BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ KHOA SINH HỌC -------*------- BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN: VI SINH VẬT HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Ngọc Lan Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyên Mã sinh viên: 17T3041104 Lớp: K41_B. Công Nghệ Sinh Học Nhóm: 1 Huế, tháng 12, năm 2019 Bài 1 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ NUÔI CẤY VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG Mục đích: làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các vi sinh vật có bào tử. Đây là khâu quan trọng nhất. khi nghiên vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường, dụng dụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống vi sinh vật đang nghiên cứu. Yêu cầu: các dụng cụ trên cần phải sạch sẽ về mặt hóa học (không dính các chất hữu cơ, vô cơ, thủy tinh cần phải trung tính) và sạch sẽ về mặt vi sinh vật học (không chứa bất kì tế bào vi sinh vật – các dụng cụ phải vô trùng). Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật. Một số dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, hộp petri, chai thủy tinh, phiến kính…. Quá trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy gồm các bước: Xử lý dụng cụ Làm nút và bao gói dụng cụ Khủ trùng dụng cụ Bước 1: Xử lý dụng cụ. Nguyên tắc chung: các dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trùng tính, thật sạch sẽ và trong, không bị nứt mẻ. Rửa dụng cụ. Các dụng thủy tinh dùng nuôi cấy vi sinh vật hoăc dùng làm các phản ứng huyết thanh phải thật sạch sẽ và tương đối trung tính. Thủy tinh không trung tính dễ làm biến đổi pH của môi trường hoặc làm sai lệch kết quả của các phản ứng huyết thanh. Do đó các dụng cụ thủy tinh nếu chưa trung tính thì cần được xử lý bằng cách: + Ngâm trong dung dịch acid loãng (dung dịch HCl hoặc H2 SO4 nồng độ 1-2%) khoảng 1-2 ngày. Cho đến khi kiểm tra pH=7 thì thôi + Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là có thể dùng được. Các dụng cụ đã nuôi cấy vi sinh vật nếu nghi ngờ vó vi sinh vật gây bệnh hoặc có độc tố, trước khi hủy bỏ và rửa thì cần phải khử trùng ở 1atm/30 phút (đối với sinh vật không gây bệnh có thể bỏ qua giai đoạn này). Ống nghiệm: + Đối với các ống nghiệm đã dùng để làm phản ứng huyết thanh cần ngâm vào dung dịch cresol 1% vầ nước xà phòng, sau đó đun sôi 30 phút, rửa lại với nước nhiều lần. + Với ống nghiệm cũ bị nhiễm khuẩn: Hấp thanh tùng ở 1200 C trong 30phut. Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi. Ngâm ống nghiệm vào nước ấm Rửa ống nghiệm bằng cách: dùng chổi chấm xà bông cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần. rửa lại nước 2-3 lần. úp ống nghiệm cho thật ráo và khô. Sấy khô ở 700 C + Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các chất vi khuẩn không gây bệnh thì không cần phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên. Đối với pipette thì dùng thép nhỏ hoặc tăm lấy bông ra và dùng vòi nước chảy ngược lại để kéo cặn trong pipette. Pipette sau khi rửa sạch nên ngâm trong dung dịch sulfo-chromic (H2SO4 đậm đặc: K2Cr2O7:=100ml : 60g : 1000ml) khoảng 1-2 ngày. Rửa lại thật kỹ bằng nước sạch (dung dịch có tính oxy hóa mạnh nên khi thao tác cần phải đeo găng tay cao su). Dụng cụ có dính mỡ, vaseline hoặc paraffin trước khi rửa cần lấy một ít bông tẩm dung dịch lau kính (hỗn hợp acetone: cồn) chùi mạnh, sau đó rửa bằng nước xà bông nóng, cuối cùng rửa lại bằng nước sạch. Nếu dụng cụ có tính kiềm cao cần ngâm trong dung dịch HCl 25% nhiều ngày, sau đó vớt ra rửa lại nước nhiều lần rồi ngâm vào nước cất 1- 2 ngày, vớt ra rửa lại vài lần, làm khô, thử lại pH của thủy tinh. Sấy khô dụng cụ. Dụng cụ được sấy kho trong tủ sấy ở nhiệt độ 80-1000C hoặc phơi khô tự nhiên. Khi xếp dụng cụ trong tủ sấy cần lưu ý không xếp quá sát nhau, phải tạo độ hở để thoát hơi nước và dụng cụ phải được xếp gọn gàng. Bước 2: làm nút và bao gói dụng cụ. Nguyên tắc: Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô. Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Làm nút và bao gói dụng cụ: Nút bông không quá ngắn hoặc quá dài, đầu nút bông phải tròn và gọn. nút bông không được quá chặt để khỏi ngă cản sự cung cấp oxygen cho vi sinh vật không quá lỏng dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường bên trong. Nếu không làm nút bông có thể làm giấy nhôm bọc bên trên miệng ống nghiệm hoặc bình tam giác. Đối với pipette thì dùng một sợi thép nhỏ hoặc tăm tre để đưa một ít bông vào đầu lớn của pipette, không nên bông quá chặt vì sẽ khó hút mẫu, nhưng nếu lỏng quá sẽ dễ hút bông ra khỏi pipette. Bình tam giác, bình cầu hoặc chai thủy tinh miệng rộng sau khi làm nút bông cần bao bọc đầu nút bông lại bằng giấy không thấm nước để tránh làm ướt nút bông khi khử trùng và hạn chế nhiễm trùng. Ống nghiệm, pipette, hộp petri, que gạt thủy tinh, cối chầy sứ…trước khi khử trùng cần được bao gói bằng giấy báo hoặc đặt vào các hộp bằng nhôm để khi khử trùng xong có thể giữ dụng cụ trong trang thái vô cực. Bước 3: khử trùng dụng cụ thí nghiệm. Nguyên tắc: sau khi khử trùng cần đảm bảo: + Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ. + Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật Phương pháp khử trùng: Có thể khử trùng dụng cụ theo hai phương pháp nhiệt khô và nhiệt ướt. Khử trùng bằng nhiệt khô: Dụng cụ khi đưa vào tủ sấy khử trùng không nên xếp quá sát nhau để không khí có thể lưu thông được và làm nóng đều các dụng cụ. lưu giữ tủ sấy ở nhiệt độ 160- 1700C trong khoảng 2 giờ. Khử trùng bằng nhiệt ướt: Dụng cụ được đưa vào nồi hấp áp lực và khử trùng ở 1atm/30-40 phút. Thông thường, các đĩa petri hoặc nút bông được bao gói bằng giấy hoặc giấy nhôm nên sau khi khử trùng cần được sấy khô trước khi sử dụng. Các phương pháp khử trùng. Khử trùng bằng nhiệt: • Khử trùng bằng phương pháp Pasteur: - Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới 1000C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các loại môi trường dễ bị hư hỏng khi đun sôi (như sữa, nước quả,bia, rượu vang…). - Khử trùng kiểu Pasteur có thể ở mức nhiệt độ 600C trong 30 phút hoặc 750C trong 15 phút hay 800C trong 10 phút. Phương pháp này chỉ giết chết tế bào sinh dưỡng nhưng không loại bỏ được bào tử. • Khử trùng bằng cách đun sôi - Thường sử dụng nồi không có bộ phận tăng áp lực để khử rung. Nồi hấp được cấu tạo bằng thùng hai vỏ làm bằng kim loại. Khi nước ở thùng ngoài được đun sôi,hơi nước sẽ vào thùng trong đựng vật liệu khử trùng rồi thoát ra ngoài. Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 1000 C. Ở nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng nảy mầm. • Khử trùng bằng nồi hấp áp lực - Phương pháp dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1 atm. Nồi hấp áp lực co làm bằng kim loại, có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. Thùng khử trùng có nắp van thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xả hơi nước được nối với phễu. Nước trong nồi phải đạt đến mức quy định. Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van xung quanh. - Khử trùng bằng nồi hấp áp lực, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo. - Để loại bỏ không khí trong nồi có hai cách: + Đóng van thoát hơi để tăng áp suất trong nồi lên khoảng 3 atm. Mở khóa van cho không khí thoát ra hết. đóng khóa van để đưa áp suất lên mức cần thiết. + Mở khóa van thoát hơi và đun cho đến khi thấy hơi nước phun ra thành một luồng trắng thì đóng van lại để đưa áp uất lên mức cần thiết. - Dụng cụ xếp vào nồi hấp áp lực phải ngay ngắn, không xếp quá xít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua. Để khử trùng các loại môi trường thông thường chỉ sử dụng áp lực 1 atm trong 20 phút. Nếu môi trường đựng trong các bình lớn thì nên giữ áp lực 1 atm trong 30 phút. Để khử trùng các dụng cụ thủy tinh có thể sử dụng áp lực 1,5 atm trong 20-30 phút. - Khi khử trùng cần lưu ý các chất không bền nhiệt như sữa, cá môi trường chứa gelatin thì chỉ khử trùng ở 0,5 atm trong thời gian 15 phút. Môi trường chứa nước quả, nước mạch nha, đường, vitamin chỉ được khử trùng ở 0,5 atm trong 20-30 phút. Môi trường nước chiết đất khử trùng 1,5 atm trong 30 phút. - Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý đến pH của môi trường. pH dưới 5,5 thạch rất dễ bị thủy phân và kh nguội không có khả năng tạo gel. Nếu môi trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramel hóa đường. Do vậy khi khử trùng phải để môi trường có pH trung tính. - Lưu ý: + Trước khi khử trùng phải kiểm tra mức nước đúng quy định. + Với nồi hấp có nhiều tay vặn khi đóng hoặc mở nồi cần phải vặn theo từng cặp đối xứng. + Theo dõi kim chỉ áp lực trong thời gian khử trùng. + Khi khử trùng xong phải đợi cho kim chỉ đồng hồ áp suất chỉ về 0, nhiệt độ trong nồi giảm hẳn mới được mở nắp. + Sau khi khử trùng xong cần nhanh chóng lấy môi trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng của nhiệt lên môi trường. + Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 30 trong khoảng 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng. • Khử trùng bằng sức nóng khô - Đặt dụng cụ muốn khử trùng vào tủ sấy ở nhiệt độ 160-170 trong 2-3 giờ  tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật. - Sử dụng để khử trùng: các dụng cụ bằng sứ, thủy tinh, kim loại… - Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần được nút kín bằng nút bông. - Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói kỹ bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra. • Khử bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn - Dùng để khử trùng que cấy, các dụng cụ bằng sắt, một số dụng cụ thủy tinh - Đưa dụng cụ muốn khử trùng lên ngọn lửa đèn cồn  các vi sinh vật bám trên bề mặt dụng cụ sẽ bị tiêu diệt. 2. Khử trùng không bằng nhiệt • Dùng nến lọc vi khuẩn - Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumin, một số loại đường… trong môi trường dễ bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. Người ta còn dùng phương pháp này để tách vi sinh vật với dịch nuôi cấy có chứa các sản phẩm trao đổi chất hoặc để tách bacteriophage từ trong một hỗn hợp dịch có chứa cả bacteriophage lẫn vi khuẩn. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng phương pháp lọc để tập trung các vi sinh vật có chứa trong một chất dịch nào đó trên bề mặt màng lọc. Với phương pháp này, các lỗ của màng lọc phải nhỏ hơn kích thước của tế bào vi khuẩn. - Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là lọc seitz. Lọc này có hai bộ phận: một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới. Hai bộ phận được gắn vào nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc. Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa hai bộ phận một màng lọc tròn bằng amianthus hay bằng nitrocellulose dày khoảng 3- 5mm (màng lọc chỉ dùng một lần). - Khi tiến hành lọc ngườ ta phải tìm cách tạo nên một sự chênh lệch áp suất trong và ngoài (hoặc trên và dưới màng lọc). Dùng cách hút để tạo nên khoảng chân không ở một phía của màng lọc, phương pháp này gọi là phương pháp tạo nên áp suất âm. Khi lọc cần phải đưa độ chênh lệch áp suấ lên dần dần,dịch lọc cần chảy ra từ rừ từng giọt (áp suất thường không quá 30 – 50 cm thủy ngân). - Sau khi lọc cần cấy dịch lọc vào môi trường thạch – nước thịt – pepone để kiểm tra mức độ vô trùng của dịch lọc. • Khử trùng bằng hóa chất - Hóa chất được dùng để khử trùng, bảo quản nguyên vật liệu và để làm sạch các buồng cấy, phòng thí nghiệm, phòng mổ… Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý đến nồng độ sử dụng, tránh gây độc đối với con người. - Sàn nhà, bàn ghế trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0.5- 3%, hoặc nước phenol 3 – 5%. Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thủy tinh… • Khử trùng bằng tia tử ngoại và bằng ánh sáng mặt trời - Tia tử ngoại có bước sóng 13 – 400 nm có tác dụng diệt khuẩn. Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử ngoại trong khoảng 30 - 40 phút. - Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 – 400 nm cũng có tác dụng diệt khuẩn. Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng cụ của phòng thí nghiệm 2 – 3 giờ sau khi đã được rửa sạch. Bài 2: CHẾ TẠO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Giới thiệu về các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Khái niệm môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thể oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường, trong đó các chất dnh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Các yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết Có độ pH thích hợp Có độ nhớt nhất định Không chứa các yếu tố độc hại Hoàn toàn vô trùng. Phân loại môi trường dinh dưỡng. Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc. có ba loại môi trường là: Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại môi trường này được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên. Môi trường tổng hợp: là môi trường gồm các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Môi trường bán tổng hợp: là thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất hữu cơ tự nhiên. Căn cứ vào tính chất lý học: có thể chia môi trường thành ba loại: Môi trường lỏng (dịch thể): thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp của vi sinh vật. Môi trường bán lỏng: môi trường này chứa 0.35 – 0.75 agar Môi trường đặc: trong thành phần môi trường này chứa 1.5-2% agar hoặc 10-20% gelatin và dùng để nghiên cứu các chất đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật. Môi trường xốp: được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp, gồm các loại môi trường như bột cám, bã mía, bột ngô… Căn cứ vào công dụng có thể có các loại môi trường sau đây: môi trường cơ bản, môi trường chọn lọc, môi trường tăng sinh, môi trường chẩn đoán phân biệt… Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ. Nguyên liệu, hóa chất: các loại hóa chất cần thiết để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật, hộp giấy pH, vải lọc, bông, dung dịch acid hoặc kiềm để điều chỉnh pH… Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri, pipet, cốc đong, phểu thủy tinh, ốn hút thủy tinh, đũa thủy tinh, muỗng, nồi nấu… Chế tạo môi trường. Một số môi trường thông dụng. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy nấm men Môi trường nuôi cấy nấm mốc Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn. Pha chế a. Môi trường Martin (môi trường nuôi nấm mốc) Glucose 10g KH2PO4 1g Agar 20g Nước 900ml Peptone 5g MgSO4.7H2O 0.5g Rose bengal 1/300 10ml pH 5.5 – 6.0 Sau khi khử trùng, để nguội môi trường xuống khoảng 450C bổ sung 3ml streptomycine 1%. Môi trường này thường sử dụng để phân lập nấm men và nấm mốc. b. Môi trường Hansen (môi trường nuôi cấy nấm men) Glucose 5g KH2PO4 1.5g Agar 10g pH 6.0 Peptone 5g MgSO4.7H2O 2g Nước 500ml Phân lập nấm men trên môi trường Hansen với nồng độ 10-5  kết quả: 1 góc các tế bào nấm men mọc lan, màu trắng sữa do nồng độ ban đầu quá cao và thao tác trải trên bề mặt không đều 1 phần xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẽ: Có các khuẩn lạc tròn màu vàng hơi nhăn: dự đoán là vi khuẩn. Có các khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, bóng: là các khuẩn lạc của nấm men c. Môi trường Gause I (môi trường nuôi cấy xạ khuẩn) Tinh bột tan 20g KNO3 1g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g Agar 20g NaCl 0.5 g Nước 500 ml pH 7.2–7.4 FeSO4 0.01g Cân đong chính xác với thành phần môi trường Gause. Với môi trường lỏng thì cân đong chính xác cho hoàn tan. Với môi trường đặc thì nấu agar cho đến khi hòa tan hết, sau đó mới đổ các hóa chất đã được hòa tan vào. Lọc Môi trường nuôi cấy cần phải trong để dễ quan sát và theo dõi sự sinh trưởng phát triern của vi sinh vật. Những môi trường đục có thể lọc qua vải thưa nhiều lớp, bông, giấy lọc hoặc có thể dùng long trắng trứng gà hoặc chất trợ lắng để làm trong môi trường. Với những môi trường không đục thì bỏ qua bước này. Điều chỉnh pH môi trường. Điều chỉnh pH môi trường bằng cách dùng các dung dịch như HCl, H2SO4, H3PO4, NaOH nồng độ 10% hoặc 0,1N. Phân phối môi trường vào các dụng cụ. Không quá 1/5 chiều cao của ống khi làm thạch nghiêng và 1/3 – 2/3 chiều cao ống khi làm thạch đứng. Khử trùng môi trường Dùng phương pháp khử trùng ướt hoặc phương pháp lọc vô trùng. Làm thạch nghiêng, thạch đứng và thạch đĩa. Thạch nghiêng: sau khi khử trùng sau, lấy các ống nghiệm còn lỏng đặt nghiêng trên thước gỗ hoặc que thủy tinh sao cho ống thạch nghiêng không quá 2/3 chiều dài của ống. tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông. Thạch đứng: đặt các ống nghiệm có chứa môi trường đặc vào giá, để yên cho môi trường nguội và đông đặc. Thạch đĩa: Đổ thạch đĩa phải được thực hiện trong tủ vô trùng. + Các thao tác: mở bao giấy, tay trái kẹp nút bông của bình rút nhẹ và mở hé nắp trên của đĩa petri, tay phải cầm bình chắc môi trường, rót nhanh vào đĩa một lượng môi trường thích hợp. Đậy nắp hộp, để yên cho môi trường nguôi và đông đặc rôi lạt ngưỡng đĩa lại. Khi đĩa môi trường bay hết hơi nước ngưng tụ, bao gói, ghi nhãn và bảo quản. Chú ý: thao tác khi đổ đĩa petri phải khẩn trương, khéo léo để tránh nhiễm khuẩn và đông thạch, không có bọt khí trên bề mặt. Sau khi đổ môi trường 1-2 ngày thì kiểm tra xem môi trường có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng. Bảo quản và kiểm tra môi trường. Môi trường thạch nếu chưa sử dụng thì bảo quản lạnh (1-50C), hạn chế tác dụng của anh sáng và không cho môi trường bị khô. Một số chú ý trong tiến hành thí nghiệm. Dụng cụ bao gói phải sạch sẽ và khô Bao gói phải thật kĩ và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Đầu nút tròn, độ chặt vừa phải  để khi lấy ra hay đậy lại dễ dàng. Phần bao gói phải chặt kín. Bài 3 KỸ THUẬT CẤY, PHÂN LẬP, NUÔI VẦ BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT Mục đích: Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu. Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng. Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật Yêu cầu: Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điềukiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi Hóa chất, dụng cụ. Dụng cụ: ống nghiệm, bình tan giác, hộp petri, pipette, cốc đong, cối chày sứ, que gạt, bình nước vô trùng… Hóa chất: các loại hóa chất để chế tạo môi trường phân lập xạ khuẩn, môi trường đất. Tiến hành. Phân lập vi sinh vật Nguyên tắc: tách từng nhóm khuẩn lạc riêng biệt trên môi trường đặc. Chọn mẫu: đất canh tác. Chuẩn bị mẫu: cân 1g đất rồi đổ vô bình tam giác. Sau đó cho 9 ml nước vào để pha loãng. Pha loãng: theo quy tắc pha loãng thập phân + Cho vào ống nghiệm 1g đất + 9ml nước vô trùng. Lấy 1ml dung dịch này cho vào ống nghiệm 1 đã chuẩn bị từ trước với 9ml nước vô trùng  ta được độ pha loãng 10-1. + Lấy 1ml dung dịch ở ống 1 cho vào ống 2 chứa 9ml nước vô trùng ta được độ pha loãng 10-2. + Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi được độ pha loãng 10-5. Cấy trên thạch đĩa. Tay trái mở hé nắp hộp petri. Dùng que gạt thủy tinh đã được khử trùng bằng đèn cồn, làm nguội qua gạt bằng cách gạt lên nắp hộp- nơi có hơi nước ngưng tụ. Với cách này vừa làm que gạt nguội vừa loại bỏ được hơi nước ngưng tụ trên nắp hộp. Tay phải cầm pipette lấy khoảng 1ml dung dịch chứa vi sinh vật ở nồng độ 10-5, nhỏ một giọt dung dịch vào đĩa petri. Dùng que gạt thủy tinh dàn đều mẫu trên đĩa. Bao gói và bão quản trong tủ ấm. Cấy chuyển qua ống thạch nghiêng Chọn mẫu: chọn đĩa có khuấn lạc nằm riêng rẽ Tay trái cầm ống nghiệm (ống giống và ống môi trường) tay phải cầm que cấy Tay phải đưa que cấy lên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng Dùng ngón út tay phải tháo nút bông Đưa que cấy vào đĩa chấm lên khuẩn lạc Cấy vào ống môi trương theo hình ziczac (chú ý không được để que cấy chạm vào miệng ống nghiệm) Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và đậy nút bông lại, khử trùng lại đầu que cấy. Bao gói và bão quản trong tủ ấm Quy trình cấy trên phải được thực hiện trong tủ cấy, sau khi cấy xong khử trùng bằng tia cực tím trong khoảng 20 phút. Kết quả cấy chuyền trên thạch nghiêng Nhận xét mẫu xấy: mẫu cấy không bị nhiễm nhưng cấy không đều tay. Phương pháp nuôi vi sinh vật. Để đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển tốt, môi trường sau khi cấy xong phải được ủ trong điều kiện thích hợp. Cần đảm bảo các điệu kiện sau: Nhiệt độ: tùy vào loại vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó. + Đối với sinh vật ưa ấm nhiệt độ tốt thích từ 20-370C + Đối với sinh vật ưa nóng nhiệt độ khoảng 50-600C + Đối với sinh vật ưa lạnh khoảng 10-150C Độ ẩm: để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần + Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường + trong điều kiện cẩn thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm. Oxi + Đối với vi sinh vật hiếu khí: Cung cấp thường xuyên vầ đầy đủ O2 Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa môi trường được lắm thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật. Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn vừa phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kì. + Đối với vi sinh vật kị khí: hạn chế tiếp xúc với Oxi Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazolin Cấy trích sâu vào môi trường đặc Nuôi cấy trong bình hút chân không Nuôi cấy trong môi trường ống nghiệm đặc biệt sâu khi rút hết không khí và hàn kín lại. Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2 . để nguội 450C. dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. làm nguội thật nhanh rồi đổ vazolin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2. Kết quả của việc nuôi cấy. Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy: Trong môi trường lỏng: vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: + Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. + Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy. Bài 4 LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM Hóa chất, dụng cụ Dụng cụ: pipette, que cấy, phiến kính phẳng, lá kính, đèn cồn, ống hút… Hóa chất: các loại thuốc nhuộm thông dụng như Fuchsin, xanh methylene, tím kết tinh, Lugol, cồn, các loại ống giống và canh trường vi sinh vật. Làm tiêu bản vi sinh vật. Phương pháp giọt ép. Đối tượng: vi khuẩn hoặc nấm men Tiến hành: dùng pipette nhỏ 1 giọt dịch lên lam kính, đối với chất rắn thì có thể nhỏ thêm 1 giọt nước vô trùng lên phiến kính sau đó hòa với vi sinh vật. Đậy lamen lên giọt dịch sao cho tránh được bọt khí. Nếu giọt dịch bị tràn thì lấy giấy lọc thấm bớt đi. Đặt lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 10X, sau đó chuyển qua vật kính 40X. Đối với nấm mốc và xạ khuẩn phát triển hệ sợi, khi làm tiêu bản phải dùng kim dìm khuẩn ti vào dịch thấm ướt, sau đó mới đậy lá kính lên trên. Nấm men Phương pháp giọt treo. Đối tượng: nấm men hoặc sự di chuyển của vi sinh vật. Bôi một lớp mỏng Vaseline quanh chỗ lõm của lam kính. Dùng que cấy lấy một giọt dịch vi sinh vật đặt vào giữa lamen. Từ từ úp ngược lamen rồi đặt vào chỗ lõm của lam kính. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát. Một số phương pháp nhuộm. Nhuộm đơn. Là phương pháp nhuộm chỉ dùng một loại thuốc nhuộm, mục đích là để quan sát hình thái hoặc đo kích thước tế bào vi sinh vật. Mẫu: bự răng Bước 1: làm vết bôi: lấy tăm lấy một ít bự răng, đặt lên lam kính đã có sẵn giọt nước, hòa tan mẫu sau đó dàn mỏng Bước 2 cố định mẫu: hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn cho tới khi khô hẳn nhằm mục đích giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính để khi rửa không bị trôi đồng thời làm cho vi khuẩn dễ bắt màu hơn. Lưu ý tránh hơ quá nóng làm biến dạng và thay đổi cấu trúc tế bào. Bước 3 nhộm mẫu: nhỏ thuốc nhuộm lên lam kính sao cho ngập hết phần mẫu vừa cố định, để trong khoảng 1-2 phút. Rửa thuốc nhuộm bằng cách: nghiêng tiêu bản trên vòi nước chảy nhẹ sao cho giọt nước không chảy trực tiếp lên mẫu, rửa cho tới khi nước phía dưới chảy ra không còn màu là được. để khô tự nhiên hoặc có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để nhanh khô. Bước 4 quan sát tiêu bản: đặt tiêu bản lên kính hiễn vi quan sát ở vật kính 10X  40X sau đó nhỏ một giọt dầu kính Lên tiêu bản và chuyển qua vật kính 100X. Tiêu bản Bự răng Nhuộm kép. Là phương pháp nhuộm phân biệt 2 loại vi sinh vật khác nhau. Phương pháp này dựa trên khả năng của một số vi khuẩn có thể bền với thuốc nhuộm tím kết tinh. Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn vi khuẩn Gram (-). Lớp peptidogycan không bắt màu với tím kết tinh nhưng nó giống như hàng rào bán thấm ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh, khi xử lí bằng Lugol sẽ tạo phức bền tăng sự giữ màu. Và khi tẩy bằng cồn hay acetone, các lỗ của peptiglycan trở nên dày hơn tăng sự giữ màu. Gram (-) có lớp peptiglycan mỏng, ít liên kết chéo, các lỗ lớn. khi tẩy màu, lớp lipid của vỏ ngoài bị loại bỏ, kích thước lỗ lớn hơn nên thuốc nhuộm tím kết tinh dễ bị tẩy màu và khi nhuộm bổ sung bằng Fushin kiềm sẽ bắt màu hồng. Chuẩn bị tiêu bản Chuẩn bị giống ống vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn Gram (-) Cho một giọt nước vô trùng lên lam kính sạch. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) hòa vào giọt nước. Dàn mỏng vi khuẩn thành vết bôi. Sau đó cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn ( tránh hơ quá nóng) hoặc là để khô tự nhiên. Nhuộm tiêu bản Sau khi hơ trên ngọn lửa đèn cồn thì để nguội sau dó nhuộm tiêu bản bằng tím kết tính để khoảng 1 phút đến 1 phút 30s. Nhỏ Lugol để cố định thời gian khoảng 1 phút đến 1 phút 30s. Tẩy cồn trong khoảng 30s Nhuộm bổ sung Fushin kiềm từ 30s- 60s Rửa lại H2O, làm khô tiêu bản để quan sát. Kết quả: E. coli Bài 5 QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SỊNH VẬT Mục đích: Quan sát và biết đánh giá phần đại thể: tốc độ phát triển, đường kính khuẩn lạc sau những khoảng thời gian nhất định; màu sắc và sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc; hình thái mặt trái của khuẩn lạc (hình dạng các nếp nhắn); màu sắc của môi trường; hình thái khuẩn ti thể; sự tạo thành các giọt nước đọng trên bề mặt khuẩn lạc,… Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ. Nguyên liệu, hóa chất: các loại thuốc nhuộm thông thường (tím kết tinh, xanh methylene, Fushin kiềm…), các hóa chất cần thiết để chế tạo môi trường nuôi cấy. Dụng cụ: kính lúp, ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri, pipette, tăm tre, lá kính, phiến kính… Quan sát hình thái xạ khuẩn. Khái quát.: Xạ khuẩn có tên khoa học là Actinomycetes, là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong trong đất, nước, bùn ao và trong các cơ chất hữu cơ khác, nhưng tập trung nhiều nhất là trong đất Dạng đơn bào, phát triển thành hệ sợi ( khuẩn ti) phân nhánh mạnh nhưng không ngăn vách. Khuẩn ti có hai loại là khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh kết cấu tạo khuẩn lạc nhỏ nhưng rắn chắc, thô rap, xù xì, nhiều màu sắc. Cuống sinh bào tử và bào tử đa dạng. Quan sát hình thái xạ khuẩn. Chuẩn bị mẫu xạ khuẩn: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường thạch đĩa Gause I Có dạng khuẩn lạc, kích thước nhỏ hơn nấm mốc, bề mặt rắn chắc, thô, ráp, xù xì, nhiều màu sắc và bám chắc vào môi trường thạch. Tế bào dạng sợi phân nhánh. Tiêu bản xạ khuẩn Quan sát hình thái nấm mốc. Khái quát: Có kích thước lớn hơn nhiều so với xạ khuẩn, vi khuẩn. Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có hoặc không có phân nhánh. Các sợi nấm có hoặc không có vách ngăn, hệ khuẩn ti phát triển mạnh tạo khuẩn lạc có kích thước lớn với màu sắc đa dạng. Sinh sản chủ yếu là bào tử vô tính Quan sát hình thái nấm mốc. Chuẩn bị mẫu nấm mốc: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường Martin Hình thái: + Có dạng khuẩn ti, khuẩn ti phát triển tạo thành khuẩn lạc kích thước lớn. + Quan sát thấy có dạng đa bào, có vách ngăn, bề mặt thô ráp xù xì. Nấm mốc bậc cao Nấm mốc bậc thấp Quan sát hinh thái nấm men. Khái quát. Thường có cấu tạo đơn bào vầ sinh sản theo lối nảy chồi. Tế bào nấm men có hình trứng, hình tròn, hình ống dài…thường là dạng đơn bào, kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào vi khuẩn Một số nấm men có khả năng tạo khuẩn ti hoặc giả khuẩn ti Quan sát hình thái nấm men Chuẩn bị mẫu nấm men: thu nhận khuẩn lạc từ môi trường Martin. Có dạng khẩn lạc, kích thước nhỏ hơn nấm mốc, bề mặt trơn láng. Tế bào có dạng hình trứng. Tiêu bản nấm men Bài 7 QUÁ TRÌNH LÊN MEN VÀ PHÂN GIẢI CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ KHÔNG CHƯA NITROGEN Dụng cụ, hóa chất. Hóa chất: môi trường Hansen, K 2Cr2O7 1%, dung dịch H2SO4 10%, KMnO4 5%, dung dịch AgNO3/NH4OH 20%, FeCl3 3%, NaOH 20%, sữa chua, nước cải muối chua, giấm, rượu. Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, phiến kính, lá kính, ống nhỏ giọt, cốc thủy tinh, giấy lọc có tẩm dung dịch AgNO3, lưới amiang. Tiến hành. Lên men ethylic: là quá trình chuyển hóa kị khí đường thành rượu ethylic và CO2 với tấc nhân lên men chính là nấm men (chủ yếu là các giống Saccharomyces, Schizosaccharomyces). Ngoài ra, một số nấm mốc (Mucor), vi khuẩn (sarcina) cũng có khả năng lên men rượu nhưng hoạt tính rất thấp. Quan sát vi sinh vật. Làm tiêu bản giọt ép hoặc tiêu bản nhuộm đơn từ dịch lên men, quan sát ở vật kính 40X. Tiêu bản vi sinh vật trong rượu Phản ứng định tính: xác định sự có mặt của rượu ethanol bằng K2Cr2O7 Cho vào ống nghiệm 1-2ml dịch lên men, thêm vào 0.5-1ml H2SO4 đậm đặc và nhỏ thêm từng giọt K2Cr2O7 1% cho đến khi màu đỏ da cam của thuốc thử này chuyển thành màu xanh lam. Dung dịch trong ống nghiệm bị chuyển thành màu xanh lam. Kết quả: màu đỏ da cam của thuốc thử chuyển sang màu xanh lam nhờ tác dụng của rượu. Phương trình phản ứng: K2Cr2O7  + 8 H2SO4 + 3CH3CH2OH → 4KCr(SO4)2 + 3CH3COOH + 11H2O Ống đối chứng: cho vào ống nghiệm 1-2ml nước, thêm vào 0,5 – 1ml đậm đặc H2SO4 và nhỏ thêm từng giọt K2Cr2O7 1% Kết quả: ống đối chứng không có sự chuyển màu của chứng tỏ không có rượu ethylic trong ống đối chứng. Lên men lactic. Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường tạo acid lactic. Dựa vào sản phẩm của quá trình lên men người ta có thể chia vi khuẩn lactic ra thành 2 nhóm: + Nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình: sản phẩm của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic, phản ứng diễn ra như sau: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + Nhóm vi khuẩn lên men lactic dị hình: sản phẩm của quá trình lên men ngoài acid lactic (khoảng 60%) còn có nhiều sản phẩm phụ khác như glycerine, acid acetic, rượu ethylic, CO2,… + Ngoài ra, một số loài nấm mốc cũng có khả năng lên men để tạo acid lactic (như Mucor) Quan sát hình thái. Phản ứng định tính: phản ứng tạo aldehyde acetic. Cho vào cốc khoảng 20ml dịch lên men, 1ml dung dịch acid H2SO4 10%, 5ml KmnO4 5%. Đậy cốc bằng một tờ giấy lọc có tẩm dung dịch AgNO3 trong NH4OH. Đặt cốc này lên ngọn lửa đèn cồn có lót lưới amiang và đun cho tới khi sôi. Quan sát sự chuyển màu của tấm giấy lọc. Phương trình phản ứng: 2KMnO4 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O + 5O 5CH3CHOHCOOH + 5O 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O Kết quả: giấy lọc chuyển sang màu nâu đen do CH3CHO bốc hơi tác dụng với AgNO3. Quá trình oxy hóa rượn thành acid acetic. Là quá trình oxy hóa hiếu khí theo phương trình phản ứng sau: CH3CH2OH + O2  CH3CHOOH + 5H2O Quan sát vi khuẩn acetic. Lấy một ít váng trắng trên bề mặt dịch lên men, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm xanh methylene hoặc Fushin kiềm, quan sát bằng vật kính 100X Tiêu bản vi khuẩn trong dấm Định tính acid acetic: phản ứng tạo (CH3COO)3Fe Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men, 1ml NaOH 20%, vài giọt dung dịch FeCl3 5% lắc đều và đun nóng trên ngọn lửa đèn cồn Phương trình phản ứng: CH3COOH + NaOH CH3COONa + H2O 3CH3COONa + FeCl3 → (CH3COO)3Fe + 3NaCl Kết quả: dung dịch chyển sang màu đỏ thẩm do có sự tạo thành sắt acetate. BÀI 8: SỰ CHUYỂN HÓA CÁC CHẤT HỮU CƠ CHỨA NITROGEN Mục đích: Quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitrogen (N) là một quá trình khép kín. Mở đầu là quá trình cố định N phân tử, tiếp theo là quá trình thối rữa, quá trình nitrite và nitrate hóa. Cuối cùng là quá trình phản nitrate hóa trả lại N tự do cho khí quyển. Sự chuyển hóa màu xảy ra liên tục trong tự nhiên, khép kín vòng tuần hoàn N, do đó có ý nghã lớn trong sản xuất nông nghiệp. Qua bài thực hành giúp sinh viên củng cố lý thuyết về các quá trình phân giải các hợp hất hữu cơ chứa nitrogen, bản chất là quá trình vi sinh vật tham gia và ý nghĩa thực tiễn. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ. Nguyên liệu, hóa chất: giấy quì, dung dịch (CH3COO)2Pb, NaOH 3%, CuSO4 1%, giấy lọc, thuốc thử Ehrlich, Griss, diphenylamine, Nessler, Bruxin, urea, vaseline, H2SO4 10%, tinh bột, dịch nuôi cấu vi khuẩn nitrite hóa, nitrate hóa và phản nitrate hóa. Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipette, ống nhỏ giọt, cốc đong, phiến kính, lá kính, dao, nilon, máy xay… Tiến hành. Quá trình thit thối rửa. Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitrogen tạo NH3 được gọi là quá trình thối rữa. Các loại vi sinh vật tham gia vào quá trình thối rữa: Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B. megatherium, B. subtilis, E. coli… Nấm mốc: Aspergillus oryzae, A. niger, Mucor… Xạ khuẩn: Streptomyces griseus, S. fradiae… Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: dung dịch thỗi rữa Quan sát vi sinh vật Lấy dung dịch lên men, nhuộm đơn, soi ở vật kính 100X để quan sát sự có mặt của các nhóm vi sinh vật. Quan sát: có các vi khuẩn hình que, lớn. số lượng nhiều. Vi khuẩn gây thối rửa Phản ứng định tính. Dùng thuốc thử Nessler: nhỏ một giọt dung dịch thối rữa ra đĩa, sau đỏ nhỏ 1 giọt Nessler lên dụng dịch sang màu vàng sẫm vừa mới lấy ra Kết quả: dung dịch chuyển sang màu đỏ nhạt. Điều này chứng tỏ trong môi trường protein đã phân giải hết. Nhận biết sự phân giải protein ( do sự tác dụng của NH4+ với Nessler, sẽ tạo ra phức hợp có màu vàng đậm). Quá trình nitrite hóa. Quá trình oxy hóa NH3 thành nitrite, xảy ra theo phương trình: 2NH3 + 3O2  2HNO2 + 2H2O Chuẩn bị mẫu: dung dịch nitrite Quan sát vi sinh vật: Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính 100X Vi khuẩn nitrite hóa Phản ứng định tính. Quá trình nitrate hóa. Quá trình oxy hóa NH3 thành nitrite rồi tiếp tục oxy hóa thành nitrate. Quá trình này xảy ra qua 2 giai đoạn. Quá trình nitrate hóa: 2HNO2 + O2  2HNO3 Chuẩn bị mẫu: dung dịch nitrate Quan sát hình thái vi sinh vật: Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính 100X Tiêu bản vi khuẩn nitrate hóa Phản ứng định tính: Dùng thuốc thử diphenylamine: nhỏ một giọt dung dịch ra đĩa, sau đỏ nhỏ 1 giọt Diphenylamine lên dụng dịch vừa mới lấy ra. Kết quả thuốc thử chuyển sang màu xanh lam Quá trình phản nitrate hóa Quá trình các vi sinh vật khử nitrate (nitrite) đến nitrogen phân tử kèm theo sự oxy hóa các hợp chất hữu cơ giải phóng CO2 và H2O được gọi là trình phản nitrate hóa. Chuẩn bị mẫu: canh trường vi khuẩn phản nitrate hóa Quan sát hình thái vi sinh vật Lấy dịch nuôi cấy làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới vật kính dầu. Tiêu bản vi khuẩn phản nitrate hóa Phản ứng định tính. Kiểm tra nitrate có được khử hết không, nitrite trong dung dịch đã được chuyển hóa hết chưa Nhỏ 1 giọt dung dịch ra đĩa, từ từ nhỏ lần lượt các loại thuốc thử Diphenylamie, Gris và Nesslen theo thứ tự, để nhìn rõ từng phản ứng của dung dịch với các loại thuốc thử. Kết quả: Dung dịch đổi màu xanh lục sau khi nhỏ Diphenylamine. Tiếp tục nhỏ Gris vào thì dung dịch bắt màu hồng sẫm, sau khi cho Nesslen thì dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt. Phân tích:Sau khi cho Diphenylamine vào xuất hiện màu xanh lục, chứng tỏ dung dịch đã khử NO3-. Dung dịch bắt màu hồng sẫm sẽ nhận biết được NO2 đang được chuyển đổi. Bài 9, 10 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS, FAECAL COLIFOMS Hóa chất, dụng cụ. Hóa chất: thuốc thử đỏ methyl, các loại môi trường nuôi cấy nhóm vi khuẩn đường ruột, mẫu nước song, nước cống. Dụng cụ: ống nghiệm, ống sinh hơi, pipette, ue cấy, ống nhỏ giọt… Khái niệm chung. Nhóm coliform hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật, chúng được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị vì sự hiện diện của chúng trong thực phẩm, trong nước hay các loại mẫu khác được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Coliform là những trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh hơi và acid ở 370C trong 24-48 giờ. Nhóm Colform gồm 4 chi là: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Coliform phân (Faecal Coliform hay E.coli giả định) là coliform chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 44,50C trong canh tryptone. Đây là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột người và động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong môi trường. Định lượng bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Nguyên tắc. Số lượng vi sinh vật đường ruột trong mẫu nước chứa mật độ thấp có thể xác định bằng phương pháp MNP. Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng theo dãy thập phân; 3-5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ ấm trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng đọ pha loãng ủ 3 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để xác định số ống dương tính cho mỗi độ pha loãng và dựa vào bảng MNP để tính ra số lượng vi sinh vật trong 1g hoặc 1ml mẫu. Quy trình phân tích. Chuẩn bị: chuẩn bị các mẫu nước cống ở độ pha loãng 100 , 10-1, 10-2 Cấy mẫu: Tuần tự cấy 3ml dịch mẫu đã pha loãng 100 vào 3 ống nghiệm giống nhau đã chứa canh LSB, mỗi ống chứa 1ml mẫu pha loãng. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng ở 10-1 và 10-2. Đây là trường hợp xác định MNP bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại. Ủ các ống trong nhiệt độ 37 trong 48 giờ. Ghi nhận các ống dương tính: có sinh hơi và chuyển từ đỏ sang vàng. Kết quả: nồng độ pha loãng 100 có 3 ống dương tính, 10-1 có 2 ống dương tính, 10-2 có 1 ống dương tính. Theo phương pháp MPN: kết quả 3,2,2 suy ra có 21 Coliforms trong 1g(ml) mẫu. Định tính coliforms: cấy xác nhận Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL. Từ một ống chứa canh LSB chuyển sang 2 ống chứa canh BGBL và chia làm hai dãy, một dãy ủ ở 370C trong 48 giờ, một dãy ủ ở 420C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống dương tính ở nhiệt độ 420C (có sinh hơi và chuyển màu môi trường từ xanh sang nhạt do xảy ra quá trình lên men) ứng với mỗi độ pha loãng. Đọc kết quả: từ số lượng các ống nghiệm chứa canh BGBL dương tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu, tra bảng MNP để tính ra mật độ Coliform trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MNP/ml mẫu. Kết quả: Số ống dương tính lần lượt ở 3 nồng độ 100, 10-0, 10-2 lần lượt là 2, 2, 1. Định tính faecal coliforms. Sau khi ủ xong: giá ủ ở 37 đem ra cấy sang môi trường thạch đĩa sau đó ủ trong 37 trong 24h rồi đọc kết quả. Cách cấy: mỗi ống ở mỗi nồng độ cấy một đường dài khoảng 1cm. Kết quả: ghi nhận các đường mọc lên khuẩn lạc có ánh kim Ở nồng độ 100 không có đường có ánh kim Ở nồng độ 10-1 không có đường có ánh kim Ở nồng độ 10-2 không có đường có ánh kim Kết quả: Đối tượng Số ống dương tính ở 3 độ pha loãng. MPN/ml Nồng độ 10-3 10-4 10-5 MPN/100ml 10-3 10-4 10-5 Coliforms 3 2 2 21 21.104.100=7x106 Coliforms chịu nhiệt 3 2 1 15 15.104.100=15x106 Faecal coliforms 0 0 0 1.1 1.1.104.100=1.1x106 Kết luận: Sau khi thực hiện thí nghiệm ta thấy rằng: Nồng độ Coliform ở mức độ pha loãng 100ml là 2.1x103 MPN. Nồng độ Coliform chịu nhiệt ở mức độ pha loãng 100ml là 2.8x103 MPN. Nồng độ Faecal coliform ở mức độ pha loãng 100ml là 0.3x103 MPN.