- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. - LÂM THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2012 LÂM THỊ HUẾ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA: 2010B BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. - LÂM THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. - Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội và Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung. - Vũ Khắc Hùng, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tại Bộ môn công nghệ sinh học – Phân viện Thú y miền Trung. - Nguyễn Thị Xuân Sâm, người đã hướng dẫn tôi cùng các thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm. - VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC. - Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc.. - VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S. - GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE. - Gen crp (cAMP receptor. - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . - ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. - VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU. - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Phương pháp tách chiết ADN tổng số. - Phương pháp tách chiết ADN plasmid. - Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di. - Phương pháp PCR. - Phản ứng phân cắt sản phẩm PCR, plasmid và lai của Vu-Khac H và Kurt Miller. - Phương pháp biến nạp của Kang và cs. - Phương pháp tạo tế bào E. - Phương pháp tiếp hợp của Kang và cộng sự. - Phương pháp lên men các loại đường. - Kiểm tra tính ổn định của gen đột biến. - Phương pháp xử lý số liệu. - TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆crp. - Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12. - Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp. - Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆crp. - choleraesuis Smith MANG GEN CRP ĐỘT BIẾN. - choleraesuis 539. - Kiểm tra tính ổn định của gen ∆crp trong chủng S. - TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆asd. - Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆asd. - Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd. - choleraesuis 539 MANG GEN ASD ĐỘT BIẾN. - choleraesuis Salmonella choleraesuis TBE Tris-Borate-EDTA T3SS Type III secretion system VP Voges prosskauer Uasd, Ucrp Đột biến gen asd, crp iiiDANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR. - choleraesuis Smith. - 51 ivDANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già lợn mắc bệnh. - 6 Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn S. - 21 Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của chủng S. - 34 Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết plasmid pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN plasmid của 4 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với enzyme cắt giới hạn BamHI/XbaI (B. - Sản phẩm cắt ADN plasmid của 3 dòng pBSIIK(+)/∆crp với enzyme cắt giới hạn XhoI/KpnI. - 36 Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại ∆crp (2,7kb) từ plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp (A) và sản phẩm cắt của 4 dòng pRE112/∆crp bằng XbaI-KpnI (B. - 37 Hình 3.5: Các khuẩn lạc S. - 38 Hình 3.6: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. - choleraesuis 539(1), S. - 39 Hình 3.7: Hình ảnh khuẩn lạc của chủng S. - Trình tự đoạn gen khuếch đại gen crp của S. - 43 Hình 3.10. - Sản phẩm PCR từ genome của S. - 44 Hình 3.11: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của chủng S. - 45 Hình 3.12: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pa12 với BamHI/XbaI (A) và 6 dòng pBSIIK(+)/∆asd với BamHI/KpnI (B. - 46 Hình 3.13: Điện di sản phẩm cắt pBSIIK+/∆asd bằng cặp enzyme XbaI-KpnI. - 47 Hình 3.14: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd bằng cặp enzyme XbaI/KpnI. - 48 Hình 3.15. - 48 Hình 3.16: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của các chủng S. - 49 Hình 3.17: Đường cong sinh trưởng của S. - 50 Hình 3.18: Sản phẩm PCR từ genome của S. - 51 Hình 3.19: Trình tự đoạn gen khuếch đại gen asd của chủng S. - Theo CIRAD - Trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [25]. - Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010. - Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. - Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E. - Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E. - Việc sử dụng kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng 2sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn. - Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắcxin vi trùng, trong đó hai loại vắcxin chết và vắcxin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. - Vắcxin chết ít hiệu quả hơn so với các loại vắcxin sống nhược độc [30]. - Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắcxin sống nhược độc. - Tuy nhiên các loại vắcxin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắcxin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [43, 56]. - Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắcxin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắcxin tái tổ hợp. - Quá trình tạo vắcxin tái tổ hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc. - Sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ những gen gây bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu . - Sau đó tổ hợp gen biểu hiện kháng nguyên ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào chủng vi khuẩn nhược độc. - Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên ngoại lai. - Vì vậy trên chủng vắcxin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên, kháng nguyên của vi khuẩn và kháng nguyên ngoại lai. - Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắcxin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó là vắcxin chết và vắcxin nhược độc. - Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để nghiên cứu chế tạo vắcxin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, giá thành hạ với một lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là 3việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra. - Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắcxin thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S. - choleraesuis) nhược độc mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của E. - Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắcxin S. - choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”. - Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/∆crp. - Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang gen crp đột biến. - Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen asd đột biến (pRE112/∆asd. - Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang hai gen crp và asd đột biến. - Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S. - choleraesuis mang hai gen crp và asd đột biến. - choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp. - Để đạt được những mục tiêu và mục đích trên, các nội dung nghiên cứu bao gồm. - Tạo dòng plasmid pRE112/∆crp. - Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/∆crp. - choleraesuis nhược độc gây đột biến gen crp. - Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp. - choleraesuis mang gen crp đã bị đột biến (S. - 4- Tạo dòng plasmid pRE112/∆asd. - Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/∆asd. - Kiểm tra kết quả gây đột biến gen asd. - choleraesuis mang hai gen crp, asd đột biến. - Đối tượng nghiên cứu: chủng S. - choleraesuis nhược độc (S
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt