Công nghệ lên men CÔNG NGHỆ LÊN MEN FERMENTATION TECHNOLOGY • Công nghệ lên men, hay công nghệ quá trình sinh họ c (bioprocess technology), bắ t nguồ n từ việ c sử dụ ng vi sinh vậ t để sả n xuấ t các thự c phẩ m như phó mát, sữ a chua, các loạ i rau củ lên men, xúc xích, nư ớ c tư ơ ng, các loạ i thứ c uố ng (bia, rư ợ u vang,..)… • Các quá trình sinh họ c từ ng đư ợ c tiế n hành thủ công, như ng ngày nay đư ợ c tiế n hành theo quy trình công nghệ và đư ợ c áp dụ ng kiế n thứ c khoa họ c hiệ n đạ i. Tempeh 19/09/2011 10:58 SA 1 Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA Lên men là gì? 3 Nguyễ n Hữ u Trí Quy trình lên men • Trong sinh hóa: lên men là quá trình phát sinh năng lư ợ ng trong đó chấ t hữ u cơ vừ a là chấ t cho điệ n tử vừ a là chấ t nhậ t điệ n tử cuố i cùng. • Trong công nghiệ p: lên men mô tả bấ t cứ quá trình sả n xuấ t sả n phẩ m bở i nuôi cấ y sinh khố i tế bào trong mộ t thiế t bị phả n ứ ng sinh họ c (bioreactor) 19/09/2011 10:58 SA 2 Nguyễ n Hữ u Trí • Bư ớ c 1: Thiế t lậ p môi trư ờ ng dùng trong tăng sinh giố ng và sả n xuấ t • Bư ớ c 2: Thanh trùng môi trư ờ ng, nồ i lên men và các thiế t bị kèm theo • Bư ớ c 3: Nhân sinh khố i đủ lớ n, mạ nh và thuầ n để cung cấ p chp các bồ n len men trong giai đoạ n sả n xuấ t • Bư ớ c 4: Cung cấ p các điề u kiệ n tố i ư u cho sự phát triể n củ a giố ng để giố ng sả n sinh sả n phẩ m • Bư ớ c 5: Chiế t và tinh chế sả n phẩ m • Bư ớ c 6: Xử lý nhữ ng chấ t thả i tạ o ra trong quy trình 19/09/2011 10:58 SA 4 Nguyễ n Hữ u Trí 1 Quy trình lên men Quy trình lên men • Quá trình lên men công nghiệ p gồ m 3 công đoạ n chính: 5 -10 mL – Trư ớ c lên men: xử lý, chế biế n, phố i trộ n và khử trùng nguyên liệ u và thiế t bị lên men – Lên men trong bioreactor vớ i điề u kiệ n thích hợ p để tạ o nhiề u sả n phẩ m mụ c tiêu – Sau lên men: thu sả n phẩ m lên men, tinh chế , bả o quả n sả n phẩ m. 0,2 -1 L 10 -100 L 100 -100.000 19/09/2011 10:58 SA 5 Nguyễ n Hữ u Trí 6 19/09/2011 10:58 SA Nguyễ n Hữ u Trí Phân loạ i lên men Quy trình lên men Dự a vào cách cho cơ chấ t vào môi trư ờ ng và thu hoạ ch sả n phẩ m mà ngư ờ i ta chia thành các dạ ng nuôi cấ y: — lên men theo mẻ — lên men theo mẻ có bổ sung cơ chấ t — lên men liên tụ c 19/09/2011 10:58 SA 7 Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA 8 Nguyễ n Hữ u Trí 2 Lên men theo mẻ Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chấ t Vi sinh vậ t đư ợ c cấ y vào nồ i lên men sau khi môi trư ờ ng đã đư ợ c chuẩ n bị . Trong điề u kiệ n nuôi cấ y vô trùng và đả m bả o các điề u kiệ n thích hợ p, vi sinh vậ t sẽ phát triể n theo mộ t đồ thị điể n hình gồ m các giai đoạ n: (1): pha lag trong pha này vi sinh vậ t chư a phân chia, tế bào thích nghi dầ n vớ i điề u kiệ n môi trư ờ ng (2): pha tăng tố c tạ m thờ i trong giai đoạ n này mậ t độ vi sinh vât bắ t đầ u tăng nhanh (3): pha tăng trư ở ng hàm mũ, vi sinh vậ t tăng trư ở ng vớ i tố c độ cự c đạ i (4): tăng trư ở ng chậ m, tố c độ tăng trư ở ng giả m so vớ i giai đoạ n tăng trư ở ng cự c đạ i (5): pha ổ n đị nh, sự hẳ n phát triể n chậ m lạ i hoặ c dừ ng • Để nâng cao năng suấ t mẻ lên men ngư ờ i ta bổ sung cơ chấ t vào trong quá trình lên men • 1/ Bổ sung từ từ các chấ t dinh dư ỡ ng làm tăng thể tích dị ch nuôi cấ y, phư ơ ng pháp này đư ợ c sử dụ ng trong công nghiệ p sả n xuấ t men bánh mì. • 2/ Bổ sung môi trư ờ ng mớ i vào bioreactor đồ ng thờ i rút ra mộ t thể tích dị ch nuôi cấ y (không chứ a tế bào) tư ơ ng ứ ng, phư ơ ng pháp này đư ợ c sử dụ ng trong nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t (6): pha chế t, tăng trư ở ng dừ ng hẳ n, tế bào bị phá hủ y 19/09/2011 10:58 SA 9 Nguyễ n Hữ u Trí Lên men liên tụ c Phư ơ ng pháp này cho phép vi sinh vậ t phát triể n dư ớ i các điề u kiệ n ổ n đị nh, sự tăng trư ở ng diễ n ra vớ i tố c độ ổ n đị nh, trong mộ t môi trư ờ ng ổ n đị nh. Ứ ng dụ ng trong mộ t số trư ờ ng hợ p như sả n xuấ t protein đơ n bào, ethanol và trong mộ t số qui trình xử lý nư ớ c thả i. 11 10 Nguyễ n Hữ u Trí