Nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm

- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Trương Quốc Phong.
- Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập được trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa từng được ai công bố trước đây.
- Biomaker và ứng dụng trong chẩn đoán.
- Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán bệnh.
- Các phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào biomaker.
- Kỹ thuật PCR, real-time PCR.
- Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay.
- Kỹ thuật protein array.
- Kỹ thuật tương tác cộng hưởng bề mặt.
- Ứng dụng phƣơng pháp tƣơng tác cộng hƣởng bề mặt trong nghiên cứu nhận diện protein huyết thanh.
- Những hạn chế trong nghiên cứu protein huyết thanh.
- Phương pháp tương tác cộng hưởng bề mặt giải pháp cho phân tích nhận diện protein huyết thanh.
- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Vật liệu nghiên cứu.
- 37 3 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ 2.1.1.
- Đối tượng nghiên cứu.
- Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Phương pháp phân tích mẫu.
- Phương pháp phân tích số liệu.
- Phân tích protein IL-2 trong mẫu huyết thanh.
- Phân tích các nồng độ khác nhau của protein IL-2 trong huyết thanh 52 3.3.2.
- Phân tích tính ổn định của tín hiệu đo protein IL-2 trong huyết thanh 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
- Vị trí đặt mẫu phân tích và dung dịch đệm trên giá đựng mẫu.
- 10 5 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ Hình 1.2.
- BNP trong hướng dẫn chẩn đoán khó thở cấp và suy tim [5.
- Động học của liên kết phân tích.
- Quá trình phân tích protein IL-2.
- Phân tích các hằng số động học tương tác giữa IL-2 với ligand.
- Phân tích các hằng số động học tương tác giữa IL-2 với ligand với các mẫu huyết thanh có độ pha loãng khác nhau.
- Phân tích tính ổn định của tín hiệu tương tác giữa các lần đo.
- 59 6 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Hiện nay, số lượng bệnh nhân bị ung thư đang gia tăng nhanh chóng.
- Do đó chẩn đoán ung thư sớm là một việc rất quan trọng để hạn chế những ca tử vong do ung thư.
- Để chẩn đoán ung thư, có thể lấy các mẫu như sinh thiết, gen, máu hoặc nước tiểu.
- Mẫu máu được xem là mẫu phân tích tiềm năng để phát hiện các chỉ thị sinh học nói chung và các chỉ thị ung thư nói riêng.
- Có rất nhiều kỹ thuật có thể được dùng để phân tích mẫu máu đã và đang được ứng dụng như kỹ thuật PCR, real-time PCR, ELISA, kỹ thuật protein array.
- Đây là các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào các biomaker.
- Trong đó kỹ thuật protein array là kỹ thuật mới có độ nhạy cao và cho phép phân tích nhiều mẫu cùng lúc, tuy nhiên cần phải đánh dấu mẫu bằng phóng xạ, các chất phát quang…có thể làm biến đổi cấu trúc của mẫu cần phân tích.
- Để khắc phục nhược điểm này, kỹ thuật phân tích mẫu bằng tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) không cần đánh dấu đang được nghiên cứu phát triển.
- Tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) không chỉ đưa ra kết quả định tính định lượng của các phân tử cần phân tích mà còn cung cấp các thông số động học 7 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ của quá trình tương tác.
- Một số nghiên cứu cho thấy tiềm năng của kỹ thuật tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) trong chẩn đoán ung thư sớm.
- Kỹ thuật này đang thu hút sự quan tam của nhiều nhà khoa học trên thế giới.
- Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này còn rất mới mẻ.
- Việc nghiên cứu và phát triển kỹ thuật này trong nghiên cứu proteomic nói chung và trong chẩn đoán sớm ung thư nói riêng sẽ mang lại nhiều lợi ích.
- Chính vì vậy, tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm”.
- Trong giới hạn của luận văn cao học, tôi xin trình bày những khảo sát ban đầu của nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm.
- Nội dung chính của luận văn.
- Phân tích IL-2 trong mẫu huyết thanh + Phân tích các nồng độ khác nhau của protein IL-2 trong huyết thanh.
- Phân tích tính ổn định của tín hiệu đo protein IL-2 trong huyết thanh 8 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG I.
- Biomaker và ứng dụng trong chẩn đoán 1.1.1.
- Với phát triển của những kỹ thuật sinh học hiện đại có khả năng nghiên cứu nhiều phân tử trên cùng một mẫu phẩm như microarray, proteonomics, ngày nay biomarker có thể là một nhóm gene hay protein liên quan đến một trạng thái bệnh lý nào đó [6].
- Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán bệnh Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu dụng của biomarker trong các lĩnh vực sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng.
- Các nhà nghiên cứu biomarker tin tưởng rằng chỉ điểm sinh học chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm biomarker sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học.
- Những ứng dụng này gồm các phương pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh.
- Chúng ta thường biết đến nhiều khám phá của gene và bệnh lý, nhưng trên thực tế việc ứng dụng của các gene này cho chẩn đoán cũng như trị liệu rất ít ỏi và giới hạn.Ngoại trừ một số bệnh do di truyền gây ra mà gen đóng một vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán, phần lớn các bệnh mãn tính như đái đường, ung thư, bệnh tim, tai biến, loãng xương, v.v… thì gen không đóng một vai trò quan trọng như nhiều người tưởng.
- Do đó, việc chẩn đoán bằng gen cho các bệnh này chưa thể đem lại lợi ích cho người bệnh.
- Vì những lý do trên, biomarker đã là một trong những nghiên cứu trọng yếu của sinh học hiện đại trong những năm qua, và đã có những kết quả cho thấy tầm quan trọng của biomarker trong việc mang lại ứng dụng của gene cho chẩn đoán bệnh lý cũng như rất nhiều khía cạnh y học, khoa học khác.
- Trong giới hạn của luận văn, tôi sẽ trình bày ứng dụng của chỉ thị sinh học (biomaker) trong chẩn đoán ung thư và bệnh tim mạch [6].
- Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán ung thƣ Để chẩn đoán bệnh ung thư, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết và phương pháp hóa sinh, hoặc kết hợp các phương pháp này.
- Phương pháp hóa sinh “enzym-miễn dịch” áp dụng các thành tựu nghiên cứu 10 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ trong ung thư học về các chỉ thị ung thư (tumor marker) để chẩn đoán sớm căn bệnh.
- Phương pháp này phát hiện chính xác các chỉ thị marker, thông qua mẫu máu hoặc nước tiểu [7].
- Trong số các chỉ thị ung thư, alpha-fetoprotein (AFP) chính là marker được sử dụng để hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư tế bào gan.
- Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán tim mạch Nhiều chỉ thị sinh học đã được nghiên cứu trong hội chứng mạch vành cấp.
- Các nghiên cứu nhằm tìm ra chỉ thị sinh học lý tưởng với độ nhạy và đặc 11 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ hiệu 100% vẫn còn tiếp tục.
- Dưới đây là một số chỉ thị sinh học được dùng trong cấp cứu: Peptide lợi niệu type B (BNP) [20]: Peptide lợi niệu type B (BNP) được tiết ra chủ yếu từ cơ tâm thất để đáp ứng với sức căng thành thất như quá tải thể tích và quá tải áp lực của tâm thất.Nhiều nghiên cứu cho thấy BNP là một chỉ số có ích cho tiên lượng trong hội chứng vành cấp.
- Nhóm nghiên cứu TIMI đã thực hiện vài nghiên cứu cho thấy nồng độ BNP giúp tiên đoán tử vong tim mạch và các biến cố tim mạch nặng khác của hội chứng mạch vành cấp.
- Hiện tại, BNP còn được dùng để hướng dẫn chẩn đoán suy tim (hình 1.2).
- BNP trong hướng dẫn chẩn đoán khó thở cấp và suy tim [5] C-reactive protein (CRP) [20]: 12 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ CRP là một chỉ thị viêm không đặc hiệu, được xem là có liên quan trực tiếp đến mảng xơ vữa động mạch vành.
- Nhiều nghiên cứu bắt đầu từ đầu những năm 1990 cho thấy CRP gia tăng giúp tiên đoán độc lập các biến cố tim mạch nặng tiên phát và thứ phát.
- Cùng với TnI và BNP, CRP là một chỉ thị có ích nhưng do không đặc hiệu nên làm hạn chế việc sử dụng CRP như là một chỉ thị trong hội chứng mạch vành cấp.
- Các nghiên cứu cho thấy nồng độ MPO tăng đáng kể ở bệnh nhân đã được xác định có bệnh mạch vành qua chụp mạch máu.
- Điều này làm cho các nhà khoa học tin rằng MPO là một chỉ thị lý tưởng .
- MPO có thể là một chỉ thị tim sớm và có ích trong cấp cứu vì nó phản ánh tình trạng không ổn định của mảng xơ vữa, nguyên nhân của hội chứng mạch vành cấp.
- Nhiều nghiên cứu nữa về MPO để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và âm thì cần thiết trước khi được áp dụng trên lâm sàng [20].
- 13 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ Albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ (Ischemia modified albumin: IMA) [20]: Các chỉ thị hiện có như troponin và CK-MB thì nhạy với hoại tử cơ tim.
- Đó là chỉ thị của các tế bào cơ tim bị chết trong nhồi máu cơ tim cấp.
- Vì vậy, một chỉ thị nhạy cho thiếu máu cục bộ cơ tim là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu.
- Các nghiên cứu sử dụng IMA ở bệnh nhân đau ngực trong phòng cấp cứu có độ nhạy là 71-98% và độ đặc hiệu là 45-65% với giá trị tiên đoán âm cho hội chứng mạch vành cấp là 90-97%.
- Sinha và cộng sự cho rằng, tiếp cận dựa trên nhiều chỉ thị như điện tim, TnT và IMA có độ nhạy là 95% trong hội chứng mạch vành cấp [29].
- Nhiều nghiên cứu tiếp theo thì cần thiết để đánh giá ích lợi của IMA trong chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp khi ECG và các troponin tim không giúp ích cho chẩn đoán.
- 14 Trần Thanh Hoài Luận văn thạc sĩ Có nhiều chỉ thị khác nhau như AST, CK, LDH, CK-MB, Myoglobin, IMA.
- Tùy theo bệnh cảnh lâm sàng, các thầy thuốc sẽ chọn lựa chỉ thị thích hợp [20].
- Các chỉ thị tim được xem như là nền tảng trong chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp.
- Chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp thường khó và chủ yếu dựa vào bệnh sử, thăm khám lâm sàng và động học của các chỉ thị.
- Các chỉ thị tim không giúp ích để loại trừ bệnh nhất là trong những giờ đầu sau khi khởi phát triệu chứng.
- Tuy nhiên, các chỉ thị có giá trị tiên đoán dương cao nên các thầy thuốc không nên "xem nhẹ" các kết quả dương tính, nhất là khi trên lâm sàng nghi ngờ có hội chứng mạch vành cấp [5].
- Các phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào biomaker Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp chẩn đoán dựa vào biomarker đã và đang phát triển.
- Trong giới hạn của luận văn, tôi xin trình bày một số kỹ thuật truyền thống đã được sử dụng và những kỹ thuật mới đang được phát triển trên thế giới 1.2.1.
- Kỹ thuật PCR, real-time PCR Kỹ thuật PCR cho phép thu nhận thông tin về trình tự gen rất nhanh bằng cách khuếch đại đoạn gen chứa điểm đột biến và sau đó phân tích trực tiếp các sản phẩm PCR thu được.
- Khả năng nhận dạng nhanh các đột biến không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng, mà còn đẩy nhanh việc nghiên cứu các bệnh di truyền.
- Độ nhạy cao của kỹ thuật PCR cho phép ứng dụng dễ dàng trong các chẩn đoán bệnh nhiễm trùng.
- Ví dụ: việc khuếch đại một số lượng lớn DNA virus trong các mẫu bệnh cho khả năng chẩn đoán bệnh sớm hơn trước khi triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện.
- Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng.
- Như vậy, có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.
- Chính đặc trưng này mà người làm thí nghiệm có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phẩn ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.Kỹ thuật real-time PCR cho kết quả nhanh và chính xác hơn kỹ thuật PCR truyền thống.Tuy nhiên, kỹ thuật này bị giới hạn bởi số lượng chất đánh dấu đặc hiệu.
- Việc tách chiết này đối với các tác nhân gây bệnh nhiều khi gặp khó khan về hàm lượng ít, do đó kết quả phân tích nhiều khi không chính xác [8].
- Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kế hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
- Phương pháp này cho phép phát hiện, định lượng trực tiếp peptides, protein, kháng thể, hoocmon…có mặt trong mẫu phân tích.
- Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ thấp (khoảng 0,1ng/ml).
- Kỹ thuật protein array Protein array là một trong những công cụ dùng để nghiên cứu tương tác giữa protein-protein, protein với các phân tử khác như DNA, RNA...để phát hiện protein đích và dự đoán chức năng của protein nghiên cứu.
- Trong kỹ thuật protein array, phiến kính thuỷ tinh là khuôn, trên đó gắn hàng ngàn mẫu dò protein.Sau đó cho mẫu sinh học đi qua chip và đánh giá hiệu quả gắn

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt