- LÊ THỊ THU LÊ THỊ THU NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHANG DÂN CHỊU NGẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MARKER ASSISTED BACKCROSSING) CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOA HỌC 2010B Hà Nội – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. - Lê Thị Thu NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHANG DÂN CHỊU NGẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ (MARKER ASSISTED BACKCROSSING) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. - TS LÊ QUANG HÒA Hà Nội – Năm 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. - Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. - Em xin cám ơn các cô chú, các anh chị em cùng bạn bè đồng nghiệp đang công tác tại phòng Sinh học Phân tử - Viện Di truyền đã quan tâm và tận tình giúp đỡ em. - Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này em đã nhận được rất nhiều sự đóng góp, hướng dẫn, giúp đỡ từ các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Viện Đào tạo sau đại học. - các anh chị, bạn bè lớp Cao học Công nghệ Sinh học Khóa 2010B trường Đại học Bách khoa Hà Nội và người thân trong gia đình, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. - Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội ngày 22 tháng 03 năm 2012 Tác giả luận văn Lê Thị Thu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa ABA Abcisis acid ADB The Asian Development Bank – Ngân hang phát triển châu Á AND Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism –Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc BĐKH Biến Đổi Khí Hậu Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn Bộ TN&MT Bộ Tài nguyên và Môi trường CAPs Cleaved Amplification Polymorphism – Đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn CTAB Cetyltrimethuyl Amonium Bromide Ctv Cộng tác viên CTPT Chỉ thị phân tử dNTPs Deoxynucleotide triphosphate ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long ĐBSH Đồng bằng Sông Hồng EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations – Tổ chức lương thực và Nông nghiệp liên hiệp Quốc GS Giáo sư IPCC Intergovernmantal Panel on Climate Change – Tổ chức liên chính phủ về biến đổi khí hậu IRRI International Rice Research Intitute – Viện nghiên cứu lúa Quốc tế Kb Kilo base MABC Marker Assisted BackCrossing – Lai trở lại Mb Megabite NST Nhiễm sắc thể NXB Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantity trait loci RAPD Ramdom Amplified Polymorphic DNA – AND đa hình được nhân bội ngẫu nhiên RGA Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng RNA Acids Ribonucleoic RFLP Restriction Fragment Length Polymorphilism –Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn. - SNP Single Nucleotide Polymorphism – Đa hình của các nucleotide đơn SSR Simple Sequence Repeats – Sự lặp lại của một trât tự đơn giản STS Sequence Tagged Site – Điểm mục tiêu đã biết trình tự Sub1 Submergence 1 UNDP United Nations Development Programme - Chương trình Phát triển Liên Hợp Quốc TBE Tris – Boric Acid – EDTA TE Tris – EDTA TGST Thời gian sinh trưởng TP Thành phố TS Tiến sỹ TT Thứ tự UCD University California Davis UCR University California Riverside UV UltraViolet – Tia cực tím Viện KHKTTV&MT Viện khoa học kỹ thuật thủy văn và môi trường DANH MỤC CÁC BẢNG TT Bảng Trang 1 Bảng 1.1: Kịch bản nước biển dâng (Cm) ở Việt Nam qua so với thời kỳ Bảng 1.2: Tác động của biến đổi khí hậu đến tình hình ngập của đồng bằng Sông Hồng trong thế kỷ 21. - 12 3 Bảng 1.3: Diện tích vùng đồng bằng duyên hải bị ngập 1m cuối thế kỷ 14 4 Bảng 2.1. - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 43 6 Bảng 3.1: Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống PSB-Rc68 và giống Khang Dân 56 7 Bảng 3.2: Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của một số cá thể PSB-Rc68/KD (BC2F2) 80 8 Bảng 3.3: Một số yếu tố cấu thành năng suất của một số cá thể PSB-Rc68/KD (BC2F2) 84 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Hình Trang 1 Hình1.1: Dự báo khí hậu toàn cầu và mực nước biển dâng trong thế kỷ 21 7 2 Hình 1.2: Kịch bản nước biển dâng 1m ở đồng bằng sông Cửu Long 11 3 Hình 1.3: Kịch bản nước biển dâng cuối thế kỷ 21 cho vùng đồng bằng sông Hồng. - 13 4 Hình 1.4 Sơ đồ phương pháp lai trở lại MABC- Marker Assisted Backcrossing 31 5 Hình 3.1: Kết quả kiểm tra đa hình các AND 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 47 6 Hình 3.2: Kết quả kiểm tra đa hình các AND 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- Khang Dân 5- PSB-Rc68 48 7 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra đa hình 2 chỉ thị RM7250 và RM7278 trên (NST1) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 49 8 Hình 3.4: Kết quả kiểm tra đa hình 5 chỉ thị trên (NST2) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 50 9 Hình 3.5: Kết quả kiểm tra đa hình chỉ thị RM6611 trên NST2 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 50 10 Hình 3.6: Kết quả kiểm tra đa hình 2 chỉ thị RM5404 và RM300 trên NST2 1- Khang dân 2- PSB-Rc68 50 11 Hình 3.7: Kết quả kiểm tra đa hình 3 chỉ thị trên (NST3) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 51 12 Hình 3.8: Kết quả kiểm tra đa hình 3 chỉ thị trên (NST4) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 51 13 Hình 3.9: Kết quả kiểm tra đa hình 3 chỉ thị trên (NST5) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 52 14 Hình 3.10: Kết quả kiểm tra đa hình 3 chỉ thị trên (NST6) 53 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 15 Hình 3.11: Kết quả kiểm tra đa hình 3 chỉ thị trên (NST7) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 53 16 Hình 3.12: Kết quả kiểm tra đa hình chỉ thị RM447 trên (NST8) 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 54 17 Hình 3.13: Kết quả kiểm tra đa hình chỉ thị trên 3 NST 1- FL478 2-BT7 3- IR64-Sub1 4- PSB-Rc68 5- Khang Dân 6- O.ri 54 18 Hình 3.14: Sơ đồ phân bố các chỉ thị SSR đa hình trên 12 NST 55 19 Hình 3.15 Vị trí của các chỉ thị phân tử tại QTL/gen Sub1 62 20 Hình 3.16: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử ART5. - Thứ tự ADN từ 1 đến 142 63 21 Hình 3.17: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử ART5. - Thứ tự ADN từ 143 đến 376 64 22 Hình 3.18: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử ART5. - Thứ tự ADN từ 378 đến 612 65 23 Hình 3.19: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử ART5. - Thứ tự ADN từ 613 đến 636 66 24 Hình 3.20: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử SC3. - Thứ tự ADN từ 1 đến 236 67 25 Hình 3.21: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử SC3. - Thứ tự ADN từ 137 đến 518 68 26 Hình 3.22: Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử SC3. - Thứ tự ADN từ 519 đến 636 69 27 Hình 3.23: Kết quả chạy điện di với RM210 trên Chr8. - 71 28 Hình 3.24: Kết quả chạy điện di với RM7250 trên Chr1 71 29 Hình 3.25: Kết quả chạy điện di với S08055 trên Chr8 71 30 Hình 3.26: Kết quả chạy điện di với RM5964 trên Chr1 72 31 Hình 3.27: Kết quả chạy điện di với RM3864 trên Chr3 72 32 Hình 3.28: Kết quả chạy điện di với R4M30 trên Chr4. - 72 33 Hình 3.29: Kết quả chạy điện di với R9M30 trên Chr9. - 73 34 Hình 3.30: Kết quả chạy điện di với RM17 trên Chr12. - 73 35 Hình 3.31: Kết quả chạy điện di với RM18 trên Chr7 74 36 Hình 3.32: Kết quả chạy điện di với RM206 trên Chr11 74 37 Hình 3.33: Kết quả chạy điện di với RM10825 trên Chr1 75 38 Hình 3.34: Kết quả chạy điện di với S07053 trên Chr7 75 39 Hình 3.35: Kết quả chạy điện di với RM547 trên Chr8 76 40 Hình 3.36: Kết quả chạy điện di với RM300 trên Chr2 76 41 Hình 3.37: Tỷ lệ các các thể mang nền di truyền giống Khang Dân (BC2F1) 77 42 Hình 3.38: Bản đồ nhiễm sắc thể của cá thể 579 thế hệ BC2F1 78 43 Hình 3.39: Bản đồ nhiễm sắc thể của cá thể số 615 thế hệ BC2F1. - Nội dung nghiên cứu của đề tài . - Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Biến đổi khí hậu những thách thức với ngành nông nghiệp Biến đổi khí hậu, những thách thức với ngành nông nghiệp thế giới . - Biến đổi khí hậu, những thách thức với ngành nông nghiệp Việt Nam……11 1.2. - Các vùng trồng lúa Việt Nam có khả năng bị ngập theo kịch bản biến đổi khí hậu . - Đại họa với vựa lúa số một – Đồng bằng sông Cửu Long. - Vùng Lúa bị ngập ở Đồng bằng Sông Hồng. - Vùng Lúa bị ngập ở Đồng bằng Duyên hải Miền Trung . - Cơ sở dy truyền tính chống chịu ngập úng ở Lúa Khái quát về tính chịu ngập úng ở Lúa . - Phân loại tính chịu ngập Dựa vào độ sâu của nước . - Di truyền tính chịu ngập úng ở cây lúa . - Các chỉ thị phân tử thông dụng được sử dụng trong nghiên cứu genom và chọn giống thực vât Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN- chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphilism. - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN bằng kỹ thuật PCR Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại . - Phương pháp chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại (MABC – Marker Assisted Backcrossing. - Giới thiệu chung về chọn giống nhờ lai trở lại (MABC . - Phương pháp MABC ( Marker Assisted Backcrossing . - Chọn tạo giống Lúa chịu ngập chìm . - Chọn tạo giống Lúa chịu ngập trên thế giới . - Chọn tạo giống Lúa chịu ngập ở Việt Nam CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Các giống lúa nghiên cứu Hóa chất và thiết bị thí nghiệm . - Phương pháp nghiên cứu . - Phương pháp bố trí thí nghiệm . - Phương pháp lai hữu tính kết hợp lai trở lại . - Phương pháp tách chiết ADN tổng số . - Phương pháp điện di trên gel Polyacrylamide không biến tính . - Phân tích số liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . - Kết quả khảo sát chỉ thị phân tử đa hình giữa PSB-Rc68 với Khang Dân Xác định chỉ thị phân tử đa hình trên 12 nhiễm sắc thể giữa giống cho gen và giống nhận gen phục vụ cho chọn lọc nền di truyền Xác định chỉ thị phân tử đa hình tại ví trí gen đích giữa giống lúa PSB-Rc68 và Khang Dân Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể mang QTL/gen Sub1 tổ hợp Khang Dân/ PSB-Rc68. - 63 3.2.1 Xác định cá thể mang QTL/gen Sub1 trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử Chọn lọc nền di truyền giống Khang Dân trong quần thể lai BC2F1 bằng chỉ thị phân tử Đánh giá một số tính trạng nông sinh học của dòng được tạo ra mang gen chịu ngập trong điều kiện nhà lưới. - 80 3.3.1 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng các cá thể thế hệ BC2F1 trong điều kiện nhà lưới Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu cấu thành năng suất các cá thể thế hệ BC2F1 trong điều kiện nhà lưới CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Kết luận. - 88 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh mục các chỉ thị dùng trong nghiên cứu Phụ lục 2: Danh mục các hóa chất dùng trong nghiên cứu. - Đặt vấn đề: Biến đổi khí hậu đã và đang diễn ra đang là mối đe dọa hiện hữu và to lớn mà nhân loại sẽ phải đương đầu trong thế kỷ 21, trái đất đang nóng dần cùng với mực nước biển dâng lên. - Mô hình nghiên cứu trong thế kỷ 21 giới khoa học đã chỉ ra rằng nhiệt độ trung bình của trái đất có thể tăng từ 1,4 – 30C khả năng xảy ra từ 2 – 4,50C, mực nước biển dâng lên 28 -163cm tùy thuộc sự phát thải hiệu ứng nhà kính cắt giảm tới mức nào để bớt các khí CO2 và các khí khác. - Mực nước biển tăng 9cm vào năm cm trong năm 2050, 45 cm trong năm 2070, 1m vào năm 2100.(Bộ TN&MT,2008)[10] Theo bản báo cáo về phát triển con người của UNDP, nếu nhiệt độ tăng thêm 20C thì 22 triệu người Việt sẽ mất nhà và 45% diện tích đất nông nghiệp ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, vựa lúa lớn nhất của Việt nam sẽ ngập chìm trong nước biển. - Ông Christophe Bahuet – phó đại diện UNDP tại Việt Nam nhận định: Biến đổi khí hậu có thể dẫn đến 5 nguy cơ lớn: giảm năng suất nông nghiệp, gia tăng tình trạng thiếu nước, thời tiết cực đoan gia tăng, các hệ sinh thái tan vỡ và bệnh tật gia tăng. - Việt Nam có tổng 5 sản lượng lúa đứng thứ 5 trên thế giới nhưng lại là nước xuất khẩu gạo thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan, chiếm khoảng 50% tổng sản lượng gạo thương mại trên thế giới hiện nay (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)[33]. - Ước tính năm 2011 sản xuất khoảng triệu tấn với hai vùng trồng lúa chính là Đồng bằng Sông Cửu Long diện tích 3,79 triệu ha chiếm 50% sản lượng lúa cả nước và Đồng bằng Sông Hồng diện tích 1,18 triệu ha chiếm 17% sản lượng (Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2009) [2]. - Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là thức ăn chính của 86 triệu dân số trong nước. - Sản lượng gạo Việt Nam có thể giảm một cách rất kịch tính do mực nước biển dâng cao và sự thay đổi lượng mưa làm thay đổi thủy học ở các vùng đồng bằng. - Mực nước biển dâng cao làm giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển. - Việc đưa ra các chiến lược thích nghi với biến đổi khí hậu và mực nước biển tăng cho hai vùng đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long có tính chất quyết định đối với nền kinh tế và an ninh lương thực Việt Nam, góp phần đảm bảo an ninh lương thực thế giới. - Để ứng phó với biến đổi khí hậu đang diễn ra ngay từ bây giờ chúng ta bắt tay vào nghiên cứu đón đầu để có được các giống chịu ngập, chịu mặn, chịu hạn cho năng suất cao và ổn định là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu nhập của nông dân tại vùng chịu ảnh hưởng.[d2] Sử dụng chỉ thị phân tử ADN cho phân tích di truyền và những tính trạng nông học quan trọng là một công cụ rất hiệu quả trong chọn giống cây trồng. - Tiềm năng của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn được thời gian chọn tạo giống, đánh giá được đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại được ảnh hưởng của nhân tố môi trường trong quá trình chọn lọc. - Chỉ thị phân tử cũng cho phép nhà chọn giống lập bản đồ hay chuyển chính xác những locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng vào những giống thích hợp hơn. - Thực vậy, ngay sau khi các vùng chính trên nhiễm sắc thể điều khiển tính chống chịu ngập được xác định. - Việc phát triển và sử dụng chỉ thị phân tử để đẩy nhanh 6 quá trình quy tụ gen đó vào những giống mới năng suất cao kết hợp chọn giống lai trở lại đã đạt được những kết quả khả quan. - Một giống lúa mới có khả năng sống sót lâu ngày trong điều kiện ngập úng hứa hẹn có thể cứu hàng triệu người trên thế giới khỏi nguy cơ chết đói. - Do đó, việc ứng dụng công nghệ chọn giống phân tử kết hợp với chọn giống truyền thống và lai trở lại để chọn lọc cải tiến giống lúa mới năng suất, chất lượng mang gen chịu ngập là một vấn đề cấp thiết. - Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa Khang Dân chịu ngập bằng phương pháp chỉ thị phân tử ( Marker Assisted BackCrossing)” 2. - Mục đích của đề tài Ứng dụng lý thuyết chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC – Marker Assisted Backcrossing) để quy tụ gen chịu ngập chìm ở Lúa (Sub1) kết hợp phương pháp chọn truyền thống giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chống ngập chìm, góp phần làm giảm chi phí, củng cố tính thương mại trong chọn giống. - Những dòng/ giống Lúa quy tụ gen chịu ngập (Sub1) chọn lọc được trong đề tài này sẽ là vật liệu khởi đầu rất tốt phục vụ cho công tác chọn tạo giống chịu ngập chìm đặc biệt cho các tỉnh đồng bằng ven biển Việt Nam, nơi chịu ảnh hưởng rõ nét nhất của tác động biến đổi khí hậu. - Nội dung nghiên cứu của đề tài - Khảo sát tính đa hình giữa giống cho gen (PSB-Rc68) và giống nhận gen Khang Dân bằng chỉ thị SSR - Lai tạo cây F1, BC1F1. - Sử dụng chỉ thị SSR, xác định cây mang gen Sub1 và có nền di truyền gần nhất với giống nhận gen để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo BC2F1. - Đánh giá một số tính trạng nông sinh học của bố, me, con lai
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt