy LAS Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của tốc độ lắc Ảnh hưởng của nồng độ LAS Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Phương pháp PCR Phương pháp tinh sạch PCR bằng KIT Bioner – Hàn Quốc Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . - PHÂN LẬP VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập Hoạt tính phân hủy LAS của các chủng lựa chọn Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên iii Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 3.1.3 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng lựa chọn ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG TRÊN MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân huỷ LAS Ảnh hưởng của nồng độ LAS KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS CỦA CHỦNG L2 XÁC ĐỊNH BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP MBAS VÀ HPLC ĐỊNH TÊN CHỦNG L2 VÀ L9 BẰNG KỸ THUẬT 16S rDNA Tách chiết DNA và sản phẩm PCR Kết quả định tên chủng Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 1 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ 1 2 3 4 LAS CHĐBM MBAS HPLC Linear Ankylbenzo Sulfonate. - Chất hoạt động bề mặt. - High Performance Liquid Chromatography Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 2 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Số liệu mức tiêu thụ bình quân các chất giặt tẩy năm Bảng 1.2 Thành phần các đồng đẳng LAS thương mại Bảng 1.3 Khả năng phân hủy LAS của một số chủng trên thế giới Bảng 1.4 So sánh khả năng phân hủy LAS của một số nhà máy theo phương pháp vật lý, sinh học Bảng 2.1 Thành phần của một phản ứng PCR Bảng 2.2 Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi Bảng 2.3 Điều kiện của một phản ứng PCR Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng Bảng 3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân hủy LAS Bảng 3.3 Khả năng phân hủy LAS sau 4 ngày nuôi chủng L2 được xác định bằng phương pháp MBAS và HPLC Bảng 3.4 Kết quả phân tích giải trình tự hai chủng L2 và L Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 3 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số loại xà bông chứa chất tẩy rửa Hình 1.2 Một số sản phẩm chăm sóc cá nhân chứa chất tẩy rửa Hình 1.3 Cấu tạo của xà phòng và chất hoạt động bề mặt Hình 1.4 Cấu tạo hóa học của 10 CHĐBM phổ biến Hình 1.5 Cơ chế tẩy rửa của CHĐBM Hình 1.6 Cấu trúc hóa học LAS Hình 1.7 Sản phẩm LAS thương mại Hình 1.8 Sơ đồ phân hủy LAS Hình 1.9 Sơ đồ xử lý nước thải ở nhà máy P&G Hình 1.10 Toàn cảnh ô nhiễm tại cửa sông Phú Lộc Hình 2.1 Phương pháp pha loãng canh trường. - Hình 2.2 Phản ứng giữa AS và MB Hình 2.3 Sơ đồ xác định hàm lượng LAS Hình 2.4 Đường chuẩn LAS đo mật độ quang ở bước sóng 650 nm Hình 2.5 Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC Hình 2.6 Qui trình tách chiết DNA Hình 2.7 Qui trình tinh sạch PCR Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của 8 chủng phân lập từ mẫu M1 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường MK quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của 6 chủng phân lập từ mẫu M2 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường MK quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại Hình 3.3 Vòng thử hoạt tính theo phương pháp cấy chấm điểm Hình 3.4 Hình thái tế bào của các chủng quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng (A): L1. - (D): L Hình 3.6 % LAS còn lại của các chủng với cùng nồng độ LAS ban đầu, sau 6 ngày nuôi (A):100ppm;(B):300ppm;(C):500ppm;(D):700ppm(bảng phụ lục)52 Hình 3.7 Khả năng phân hủy LAS của các chủng khi thay đổi nồng độ Hình 3.8 Kết quả tách chiết DNA của hai chủng L2 và L Hình 3.9 Sản phẩm PCR của hai chủng L2 và L Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 4 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội MỞ ĐẦU Đồng hành với sự phát triển kinh tế, khoa học kỹ thuật, đời sống của con người ngày càng được nâng cao thì mức độ tàn phá thiên nhiên ngày càng nghiêm trọng, một trong những ảnh hưởng của con người đến tự nhiên chính là hiện tượng ô nhiễm môi trường. - Phần lớn lượng nước thải đều không được được qua hệ thống xử lý hoặc thu gom đến một nhà máy xử lý nước thải chung, mà thải thẳng vào các ao hồ, sông suối. - Hiện nay trên thế giới có khoảng 6 tỷ người sinh sống vì vậy lượng nước thải sinh hoạt hàng ngày lên tới hàng trăm tỷ m3. - Cùng