Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen 4CL1 vào cây xoan ta (Melia azedarach L.)

- NGUYỄN NHƯ NGỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR VÀ CHUYỂN GEN 4CL1 VÀO CÂY XOAN TA ( Melia azedarach L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.
- Hồ Văn Giảng, Giám đốc trung tâm Giống và Công nghệ Sinh học- trường Đại học Lâm Nghiệp, chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) có sức sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt” đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
- Một số loài cây rừng đã và đang được nghiên cứu chuyển gen ở Trung Quốc 8 2 Bảng 1.2.
- Đặc điểm của một số gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau 18 3 Bảng 2.1.
- Thành phần phản ứng cắt các vector chuyển gen pBI 121 và vector tách dòng PCR 2.1- 4CL1 bằng cặp enzym giới hạn.
- Thành phần phản ứng ghép nối vector pBI121 với gen 4CL1 để tạo vector tái tổ hợp.
- Thành phần phản ứng PCR nhân gen 4CL1 44 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang1 Hình 1.1.
- Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu 5 2 Hình1.2.
- Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ Clive James Hình 1.3.
- Hình thái cây trưởng thành, Hoa và Quả của cây Xoan ta 22 7 Hình 1.7.
- Kết quả thôi gel thu nhận gen 4CL1 và vector pBI121 50 12 Hình 3.3.
- Kết quả PCR nhân gen 4CL1 53 15 Hình 3.6.
- tumefaciens LB1và LB2 56 19 Hình 3.10.
- Kết quả cắt plasmid dòng LB1 và LB2 bằng enzym giới hạn 56 20 Hình 3.11.
- Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ các dòng LB1 và LB2 .
- 57 21 Hình 3.12.
- Cây mầm Xoan ta in vitro tái sinh từ hạt 58 22 Hình 3.13.
- Thân mầm Xoan ta cộng sinh với vi khuẩn A.
- tumefaciens mang vector pBI121 – 4CL1 59 23 Hình 3.14.
- Các giai đoạn phát triển của vật liệu nhận gen trên môi trường chọn lọc 60 24 Hình 3.15.
- Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 62 25 Hình 3.16.
- Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 ở điều kiện tự nhiên sau 1 tháng 63 26 Hình 3.17.
- Ảnh điện di ADN tổng số từ 9 dòng Xoan ta chuyển gen 64 27 Hình 3.18.
- Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ 16 dòng Xoan ta chuyển gen 65 28 Hình 3.19.
- Kết quả southern blot từ ADN cây Xoan ta chuyển gen, dòng T5 66 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan lời cảm ơn Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN .
- Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam .
- Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới .
- Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam .
- Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam .
- Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới .
- Tình hình nghiên cứu cây lâm nghiệp biến đổi gen ở Việt Nam .
- Gen 4CL1 – điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .
- Tình hình nghiên cứu gen 4CL1 trên thế giới .
- Tổng quan về cây Xoan ta (Melia azedarach L .
- Giới thiệu về cây Xoan ta .
- Tình hình nghiên cứu phát triển giống Xoan ta .
- Chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .
- Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu .
- Giới thiệu về vector chuyển gen pBI .
- Các thành phần cấu trúc của vector pBI Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .
- Vật liệu và hoá chất nghiên cứu .
- Phương pháp nghiên cứu .
- Thiết kế vector chuyển gen 4CL .
- tumefaciens mang vector chuyển gen .
- Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta .
- Tạo các đoạn thân mầm để cảm ứng phục vụ cho chuyển gen .
- Tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh .
- Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan chuyển gen Nhân gen mục tiêu bằng phương pháp PCR Phương pháp lai Southern blot Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .
- Thiết kế vector chuyển gen tái tổ hợp pBI12-4CL .
- Cắt vector chuyển gen pBI121 và pCR2.1-4CL1 bằng cặp enzym BamHI/SacI và thôi gel để thu nhận sản phẩm cắt .
- Biến nạp vector chuyển gen mang gen 4CL1 vào vi khuẩn A.
- tumefaciens chủng LBA Tuyển chọn các dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen .
- Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta .
- Tạo các cây mầm in vitro để tạo vật liệu phục vụ cho chuyển gen .
- Tạo cây con Xoan ta chuyển gen 4CL .
- Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây chuyển gen .
- Kết quả tách chiết ADN tổng số của cây con Xoan ta chuyển gen .
- Gỗ Xoan được ưa chuộng dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và điêu khắc… Do đó, Xoan ta đã được chọn là loài cây gỗ lớn quan trọng được xếp vị trí thứ nhất và thứ hai trong danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm.
- Mặc dù vậy, các giống Xoan ta đang trồng hiện nay vẫn chưa đáp ứng được những yêu cầu của người trồng rừng sản xuất và người sử dụng bởi gỗ Xoan sau khi thu hoạch thường phải ngâm trong nước từ 5 đến 6 tháng thì gỗ mới bền, không bị mối, ít bị biến dạng khi sử dụng.
- Chính vì vậy, thực tiễn luôn đòi hỏi tạo ra giống Xoan ta có sức sinh trưởng nhanh hơn, chất lượng gỗ tốt hơn nữa để đáp ứng nhu cầu gỗ cho con người.
- Việc áp dụng các kỹ thuật tiên tiến trong công nghệ sinh học để cải thiện giống cây trồng, vật nuôi là vô cùng quan trọng, trong đó kỹ thuật chuyển gen thực vật được xem là một giải pháp phù hợp, cho phép các nhà khoa học nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng mới mang các tính trạng đáp ứng mục tiêu của con người.
- Đến nay, trong lĩnh vực nông nghiệp đã có hàng loạt các giống cây trồng biến đổi gen được tạo ra và gây trồng thương mại như: Đậu tương, Ngô, Lúa, Bông, Cà chua, Khoai tây, Cải dầu,…góp phần quan trọng vào việc đảm bảo an ninh lương thực trên phạm vi toàn cầu.
- Trong lĩnh vực tạo giống cây trồng lâm nghiệp biến đổi gen đã có một số đối tượng cây trồng được quan tâm nghiên cứu như: Cây Dương, Bạch đàn, Thông… Hướng nghiên cứu cải thiệt chất lượng gỗ cây lâm nghiệp bằng kỹ thuật chuyển gen thường tập trung vào các gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ sinh, đặc biệt là lignin ở thực vật, như gen PAL, COMT, CCR, CAD, C4H, C3H, 4CL,… Trong đó gen 4CL1 mã hóa cho 4-coumarate:coenzym A ligase được xem là enzym chìa khóa có vai trò quan trọng trong việc điều hoà sinh tổng hợp lignin ở thực vật.
- Do đó, chúng tôi chọn gen 4CL1 làm gen mục tiêu để chuyển vào đối tượng Xoan ta, nhằm tạo ra giống Xoan ta biến đổi gen có chất lượng gỗ tốt, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và giá trị sử dụng gỗ Xoan ta.
- Để góp phần thực hiện mục tiêu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.
- đây là một trong những nội dung quan trọng của đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) biến đổi gen có khả năng sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020.
- 3Mục tiêu của đề tài: Mục tiêu chung: Nhằm góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật chuyển gen vào cây Xoan ta.
- Làm cơ sở cho công tác tạo giống cây trồng biến đổi gen ở loài Xoan ta cũng như các loài cây lâm nghiệp khác.
- Thiết kế được cấu trúc vector chuyển gen và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phù hợp cho biến nạp gen 4CL1 vào đối tượng Xoan ta.
- Tạo được một số dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 trong phạm vi phòng thí nghiệm.
- Xây dựng cấu trúc vector để biểu hiện gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển gen.
- Tumefaciens mang vector biểu hiện gen 4CL1 trong cây Xoan ta.
- Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta.
- Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển gen.
- Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 1.1.1.
- Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới Theo bản báo cáo tổng kết số 34 năm 2005 của tổ chức ISAAA (International Service for the Acquisition of the Agribiotech Applications), tính đến năm 2005 tổng diện tích đất trồng cây biến đổi gen đạt 75 triệu hecta, tăng trên 205 lần trong khoảng thời gian 10 năm (từ 1996 đến 2005), liên quan tới khoảng 8,5 triệu nông dân canh tác trên khắp thế giới, 90% trong số họ là nông dân ở các nước đang phát triển và nghèo tài nguyên thiên nhiên.
- Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng lên gấp 3 lần trong vòng 9 năm, từ 6 nước năm 1996 lên 9 nước năm 1998, lên 12 nước (1999) và lên 21 nước (2005).
- Hiện nay, cây trồng biến đổi gen chủ yếu được trồng ở các nước phát triển (chiếm 62.
- Trong những năm gần đây thị phần cây trồng biến đổi gen tại các nước đang phát triển liên tục tăng nhanh hàng năm với mức tăng cao tại các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Philippin), cũng như châu Mỹ Latinh (Achentina, Braxin, Mexico, Uruguay và Paraguay) hay ở Nam Phi [12,35].
- Diện tích cây trồng chuyển gen tính đến năm 2007 đã tăng lên 114,3 triệu ha.
- Khoảng 670 sản phẩm cây trồng biến đổi gen đã được phép có mặt tại thị trường của 53 quốc gia.
- Nông dân nhiều nước đã trồng các cây chuyển gen mang nhiều đặc tính tốt.
- Việc trồng cây biến đổi gen trên thế giới đã giúp nông dân tăng năng suất từ 5 – 50%.
- Đã có tới 12 triệu nông dân trên thế giới tham gia vào việc trồng cây biến đổi gen [13].
- Các con số này vẫn được tăng lên hàng năm, tính đến nay đã có 25 nước tham gia trồng cây trồng chuyển gen, trong đó có thêm các nước: Australia, Bulgaria, 5Pháp, Đức, Rumani, Tây Ban Nha, Philipin, Colombia, Chile, Honduras, Séc, Slovakia, Bồ Đào Nha, Ba Lan, Paraguay, Uruguay… Hình1.1: Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu Tổng doanh thu mà cây trồng biến đổi gen mang lại kể từ khi được đưa vào thương mại (1996) đến nay khoảng 30 tỷ USD.
- Như vậy, trên bình diện toàn cầu chúng ta có thể lạc quan tin rằng diện tích và số người trồng cây biến đổi gen trên thế giới, đặc biệt là các quốc gia đang phát triển, sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới [12,37].
- Một số loại cây trồng biến đổi gen phổ biến được trồng thương mại với diện tích lớn, mang lại hiệu quả kinh tế rõ rệt cho các nước trên thế giới, đặc biệt là các cây đậu tương, ngô, bông và cây cải dầu [29,45].
- 6 Hình 1.2: Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ Clive James .
- Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam Ở Việt Nam, vấn đề chuyển gen vào thực vật vẫn còn là lĩnh vực mới mẻ, đang đi vào giai đoạn nghiên cứu và ứng dụng bước đầu, tuy nhiên trong lĩnh vực này, các nhà khoa học cũng đã thu được những kết quả đáng kể.
- Các nghiên cứu liên quan đến cây trồng biến đổi gen được tập trung triển khai tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các viện nghiên cứu, trường đại học thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
- Tại Viện Công nghệ sinh học, hướng nghiên cứu tạo các giống cây trồng biến đổi gen đã được đẩy mạnh ngay từ cuối những năm 90.
- Ngoài ra, trong khuôn khổ các đề án hợp tác trong nước và quốc tế, những vấn đề nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng công nghệ biến đổi gen, chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ, chuyển gen cry và gen chịu hạn vào cây bông… đã và đang được triển khai hiệu quả với một số loài cây biến đổi gen trồng thử nghiệm ở nhà kính [56].
- Việc đưa một số giống cây trồng biến đổi gen vào sản xuất cũng đang được triển khai.
- Ngày Thủ tướng Chính phủ đã ký Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg về việc phê duyệt "Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020" với tầm nhìn đến năm 2020 đưa diện tích trồng trọt các giống cây trồng mới tạo ra bằng kỹ thuật CNSH chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng trọt các giống cây trồng biến đổi gen chiếm 30 – 50%.
- Cho đến nay, đã có 3 cây trồng biến đổi gen hiện diện trên đồng ruộng là lúa, ngô và bông, dự tính đến cuối năm 2011 cây trồng chuyển gen sẽ được trồng trên một diện tích lớn ở nước ta [1,2,56].
- Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 1.2.1.
- Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới Nhìn chung, lĩnh vực nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen thường phát triển chậm hơn so với cây nông nghiệp, tuy nhiên những nghiên cứu chuyển gen vào cây rừng đã được thực hiện ở một số nước trên thế giới như Singapo, Trung Quốc, Đài Loan, Australia, Braxin, Ấn Độ,…(Wang, 2006).
- Nếu như vào năm 1996 cây nông nghiệp biến đổi gen chính thức được trồng thương mại hoá, thì đến năm 2002, Trung Quốc là nước duy nhất đã có 2 loài cây lâm nghiệp biến đổi gen được trồng thương mại hoá.
- Đó là cây Bạch dương (Populus nigra) chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn lá được trồng khảo nghiệm trên 80 hecta vào năm 1999 và trồng thương mại 200-300 hecta vào năm 2002.
- tomentosa) chuyển gen cry1A(c) và API

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt