- HÀ QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ CHITIN ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. - HÀ QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ CHITIN ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. - LÊ THANH HÀ Hà Nội – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Hà Quang Tùng, tôi xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của tiền xử lý chitin đến hiệu quả của quá trình thủy phân chitin bằng chitinase” là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. - Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác. - LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời trân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. - Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Thanh Hà, Nghiên Cứu Sinh Đặng Thị Hường đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian làm thực hiện luận văn. - Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. - Cấu trúc tinh thể chitin. - Tính chất của chitin. - Ứng dụng của chitin. - Các yếu tố tác động ảnh hưởng đến cấu trúc tinh thể của chitin. - Cơ chế xúc tác thủy phân chitin của chitinase. - Các nghiên cứu về chitinase từ nấm mốc Penicillium. - Cấu trúc hóa học và tính chất của GlcNAc. - Phương pháp thu nhận GlcNAc. - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Nguyên liệu. - Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù. - Phương pháp thu nhận chế phẩm chitinase. - Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase. - Phương pháp chạy sắc ký bản mỏng. - Phương pháp xác định hàm ẩm nguyên liệu. - Phương pháp xác định Nitơ tổng số (phương pháp Kjeldahl. - Phương pháp xác định hàm lượng protein (phương pháp Biuret. - Phương pháp xác định hàm lượng chitin trong nguyên liệu. - Xác định hiệu suất thủy phân. - Phương pháp nghiên cứu dùng trong xử lý nguyên liệu chitin. - Phương pháp phân tích SEM (Scanning Electron Microscope. - Phương pháp phân tích HPLC (High Performance Liquid Chromatography. - Lựa chọn nguồn nguyên liệu chitin. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các phƣơng pháp tiền xử lý đến hiệu quả thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý vật lý. - Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý hóa học riêng rẽ hay kết hợp vật lý. - Một số đặc tính hóa lý và sinh học của chitin phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình (Mw) và mức độ N-acetyl hóa (DA Bảng 1.2. - Khảo sát điều kiện xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin Bảng 2.2. - Các phân đoạn kích thước nguyên liệu chitin được sử dụng Bảng 2.3. - Khảo sát điều kiện siêu âm nguyên liệu chitin Bảng 3.1. - Hàm lượng chitin của các loại nguyên liệu Bảng 3.2. - Kết quả định lượng hàm lượng dịch đường sau thủy phân bằng HPLC (các mẫu khảo sát ở cùng khối lượng 5 mg Bảng PL1. - Ảnh hưởng của kích thước chitin lên hiệu suất thủy phân Bảng PL6. - Ảnh hưởng của chế độ siêu âm lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni ....63 Bảng PL7. - Ảnh hưởng của siêu âm gián đoạn lên hiệu suất thủy phân Bảng PL8. - Khảo sát tác động siêu âm lên các loại kích thước chitin mũ ni Bảng PL9. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni thô Bảng PL10. - Ảnh hưởng của xử lý vật lý lên hiệu suất thủy phân chitin gel Bảng PL11. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin gel DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. - Ba dạng Cấu trúc chitin Hình 1.3. - Liên kết hydro nội phân tử của chitin Hình 1.4. - Liên kết hydro của tinh thể α-chitin (a) và β – chitin (b Hình 1.5. - Cấu trúc mạng tinh thể α-chitin theo mô tả của Minke và Blackwell ........6 Hình 1.6. - Phân tích x – ray cấu trúc của β – chitin (theo trục a, b Hình 1.7. - Cấu trúc hóa học của GlcNAc Hình 3.1. - Hiệu suất thủy phân của chitin tôm mũ ni, chitin tôm sú và chitin mực .31 Hình 3.2. - Ảnh hưởng của kích thước chitin lên hiệu suất thủy phân Hình 3.3. - Ảnh hưởng của chế độ siêu âm lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni ......35 Hình 3.4. - Kết quả sắc ký TLC từ dịch thủy phân của chitin kích thước < 63µm .....37 Hình 3.5. - Ảnh hưởng của siêu âm gián đoạn lên hiệu suất thủy phân Hình 3.6. - Khảo sát tác động siêu âm lên các loại kích thước chitin mũ ni Hình 3.7. - Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin Hình 3.8. - Sắc ký đồ HPLC của dịch thủy phân 120 giờ các mẫu chitin Hình 3.10. - Ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni ..44 Hình 3.11. - Ảnh hưởng của vi sóng lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni Hình 3.12. - Ảnh hưởng của nhiệt, vi sóng lên hiệu suất thủy phân chitin mực Hình 3.13. - Ảnh hưởng nhiệt độ 1500C, áp suất 3,7 atm lên hiệu suất thủy phân .....46 Hình 3.14. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni thô Hình 3.15. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni nghiền ...48 Hình 3.16. - Ảnh hưởng của hóa chất kết hợp siêu âm lên hiệu suất thủy phân Hình 3.17. - Ảnh hưởng của xử lý vật lý lên hiệu suất thủy phân chitin gel Hình 3.18. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin gel Hình 3.19. - Ảnh hưởng của hóa chất lên hiệu suất thủy phân qua rửa chitin gel ......51 Hình 3.20. - Kết quả sắc ký TLC từ dịch thủy phân của nguyên liệu gel Hình PL1. - Các loại kích thước nguyên liệu chitin mũ ni Hình PL4. - Một số mẫu Chitin sú và chitin mực Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Công Nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU Chitin lần đầu được biết đến vào năm 1811 bởi nhà khoa học người Pháp Henri Braconnot phát hiện trong nấm khi xử lý với kiềm và đề xuất tên là fungine. - Năm 1823, Odier tách được chất tương tự từ lớp biểu bì bọ cánh cứng bằng xử lý với kiềm nóng và ông đề xuất tên đang sử dụng hiện nay là chitin. - Đây chính là tiền đề mở ra loạt nghiên cứu về cấu trúc, ứng dụng của chitin và dẫn xuất chitin [45]. - Hiện nay, Chitin thương mại chủ yếu thu được từ xử lý vỏ giáp xác như tôm, cua. - Trên thế giới hàng năm khoảng 1010 đến 1011 tấn chitin được hình thành và hiện nay năng suất sản xuất chitin mới dừng lại ở mức 80.000 tấn chitin/năm từ việc xử lý động vật giáp xác biển [17. - Chitin trong vỏ giáp xác có thể dùng để sản xuất chitosan, chitooligosaccharide, N - Acetyl - D - glucosamine, D - glucosamine có giá trị kinh tế cao và có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực. - Ngoài ra, GlcNAc có thể dùng để chuyển đổi thành nhiên liệu sinh học bằng Rhodotorula glutinis, sản xuất acid sialic, làm mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm [25. - Thủy phân hóa học khắc nghiệt dẫn đến Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Công Nghệ Sinh Học thay đổi vòng glucose, sản phẩm có vị đắng do sự hiện diện của một lượng nhỏ các chất dư O-acetyl hóa và di-acetyl hóa, tạo muối glucosamine hydrochloride (GlcNHCl) gây tác dụng phụ của muối vô cơ [56. - Phương pháp enzyme có nhiều lợi thế hơn so với phương pháp hóa học là đơn giản, kinh tế, không yêu cầu cao về kỹ thuật, an toàn môi trường, phản ứng diễn ra ở điều kiện nhẹ nhàng, sản phẩm giữ được tính chất tự nhiên. - Tuy nhiên, phương pháp này bị hạn chế là do cấu trúc khó bị thủy phân của chitin. - Sự tương tác lưỡng cực mạnh mẽ giữa các chuỗi polymer, đồng thời liên kết hydro tạo nên mạng tinh thể khó bị phá vỡ dẫn đến hiệu quả khi thủy phân không cao. - Do đó, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc biến đổi các cấu trúc tinh thể chitin để nâng cao hiệu quả thủy phân. - Đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của tiền xử lý chitin đến hiệu quả của quá trình thủy phân chitin bằng chitinase” do vậy đã được đặt ra. - Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm 1. - Tìm hiểu đánh giá khả năng thủy phân của một số loại chitin 2. - Nghiên cứu tác động của phương pháp tiền xử lý vật lý và hóa học đối với chitin nhằm nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Công Nghệ Sinh Học Chƣơng 1. - Giới thiệu chitin Chitin là một poly-beta-1,4-N-Acetylglucosamine và là polymer sinh học đa dạng và nhiều nhất ở trong tự nhiên. - Công thức phân tử chitin [C8H13O5]n, Mchitin = (203,09)n Trọng lượng phân tử trung bình khoảng từ 1,03x106– 2,5x106 Dalton [11]. - Cấu trúc tinh thể chitin Có 3 dạng của chitin: α, β và γ chitin. - Dạng α -chitin (vỏ tôm, cua) được phân bố rộng rãi nhất, cả α – chitin và β - chitin ( mực) đều được thương mại hóa [19]. - Các chuỗi α-chitin được sắp xếp song song ngược chiều nhau đều đặn, cách sắp xếp này giúp hình thành thêm các liên kết hydro giữa các chuỗi dẫn đến dạng này ổn định và bền nhất. - Dạng β-chitin các chuỗi được bố trí song song cùng chiều Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Công Nghệ Sinh Học ít ổn định hơn. - Ba dạng Cấu trúc chitin Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α bằng xử lý với kiềm (KOH) nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [19. - Dạng γ-chitin thu được chủ yếu từ nấm và nấm men rất ít nghiên cứu được thực hiện vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của α-chitin [21. - Cấu trúc tinh thể chitin được ổn định bằng liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và giữa các phân tử. - Mỗi một chuỗi có các liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận gọi là liên kết nội phân tử bao gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl trên C-6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH-trên C-3 và oxy ở trong vòng, liên kết hydro rộng lớn này giúp tăng cường độ cứng của chuỗi tinh thể chitin Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bằng sự chi phối bởi liên kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [5. - Liên kết hydro nội phân tử của chitin Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Công Nghệ Sinh Học Hình 1.4. - Liên kết hydro của tinh thể α-chitin (a) và β – chitin (b)
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt