Nghiên cứu phương pháp xác định nhanh Aflatoxin M1 trong sữa.

- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 1 MỤC LỤC MỤC LỤC.
- Giới thiệu về Aflatoxin M1.
- Sự hình thành Aflatoxin M1 [9.
- Tình hình nhiễm Aflatoxin M1.
- Các phương pháp xác định Aflatoxin M1.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
- 26 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 2 1.5.2.
- Các loại detector trong HPLC.
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Đối tượng nghiên cứu.
- Phương pháp nghiên cứu.
- Phân tích định tính Aflatoxin M1.
- Phân tích định lượng Aflatoxin M1 trong sữa.
- Kiểm định độ chính xác của phép đo bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC.
- Kết quả phân tích định tính Aflatoxin M1.
- Thu nhận và tổng hợp Aptamer đặc hiệu aflatoxin M1.
- Ứng dụng Aptamer phân tích định tính Aflatoxin M1 trong sữa.
- Kết quả phân tích định lượng AFM1 trong sữa bằng phương pháp điện hóa sử dụng aptamer.
- Phương trình Hồi quy tuyến tính giữa điện trở kháng EIS và nồng độ Aflatoxin M1.
- Kiểm định độ chính xác của phép đo bằng phương pháp HPLC.
- 54 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 3 MỞ ĐẦU Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn nhận được sự quan tâm của người dân bởi điều này liên quan trực tiếp đến sức khoẻ của họ.
- Đặc biệt trong thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các số liệu khảo sát tình hình nhiễm các chất gây hại đến sức khoẻ con người trong một số loại thực phẩm.
- Các chất độc hại khi xâm nhập vào cơ thể có thể gây ra nhiều chứng bệnh mà hiện nay khoa học còn đang trong thời kì nghiên cứu để chữa trị, ví dụ như bệnh ung thư.
- Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, gió mùa, là điều kiện thuận lợi cho các loại vi sinh vật mà đặc biệt là nấm mốc phát triển.
- Ngoài việc gây tổn thất về chất lượng cảm quan, dinh dưỡng, tổn thất về khối lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố có tính chất nguy hiểm đến sức khỏe của con người, động vật và ảnh hưởng tới nền kinh tế.
- Nấm mốc phát triển trên lương thực, thực phẩm sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt như protein, lipid, gluxid…đồng thời còn tiết ra độc tố.
- Độc tố Aflatoxin do dòng nấm Aspegillus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản gây độc cho người và gia súc.
- Độc tố Aflatoxin được chia thành nhiều nhóm B, M, G..
- Aflatoxin là tác nhân gây phá huỷ gan, xơ gan, ung thư gan một cách cấp tính và kinh niên ở người (cũng như các động vật nhạy cảm), gây ra dị tật thai nhi ở phụ nữ mang thai, những rối loạn về dinh dưỡng như suy dinh dưỡng, thiếu protein.
- Aflatoxin khi nhiễm trong thức ăn của bò sẽ tạo thành 2 sản phẩm chuyển hoá trong sữa cũng có độc tính cao là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 4 Aflatoxin M1 là hợp chất chuyển hoá của Aflatoxin B1 (chất có độc tính mạnh nhất) có khả năng xâm nhập vào trong ADN.
- Xuất phát từ thực tế hiện nay thức ăn cho gia súc đặc biệt là thức ăn cho các loài gia súc sinh ra sữa thường ẩm mốc và chứa hàm lượng lớn Aflatoxin, dẫn đến sữa cũng chứa hàm lượng Aflatoxin M1 có độc tính cao, có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe người dùng, mà đặc biệt là trẻ em, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài.
- Nghiên cứu phương pháp xác định nhanh Aflatoxin M1 trong sữa” với các mục tiêu như sau.
- Xây dựng được test thử định tính nhanh Aflatoxin M1 trong các sản phẩm sữa.
- Định lượng được lượng Aflatoxin M1 có trong các sản phẩm này.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 5 PHẦN 1.
- Aflatoxin là gì? [1][2] Aflatoxin (AF) là một nhóm độc tố vi nấm được sinh ra bởi: 3 chủng nấm mốc Aspegillus flavus, A.parasiticus và có thể cả A.nomius.
- Bào tử của các chủng nấm mốc trên có thể nhiễm vào cây trồng phát triển và sinh độc tố vi nấm trong thời kỳ sinh trưởng của cây hay trong quá trình phơi sấy khô và bảo quản sau thu hoạch.
- Những điều kiện khắc nghiệt như hạn hán, côn trùng tàn phá hoặc gió xoáy, mưa dầm, thu hoạch chậm, phơi sấy không kịp thời và có độ ẩm cao, thiếu các phương tiện bảo quản khoa học là những yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhập của nấm mốc và sinh hàm lượng AF cao trong thực phẩm.
- Hình 1.1: Aspegillus parasiticus Hình 1.2: Aspegillus flavus Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 6 Các đối tượng lương thực, thực phẩm dễ bị nhiễm AF là.
- Các thực phẩm giàu tinh bột: lạc, ngô, gạo, bột mì và các sản phẩm chế biến.
- Các loại sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa.
- AF G1 và G2 tương ứng là dẫn xuất dihydroxyl của AF B1 và B2.
- Trong sữa của các loại gia sức, AF B1 và B2 chuyển hóa thành AF M1 và M2.
- AF B1 là độc tố nguy hiểm nhất trong các loại AF, chỉ với một lượng nhỏ (0,03ppm) AF trong khô lạc có thể gây ra u gan.
- Về mặt cấu tạo, có thể coi AF B1 là hợp chất mẹ, AF M1 và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B1 và B2 theo thứ tự như hình 1.3 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 7 Hình 1.3.
- Dựa vào tính chất này cho phép phát hiện các hợp chất AF ở nồng độ rất thấp (0,5ng hay thấp hơn trên một vết của sắc ký bản mỏng), là cơ sở để phân tích định đính là định lượng AF bằng phương pháp hóa lý.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 8 AF hòa tan tốt trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform và methanol, đặc biệt là dimetyl sulfoxit là dung môi được sử dụng như phương tiện trong việc đưa AF vào cơ thể động vật.
- Do đó nó vẫn có thể tồn tại trong thực phẩm khi nấm mốc đã bị tiêu diệt bởi quá trình xử lý nhiệt.
- Sự có mặt của các vòng lacton trong phân tử AF làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này rất quan trọng trong chế biến thực phẩm vì xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm AF trong các sản phẩm thực phẩm.
- Tuy nhiên nếu sau quá trình xử lý kiềm mà có sự axit hóa sẽ làm phản ứng ngược lại để tạo AF Các AF khá bền với enzyme tiêu hóa, AF B1 là phân tử ái mỡ có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng hấp thụ sau khi ăn.
- Sự chuyển hóa AF B1 ở đường tiêu hóa chính là nhờ sự hoạt động tương tác giữa các protein ở niêm mạc ống tiêu hóa tạo ra sản phẩm AF B1- epoxie, AF B1- dihydrodio hoặc AF B2α.
- AF B1 và các sản phẩm chuyển hóa của nó được bài tiết qua 3 con đường chính là qua mật, sữa và nước tiểu (sản phẩm của AF B1 qua sữa là AF M1).
- Người ta dã xác định có sự tương quan tuyến tính giữa AF B1 ăn vào và lượng AF M1 trong sữa.
- Lượng AF M1 trong sữa nước tính khoảng 1% lượng AF B1 ăn vào.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 9 1.1.4.
- Nhóm M: Aflatoxin M1 (AF M1), Aflatoxin M2 (AF M2.
- Trong đó AF B1 là chất có tính độc nhất.
- Năm 1988, tổ chức quốc tế nghiên cứu ung thư IARC đã đưa AF B1 vào danh sách các hợp chất gây ung thư gan nguy hiểm.
- Còn AF B2, G2 là 2 dẫn chất khử hydro tương ứng của AF B1 và G1.
- AF B1, G1 có khả năng gây ung thư cao hơn nhiều so với AF B2 và AF G2.
- AFB1, B2 khi nhiễm trong thức ăn của bò sẽ tạo thành 2 sản phẩm chuyển hoá trong sữa cũng có độc tính cao và có tên thứ tự là AFM1 và AFM2.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 10 1.1.5.
- Tính chất độc hại của Aflatoxin [4] Độc tố AF rất bền vững, nhiệt độ nấu nướng thông thường không thể phân huỷ được AF, nó có thể tồn tại ở nhiệt độ trên 2600C.
- Do đó, sự nhiễm độc tố AF không chỉ gây thiệt hại đơn thuần về mặt kinh tế, mà tác hại lớn nhất là ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng, tác động nguy hiểm đến con người không kém các chất độc hại có nguồn gốc hoá học khác.
- Trong tất cả các loại độc tố nấm mốc thì AF là độc tố nguy hiểm nhất, nồng độ giới hạn được WHO quy định có trong thực phẩm là 5ppb, có trong sữa là 0,5 ppb (theo QCVN 8-1:2011/BYT).
- Người ta cũng chứng minh rằng vòng α, β- lacton không bão hòa có trong phân tử AF làm cho hoạt chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hơn DNA nhân tế bào do đó làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tế bào [5] Bệnh nhiễm độc tố vi nấm (Aflatoxicosis) là do tiêu thụ những thực phẩm bị nhiễm AF.
- Độc tính của AF trên động vật thí nghiệm gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mãn tính.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 11 Khả năng gây ung thư của AF được Wogan nghiên cứu và được IARC đánh giá.
- Các u gan và thận: khi cho các AF uống qua đường miệng, chủ yếu là B1 đã gây ung thư ở tất cả các loài động vật nghiên cứu (gồn cả động vật linh trưởng không phải người).
- Độc tính của độc tố này được đánh giá là cao gấp 10 lần axit hydroxyanic và gấp 68 lần Arsen.
- AF là tác nhân gây phá huỷ gan, xơ gan, ung thư gan một cách cấp tính và kinh niên ở người (cũng như các động vật nhạy cảm), gây ra dị tật thai nhi ở phụ nữ mang thai, những rối loạn về dinh dưỡng như suy dinh dưỡng, thiếu protein.
- Điều đặc biệt nguy hiểm là tác động bệnh lý của AF có tính cộng hưởng với các tác nhân khác như: virut viêm gan B (HBV), hoặc những độc tố di truyền.
- Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở các vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với AF, nhưng cơ chế tác động của AF gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của AF B1 với DNA của tế bào gan của các bệnh nhân ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn tìm được trong máu ngoại vi, máu nhau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với AF B1.
- Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm AF B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là đột biến gen P35- một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính.
- Các số liệu nghiên cứu ở các vùng ung thư khác nhau ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy nồng độ AF thực tế ở thức ăn đã liên quan tới tai biến ung thư gan ở các vùng đó.
- Tỷ lệ này dao động từ µg/kg trọng lượng cơ thể trong 1 ngày Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 12 và gây tai biến ung thư dao động từ 1,2 – 13 người trên 100.000 dân trong một năm.
- Bệnh nhiễm AF cấp tính ít đượct thông báo, có thể kể ra một số trường hợp như: ba tre em Đài Loan và 1 trẻ em ở Uganda đã bị hoại tử gan cấp tính liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm AF ở mức 200 µg/kg và 1700 µg/kg là bằng chứng có tính thuyết phục nhất về sự liên quan của AF và bệnh gan cấp tính.
- Sự chuyển hóa Aflatoxin trong cơ thể Sau những nghiên cứu rộng rãi trên chuột, cá hồi, AF mà đặc biệt là AF B1 được khẳng định như một tác nhân chuyển hóa gây ung thư.
- Sự chuyển hóa của AF đóng vai trò quyết định tới mức độ gây độc tính của AF.
- Sau khi ăn vào bụng, AF được chuyển hóa bởi nhóm ezyme Cytochrome P450 trong gan, nơi chúng được chuyển hoá thành những sản phẩm như Aflatoxicol, AF Q1, AF P1 và AF M1.
- Cùng với những sản phẩm như trên, AF 8,9 epoxide cũng được hình thành.
- Hàm lượng sản phẩm chuyển hóa này phụ thuộc vào độ nhạy cảm của DNA và vật chủ bằng cách xen vào DNA, hình thành liên kết guanine của DNA.
- Sự xen giữa này của epoxide gây ra sự chuyển vị trí giữa G và T ở codon 249 của gen P53 trong gan dẫn đến gây ung thư.
- Điều này quan sát thấy ở hầu hết các mẫu thí nghiệm và điều đó cũng chỉ ra nguyên nhân chính dẫn đến ung thư của AF.
- Khả năng ung thư tùy thuộc vào khả năng khử độc của gan, yếu tố di truyền, độ tuổi và một số yếu tố dinh dưỡng [7] Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 13 1.2.
- Giới thiệu về Aflatoxin M1 1.2.1.
- Thông tin chung - Danh pháp: Aflatoxin M1 - Công thức phân tử: C17H12O7 - Cấu trúc phân tử.
- Sự hình thành Aflatoxin M1 [9] Sự xâm nhập của AF M1 vào sữa và các sản phẩm sữa theo 2 con đường chủ yếu.
- Sữa và các sản phẩm sữa khi được bảo quản không tốt có thể là môi trường thuận lợi cho sự phát triển các loại nấm mốc như loại nấm dòng Aspergillus.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 14 AF M1 là hợp chất chuyển hoá của AF B1:4-hydroxyl-aflatoxin B1.
- Hàm lượng chuyển hoá thành AF M1 trong sữa bằng khoảng 1- 3% của lượng AF B1 ăn vào.
- Do đó, khi con người sử dụng những sản phẩm sữa bị nhiễm độc, AF M1 sẽ chuyển vào cơ thể gây nên những hiểm họa nghiêm trọng cho sức khoẻ người tiêu dùng.
- AF M1 là chất chuyển hoá của AF B1 nên độc tính của nó không kém gì so với AF B1.
- Hơn nữa, A FM1 có thể xâm nhập vào trong ADN, gây những tổn thương cho gan dẫn đến nguy cơ ung thư gan rất cao.[12] 1.2.4.
- Tình hình nhiễm Aflatoxin M1 Sự nhiễm A FM1 trong sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa ở một số nước trên thế giới được tổng kết trong bảng sau: [5][4] Quốc gia Tổng số mẫu phân tích Mẫu > 0,05ppb Mẫu > 0,5 ppb Vượt giới hạn cho phép.
- Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm Brazil sữa bột) 6 2 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 15 Mĩ sữa tươi sữa chế biến Indonexia Philippin Hàn Quốc UAE Iran Bảng 1.1: Sự nhiễm Aflatoxin ở một số sản phẩm sữa ở một số nước Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm nên vấn đề bảo quản cho sản phẩm thực phẩm cần được làm tốt, trước hết là tránh các độc tố vi nấm, vì AF rất dễ bị ô nhiễm, rất khó kiểm tra phát hiện sự ô nhiễm để xử trí kịp thời.
- Năm 1990-1995 Viện Dinh Dưỡng đã kiểm tra 387 mẫu lương thực thực phẩm nhận thấy có 73 mẫu (19%) bị ô nhiễm AF và trong đó có 19 mẫu (4,9%) có hàm lượng AF vượt quá giới hạn cho phép theo quy định 867/QĐ-BYT/1998 của Bộ Y tế.
- Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Quỳnh Trang 16 Năm 2007, Chi cục thú y thành phố Hồ Chí Minh qua kiểm tra phân tích độc tố AFM1 trong 96 mẫu sữa đã thu được độc lập tại các điểm trung chuyển sữa có 7 mẫu chứa hàm lượng AFM1 vượt ngưỡng chiếm 7,29%.
- Giới hạn cho phép Một số nước trên thế giới đã đưa ra giới hạn nhiễm AF M1 tối đa cho phép trong các loại thực phẩm như sau: [3] Quốc gia Giới hạn cho phép ( ppb) Thực phẩm ASEAN 0,50 Sữa Bỉ 0,05 Sữa Pháp 0,03 Sữa trẻ em 0,05 Sữa người lớn Thổ Nhĩ Kì 0,05 Sữa và các sản phẩm 0,25 Pho mát Mĩ 0,50 Sữa Thuỵ Sĩ 0,05 Sữa và các sản phẩm sữa

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt