- NGÔ THỊ DUY NGỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME ALGINATE LYASE TỪ GAN TỤY ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. - BÙI MINH LÝ Tên luận văn: Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính của enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - 3 1.1 SƠ LƢỢC VỀ ALGINATE LYASE. - 3 1.1.1 Khái niệm về polysaccharide lyase và alginate lyase. - 3 1.1.2 Các nguồn thu nhận alginate lyase. - 4 1.1.3 Cấu trúc của alginate lyase. - 6 1.1.4 Cơ chế xúc tác của alginate lyase. - 10 1.1.5 Các đặc tính căn bản của alginate lyase. - 13 1.1.6 Chức năng sinh học của alginate lyase. - 16 1.1.7 Ứng dụng của alginate lyase. - 20 1.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN ALGINATE LYASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM. - 26 2.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp kết tủa. - 26 2.2.2.3 Giai đoạn 3: Tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp lọc gel. - 27 2.2.2.4 Giai đoạn 4: Xác định một số đặc tính của chế phẩm alginate lyase. - 29 2.2.3.1 Xác định hoạt độ enzyme alginate lyase. - 35 3.1 TRÍCH LY ENZYME ALGINATE LYASE TỪ GAN TỤY ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA. - 35 3.1.1 Xác định tỷ lệ khối lƣợng gan tụy/ dung môi (w/v) cho quá trình trích ly enzyme alginate lyase. - 39 3.2 KHẢO SÁT TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA. - 40 3.2.1 Tinh sạch enzyme alginate lyase trong dịch chiết từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra bằng dung môi hữu cơ (ethanol và acetone. - 40 3.2.1.1 Kết tủa alginate lyase bằng ethanol. - 40 3.2.1.2 Kết tủa alginate lyase bằng acetone. - 44 v 3.3 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL. - 50 3.5 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ALGINATE LYASE. - Sự phân cắt alginate bởi (A) endo alginate lyase (B) exo alginate lyase . - Ốc bàn tay Lambis chiragra. - Sơ đồ nghiên cứu. - Ảnh hƣởng của tỷ lệ gan tụy/dung môi đến quá trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Ảnh hƣởng của pH dung môi đến quá trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến quá trình trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng ethanol. - Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng acetone. - Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng ammonium sulphate. - So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase sau tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa các tác nhân khác nhau. - Sắc ký đồ kết quả tinh sạch alginate lyase với Sephadex G-75 của chế phẩm tủa ethanol. - 46 Hình 3.10. - Sắc ký đồ kết quả tinh sạch alginate lyase với Sephadex G-75 của chế phẩm tủa ammonium sulphate. - 48 Hình 3.11. - So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. - 50 Hình 3.12. - Kết quả điện di enzyme alginate lyase. - 51 Hình 3.13. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - 52 Hình 3.14. - Ảnh hƣởng của pH phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. - Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra theo thời gian tại các pH khác nhau. - Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase có khối lƣợng phân tử 40 kDa. - Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase có khối lƣợng phân tử 30 kDa. - Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase qua các giai đoạn tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa ethanol kết hợp với sắc ký lọc gel. - Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase qua các giai đoạn tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký lọc gel. - Kết quả trích ly alginate lyase với các yếu tố trích ly khác nhau. - Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng ethanol. - Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng acetone. - Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng ammonium sulphate. - Tổng kết quá trình tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp tủa. - Giá trị OD 280nm và hoạt độ alginate lyase của các phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme đã qua kết tủa bằng ethanol Venzyme:Vethanol=20:80. - Giá trị OD 280nm và hoạt độ alginate lyase của các phân đoạn sau lọc gel (mẫu enzyme đã qua kết tủa bằng (NH4)2SO4 70% độ bão hòa. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase. - Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. - Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian tại các pH khác nhau. - Trong nhiều năm gần đây, các oligosaccharide đƣợc tạo ra do quá trình phân cắt alginate bởi enzyme alginate lyase đã thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau nhƣ kích thích sự tăng trƣởng rễ ở thực vật bậc cao, tăng tỉ lệ phát triển của Bifidobacterium sp., kích thích sự phân chia tế bào, có hoạt tính kháng u, kháng khuẩn. - Vì vậy việc sử dụng alginate lyase để tận dụng nguồn alginate khổng lồ này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. - Việc nghiên cứu alginate lyase không chỉ mở rộng việc điều chế và sử dụng các oligosaccharide alginate mà còn là công cụ để xác định cấu trúc alginate cũng nhƣ tƣơng quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide này. - Bên cạnh đó, alginate lyase là một enzyme quan trọng trong việc tiêu hóa alginate để cung cấp carbon và năng lƣợng cho các động vật thân mềm biển ăn rong. - Vì vậy, alginate lyase đƣợc xem nhƣ là một nhân tố chìa khóa để giúp hiểu rõ cơ chế tiêu hóa của các loài động vật thân mềm biển. - Alginate lyase có thể thu nhận từ rong biển, động vật thân mềm biển (tuyến tiêu hóa của các loài) và vi sinh vật. - So với alginate lyase từ các nguồn khác, việc thu nhận enzyme từ động vật thân mềm còn ít đƣợc đề cập, một số công trình nghiên cứu trên thế giới chỉ tập trung chủ yếu vào một số loài nhƣ bào ngƣ (Haliotis rufescens, H. - Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính của enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra”. - Hiện nay chƣa có đề tài trong nƣớc nghiên cứu về alginate lyase từ động vật thân mềm biển. - Mục tiêu nghiên cứu - Xác định điều kiện tối ƣu để tách chiết, tinh sạch alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra - Xác định một số các tính chất của chế phẩm alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra. - 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƢỢC VỀ ALGINATE LYASE 1.1.1 Khái niệm về polysaccharide lyase và alginate lyase Polysaccharide lyase Polysaccharide lyase (PL) hay eliminase (EC 4.2.2-) là một nhóm enzyme phân cắt các liên kết glycoside trong các phân tử polysaccharide chứa acid uronic, thông qua cơ chế khử β tạo ra các oligosaccharide không bão hòa [27]. - Alginate lyase Alginate lyase hay alginase hoặc alginate depolymerase là một loại enzyme thuộc nhóm enzyme PL, đƣợc xếp vào 7 họ của PL là PL và -18 dựa trên cấu trúc bậc một (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY. - Alginate lyase phân cắt các liên kết glycoside ở trong phân tử alginate bằng cơ chế khử β, tạo ra các oligosaccharide không bão hòa chứa một nối đôi giữa cacbon thứ 4 và carbon thứ 5 ở đầu không khử. - Enzyme alginate lyase đƣợc phân loại dựa vào việc phân cắt đặc hiệu với cơ chất alginate giàu mannuronate (M) hay giàu guluronate (G), nhƣ poly (M) lyase [(1,4)-β-D-mannuronate lyase] (EC 4.2.2.3) hoặc là poly(G) lyase [(1,4)-α-L-guluronate lyase] (EC . - Alginate lyase đƣợc tìm thấy cả ở sinh vật tổng hợp đƣợc alginate và ở sinh vật không tổng hợp alginate. - Ở những sinh vật không tự tổng hợp đƣợc alginate, alginate lyase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa alginate nhƣ nguồn 4 cacbon. - Còn ở vi sinh vật tổng hợp alginate, alginate lyase đóng vai trò nhất định trong cả quá trình tổng hợp và phân giải alginate [20]. - 1.1.2 Các nguồn thu nhận alginate lyase Alginate lyase từ rong biển Ở rong biển, năm 1973 tác giả Madgwich và cs đã phát hiện trong dịch chiết của rong Laminaria digitata có chứa enzyme alginate lyase [30]. - Tiếp đó năm 1978 tác giả cũng đã tìm ra alginate lyase có trong rong Pelvetia canaliculata [31]. - Một nghiên cứu về alginate lyase ở rong Undaria pinnatifida đã đƣợc công bố bởi hai tác giả Watanabe và Nisizawa vào năm 1982 [54]. - Tác giả Shiraiwa và cs [48] đã công bố về hoạt tính enzyme alginate lyase ở các loài rong khác nhau. - Alginate lyase từ rong biển đóng một vai trò trong quá trình chuyển hóa alginate ở vách tế bào rong. - Mặc dù các công bố về alginate lyase từ rong biển còn khá ít nhƣng các dẫn chứng khoa học ở trên đã chứng tỏ rằng trong một vài loài rong biển có chứa alginate lyase với mức độ khác nhau. - Alginate lyase từ động vật thân mềm biển Alginate lyase có nguồn gốc từ động vật thân mềm biển cũng đƣợc phát hiện ở khá nhiều loài. - 5 Alginate lyase trong giới động vật thân mềm biển đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1968 từ gan tụy của hai loài bào ngƣ Haliotis rufescens và H. - Một số loài bào ngƣ khác cũng đã đƣợc nhiều tác giả công bố có chứa alginate lyase trong dịch tiêu hóa nhƣ là H. - Bên cạnh bào ngƣ, ốc thỏ biển là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase khá phong phú nhƣ loài Dolabella auricular [37], Aplysia depilans [5], A. - [7], Omphalius rusticus [14] và Littorina brevicula [14] cũng đƣợc nghiên cứu là có chứa alginate lyase. - Ngoài ra ở lớp hai mảnh vỏ, hoạt tính enzyme alginate lyase còn đƣợc phát hiện có trong sợi thủy tinh thể của các loài Choromytilus meridionalis, Perna perna, và Spisula solidissima [46. - Alginate lyase từ vi sinh vật Vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và nấm cũng đƣợc công bố có chứa alginate lyase nhƣ là Agarivorans sp. - Vi sinh vật biển và vi sinh vật đất có chứa nhiều hơn một loại alginate lyase cho việc phân giải các alginate có cấu trúc phức tạp. - Việc xác định sự phân bố của alginate lyase trong sinh giới vẫn đang tiếp diễn. - Đến nay đã có hơn 50 enzyme alginate lyase đặc hiệu với các cơ chất đa dạng đã đƣợc tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau. - 6 1.1.3 Cấu trúc của alginate lyase Cấu trúc bậc nhất Khi nghiên cứu trình tự amino acid trong phân tử enzyme các nhà khoa học nhận thấy : thứ tự các amino acid trong chuỗi có vai trò quan trọng vì là cơ sở cho việc hình thành cấu trúc không gian của enzyme và từ đó qui định đặc tính của enzyme. - Đối với enzyme AlgL từ chủng Pseudomonas aeruginosa khi tiến hành so sánh sự tƣơng đồng bắt cặp trình tự bậc nhất cho thấy mức độ tƣơng đồng và mức độ quan hệ họ hàng so với các enzyme alginate lyase khác là 65% và 78% đối với enzyme từ chủng Halomonas marina, 65% và 78% đối với enzyme từ chủng Azotobacter vinelandii, 65% và 77% cho enzyme từ chủng P. - Đặc biệt đáng chú ý là trình tự gồm 6 amino acid “NNHSYW” đƣợc bảo thủ ở trung tâm của chuỗi protein ở các alginate lyase từ 6 chủng vi khuẩn (Bảng 1.1) [55]. - Trình tự amino acid bảo thủ của một số chủng vi khuẩn Loài Alginate lyase Trình tự bảo thủ Chiều dài chuỗi protein A.chroococcum AcAlgL -195I N N H S Y W A 202- 372 aa A.vinelandii AvAlgL -196I N N H S Y W A 203- 374 aa P.aeruginosa PaAlgL -199I N N H S Y W A 206- 367 aa P.syringae PsAlgL -201I N N H S Y W A 208- 379 aa H.marina HmAL -201T N N H S Y W A 208- 375 aa Sphingomonas sp. - ALY1-III -189C N N H S Y W R 196- 364 aa Vùng bảo thủ -N N H S Y W- Một vùng khác gồm 9 amino acid “WLEPYCALY” ở đầu C đƣợc bảo thủ tốt ở các alginate lyase từ chủng P
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt