- PHAN THỊ HƯƠNG TRÀ ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENESĐƯỢC PHÂN LẬP TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. - LÊ QUANG HÒA HÀ NỘI - 2010 Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Khóa luận nghiên cứu này sẽ không có thể thực hiện được nếu không có sự hỗ trợ của nhiều người. - Lê Quang Hòa – Phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử - Viện CNSH & CNTP – Trường ĐHBK Hà Nội, người đã hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian làm việc ở phòng thí nghiệm và luôn sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. - Tôi cũng muốn bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. - Đặc biệt cảm ơn đến tất cả các cán bộ nhân viên phòng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm Công nghệ cao và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học cùng với các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh thực tập tại đây đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm. - Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi, những người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. - Học viên Phan Thị Hương Trà Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, những nội dung được trình bày trong luận văn này là do sự tìm tòi, nghiên cứu của chính bản thân. - Các kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào của các tác giả khác. - Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010 Tác giả Phan Thị Hương Trà Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU PHẦN I. - monocytogenes gây ra I.1.2.1. - monocytogenes gây ra I.1.3. - Tình hình ngộ độc thực phẩm do L. - monocytogenes gây ra I.1.3.1. - Các phương pháp phát hiện L. - Các phương pháp truyền thống I.2.1.1. - Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái vi sinh vật học I.2.1.2. - Phương pháp sinh hóa I.2.1.3. - Phương pháp huyết thanh học I.2.2. - Các phương pháp không truyền thống I.2.2.1. - Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay I.2.2.2. - Phương pháp lai phân tử DNA (DNA-Hybridization Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học I.2.2.3. - Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction I.3. - Các phương pháp xác định kiểu phụ của L. - Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu hình I.3.1.1. - Phương pháp huyết thanh học I.3.1.2. - Phương pháp dựa trên kiểu của thể thực khuẩn I.3.1.3. - Phương pháp MLEE (multilocus enzyme electrophoresis I.3.1.4. - Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu esterase I.3.2. - Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu gen I.3.2.1. - Phương pháp PFGE (pulsed-field gel electrophoresis I.3.2.2. - Phương pháp ribotyping I.3.2.3. - Các phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR I.3.2.4. - Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên trình tự DNA I.4. - Các phương pháp xác định độc tính của L. - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. - Phương pháp nghiên cứu II.2.1. - Xây dựng quy trình phân lập L. - monocytogenes từ thực phẩm II.2.1.1. - Giai đoạn tăng sinh từ mẫu thực phẩm ban đầu II.2.1.2. - Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L. - Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được II.2.2.1. - Thu DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học II.2.2.2. - Phương pháp phân tích trình tự gen PHẦN III. - monocytogenes từ thực phẩm III.1.1. - Kết quả phân lập L. - Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được III.2.1. - Xác định kiểu phụ của các chủng dựa trên trình tự gen đặc trưng ...83III.2.4.3. - Phân tích dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được PHẦN IV. - Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ 1 aw Water activity (hoạt độ của nước) 2 DNA Axit Deoxyribonucleic 3 bp Base pair (cặp bazơ) 4 dNTP Deoxynucleotide 5 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid 6 EtBr Ethidium Bromide 7 MVLST A multi-virulence-locus sequence typing 8 kDa Kilo Dalton 9 LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA 10 PCR Polymerase Chain Reaction 11 PEG Polyetylen Glycol 12 TAE Tris - Acetate - EDTA 13 TE Tris - EDTA 14 PBS Phosphate Buffered Saline- muối đệm phosphate 15 HFb Half Fraser Broth (Môi trường tiền tăng sinh Lm) 16 Fb Fraser Broth (Môi trường tăng sinh Lm) 17 CFU Colony forming unit (Số đơn vị hình thành khuẩn lạc) 18 CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes là một trong những vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm trên cả người và động vật. - Một đặc tính đặc biệt của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp nên các mặt hàng đông lạnh như thịt, xúc xích, các sản phẩm bơ, sữa …có nguy cơ cao bị nhiễm loại vi khuẩn này . - chính vì vậy người ta thường không nhận biết được ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. - Nếu độc tính đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, viêm dạ dày. - monocytogenes nguy hiểm hơn rất nhiều so với các tác nhân gây bệnh thông qua thực phẩm phổ biến như Salmonella (với tỷ lệ tử vong 0,38. - Vi khuẩn L. - monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. - Ở Việt Nam, với sự phát triển của nền kinh tế , lối sống công ngiệp hóa và nhu cầu sử dụng các thực phẩm chế biến sẵn như sữa và các sản phẩm của sữa, trứng và các Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học sản phẩm của trứng, đặc biệt là thực phẩm đông lạnh ngày càng gia tăng trong bữa ăn hàng ngày của người dân thì nguy cơ nhiễm bệnh do L. - monocytogenes nhưng đã có một số nghiên cứu phát hiện được sự nhiễm tạp của loại vi khuẩn này trong một số loại thực phẩm chế được biến sẵn. - Bên cạnh đó, khả năng gây bệnh và dịch của các chủng L. - monocytogenes có nguồn gốc từ thực phẩm ở nước ta nói chung và ở Hà Nội nói riêng vẫn còn chưa được xác định.. - Do vậy, trong khuôn khổ của luận văn cao học này, chúng tôi đã nghiên cứu “Phân lập và xác định độc tính bằng dịch tễ học phân tử của các chủng Listeria monocytogenes từ các mẫu thực phẩm thu thập được trên địa bàn Hà Nội”. - Nghiên cứu này đã giải quyết các vấn đề sau: ¾ Xây dựng quy trình phân lập L. - monocytogenes từ thực phẩm. - ¾ Áp dụng quy trình đã xây dựng để phân lập các chủng L. - monocytogenes từ các mẫu thực phẩm trên địa bàn Hà Nội. - ¾ Nghiên cứu dịch tễ học của các chủng đã phân lập dựa trên việc phân tích trình tự của các gen mang độc tính – MVLST (Multi-virulence-locus sequence typing). - Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học PHẦN I. - monocytogenes là một loại vi khuẩn có thế khiến phụ nữ mang thai bị sẩy thai, gây ra bệnh viêm màng não ở người già hoặc những người có hệ miễn dịch yếu [51]. - monocytogenes được biết đến lần đầu tiên vào năm 1911 khi Hulpher, nhà vi sinh vật học Thụy Điển, phân lập được một loài vi khuẩn từ bệnh hoại tử gan thỏ và ông đặt tên là Bacillus hepatic. - Các đặc tính của loài vi khuẩn do Hulpher mô tả cho thấy nó rất giống với L. - Đồng thời vào năm 1927, Pirie trong quá trình nghiên cứu nguyên nhân gây ra bệnh dịch đối với động vật ở Nam Phi đã phát hiện ra một vi sinh vật mới và đặt tên là Listerella hepatolytica. - Sự giống nhau về các đặc tính của hai chủng này dẫn đến kết quả Murray và Pirie đã thống nhất gọi vi khuẩn này là Listerella monocytogenes. - Năm 1929, Nyfeldt đã lần đầu tiên phân lập loài vi khuẩn này từ người. - ivanovii có khả năng gây bệnh [56]. - Nhiều nghiên cứu cho thấy, L. - monocytogenes có khả năng gây bệnh cho cả người và động vật trong khi đó L. - Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học Bảng 1. - monocytogenes có thể tồn tại độc lập hoặc tạo chuỗi ngắn. - Loài vi khuẩn này không hình thành capsul và không sinh bào tử. - monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trường. - Khi nuôi cấy ở 20-250C trong tiêu bản giọt treo, vi khuẩn L. - Hình 1.Vi khuẩn L. - monocytogenes Giới Bacteria Ngành Lớp Bộ Họ Chi Firmicutes Bacilli Bacilales Listeriaceae Listeria Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học I.1.1.2. - monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, không sinh bào tử. - Chúng có khả năng sinh trưởng trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và thậm chí trong điều kiện chân không. - Tốc độ sinh trưởng và phát triển của L. - monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ -4 tới 500C, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng là 30-370C. - Về lý thuyết, nhiệt độ càng thấp thì vi khuẩn sinh trưởng càng chậm. - Thời gian phát triển trung bình của L. - Nhiệt độ dưới 00C sẽ gây ức chế sự phát triển của L. - Nhìn chung, pH thích hợp cho sự phát triển của L. - Sự sinh trưởng ở pH thấp còn phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy và loại axit có trong môi trường. - monocytogenes có thể tồn tại nhưng không sinh trưởng. - Một số thí nghiệm cho thấy rằng nếu có khoảng 0,1% axit axetic, axit xitric và axit lactic trong môi trường lỏng tryptose sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của L. - Sự sinh trưởng cũng sẽ bị suy giảm khi có mặt vi khuẩn lactic. - Nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn lactic tạo môi trường pH thấp và trong một số trường hợp tạo ra các chất có tính diệt khuẩn. - Hoạt độ nước (aw) thích hợp cho sự sinh trưởng và phát trển của L. - Hoạt độ nước tối thiểu cho sự sinh trưởng của hầu hết các chủng là 0,93, tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trưởng trong điều kiện aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại với một thời gian dài trong tình trạng aw rất thấp. - monocytogenes có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối khá cao 10-12%. - Loài vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trong môi trường có nồng độ Luận văn thạc sĩ Phan Thị Hương Trà Công nghệ sinh học muối vừa phải (6,5. - monocytogenes không thể phát triển trong các loại thực phẩm ăn liền là: pH 5,0-5,5 và aw < 0,95 pH
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt