- Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương BÀI 2 : CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I. - Khái niệm : Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. - Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. - Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. - Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. - Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. - Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật. - Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. - Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết: Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau. - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu. - Phân lập vi sinh vật thuần khiết. - Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc. - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập a. - Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó. - Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng nêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường đều đồng nhất. - Mức độ thuần khiết của chủng có thể được kiểm tra như sau: 37 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn của chủng thuần chỉ tạo ra một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống với khuẩn lạc của chủng ban đầu. - Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau trong quan sát dưới kính hiển vi. - Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ bị nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác vô trùng. - Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn. - Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. - Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc , kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên tục - Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau: 1. - Kỹ thuật hộp ria. - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống. - Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc). - Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. - Kỹ thuật hộp trải. - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri. - Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. - Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. - Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường. - Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. - Kỹ thuật hộp đổ. - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri. - 38 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. - Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. - Phân lập các vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa pêtri a. - Phân lập vi sinh vật hiếu khí. - Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi trường thích hợp. - Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi đĩa thứ 3. - Đặt các đĩa pêtri 1, 2, 3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nhất định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3. - Phân lập vi sinh vật kị khí. - Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí trong môi trường. - Để nguội môi trường còn 45 - 50 0C. - Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp. - Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. - Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Có nhiều cách kiểm tra: 1. - Kiểm tra vết cấy: Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc. - Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. - 39 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ. - Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc. - Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. - Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. - Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường. - Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. - Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật. - Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. - Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống. - Thực hành phân lập vi sinh vật từ các loại canh trường khác nhau 3.1. - Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis. - Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. - Soi kính hiển vi : Tế bào Bac. - sublitis có hình que, dài, bào tử hình ôvan nằm ở xa tâm hay gắn tâm khuẩn lạc. - Tế bào có kích thước (3 - 5 x 0,6) µm. - Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor. - Có thể phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ít ngày. - Loại mốc này thường có trên vỏ cam, chanh để lâu ngày 40 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy một ít sợi nấm cấy vào môi trường thạch nghiêng thích hợp (Czapek). - Phân lập nấm men. - Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như. - Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi. - Khuẩn lạc cho màu trắng sữa - Chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy vào môi trường thích hợp ng khoai tây - đường cám hay môi trường Sabouraud)