Bioreactor (thiế t bị phả n ứ ng sinh họ c) Môi trư ờ ng luôn đư ợ c cho vào đồ ng thờ i dị ch lên men (môi trư ờ ng, phụ phẩ m, vi sinh vậ t) đư ợ c lấ y ra vớ i cùng mộ t tố c độ , nhằ m giữ thể tích dị ch lên men luôn ổ n đị nh. 19/09/2011 10:58 SA 19/09/2011 10:58 SA Nguyễ n Hữ u Trí Mộ t số dạ ng bioreactor phổ biế n a)Biorector khuấ y liên t ụ c b)Bioreactor dạ ng tháp c)Bioreactor tuầ n hoàn d)Bioreactor yế m khí e)Bioreactor chứ a bùn hoạ t tính xử lý nư ớ c thả i 19/09/2011 10:58 SA 12 Nguyễ n Hữ u Trí 3 Bioreactor (thiế t bị phả n ứ ng sinh họ c) • Bioreactor là thiế t bị quan trọ ng để thự c hiệ n các quá trình sả n xuấ t sinh họ c như lên men bia, acid hữ u cơ , acid amin, kháng sinh, enzyme, vaccine, xử lý chấ t thả i. • Trong thiế t bị lên men, vi sinh vậ t đư ợ c phân tán trong môi trư ờ ng, khí O2 và các chấ t dinh dư ỡ ng đư ợ c tế bào hấ p thu đồ ng thờ i các sả n phẩ m phụ như nhiệ t độ , CO2 , các chấ t biế n dư ỡ ng không cầ n thiế t phả i đư ợ c loạ i ra khỏ i tế bào. 19/09/2011 10:58 SA 13 Nguyễ n Hữ u Trí Cấ u tạ o cơ bả n củ a nồ i lên men Nồ i lên men Hệ thố ng thanh trùng Bộ phậ n khuấ y, cung cấ p khí Hệ thố ng giám sát – điề u chỉ nh nhiệ t độ Hệ thố ng giám sát – điề u chỉ nh pH Hệ thố ng nạ p mẫ u Hệ thố ng giám sát – phá bọ t 19/09/2011 10:58 SA Bioreactor Nguyễ n Hữ u Trí Bioreactor Hình dạ ng củ a các bioreactor thay đổ i nhanh chóng trong vài thậ p niên gầ n đây. Để nâng cao khả năng thông khí và khuấ y trộ n ngư ờ i ta sử dụ ng hai hệ thố ng cả i tiế n sau: Hệ thố ng đầ u tiên sử dụ ng các thiế t bị thông khí và khuấ y trộ n cơ họ c điể n hình là bồ n lên men vớ i hệ thố ng khuấ y trộ n ở trung tâm (centrally stirred tank reactor CSTR). Các thiế t bị này có chứ a mộ t hoặ c nhiề u cánh khuấ y. Cánh khuấ y giúp tăng O2 hòa tan, giúp các thành phầ n trong bồ n lên men đư ợ c phố i trộ n đề u vớ i nhau, tạ o điề u kiệ n cho chấ t dinh dư ỡ ng và khí O2 thấ m vào trong tế bào, cho phép trao đổ i nhiệ t tố t hơ n. —Hệ thố ng sử dụ ng các thiế t bị thông khí và khuấ y trộ n cơ họ c —Hệ thố ng sử dụ ng hệ thố ng bơ m cơ họ c hoặ c bơ m khí độ ng họ c 19/09/2011 10:58 SA 14 15 Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA 16 Nguyễ n Hữ u Trí 4 Bioreactor Đố i vớ i tấ t cả các quá trình lên men, yêu cầ u quan trọ ng nhấ t là phả i đả m bả o sao cho mọ i thành phầ n tham gia phả i đư ợ c đặ t trong điề u kiệ n giố ng nhau. Các thông số lý hóa trong quá trình lên men phả i đư ợ c kiể m soát chặ t chẽ để đả m bả o cho mỗ i tế bào đề u đư ợ c đặ t trong điề u kiệ n như nhau. Hệ thố ng thứ hai sử dụ ng hệ thố ng bơ m cơ họ c hoặ c bơ m khí độ ng họ c làm thiế t bị phân phố i khí trong bioreactor. Dung dị ch trong thiế t bị này di chuyể n theo dòng tuầ n hoàn. 19/09/2011 10:58 SA Để kiể m soát tố t quá trình lên men cầ n phả i hiể u đư ợ c trạ ng thái củ a quá trình và khả năng đáp ứ ng củ a vi sinh vậ t đố i vớ i các điề u kiệ n khác nhau củ a môi trư ờ ng. Các thông số trong quá trình lên men có thể đư ợ c kiể m soát mộ t cách trự c tiế p hoặ c gián tiế p. Quá trình kiể m soát trự c tiế p đư ợ c thự c hiệ n thông qua các sensor đặ t trong bồ n lên men. Phư ơ ng pháp này thư ờ ng đư ợ c áp dụ ng vớ i các thông số như nhiệ t độ , pH, hàm lư ợ ng O2, CO2 hòa tan. 17 Nguyễ n Hữ u Trí Hiệ u quả lên men — Để đạ t hiệ u quả lên men cao thì cầ n đáp ứ ng nhữ ng yêu cầ u sau — 1. Thiế t bị lên men phả i đư ợ c thiế t kế sao cho hạ n chế đế n mứ c thấ p nhấ t khả năng tạ p nhiễ m. — 2. Thể tích dị ch nuôi cấ y trong thiế t bị phả n ứ ng phả i đư ợ c duy trì ổ n đị nh tránh thấ t thoát hoặ c bay hơ i. — 3. Mứ c độ O2 hòa tan phả i đư ợ c điề u chỉ nh phù hợ p — 4. Các thông số như nhiệ t độ , pH cầ n đư ợ c kiể m soát chặ t chẽ , các thành phầ n phả n ứ ng phả i đư ợ c phố i trộ n tố t 19/09/2011 10:58 SA 19 Nguyễ n Hữ u Trí Kiể m soát gián tiế p đư ợ c thự c hiệ n bằ ng cách lấ y mẫ u trong quá trình lên men và đem phân tích. Phư ơ ng pháp này dùng để đo hàm lư ợ ng DNA, RNA, enzyme và sinh khố i 19/09/2011 10:58 SA 18 Nguyễ n Hữ u Trí Sả n xuấ t trên quy mô lớ n (scale up) Trư ớ c hế t các quá trình lên men công nghiệ p đư ợ c thự c hiệ n ở quy mô phòng thí nghiệ m, sau đó nâng lên mứ c sả n suấ t thử (pilot) và cuố i cùng là mở rộ ng sả n xuấ t trên quy mô công nghiệ p. Các số liệ u thu đư ợ c từ quy mô phòng thí nhiệ m đư ợ c dùng làm cơ sở để thiế t lậ p hệ thố ng pilot và hệ thố ng sả n xuấ t công nghiệ p. Khi mở rộ ng qui mô sả n xuấ t cầ n phả i chú ý đế n chế độ khuấ y trộ n, thông khí, kiể m soát các thông số sả n xuấ t, đả m bả o điề u kiệ n vô trùng Bioreactor ở quy mô công nghiệ p trong quá trình sả n xuấ t. 19/09/2011 10:58 SA 20 Nguyễ n Hữ u Trí 5 Thiế t kế môi trư ờ ng cho quá trình lên men Việ c chuẩ n bị môi trư ờ ng có vai trò rấ t quan trọ ng, nó là nề n tả ng cho toàn bộ quá trình lên men. Nế u môi trư ờ ng đư ợ c thiế t kế không tố t sẽ dẫ n hiệ u quả lên men thấ p, vi sinh vậ t tăng trư ở ng kém và năng suấ t tạ o sả n phẩ m thấ p Nư ớ c thư ờ ng là thành phầ n chủ yế u trong môi trư ờ ng nuôi cấ y tế bào vi sinh vậ t, độ ng vậ t và thự c vậ t, nó ả nh hư ở ng đế n sự phát triể n củ a sinh vậ t cũng như sự hình thành sả n phẩ m. Nư ớ c là nguồ n nguyên liệ u đầ u vào quan trọ ng nhấ t đố i vớ i nhiề u quá trình lên men nên nó cầ n phả i đư ợ c kiể m soát cẩ n thậ n. 19/09/2011 10:58 SA 21 Nguyễ n Hữ u Trí Thiế t kế môi trư ờ ng cho quá trình lên men Nguồ n dinh dư ỡ ng cơ bả n cầ n thiế t cho sự phát triể n củ a vi sinh vậ t gồ m nguồ n carbon cung cấ p năng lư ợ ng, nguồ n nitơ , các thành phầ n vô cơ . Trong hầ u hế t các quá trình lên men nguồ n carbon và nitơ thư ờ ng đư ợ c lấ y từ hỗ n hợ p các cơ chấ t rẻ tiề n hoặ c phế phẩ m từ các quá trình sả n xuấ t. Quá trình thanh trùng cũng cầ n đư ợ c quan tâm đặ c biệ t sao cho vừ a đả m bả o tiêu diệ t toàn bộ các vi sinh vậ t tạ p nhiễ m vừ a hạ n chế đế n mứ c thấ p nhấ t sự biế n chấ t củ a các thành phầ n môi trư ờ ng. Phư ơ ng pháp thanh trùng theo mẻ đang đư ợ c sử dụ ng rộ ng rãi • Cơ chấ t sử dụ ng: hạ t ngũ cố c, cám lúa mì, rơ m, mùn cư a hay gỗ dăm bào, và nhiề u loạ i nguyên liệ u từ độ ng vậ t và thự c vậ t. Các hợ p chấ t này là nhữ ng phân tử polymer, không tan hay ít tan trong nư ớ c, giá thành rẻ , dễ thu nhậ n; là nơ i tậ p trung nguồ n dinh dư ỡ ng cho vi sinh vậ t phát triể n. • Thành phầ n vi sinh vậ t trong lên men cơ chấ t rắ n có thể là chủ ng thuầ n hoặ c hỗ n hợ p vi sinh vậ t. • Thự c phẩ m lên men cơ chấ t rắ n: – Ở phư ơ ng Đông: nư ớ c tư ơ ng, tempeh, sả n xuấ t enzyme trên quy mô công nghiệ p. – Ở phư ơ ng Tây: thứ c ăn gia súc ủ chua (silage), nuôi trồ ng nấ m, sả n xuấ t phó mát và sauerkraut, và làm phân bón từ thự c vậ t và chấ t thả i độ ng vậ t. – Mộ t số sả n phẩ m khác: ethanol, methane, sinh khố i sinh vậ t có thể ăn đư ợ c (edible biomass). 19/09/2011 10:58 SA Nguyễ n Hữ u Trí Ví dụ về lên men sử dụ ng cơ chấ t rắ n Lên men cơ chấ t rắ n 23 22 19/09/2011 10:58 SA Nguyễ n Hữ u Trí Ví dụ Cơ chấ t Vi sinh vậ t liên quan Sả n phẩ m từ nấ m (Châu Âu và phư ơ ng Đông) Rơ m, phân bón Agaricus bisporus Lentinus edodes Volvariella volvaceae Sauerkraut (dư a cả i bắ p Đứ c) Cả i bắ p Vi khuẩ n lactic Nư ớ c tư ơ ng Đậ u nành và lúa mì Aspergillus oryzae Rhizopus oligosporus Tempeh Đậ u nành Ontjom Bánh đậ u phộ ng ép Neurospora sitophila Phó mát Sữ a đông Penicillium roquefortii Thiobacillus spp. Tuyể n khoáng Quặ ng giá trị thấ p Acid hữ u cơ Đư ờ ng mía, mậ t rỉ đư ờ ng Aspergillus niger Enzymes Cám mì, … Aspergillus niger Làm phân bón Hỗ n hợ p vậ t liệ u hữ u cơ Nấ m, vi khuẩ n, xạ khuẩ n Xử lý chấ t thả i Chấ t thả i Vi khuẩ n, nấ m và độ ng vậ t nguyên sinh 19/09/2011 10:58 SA 24 Nguyễ n Hữ u Trí 6 Thuậ n lợ i và bấ t lợ i củ a lên men cơ chấ t rắ n so vớ i lên men lỏ ng Thuậ n lợ i • Các loạ i bioreactor sử Môi trư ờ ng đơ n giả n, giá thành rẻ . Nhu cầ u thông khí có thể đư ợ c đáp ứ ng bằ ng khuế ch tán khí hoặ c làm thông khí không liên tụ c. Năng suấ t sả n phẩ m có thể cao. Chi phí năng lư ợ ng thấ p hơ n so vớ i bioreactor thùng khuấ y. - khuấ y trộ n gián đoạ n Các quá trình bị hạ n chế chủ yế u do khuôn chị u đư ợ c độ ẩ m thấ p. Tạ o ra lư ợ ng nhiệ t trao đổ i khi tiế n hành trên quy mô lớ n. Khó kiể m soát chính xác độ ẩ m, sinh khố i, lư ợ ng O2, CO2 - khuấ y trộ n liên tụ c • Koji đư ợ c sả n xuấ t trong hệ tụ c hoặ c liên tụ c. Sự giớ i hạ n sả n phẩ m. Chi phí củ a tiề n xử cuố i Tố c độ phát triể n củ a vi sinh vậ t thấ p hơ n. Nguyễ n Hữ u Trí Đầ u nhữ ng năm 1950, virus bạ i liệ t đư ợ c nuôi cấ y số lư ợ ng lớ n trong các tế bào độ ng vậ t đư ợ c nuôi cấ y để chế vaccine chố ng bạ i liệ t. Vaccine virus khác như • quai bị , sở i, adenovirus Nử a cuố i thế kỷ 20, tậ p trung vào cả i tiế n môi trư ờ ng và quá trình nuôi cấ y  để tạ o ra tế bào có khả năng phát triể n, tồ n tạ i độ c lậ p và có khả năng phân chia tích cự c Các loạ i tế bào đư ợ c nuôi cấ y : ngư ờ i, chuộ t (rat, mice, hamster), khỉ , gia súc, cừ u, ngự a và gầ n đây là cá và côn trùng. • Thành phầ n môi trư ờ ng: chấ t hữ u cơ như amino acid, vitamin, acid hữ u cơ và các chấ t khác, đệ m muố i vô cơ . Vài loạ i môi trư ờ ng còn chứ a huyế t thanh (5-20%) để nhân tố tăng trư ở ng, nguyên tố vi lư ợ ng, chấ t béo,… 19/09/2011 10:58 SA 27 cung cấ p Nguyễ n Hữ u Trí lý phả i cân đố i vớ i giá trị sả n phẩ m 19/09/2011 10:58 SA 26 Nguyễ n Hữ u Trí Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t • thố ng nuôi cấ y mẻ bán liên • Mộ t số quá trình lên men cơ chấ t rắ n cầ n tiế n hành tiề n xử lý nguyên liệ u thô để tăng giá trị dinh dư ỡ ng và giả m kích thư ớ c củ a các thành phầ n (ví dụ như bộ t rơ m, cắ t nhỏ nguyên liệ u thự c vậ t) Bioreactor thiế t kế không hoạ t độ ng tố t. 25 dụ ng trong lên men cơ chấ t rắ n - không khuấ y trộ n Bấ t lợ i Nguyên liệ u có độ ẩ m thấ p tiế t kiệ m đư ợ c không gian củ a bioreactor, lư ợ ng chấ t lỏ ng cầ n xử lý ít, nguyên liệ u chứ a ít vi sinh vậ t hơ n, thư ờ ng không cầ n khử trùng, dễ xử lý sau lên men. 19/09/2011 10:58 SA Lên men cơ chấ t rắ n • Trong môi trư ờ ng dinh dư ỡ ng thích hợ p, tế bào độ ng vậ t phát triể n như sinh vậ t đơ n bào, sinh sả n bằ ng cách phân đôi. Các tế bào độ ng vậ t thiế u vách cứ ng bên ngoài tế bào nên dễ bị tổ n thư ơ ng do lự c tác độ ng và do thay đổ i áp suấ t thẩ m thấ u. • Nuôi cấ y tế bào mớ i đư ợ c phân tách từ cấ y sơ cấ p. cơ thể độ ng vậ t gọ i là nuôi Ở giai đoạ n này,các tế bào thư ờ ng ở dạ ng hỗ n hợ p không đồ ng nhấ t như ng vẫ n còn đạ i diệ n cho các loạ i tế bào mẹ và biể u hiệ n đặ c tính đặ c hiệ u mô. • Sau vài lầ n nuôi cấ y thứ cấ p trên môi trư ờ ng mớ i, các dòng tế bào sẽ chế t hoặ c biế n đổ i thành dòng tế bào có khả năng phân chia liên tụ c. Các dòng tế bào này có nhiề u thay đổ i so vớ i khi nuôi cấ y sơ cấ p về hình thái tế bào, tố c độ tăng trư ở ng gia tăng, gia tăng sự biế n đổ i nhiễ m sắ c thể ,… 19/09/2011 10:58 SA 28 Nguyễ n Hữ u Trí 7 Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t • Tế bào độ ng vậ t có thể phát triể n trong nuôi cấ y huyề n phù hoặ c trên bề mặ t rắ n. – Tế bào Hela (tế bào từ khố i u ác tính ở trong cả hai trạ ng thái. ngư ờ i) có thể phát triể n • Nuôi cấ y huyề n phù: sử dụ ng bioreactor dạ ng thùng khuấ y vớ i thể tích khá lớ n dự a trên cơ sở bioreactor trong nuôi cấ y mẻ từ nghiên cứ u vi sinh vậ t. • Kế t hợ p nuôi cấ y bám và nuôi cấ y huyề n phù: sử cự c nhỏ (microcarrier beads). – Tế bào nguyên bào lympho (lymphoblastoid) có thể phát triể n trong môi trư ờ ng lỏ ng. Nuôi cấ y lớ p đơ n tế bào độ ng vậ t bị ả nh hư ở ng bở i diệ n tích bề mặ t có khả năng bám  phả i tìm cách gia tăng diệ n tích bề mặ t Nguyên tắ c: các tế bào cầ n chỗ bám (anchorage-dependent cells) đư ợ c gắ n lên nhữ ng hạ t DEAE-Sephadex đặ c biệ t, các hạ t này có khả năng lơ lử ng trong huyề n phù. Bằ ng cách này nhữ ng lợ i thế về kỹ thuậ t củ a bioreactor thùng khuấ y có thể đư ợ c sử dụ ng vớ i nhữ ng tế bào đư ợ c neo lạ i. Nuôi cấ y trong ố ng hoặ c bình chứ a quay tròn để bả o đả m sự đổ i khí và chấ t dinh dư ỡ ng. Phầ n lớ n quy trình nuôi cấ y tế huyề n phù tế bào. – Các tế bào lư ỡ ng bộ i sơ trên môi trư ờ ng rắ n. • cấ p hoặ c tế bào ban đầ u chỉ phát triể n trao Gầ n đây, sử dụ ng nhữ ng vòng ố ng Teflon có khả năng cho khí đi qua, mỗ i ố ng có diệ n tích bề mặ t 10 000 cm2, có thể kế t hợ p 20 ố ng thành mộ t thiế t bị nuôi cấ y. 19/09/2011 10:58 SA 29 Nguyễ n Hữ u Trí Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t • • • dụ ng nhữ ng hạ t mang Ứ ng dụ ng: – Sả n xuấ t vaccine (bạ i liệ t, quai bị , bệ nh dạ i,…), – Nghiên cứ u độ c chấ t và thuố c nhằ m giả m thử nghiệ m trên độ ng vậ t – Sả n xuấ t các cơ quan nhân tạ o và da – Sả n xuấ t protein dùng cho chẩ n đoán (kháng thể đơ n dòng), interferons, hormones, insulin,… Kháng thể đơ n dòng là sả n phẩ m quan trọ ng nhấ t trong nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t (đạ t giá trị gầ n 3 tỉ $ năm 2001, và hiệ n đang gia tăng). Trong tư ơ ng lai: cả i tiế n các dòng tế bào theo các hư ớ ng như gia tăng năng suấ t, khả năng phát triể n trên môi trư ờ ng không có huyế t thanh và gia tăng phạ m vi sả n xuấ t các phân tử sử dụ ng trong trị liệ u ở ngư ờ i. Các dòng tế bào độ ng vậ t (tế bào buồ ng trứ ng chuộ t, tế bào ung thư tủ y số ng ở chuộ t (mouse myeloma), tế bào võng mạ c ngư ờ i, tế bào thậ n phôi ngư ờ i) là hệ thố ng chiế m ư u thế trong sả n xuấ t protein tái tổ hợ p ứ ng dụ ng trong điề u trị bở i vì chúng có thể tạ o ra protein đư ợ c gấ p cuộ n đúng, có khả năng lắ p ráp và biế n đổ i sau dị ch mã. 19/09/2011 10:58 SA 31 Nguyễ n Hữ u Trí • microcarrier bead bào độ ng vậ t liên quan đế n nuôi cấ y Hầ u như tấ t cả nhữ ng quy trình sả n xuấ t có năng suấ t cao đề u sử dụ ng phư ơ ng pháp nuôi cấ y huyề n phù theo mẻ hoặ c nuôi cấ y bán liên tụ c. 19/09/2011 10:58 SA 30 Nguyễ n Hữ u Trí Công nghệ nuôi cấ y tế bào độ ng vậ t • Kỹ thuậ t chế tạ o mô là mộ t dạ ng củ a y họ c phụ c hồ i, nhữ ng sả n phẩ m chính như da đang trở thành mộ t phư ơ ng pháp trị liệ u thành công. • Nhữ ng sả n phẩ m củ a kỹ thuậ t chế tạ o mô có giá thành sả n xuấ t và chi phí nghiên cứ u cao. • Phầ n lớ n nhữ ng sả n phẩ m củ a kỹ thuậ t chế tạ o mô ở ngư ờ i đư ợ c tiế n hành bằ ng cách nuôi cấ y tế bào từ chính bệ nh nhân hoặ c ngư ờ i hiế n tặ ng và sau đó cho chúng mọ c trên mộ t giá thể thích hợ p và kích thích các tế bào tăng sinh để hình thành các mô đặ c trư ng. Xư ơ ng Giá thể đư ợ c tạ o ra từ các vậ t liệ u sinh họ c tự nhiên, tổ ng hợ p hay bán tổ ng hợ p. Cấ u trúc củ a giá thể sẽ xác đị nh hình dạ ng củ a mô. Sả n phẩ m củ a kỹ thuậ t chế tạ o mô có thể thay thế cho mô củ a ngư ờ i hiế n tặ ng sử dụ ng trong cấ y ghép và phẩ u thuậ t tái tạ o. 19/09/2011 10:58 SA 32 PCL Nguyễ n Hữ u Trí Xư ơ ng phát triể n trên giá thể PCL 8 Công nghệ nuôi cấ y tế bào thự c vậ t • Nuôi cấ y tế bào thự c vậ t hay cơ trong vi nhân giố ng thự c vậ t • Nuôi cấ y huyề n phù tế bào nhiề u loài thự c vậ t trong bioreactor để thu đư ợ c lư ợ ng lớ n sả n lư ợ ng như nicotine, alkaloids và nhân sâm (ginseng),...  các quy trình như vậ y đư ợ c xem như là công nghệ sinh họ c tế bào thự c vậ t. • quan Hiệ n tạ i ngư ờ i ta dự đị nh lên men trên quy mô lớ n để sả n xuấ t thư ơ ng mạ i các sả n phẩ m từ thự c vậ t có giá trị cao như mao đị a hoàng (digitalis), hoa nhài, bạ c hà (spearmint), codeine,… 19/09/2011 10:58 SA 33 Công nghệ nuôi cấ y tế bào thự c vậ t • Phư ơ ng pháp lên men theo cách tăng sinh tế bào thự c vậ t trong môi trư ờ ng lỏ ng đư ợ c khuấ y trộ n bắ t nguồ n từ kỹ thuậ t nuôi cấ y vi sinh vậ t. • Tế bào thự c vậ t phát triể n chậ m hơ n so vớ i tế bào vi sinh vậ t Bioreactor nuôi cấ y rễ tơ nhân sâm Hàn Quố c Nguyễ n Hữ u Trí • Đặ c tính phổ biế n củ a nuôi cấ y tế bào thự c vậ t: giai đoạ n tăng trư ở ng và giai đoạ n tạ o sả n phẩ m thư ờ ng tách biệ t nhau, đòi hỏ i điề u kiệ n cho tăng trư ở ng và tạ o sả n phẩ m đư ợ c tố i ư u hóa theo cách khác nhau. • Quá trình nuôi cấ y theo mẻ và fed-batch (lên men bổ sung dinh dư ỡ ng) là nhữ ng hệ thố ng bioreactor phổ biế n nhấ t. Quá trình xử lý sau lên men chủ yế u liên quan đế n việ c phân tách dị ch lên men trong bioreactor thành pha lỏ ng và pha rắ n, và sau đó là cô đặ c và tinh sạ ch sả n phẩ m. Quá trình xử lý sau lên men gồ m nhiề u giai đoạ n Phân tách • Các sả n phẩ m khác nhau đáng kể về kích thư ớ c phân tử , thành phầ n hóa họ c, yêu cầ u về độ tinh sạ ch  cầ n các phư ơ ng pháp khác nhau để thu hồ i và tinh sạ ch  Thiế t kế quá trình xử lý sau lên men phù hợ p vớ i từ ng sả n phẩ m để hiệ u quả thu hồ i sả n phẩ m cao. • Quá trình xử lý sau lên men là mộ t công đoạ n tố n nhiề u chi phí trong toàn bộ quá trình sả n xuấ t. Sự cả i tiế n quá trình xử lý sau lên men sẽ giúp tăng hiệ u quả và giả m chi phí củ a toàn bộ quy trình. 19/09/2011 10:58 SA 35 Nguyễ n Hữ u Trí Nguyễ n Hữ u Trí Quá trình xử lý sau lên men Quá trình xử lý sau lên men • Quá trình sau lên men liên quan đế n tách chiế t và tinh chế sả n phẩ m thành dạ ng thích hợ p cho mụ c đích nhấ t đị nh. • Các loạ i sả n phẩ m: toàn bộ tế bào, amino acid, vitamin, acid hữ u cơ , dung môi, enzyme, vaccine, protein trị liệ u, kháng thể đơ n dòng. 34 19/09/2011 10:58 SA Cô đặ c Tinh chế Lọ c (Filtration) Ly tâm (Centrifugation) Tuyể n nổ i (Flotation) Phá vỡ (Disruption) Hòa tan (Solubilisation) Ly trích (Extraction) Xử lý nhiệ t (Thermal processing) Lọ c qua màng (Membrane filtration) Kế t tủ a (Precipitation) Kế t tinh (Crystallisation) Sắ c ký (Chromatography) Biế n đổ i Làm khô 19/09/2011 10:58 SA 36 Nguyễ n Hữ u Trí 9 Quá trình xử lý sau lên men Quá trình xử lý sau lên men • Quá trình xử lý sau lên men phụ thuộ c rấ t nhiề u vào tính chấ t vậ t lý và hóa họ c củ a sả n phẩ m. • Sự phân tách các thành phầ n trong pha lỏ ng củ a dị ch lên men có thể liên quan tớ i quá trình lắ ng, lọ c, ly tâm hay phân tách bằ ng điệ n độ ng họ c  mứ c độ cuố i cùng củ a quá trình phụ thuộ c vào mụ c đích sử dụ ng củ a sả n phẩ m cuố i cùng. Khi sả n phẩ m đã đư ợ c tách khỏ i pha lỏ ng và pha rắ n (như sinh khố i vi sinh vậ t), dị ch lên men sẽ đư ợ c loạ i bỏ và xử lý. • Các phư ơ ng pháp đư ợ c sử dụ ng tách riêng sả n phẩ m cuố i bao gồ m: làm khô, chư ng cấ t, lắ ng, lọ c màng, sắ c ký hấ p thụ , sắ c ký ái lự c, sắ c ký trao đổ i ion và sắ c ký lọ c gel,… • Sả n phẩ m cuố i cùng củ a giai đoạ n tinh sạ ch sau lên men cầ n có mứ c độ ổ n đị nh nhấ t đị nh để tiêu thụ trên thị trư ờ ng. • Cầ n cầ n thậ n để tránh sự nhiễ m vi sinh vậ t và tránh sự hư hỏ ng, tránh sự biế n tính sả n phẩ m có chứ a protein. • Cầ n hiể u biế t về độ ng họ c tăng trư ở ng và tạ o sả n phẩ m củ a từ ng đố i tư ợ ng (vi sinh vậ t, tế bào thự c vậ t, độ ng vậ t) để thiế t kế môi trư ờ ng lên men phù hợ p, hiệ u suấ t tạ o sả n phẩ m cao. 19/09/2011 10:58 SA 37 Nguyễ n Hữ u Trí Các sả n phẩ m lên men trong công nghiệ p thự c phẩ m Các sả n phẩ m từ sữ a (phô mai, sữ a chua), sả n phẩ m từ cá và thị t Thứ c uố ng (rư ợ u, trà và cà-phê) Nấ m men bánh mì (Baker’s yeast) Phụ gia thự c phẩ m (chấ t chố ng oxi hóa, chấ t tạ o màu, gia vị ,…) Các thự c phẩ m truyề n thố ng (nư ớ c tư ơ ng, tempeh, miso) Các sả n phẩ m từ nấ m Amino acid, vitamin Các sả n phẩ m từ tinh bộ t Glucose, siro có hàm lư ợ ng fructose cao (high-fructose syrup) Các protein đư ợ c cả i biế n, pectin 19/09/2011 10:58 SA 39 Nguyễ n Hữ u Trí Thiế t kế quá trình xử lý sau lên men phả i phù hợ p vớ i từ ng sả n phẩ m và giá thành sả n phẩ m. • Quá trình xử lý sau lên men sẽ tiế p tụ c là mộ t trong nhữ ng công đoạ n nhiề u thử thách nhấ t củ a quá trình công nghệ sinh họ c. 19/09/2011 10:58 SA 38 Nguyễ n Hữ u Trí Các sả n phẩ m lên men trong công nghiệ p thự c phẩ m Các sả n phẩ m như thự c phẩ m và thứ c uố ng vẫ n là sả n phẩ m thư ơ ng mạ i chính. Các sả n phẩ m mớ i từ vi khuẩ n, độ ng vậ t và tế bào thự c vậ t đang tăng lên, gồ m: – Các chấ t trao đổ i sơ cấ p như acid acetic và acid lactic, glycerol, acetone, butyl alcohol, acid hữ u cơ , amino acid, vitamin và các loạ i đư ờ ng đa (polysaccharide). – Các chấ t trao đổ i thứ cấ p như penicillin, streptomycin, cephalosporin, giberellin,… – Enzymes sử dụ ng trong công nghiệ p như enzyme ngoạ i bào (như là amylases, pectinases và proteases) và enzyme nộ i bào (invertase, asparaginase, các enzyme cắ t giớ i hạ n, ...) – Kháng thể đơ n dòng, vaccine, protein dùng trong chữ a bệ nh. 19/09/2011 10:58 SA 40 Nguyễ n Hữ u Trí 10 Các sả n phẩ m lên men trong công nghiệ p thự c phẩ m Protein đơ n bào (SCP) • Sinh khố i vi sinh vậ t đư ợ c tổ ng hợ p thư ơ ng mạ i gọ i là protein đơ n bào (SCP - single cell protein) sử dụ ng các loài tả o đơ n bào như Chlorella hoặ c Spirulina đư ợ c sử dụ ng cho ngư ờ i hoặ c độ ng vậ t, hoặ c tế bào nấ m men đư ợ c sử dụ ng trong ngành công nghệ nư ớ c giả i khát, sinh khố i vi khuẩ n cũng đư ợ c sử dụ ng làm thứ c ăn cho độ ng vậ t, sinh khố i củ a Fusarium graminearum cũng đư ợ c sử dụ ng cho mụ c đích này. 19/09/2011 10:58 SA 41 Nguyễ n Hữ u Trí Protein đơ n bào (SCP) - Nuôi cấ y vi sinh vậ t tậ n dụ ng nhữ ng phụ phẩ m củ a các ngành công nghiệ p như bã mía, phụ phẩ m dầ u mỏ … để thu sinh khố i như mộ t nguồ n cung cấ p protein cho ngư ờ i và gia súc hay còn đư ợ c gọ i là protein đơ n bào (SCP – single cell protein). - Công nghệ này ngày càng phát triể n và hư ớ ng tớ i việ c tạ o nhữ ng vi sinh vậ t sả n xuấ t nhữ ng chấ t cầ n thiế t như acid amin, vitamin, acid nucleic… 19/09/2011 10:58 SA 43 Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA 42 Nguyễ n Hữ u Trí SCP từ các vậ t liệ u chấ t thả i hữ u cơ Nhữ ng vậ t liệ u mà tạ o nên các chấ t thả i hữ u cơ thư ờ ng nên đư ợ c tái chế trở lạ i hệ sinh thái, ví dụ chấ t thả i carbohydarte, đư ờ ng, tinh bộ t, nư ớ c sữ a, mậ t đư ờ ng; chấ t thả i lignocellulose, rơ m, bã mía,và cả phân xanh củ a độ ng vậ t. Nhiề u chấ t thả i đư ợ c đề xuấ t là có thể đư ợ c biế n đổ i thành protein mà độ ng vậ t và có thể là con ngư ờ i cũng ăn đư ợ c Có hai cách tiế p cậ n nghiên cứ u là nhậ n đư ợ c sự công nhậ n là đã đóng góp to lớ n vào việ c dùng protein củ a con ngư ờ i: protein nấ m (myco-protein) QuornTM và sả n xuấ t nấ m ăn đư ợ c. 19/09/2011 10:58 SA 44 Nguyễ n Hữ u Trí 11 Myco-protein là sinh khố i tế bào đư ợ c chế biế n từ nấ m sợ i Fusarium venenatum. QuornTM myco-protein (protein đơ n bào củ a công ty Marlow Foods Ltd có tên thư ơ ng mạ i là QuornTM myco-protein) Ba tiêu chuẩ n đư ợ c xem xét cho thự c phẩ m protein đơ n bào là : — Nó phả i “ngon” để ăn — Sả n phẩ m cuố i cùng các cơ chấ t và chấ t trung gian đư ợ c dùng trong quá trình chế biế n phả i an toàn để ăn. — Quan trọ ng nhấ t là thự c phẩ m cuố i cùng giàu dinh dư ỡ ng Vi sinh vậ t là mộ t nguồ n SCP tuyệ t vờ i như ng chỉ có mộ t sả n phẩ m SCP đư ợ c chấ p nhậ n để cho con ngư ờ i tiêu thụ đó là protein nấ m. 19/09/2011 10:58 SA 45 Nguyễ n Hữ u Trí Myco-protein là sinh khố i tế bào đư ợ c chế biế n từ nấ m sợ i Fusarium venenatum. Sau đó sả n xuấ t quy mô lớ ncác tháp lên men chứ a chu trình áp suấ t, V=40.000l (có khả năng sả n xuấ t 1000 tấ n mycoprotein mỗ i năm ) Gầ n đây là thiế t bị lên men V=150 000lnuôi cấ y nấ m trong các dòng chả y liên tụ c (có khả năng sả n xuấ t 5000-7000 tấ n mycoprotein mỗ i năm ) Môi trư ờ ng lỏ ng đã khử trùng đư ợ c bơ m liên tụ c vào trong thiế t bi lên men. Môi trư ờ ng chứ a đư ờ ng glucose, cùng vớ i muố i khoáng và yế u tố tăng trư ở ng giúp sợ i nấ m mọ c dài hơ n. Không khí khử trùng và amonia cũng đư ợ c bơ m vào. Nhiệ t độ duy trì ở 30-32oC và sinh khố i tăng gấ p đôi sau mỗ i 5 giờ . 19/09/2011 10:58 SA 47 Chủ ng F. venenatum PTA-2684 đư ợ c nuôi cấ y từ mộ t mẫ u đấ t trồ ng lấ y từ Buckinghamshire, United Kingdom, Marlow Foods Ltd chọ n chủ ng này từ hơ n 3000 sinh vậ t thu nhậ n trên khắ p thế giớ i Nguồ n cơ chấ t là tinh bộ ttinh bộ t cầ n thiế t phả i bị thủ y phân thành carbohydrate hòa tan (glucose) để kiể m soát sự lên men tố t Ở nhữ ng nghiên cứ u ban đầ u, sinh khố i hệ sợ i nấ m củ a proteinnấ m đư ợ c sả n xuấ t trong các thùng bioreactor có cánh khuấ y 300l. Kiể m tra an toàn củ a sả n phẩ m trên phạ m vi rộ ng mộ t khoả ng thờ i gian là trên 12 năm trên các độ ng vậ t và con ngư ờ i (các tình nguyệ n viên), cho thấ y là mycoprotein có thể đư ợ c tiêu thụ , không có bấ t kì tác hạ i nào. 19/09/2011 10:58 SA 46 Nguyễ n Hữ u Trí Myco-protein là sinh khố i tế bào đư ợ c chế biế n từ nấ m sợ i Fusarium venenatum. • Fusarium đư ợ c cấ y vào trong thiế t bị lên men đư ợ c tổ chứ c ở dạ ng mộ t hệ thố ng nuôi cấ y liên tụ c chạ y rấ t nhiề u tuầ n. • Dư ớ i nhữ ng diề u kiệ n phát triể n tố i ư u, thờ i gian nhân đôi củ a hệ sợ i nấ m là nằ m giữ a 3.5 và 4.1 cho phép sả n xuấ t 300 đế n 350 kg sinh khố i trên giờ . Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA 48 Nguyễ n Hữ u Trí 12 Myco-protein là sinh khố i tế bào đư ợ c chế biế n từ nấ m sợ i Fusarium venenatum. Sinh khố i sau đó đư ợ c đư a vào xử lý nhiệ t để giả m hàm lư ợ ng RNASinh khố i nấ m đư ợ c đun nóng lên đế n 90C và đư ợ c cô đặ c bằ ng ly tâm  bộ t nhão  đị nh hình bở i kỹ thuậ t chế biế n thự c phẩ m thành nhữ ng hình dạ ng thích hợ p cho nhữ ng sả n phẩ m cuố i, thêm gia vị , màu sắ c … QuornTM cung cấ p mộ t thự c phẩ m hàm lư ợ ng calo thấ p (80kcal/100g), không có chấ t béo độ ng vậ t và cholesterol và hàm lư ợ ng chấ t béo bão hòa thấ p, chấ t xơ cao 19/09/2011 10:58 SA 49 Sả n xuấ t nấ m ăn đư ợ c -Nuôi các nấ m sinh bào tử có thể ăn đư ợ c trên chấ t thả i lignocellulose như gỗ và rơ m -Trong quá trình nuôi cấ y cơ chấ t cho sự phát triể n củ a : • Agaricus bisporus là rơ m đã lên men Nguyễ n Hữ u Trí • Lentinula là gỗ 19/09/2011 10:58 SA 50 Nguyễ n Hữ u Trí Nuôi nấ m Lentinula edodes Nuôi nấ m Agaricus Rơ m đư ợ c trộ n vớ i phân độ ng vậ t và các hợ p chấ t nitơ hữ u cơ từ 1 đế n 2 tuầ n sả n phẩ m cuố i là mộ t cơ chấ t duy nhấ t thích hợ p cho sự phát triể n nhanh củ a Agaricus Lentinula edodes là nấ m đư ợ c trồ ng phổ biế n thứ giớ i và nó đã đư ợ c trồ ng trên 2000 năm hai trên thế Không có mộ t công thứ c phân trộ n chuẩ n nào, hiệ n tạ i chỉ dự a vào sự sẵ n có và giá củ a các vậ t liệ u thô và các chấ t bổ sung trong mộ t khu vự c trồ ng cụ thể . Hiệ n nay trên 90% sả n lư ợ ng củ a nó đư ợ c sả n xuấ t ở Nhậ t như ng sự nuôi cấ y đã mở rộ ng đế n Trung quố c, hàn quố c, singapore, đài loan, sri lanka và gầ n đây là sang Mỹ và châu âu. Khi nấ m sợ i đã mọ c khắ p trong phân trộ n đã đư ợ c chuẩ n bị (thư ờ ng chứ a trong các hộ p bằ ng gỗ lớ n), các điề u kiệ n nhiệ t độ , độ ẩ m củ a môi trư ờ ng bị thay đổ i và sau đó cấ u trúc nấ m lớ n hình thành mộ t cách nhanh chóng vớ i mộ t số lư ợ ng lớ n hay gọ i là “nả y mầ m”. Phư ơ ng pháp nuôi cấ y truyề n thố ng là cấ y bào tử hay sợ i nấ m vào khúc gỗ (1.8m ×0.15 m) để khúc gỗ tớ i tớ i 5 tháng để các nấ m mọ c lên  sau đó trong suố t thờ i gian đầ u củ a mùa hè và mùa thu, các nấ m sẽ phát triể n mạ nh và đư ợ c thu hoạ ch. Sau đó chúng đư ợ c thu hoạ ch bằ ng cách cắ t bằ ng tay và khoả ng từ 7 đế n 10 ngày sau đó sẽ tớ i mộ t vụ khác. Thư ờ ng thì có tớ i 4 vụ trư ớ c khi quá trình chế biế n kế t thúc 19/09/2011 10:58 SA 51 Nguyễ n Hữ u Trí Việ c sả n xuấ t theo mùa này đư ợ c tăng cư ờ ng bở i sự nấ m để có thể tiêu thụ quanh năm. sấ y khô Nấ m thu toàn bộ chấ t dinh dư ỡ ng từ lignoceluose củ a khúc gỗ . 19/09/2011 10:58 SA 52 Nguyễ n Hữ u Trí 13 Nuôi nấ m Lentinula edodes Gầ n đầ y hơ n, mộ t phư ơ ng pháp mớ i củ a việ c nuôi cấ y đã phát triể n:mùn cư a đư ợ c trộ n vớ i chấ t bổ sung ngũ cố c và đư ợ c ép thành các gói nhự a lớ n- sự sả n xuấ t trên khúc gỗ nhân tạ o Các túi đư ợ c khử trùng  sau đó cấ y vô trùng các nấ m thuầ n  sau môt khoả ng thờ i gian phát triể n sinh dư ỡ ng, đư ợ c cả m ứ ng để sả n xuấ t nấ m Cuố i cùng, sau khi sả n xuấ t nấ m, các cơ chấ t đã dùng rồ i có thể dùng làm thứ c ăn cho độ ng vậ t hay làm phân sinh họ c. Chân thành cả m ơ n Lentinula edodes và các loài nấ m châu á khác là các loạ i nấ m chữ a bệ nh 19/09/2011 10:58 SA 53 Nguyễ n Hữ u Trí 19/09/2011 10:58 SA 54 Nguyễ n Hữ u Trí 14