với lượng nước thải đó là hàng trăm ngàn tấn các chất hữu cơ, dầu mỡ, chất dinh dưỡng (giàu nitơ, phot pho. - Tuy nhiên phần lớn lượng chất thải này không được xử lý mà thải trực tiếp ra môi trường. - Ở Việt Nam cũng vậy, hàng ngày có hàng triệu m3 nước thải được đổ vào môi trường do hoạt động sinh hoạt gia đình của con người, đó là chưa kể đến các hoạt động công nghiệp, nông nghiệp… mà phần lớn lượng nước thải trong sinh hoạt trong số này không được xử lý mà đổ trực tiếp ra môi trường đất hay nước. - Điều này không chỉ gây nguy hại cho môi trường xung quanh do sự phân hủy các chất dinh dưỡng mà còn nguy hiểm hơn khi các chất ô nhiễm này ngấm xuống tầng nước ngầm gây ô nhiễm nước ngầm vốn là nguồn nước sinh hoạt của nhiều người dân. - Các chất tẩy rửa đi vào nước thải sinh hoạt qua quá trình tắm giặt, gội và rửa. - Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu sử dụng chất tẩy rửa càng tăng. - Trong chất tẩy rửa thành phần chất hoạt động bề mặt chiếm tỷ trọng lớn, các chất này không những gây ra ô nhiễm mà còn ảnh hưởng đến khả năng hòa tan oxy trong hệ thống xử lý nước thải, dẫn đến giảm khả năng phân hủy sinh học của hệ thống xử lý. - Hàng năm trên thế giới sử dụng khoảng hơn 4 triệu tấn chất hoạt động bề mặt, trong đó Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 5 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Linear Alkylbenzo Sulfonate (LAS) chiếm khoảng 50%. - Đã có nhiều phương pháp đưa ra để loại bỏ chất này ra khỏi nước thải, trong đó phương pháp sinh học có nhiều triển vọng nhất. - Sự phân hủy sinh học LAS đã được tiến hành trong hơn 30 năm qua, nhiều chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các khu vực bị ô nhiễm LAS để xử lý nước thải của khu vực đó. - Ở châu Âu 99% các chất hoạt động bề mặt chính được loại bỏ bằng các hệ thống xử lý. - Ở nước ta, chưa có nghiên cứu về việc sử dụng vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất tẩy rửa có trong nước thải. - Vì vậy, việc “Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy chất hoạt động bề mặt Linear Ankylbenzo Sulfonate (LAS)” là rất cần thiết. - Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 6 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. - GIỚI THIỆU VỀ CHẤT TẨY RỬA 1.1.1Chất tẩy rửa là gì? Chất tẩy rửa sử dụng cho việc làm sạch có thành phần rất phức tạp, nhưng thành phần chính thường gồm: 9 Chất hoạt động bề mặt. - 9 Các chất xây dựng. - 9 Các chất phụ gia. - Mỗi thành phần trong chất tẩy rửa có những đặc tính riêng trong việc tẩy rửa, tuy nhiên chúng vẫn có tác động tương hỗ giữa các chất này hay các chất khác. - Ngoài thành phần chính trên đây, tùy theo yêu cầu mục đích sử dụng của từng loại bột giặt, người ta có thể thêm vào các phụ gia cần thiết hoặc loại bỏ các chất không cần thiết. - 1.1.2 Cơ chế tẩy rửa Cơ sở lý hóa của việc làm sạch các vết bẩn từ bề mặt chất mang là do việc hấp phụ của chất hoạt động bề mặt lên các bề mặt nhiễm bẩn, hay sự hấp phụ chọn lọc của các hợp chất chelat lên các hạt bẩn phân cực. - Tính chất hóa học của bề mặt chất tẩy rửa/chất lỏng và bề mặt phân cách chất bẩn/chất lỏng bị thay đổi khi có sự hấp phụ của hợp chất tẩy rửa. - Mức độ hấp phụ phụ thuộc vào nồng độ các chất hoạt động bề mặt, vào các chất khác có trong dung dịch, vào nhiệt độ và đặc biệt phụ thuộc vào loại bề mặt chất tẩy rửa hay các chất bẩn. - Sự hấp phụ xảy ra càng mạnh thì sự tẩy rửa càng tốt. - Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 7 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 1.1.3 Một số chất tẩy rửa thường gặp a. - Xà phòng: Hình 1.1 Một số loại xà bông chứa chất tẩy rửa Xà bông là chất tẩy rửa đầu tiên xuất hiện trong nền văn minh nhân loại. - Cách đây 2500 năm trước công nguyên người Sumer đã tự tìm cho mình công thức chế biến xà bông: “tro (than) đun với dầu”. - Sau đó người Ai Cập đã cải tiến bằng một chất xút tự nhiên – chất Trona (1 lớp vỏ khô cứng bên bờ hồ nước mặn) hòa vào các chất mỡ. - Cho tới cuối thế kỷ 18 thì cuộc cách mạng về xà bông nổ ra khi Chervereul đã thành công khi giải thích được phản ứng hóa học giữa chất kiềm và triglyxerit [4]. - Từ thời kỳ này, sự sản xuất công nghiệp trở nên dễ dàng hơn, việc sử dụng xà bông trở thành phổ biến. - Thị trường sản xuất các sản phẩm tẩy rửa cũng ngày càng đa dạng về chủng loại để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, chẳng hạn như: 9 Các sản phẩm để giặt quần áo hay các loại vải có màu sắc. - 9 Các chất làm mềm vải. - 9 Các chất lau chùi gia dụng. - 9 Các dạng sản phẩm để chăm sóc cá nhân Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 8 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội b. - Sản phẩm chăm sóc cá nhân: Hình 1.2 Một số sản phẩm chăm sóc cá nhân chứa chất tẩy rửa Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu chăm sóc cá nhân ngày càng đòi hỏi cao. - Hàng loạt các sản phẩm làm đẹp ra đời như dầu gội đầu, dầu xả, kem đánh răng, sữa tắm… đa dạng về chủng loại và hương thơm mang lại nguồn doanh thu cao. - Trong quá trình sản xuất sản dầu gội thì chất hoạt động bề mặt là 1 nguyên liệu lý tưởng vì: khả năng tạo bọt cao khi có chất nhờn, không gây kích ứng cho da (α-olefinsulfonat), không cay mắt (sulfosuccinat. - Trong quá trình sản xuất kem đánh răng thì chất tẩy rửa giúp: tẩy mảng bám trên răng, tạo bọt, hòa tan và phân tán các mùi hương không tan trong nước…Theo số liệu thống kê năm 1996 mức tiêu dùng trung bình 4,5kg chất tẩy rửa mỗi người dân trong một năm [4]. - Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 9 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Bảng 1.1 Số liệu mức tiêu thụ bình quân các chất giặt tẩy năm 1996 [4] Khu vực Mức tiêu thụ(kg/người dân/năm) Bắc Mỹ 9,8 Tây Âu 9,5 Nhật Bản 4,5 Châu Mỹ La Tinh 3,8 Đông Nam Á và Châu Úc 2 Châu Phi 2 1.2. - CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT VÀ LAS 1.2.1 Chất hoạt động bề mặt 1.2.1.1 Lịch sử ra đời Xà bông là chất tẩy rửa đầu tiên xuất hiện trong nền văn minh nhân loại. - Ban đầu sự chế biến xà phòng còn thô sơ nhưng nó được xem là sản phẩm xa xỉ để tắm gội và là mỹ phẩm trong nhiều thế kỷ. - Cuối thế kỷ 18 khi ngành sản xuất xà bông phát triển rầm rộ các nhà khoa học mở ra hướng nghiên cứu về những sản phẩm thay thế chất hữu hiệu hơn cả xà bông có được nhờ tổng hợp các hóa chất. - Fritz Guinther đã thành công khi sáng chế ra chất tẩy rửa tổng hợp đầu tiên là Ankylnaphatalen. - Tuy nhiên Ankylnaphatalen có chuỗi phân tử quá ngắn không thể đáp ứng đầy đủ được những đặc tính của chất tẩy rửa [4]. - Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hồ Bích Duyên 10 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Cho tới năm 1946, sự phát hiện ra Ankylbenzen Sulfonate (ABS) đã tạo ra một bước ngoặc quan trọng và trở thành chất hoạt động bề mặt “nổi tiếng” nhất sau xà bông bởi tính chất ít cảm ứng với chất vôi, hiệu quả cao trong việc tẩy rửa. - Nhưng nhược điểm của ABS là nó có khả năng phân giải sinh học yếu tạo ra những khối bọt lớn trên các dòng thải gây ảnh hưởng tới môi trường. - Chính vì vậy mà ABS dần bị cấm sử dụng ở một số quốc gia, đầu tiên là Đức, Pháp, Ý, Nhật. - LAS đã trở thành một tác nhân làm sạch chính để tẩy rửa quần áo hầu hết trên thế giới. - LAS có khả năng phân hủy nhanh hơn so với chuỗi tương tự tetrapropyl benzene sulfonate của ABS. - LAS được đưa vào thị trường thế giới năm 1964 và được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay. - Ở Việt Nam, mãi đến ngày theo chỉ thị của Thủ tướng Chính phủ thì tất cả các cơ sở sản xuất, kinh doanh mới phải sử dụng LAS thay thế cho dodexyl benzen sunfonic axit (DBSA) trong công nghiệp chất tẩy rửa tổng hợp [2, 4]. - Cùng với sự phát triển của các chất hoạt động bề mặt, các hợp chất tẩy rửa cũng được cải thiện. - Dần dần, các cách thiết lập công thức được phong phú hơn, chẳng hạn bằng cách thêm các tác nhân ngăn ngừa các hạt bẩn bám lại, các chất tẩy quang học và enzyme, các chất hoạt hóa làm trắng… 1.2.1.2 Định nghĩa Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) là thành phần không thể thiếu trong các sản phẩm chất tẩy rửa. - Nhiệm vụ của nó là đảm bảo tẩy đi các vết bẩn và những chất lơ lửng trong nước giặt để ngăn cản sự bám lại của chúng trên bề mặt tẩy rửa. - Nhờ có một số tính chất đặc biệt như khả năng tẩm ướt, tạo bọt, làm ổn định huyền phù, nhũ tương, nên các hợp chất hoạt động bề mặt được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp (dệt nhuộm, tuyển nổi quặng, khai thác dầu mỏ, chế hoá kim loại, sản xuất polyme, sơn, sợi hoá học, da, vật liệu cho phim ảnh, thuốc nhuộm, mỹ phẩm. - trong nông nghiệp (điều chế huyền phù, nhũ tương của các chất bảo vệ thực vật
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt