TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

- NGUYỄN THỊ LAN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hà Nội – 2011 Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.
- Nội dung nghiên cứu 2 4.
- Nguyễn Thị Thùy Vân ii SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 2.2.1.
- Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter 13 2.2.2.
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy của các chủng A.xylinum 14 2.2.2.1.
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 15 2.2.3.1.
- Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11].
- Phân lập vi khuẩn Acetobacter 19 3.1.3.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum tạo màng Bacterial Celullose (màng BC) 21 GVHD: ThS.
- Nguyễn Thị Thùy Vân iii SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3.
- Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng 24 3.3.
- Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum 28 3.3.3.
- Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 29 3.3.3.1.
- Khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng Acetobacter xylinum 29 3.3.3.2.
- Khả năng đồng hoá nguồn nitơ của các chủng Acetobacter xylinum 30 3.3.4.
- Nguyễn Thị Thùy Vân iv SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU HÌNH Trang Hình 1.1.
- Tế bào vi khuẩn A.xylinum 4 Hình 1.2.
- Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum 17 Hình 3.2.
- Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn 20 Hình 3.5.
- Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trên bề mặt môi trường dịch thể 23 Hình 3.6.
- Khả năng tạo màng cellulose của các chủng A.xylinum 23 Hình 3.7.
- Hình dạng tế bào của hai chủng vi khuẩn A.xylinum 27 Hình 3.9.
- Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum 5 Bảng 1.2.
- Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum 28 Bảng 3.3.
- Nguyễn Thị Thùy Vân v SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ A.
- Nguyễn Thị Thùy Vân vi SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN MỞ ĐẦU 1.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 1 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer lớn.
- Thế giới đã có nhiều nghiên cứu về màng trị bỏng từ cellulose vi khuẩn.
- Từ những lí do nói trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng Bacterial Cellulose ( màng BC ) có đặc tính dai, mỏng” 2.
- Mục tiêu của đề tài - Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum đã phân lập có khả năng tạo màng Bacterial Cellulose dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng đã tuyển chọn.
- Nội dung nghiên cứu - Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo màng Bacterial Cellulose (BC) dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A.xylinum.
- Ý nghĩa của đề tài - Đề tài nghiên cứu lựa chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo màng BC dai mỏng.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 2 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN NỘI DUNG CHƯƠNG 1.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 3 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 1m Hình 1.1.
- Vi khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [18].
- Nguyễn Thị Thùy Vân 4 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 5 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Theo Bergey Acetobacter xylinum được xếp vào chi Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 6 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 1.2.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 7 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose *Vị trí tổng hợp Vị trí tổng hợp cellulose của tế bào A.xylinum nằm giữa lớp màng lipopolysaccharide và lớp màng sinh chất.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 8 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Hình 1.3 Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum [22] Kích thước của dải ribbon còn nhiều ý kiến chưa đồng nhất, nó có thể đạt từ 3-4 x 70-80 nm [33], 3,2x133 nm (Brown và cs, 2000).
- Nguyễn Thị Thùy Vân 9 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Những nghiên cứu về A.xylinum trên thế giới tập trung theo hai hướng cơ bản: *Hướng thứ nhất: chủ yếu là phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính sinh học của A.xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh giới.
- *Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm cũng như ứng dụng của bacterial cellulose vi khuẩn A.xylinum.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 10 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN giả như C.
- Nguyễn Thị Nguyệt (2008) đã nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) đã nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn A.xylinum và đã phân lập được 14 chủng từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 11 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN CHƯƠNG 2.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 12 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN - Dihyroxyaceton, Blue Bromophenol 0.04% (xuất xứ: Trung Quốc) -,Pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2, H2SO4 (xuất xứ: Trung Quốc.
- Môi trường 2.1.3.1.
- Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 13 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Tiến hành phân lập: Vớt mẫu màng đã được rửa qua cho vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng.
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy của các chủng A.xylinum 2.2.2.1.
- Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi Làm tiêu bản các chủng vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram.
- Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1] Cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu lên các hộp petri có chứa môi trường đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 14 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN - Cấu trúc khuẩn lạc: Đồng nhất, dạng hạt nhỏ, dạng hạt lớn.
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 2.2.3.1.
- Sử dụng môi trường sau để khử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 15 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetate bị oxy hoá, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không là âm tính.
- Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 16 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN CHƯƠNG 3.
- Phân lập chủng Acetobacter xylinum Nguyên liệu được sử dụng để phân lập vi khuẩn A.xylinum gồm 4 nguồn được chia làm 2 nhóm.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 17 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Khâu 1 trong qui trình, làm giầu mẫu nguyên liệu là để cho các vi khuẩn trong không khí có điều kiện phát triển, sinh sản, tăng số lượng trên môi trường chứa nguyên liệu ta đã chuẩn bị để thu được nhiều tế bào vi khuẩn dùng cho các khâu phân lập, tuyển chọn tiếp theo.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 18 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Chuối Bia Hà Nội Hình 3.
- Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter trên môi trường 1 theo phương pháp của Winogradski 1, [2].
- Các chủng Acetobacter có khả năng sinh acid acetic, acid này phân giải CaCO3 GVHD: ThS.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 19 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN trong môi trường do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 20 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Hầu hết các chủng vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá rượu ethanol thành acid acetic (hình 3.3).
- Nguyễn Thị Thùy Vân 21 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3.1.3.
- Tiến hành nuôi cấy 8 chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường dịch thể ở nhiệt độ 300C và theo dõi khả năng tạo màng BC của các chủng.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 22 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Mỏng Váng màng Nhăn, dễ vỡ Mỏng dai Hình 3.
- Khả năng tạo cellulose của các chủng A.xylinum GVHD: ThS.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 23 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Kết quả trong 6 chủng Acetobacter có 3 chủng có khả năng hình thành màng BC.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 24 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Sự hình thành màng BC của 3 chủng vi khuẩn này là khác nhau.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 25 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN VC1 R1 B4 BHN2 Hình 3.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 26 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy hình dạng tế bào của 2 chủng vi khuẩn như sau: B4 R1 BHN2 Hình 3.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 27 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 3.3.2.
- Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum Khi phát triển trên bề mặt các môi trường đặc thì vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng của loài đó.
- Vì vậy việc miêu tả khuẩn lạc là một trong những việc cần thiết khi nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn.
- 9 Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum GVHD: ThS.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 28 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Khi sinh trưởng trên bề mặt môi trường đặc 2 chủng vi khuẩn A.xylinum đã phân lập hình thành các khuẩn lạc khác nhau: khuẩn lạc của chủng B4 có dạng hạt lớn, tròn có vành, màu vàng sẫm và bề mặt nhẵn bóng.
- Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 3.3.3.1.
- Nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn nói trên trong môi trường dịch thể (môi trường 3) có thay đổi nguồn carbon khác nhau.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 29 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Bảng 3.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 30 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN Bảng 3.4.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 31 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN sinh trưởng, sinh trưởng yếu, sinh trưởng tốt.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 32 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.
- Kết luận - Từ 4 nguồn nguyên liệu đã phân lập được 6 chủng có khả năng hình thành màng trên môi trường lỏng.
- B4) có khả năng hình tạo màng BC dai, mỏng.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 33 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.
- Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng.
- Nguyễn Thị Nguyệt, Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 34 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 11.
- Nguyễn Thị Thùy Vân (2009).
- Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 35 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN 20.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 36 SV: Nguyễn Thị Lan Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN BC parchment paper”.
- Nguyễn Thị Thùy Vân 37 SV: Nguyễn Thị Lan