Phân lập và tuyển chọn chủng sinh vật tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng trong khâu nghiền bột giấy.

- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học i Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong khóa học vừa qua.
- Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Tô Kim Anh và TS Phạm Tuấn Anh là hai thầy cô đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài.
- Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi trong quá trình nghiên cứu.
- Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Hoàng Nam, ThS Lê Tuân, KS Nguyễn Khoa Đăng đã luôn giúp đỡ ủng hộ tôi trong thời gian nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
- Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia đình đã luôn là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã cộng tác giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn thạc sỹ.
- Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2013 Học viên Phạm Khánh Dung Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học ii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất cả số liệu nghiên cứu đề tài là hoàn toàn trung thực.
- Học viên Phạm Khánh Dung Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học iii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.
- Công nghệ sản xuất giấy.
- Nguyên liệu sản xuất giấy.
- Quy trình sản xuất bột giấy.
- Quy trình nghiền bột giấy.
- Hệ enzyme thủy phân cellulose.
- Enzyme Endo-β-1,4-glucanases.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ.
- Ảnh hƣởng của pH.
- Ảnh hƣởng của ion kim loại.
- Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ.
- 21 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học iv Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B 1.3.5.
- Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
- Nhiệt độ nuôi cấy.
- pH môi trƣờng nuôi cấy.
- Ứng dụng của enzyme trong sản xuất nghiền.
- Làm thay đổi một số thuộc tính của xơ sợi, bột giấy và giấy.
- Nâng cao khả năng tổng hợp enzym nhờ đột biến.
- Các tác nhân gây đột biến hóa chất.
- Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc.
- 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.
- Hóa chất và môi trƣờng.
- Phƣơng pháp.
- Phƣơng pháp phân lập.
- Môi trƣờng.
- Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
- Phƣơng pháp định tính hoạt tính enzyme thông qua xác định vòng thủy phân .
- 37 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học v Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B 2.2.4.
- Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng thuốc thử DNS .
- Xác định hoạt độ enzyme endoglucanase.
- Định tên sinh học phân tử.
- Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-glucanase.
- Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất.
- Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng.
- Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy.
- Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ.
- Ảnh hƣởng của nitơ hữu cơ.
- Ảnh hƣởng của nitơ vô cơ.
- Phƣơng pháp đột biến chủng nấm mốc.
- Tuyển chọn chủng đột biến thu đƣợc.
- Tuyển chọn sơ bộ dựa vào vòng thủy phân với thuốc thử lugol.
- Tuyển chọn dựa vào hoạt độ enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ các chủng đột biến.
- Khảo sát đặc tính của enzyme thu đƣợc từ chủng tự nhiên và chủng đột biến 46 2.2.9.1.
- Khảo sát độ bền nhiệt độ và bền pH của enzyme endo-glucanase 46 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học vi Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B 2.2.9.2.
- Khảo sát nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu của enzyme endo-glucanase 46 2.2.10.
- 47 2.2.11.
- 47 2.2.11.1.
- 47 2.2.11.2.
- Kết quả phân lập.
- Kết quả tuyển chọn.
- Kết quả tuyển thông qua xác định vòng thủy phân.
- Kết quả tuyển chọn thong qua xác định hoạt độ enzyme endo-glucanase bằng phƣơng pháp DNS.
- Định tên bằng sinh học phân tử.
- 62 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học vii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B 3.3.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng R22-20.
- Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất.
- Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng.
- Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy.
- Nâng cao khả năng tổng hợp enzyme của chủng tự nhiên nhờ đột biến.
- Tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng đột biến UV13.
- Ảnh hƣởng nồng độ nitơ hữu cơ.
- Ảnh hƣởng nồng độ nitơ vô cơ.
- Hoạt độ enzyme endo-glucanase của chủng đột biến UV13 theo ngày nuôi 69 3.6.
- Đặc tính của enzyme endo-glucanase thu đƣợc từ chủng đột biến.
- Nhiệt độ tối ƣu.
- pH tối ƣu.
- Bền nhiệt độ.
- 79 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học viii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Thành phần cấu trúc lignocellulose 2 2 Hình 1.2: Công thức hóa học của cellulose 4 3 Hình 1.3: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 4 4 Hình 1.4: Công thức hóa học của hemicellulose 6 5 Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin 7 6 Hình 1.6: Các liên kết giữa lignin và polysaccarid 9 7 Hình 1.7: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 14 8 Hình 1.8: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan.
- (B) Thủy phân các xylooligosaccharide bởi enzyme β-xylosidase 16 9 Hình 1.9: Cấu trúc không gian của endoglucanase 19 10 Hình 1.10: Cơ chế xúc tác của enzyme endo-glucanase 22 11 Hình 1.11: Ảnh hƣởng của tia UV 27 12 Hình 3.1 : Hình ảnh một số chủng phân lập từ rơm 58 13 Hình 3.2 : Hình ảnh kết quả tuyển chọn bằng nhỏ lugol 59 14 Hình 3.3: Khuẩn lạc của: Aspergillus fumigatus Fresenius 62 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học ix Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B 15 Hình 3.4: Đầu sinh bào tử trần của Aspergillus fumigatus Fresenius (X Hình 3.5: Hình ảnh lựa chọn sơ bộ trên môi trƣờng CMC và tỷ lệ vòng thủy phân 66 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học x Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses 3 2 Bảng 1.2: Các enzyme phân hủy cellulose 13 3 Bảng 3.1 : Số chủng phân lập từ rơm 57 4 Bảng 3.2: Tổng hợp tỷ lệ vòng thủy phân của các chủng đột biến so với chủng gốc 65 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học xi Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT Tên Trang 1 Biểu đồ 3.1 :Biểu đồ kết quả đo vòng thủy phân 59 2 Biểu đồ 3.2: Hoạt độ enzyme endo-glucanase của các chủng nấm 60 3 Biểu đồ 3.3 : Biểu đồ khảo sát nồng độ CMC 63 4 Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 64 5 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy 65 6 Biểu đồ 3.6.
- Hoạt độ enzyme của chủng đột biến so với chủng R22-20 67 6 Biểu đồ 3.7: Ảnh hƣởng của Nitơ hữu cơ 68 7 Biểu đồ 3.8: Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ vô cơ 69 8 Biểu đồ 3.9: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ enzyme endo-glucanase của chủng đột biến UV13 70 9 Biểu đồ 3.10: Nhiệt độ tối ƣu của endo-glucanase từ chủng UV13 71 10 Biểu đồ 3.11: pH tối ƣu của endo-glucanase từ chủng UV13 72 11 Biểu đồ 3.12: Khả năng bền trong các nhiệt độ khác nhau của endo-glucanase từ chủng UV13 73 12 Biểu đồ 3.13: Khả năng bền trong các pH khác nhau của endo-74 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học xii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B glucanase từ chủng UV13 13 Biểu đồ 3.14: Độ bền pH của 2 enzyme endo-glucanase từ 2 chủng UV13 và R22-20 (tại thời điểm sau 5h ủ) 75 14 Biểu đồ 3.15: Hiệu suất thu hồi enzyme bằng các phƣơng pháp khác nhau 76 15 Biểu đồ 3.16: Hiệu suất sấy đông khô enzyme với chất mang Magnesi Stearat 77 Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học xiii Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B ĐẶT VẤN ĐỀ Giấy đóng vai trò rất quan trọng và góp phần thúc đẩy các nền kinh tế khác phát triển.
- Trong công nghiệp bột giấy và giấy, chi phí năng lƣợng chiếm tới 25% tổng chi phí sản xuất loại bột giấy trong đó năng lƣợng sử dụng cho quá trình nghiền bột giấy chiếm khoảng 15-18% tổng năng lƣợng cần thiết.
- Việc sử dụng enzyme nhƣ một phƣơng thức để thay đổi thuộc tính của xơ sợi nhằm cải thiện khả năng nghiền của bột giấy đã đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và đi sâu nghiên cứu.
- Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiền hành nghiên cứu về enzyme endo-glucanase với đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng sinh vật tổng hợp enzyme endocellulase ứng dụng trong khâu nghiền bột giấy”.
- Nội dung nghiên cứu.
- Tuyển chọn chủng vi sinh vật cho hoạt độ enzyme endo-glucanase cao nhất.
- Nâng cao khả năng sinh enzyme endo-glucanase của chủng tự nhiên bằng phƣơng pháp đột biến tia UV.
- Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp enzyme của chủng đột biến.
- Khảo sát đăc tính enzyme của chủng đột biến: bền nhiệt độ, bền pH và nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu.
- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 1 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.
- Công nghệ sản xuất giấy 1.1.1.
- Từ giai đoạn này đến đầu thế kỷ 20, giấy đƣợc làm bằng phƣơng pháp thủ công để phục vụ cho việc ghi chép, làm tranh dân gian vàng mã… Năm 1912, nhà máy sản xuất bột giấy đầu tiên bằng phƣơng pháp công nghiệp đi vào hoạt động với công 4.000 tấn/năm tại Việt Trì.
- Trong thập niên 1960, nhiều nhà máy giấy đƣợc đầu tƣ xậy dựng nhƣng hầu hết đều có công suất nhỏ (dƣới 20.000 tấn/năm) nhƣ nhà máy giấy Việt Trì, nhà máy bột giấy Văn Điển, nhà máy giấy Đồng Nai, nhà máy giấy Tân Mai vv… Năm 1975, tổng công xuất thiết kế của ngành giấy Việt Nam là 72.000 tấn/năm nhƣng do ảnh hƣởng của chiến tranh và mất cân đối giữa sản lƣợng bột giấy và giấy nên sản lƣợng thực tế chỉ đạt 28.000 tấn/năm.
- Năm 1982, nhà máy giấy Bãi Bằng do Chính Phủ Thụy Điển tài trợ đã đi vào sản xuất với công suất thiết kế là 53.000 tấn bột giấy/năm và 55.000 tấn giấy/năm, dây truyền sản xuât khép kín, sử dụng công nghệ cơ-lý và tự động hóa.
- Nhà máy cũng xây dựng đƣợc vùng nguyên liệu.cơ sở hạ tầng, cơ sở phụ trợ nghƣ điện, hóa chất và trƣờng đào tạo nghề phục vụ cho hoạt động sản xuất.
- Mặc dù đã có sự tăng trƣởng đáng kể tuy nhiên tới nay đóng góp của ngành về tổng giá trị sản xuất quốc gia vẫn rất nhỏ [52].
- Nguyên liệu sản xuất giấy Nguyên liệu sản xuất bột giấy chủ yếu từ thực vật nhƣ: gỗ lá rộng, gỗ lá kim, họ thân thảo, họ tre nứa… hay còn gọi là vật liệu lignocellulose.
- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 2 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.1).
- Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đƣờng khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng đƣợc tổng hợp từ tiền phenylpropanoid.
- Dƣới đây là thành phần nguyên liệu lignocelluloses trong tự nhiên.
- Hình 1.1: Thành phần cấu trúc lignocellulose Thành phần cấu tạo và phần trăm của cellulose, hemicelluloses và lignin là khác nhau giữa các loài, trong cùng một cây hay các cây khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trƣởng, phát triển của cây và các điều kiện khác.
- Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học 3 Học viên: Phạm Khánh Dung Lớp: CH.CNSH2011B Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses [49] Nguồn lignocelluloses Cellulose.
- Thân gỗ cứng Thân gỗ mềm Giấy Lá cây Giấy báo Giấy thải từ bột giấy hóa học .
- Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển [33, 36], hàng năm thực vật tổng hợp đƣợc khoảng 1.5x1011 tấn cellulose [11]

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt