Thí nghiệm vi sinh vật học BÀI 2 : CÁC PH I. ThS.Lê Xuân Phương NG PHÁP PHÂN L P VI SINH V T Khái ni m : Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đ a về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng d ng vi sinh vật. Vi sinh vật dạng thuần khiết là gi ng vi sinh vật đ ơc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. - Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật th ng tồn tại dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Mu n nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử d ng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đ a chúng về dạng thuần khiết. - Nguyên tắc: Tách r i các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi tr ng dinh d ỡng đặc tr ng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. II. Ph ng pháp phân l p vi sinh v t thu n khi t: Quá trình phân lập vi sinh vật dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật dạng thuần khiết gồm các b ớc cơ bản sau: - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu. - Phân lập vi sinh vật thuần khiết. - Kiểm tra độ tinh khiết c a các khuẩn lạc. 2.1. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập a. Yêu c u: - Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đ a về dạng l ng bằng cách: + Nghiền mẫu. + Hoà tan mẫu trong n ớc cất vô trùng. Sau thực hiện nh mẫu là dạng l ng. + Tiếp t c pha loãng nồng độ cần thiết. + Cấy mẫu trên môi tr ng đặc tr ng c a nó. - Để có đ ợc ch ng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng nêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi tr ng đều đồng nhất. Mức độ thuần khiết c a ch ng có thể đ ợc kiểm tra nh sau: 37 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn c a ch ng thuần chỉ tạo ra một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi tr ng có hình thái gi ng với khuẩn lạc c a ch ng ban đầu. - Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái gi ng nhau trong quan sát d ới kính hiển vi. Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần l u ý hạn chế thấp nhất nguy cơ bị nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu c a thao tác vô trùng. b. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: - Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một s kỹ thuật ria th ng dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria b n góc , kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên t c - Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn đ ợc thực hiện nh sau: 1. Kỹ thuật hộp ria: - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu gi ng. - Ria các đ ng trên đĩa pêtri chứa môi tr ng thích hợp (ria chữ T và ria b n góc). Sau mỗi đ ng ria, đ t khử trùng đầu que cấy và làm nguội tr ớc khi thực hiện đ ng ria tiếp theo. - Bao gói đĩa pêtri, nhiệt độ và th i gian thích hợp trong t ấm. 2. Kỹ thuật hộp trải: - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa gi ng vi sinh vật lên bề mặt môi tr ng trong đĩa pêtri. - Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng c a ngọn lửa. - M đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch c a đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch gi ng lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch gi ng đều khắp bề mặt môi tr ng. - Rút thanh gạt kh i đĩa, đậy đĩa, gói và hợp trong t ấm. nhiệt độ và th i gian thích 3. Kỹ thuật hộp đổ: - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa gi ng vi sinh vật lên bề mặt môi tr ng trong đĩa pêtri. 38 Thí nghiệm vi sinh vật học - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi tr vào đĩa petri đã cấy mẫu. ThS.Lê Xuân Phương ng đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 550C - Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ng ợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch gi ng đ ợc trộn đều trong môi tr ng cấy. - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên. 2.2. Phân lập các vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa pêtri a. Phân lập vi sinh vật hiếu khí: + Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi tr ng thích hợp. + Dùng que gạt th y tinh phân ph i dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch. + Tiếp t c sử d ng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi đĩa thứ 3. + Đặt các đĩa pêtri 1, 2, 3 trên vào t ấm nhiệt độ thích hợp sau một th i gian nhất định tuỳ gi ng vi sinh vật ta sẽ nhận đ ợc các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3. b. Phân lập vi sinh vật kị khí: + Dùng môi tr ng đặc trong ng nghiệm đem ch ng cách thuỷ để loại b không khí trong môi tr ng. + Để nguội môi tr ng còn 45 - 50 0C. + Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ng môi tr ng, đậy nút lại, lắc tròn quanh tr c ng nghiệm. + Rót nhanh môi tr ng ng nghiệm vào nắp d ới c a đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi tr ng không còn không khí. + Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp c a đĩa petri và nhiệt độ thích hợp. + Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong kh i môi tr ng, dùng que cấy cắt cả kh i môi tr ng rồi cấy vào môi tr ng l ng thích hợp. 2.3. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Có nhiều cách kiểm tra: 1. Kiểm tra vết cấy: Quan sát sự sinh tr ng c a vi sinh vật qua vết cấy trên môi tr ng đặc. + Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng t gi ng mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. 39 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại b . 2. Kiểm tra lại độ thuần ch ng c a các loại khuẩn lạc: + Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi tr ng thạch nghiêng. + Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng nồng độ cần thiết trong n ớc cất vô trùng. + Nh 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi tr ng. + Dùng 1 que gạt phân ph i giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. + Đặt các đĩa pêtri trên vào t ấm với nhiệt độ và th i gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật. + Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết c a khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết c a gi ng. III. 3.1. Th c hành phân l p vi sinh v t t các lo i canh tr ng khác nhau Phân l p vi khu n Bacillus subtilis: - C khô cắt nh , cho vào 1 bình tam giác. - Bổ sung thêm: + Một chút phân + N ớc sạch đổ ngập c . - Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh d ỡng và các tế bào không sinh bào tử. - Đậy nút bông, để t ấm nhiệt độ 25 - 26 0C trong 48 - 72 h. - Kết quả: + Xuất hiện lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus sublitis vì c khô bao gi cũng có bào tử c a vi khuẩn này. + Soi kính hiển vi : Tế bào Bac. sublitis có hình que, dài, bào tử hình ôvan nằm xa tâm hay gắn tâm khuẩn lạc. Tế bào có kích th ớc (3 - 5 x 0,6) µm. 3.2. Phân l p n m m c Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor: - Có thể phân lập các loài nấm m c này trên cơm nguội, xôi làm m c t ơng, bánh mì để khô ít ngày. - Thông qua màu sắc c a m c để nhận diện. + M c có màu trắng: Có thể là Mucor hay Rhizopus. + M c có màu đen là Aspergillus niger. + M c có màu xanh l c là Penicillium italicum. Loại m c này th ng có trên v cam, chanh để lâu ngày 40 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Dùng que cấy đầu hình th ớc thợ lấy một ít sợi nấm cấy vào môi tr ng thạch nghiêng thích hợp (Czapek). 3.3. Phân lập nấm men: - Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi tr ng nh : + Bề mặt trái cây và dịch ép một s trái cây nh táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, ... + Trong r ợu nếp, trong các bánh men r ợu, trong bia, trong n ớc mía, trong hạt kêphia. - Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi th ng có dạng hình cầu hay hình trứng. Tế bào có kích th ớc lớn, có khả năng nảy chồi. Khuẩn lạc cho màu trắng sữa - Chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy vào môi tr ng thích hợp ng khoai tây - đ ng cám hay môi tr ng Sabouraud). 41