Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus SPP.) và đa dạng di truyền của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam trung bộ Việt Nam

- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GIỮA CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI ỐC CỐI CONUS TEXTILE Ở VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ - VIỆT NAM.
- Đặng Thúy Bình (Viện phó – Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trƣờng, Trƣờng ĐH Nha Trang), TS.
- Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trƣờng – ĐH Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn.
- Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2012 Học viên Lê Thị Thu Hà iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự chỉ bảo của thầy cô hƣớng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Sinh học phân tử - Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trƣờng - ĐH Nha Trang.
- Mục đích nghiên cứu của đề tài .
- TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG .
- ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP .
- Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp .
- Đặc điểm hình thái của ốc cối Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp .
- Đặc điểm sinh sản của ốc cối .
- CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP .
- Ứng dụng y học của độc tố ốc cối .
- CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.
- CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN.
- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI.
- Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của ốc cối.
- Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa.
- Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dƣỡng ở ốc cối (Conus spp.
- Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam.
- Nghiên cứu di truyền độc tố.
- Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm.
- 24 CHƢƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- ĐỐI TƢỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.
- PHƢƠNG PHÁP THU MẪU ỐC CỐI.
- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- 30 2.2.1 Phân tích đa dạng loài ốc cối.
- So sánh trình tự các loài ốc cối.
- Phân tích đa dạng loài ốc cối Conus textile dựa trên hapotype.
- 34 Hình 3.3: Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A) và CO1 mt DNA (B) của một số mẫu ốc cối.
- Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên các chỉ thị phân tử CO1 và 16S mtDNA.
- ĐA DẠNG DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS TEXTILE.
- 49 3.4.1 Đa dạng di truyền Conus textile.
- Di tuyền quần thể của ốc cối (Conus textile) tại vùng biển Nam Trung Bộ.
- Đa dạng haplotype.
- Di truyền quần thể của ốc cối Conus textile tại vùng ven biển Nam Trung Bộ.
- 67 So sánh trình tự DNA của một số loài ốc cối có đặc điểm hình thái ngoài giống nhau.
- 67 vii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều đoạn nhân bản) ATP Adenosine triphosphate BI Bayesain inference bp Base pair (cặp bazơ) BT Giá trị bootstrap cDNA Complementary DNA CLC Cù Lao Chàm CO1 Oxidase cytochrom c subunit 1 cs Cộng sự D-loop Displacement loop DNA Deoxyribonucleic acid dNPT Deoxynucleotide triphosphate ĐVTM Động vật thân mềm EST Expressed sequence tags ITS Internal Transcribed Space kb Kilo base LS Lý Sơn ML Maximum likelihood MP Parsimony mt DNA Mitochondrial DNA (DNA ti thể) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa hình của mồi) PP Posterior probability (độ tin cậy) RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn DNA đƣợc khuyếch đại ngẫu nhiên) rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) SC Sông Cầu SNP Single Nucleotide Polymorphism (đa hình nucleotide đơn) SSR Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản TBE Tris-Boric acid-EDTA VP Vân Phong ESTs Expressed sequence tags NMDA N-methyl-D-aspartate viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm peptide độc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các nhóm ốc cối khác nhau Bảng 1.2 Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể Bảng 2.1 Trình từ các đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bảng 2.3 Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng loài ốc cối Bảng 2.4 Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần thể Conus textile Bảng 3.1 Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối Bảng 3.2 Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phƣơng pháp MP, ML và BI.
- Bảng 3.3 Giá trị tƣơng đồng của các haplotype trình tự gen CO1 mtDNA của Conus textile Bảng 3.4 Mã số các đoạn gen 16S và CO1 của các mẫu ốc cối đƣợc đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế Genbank DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) Hình 1.2 Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) Hình 1.3 Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile Hình 1.4 Cấu trúc trình tự DNA ribosome Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự Hình 3.1 Vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA ốc cối Hình 3.2 Ảnh kết quả điện di DNA tổng số Hình 3.3 Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A) và CO1 mt DNA (B) của một số mẫu ốc cối Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của ốc cối Hình 3.5 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối Hình 3.6 Cây phát sinh loài theo phƣơng pháp BI dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối Hình 3.7 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối Conus textile 1 MỞ ĐẦU Đa dạng sinh học là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con ngƣời, là nguồn tài nguyên lớn của mỗi quốc gia.
- Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt chủng đã đƣợc liệt kê trong danh mục những loài cần đƣợc bảo tồn [97].
- Ốc cối là loại động vật thân mềm, có nọc độc, sống chủ yếu sống ở các vùng biển nhiệt đới trong những rạn san hô.
- Vỏ ốc cối đƣợc khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ, đồ lƣu niệm đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng.
- Ở Việt Nam có hơn 76 loài ốc cối [45] và khoảng 500 - 700 loài đƣợc ghi nhận trên toàn thế giới [67,22].
- Ốc cối thƣờng đƣợc khai thác để làm hàng mỹ nghệ và còn là nguồn thực phẩm cao cấp ở một số quốc gia nhƣ Vanuatu, New Caledonia, Philippines.
- Gần đây, ốc cối còn đƣợc biết đến nhƣ là một loại dƣợc liệu quí để chữa các cơn đau mãn tính, ung thƣ và nhiều bệnh khác [71,88,79].
- Chính điều này sẽ làm tăng mối đe dọa cho các loài ốc cối nếu con ngƣời tiếp tục khai thác quá mức mà không có biện pháp bảo vệ.
- Những nghiên cứu về ốc cối ở Việt Nam phần lớn vẫn đƣợc thực hiện ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và tƣ liệu liên quan [45], phân loại, mô tả đặc điểm hình 2 thái [68].
- xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố [94].
- Từ năm Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trƣờng, Đại học Nha Trang đã tiến hành khảo sát, phân loại, mô tả đặc điểm hình thái, xây dựng môi quan hệ tiến hóa và bƣớc đầu khảo sát độc tính của các loài ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung bộ [3].
- Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền, mối quan hệ tiến hóa vẫn còn rât hạn chế.
- Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus spp.) và đa dạng di truyền của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam Trung Bộ - Việt Nam”.
- Mục đích nghiên cứu của đề tài Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus spp.) và nghiên cứu đa dạng di truyền, cấu trúc quần thể của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam Trung Bộ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
- Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài  Ý nghĩa khoa học của đề tài Ốc cối (Conus spp.) bao gồm khoảng 700 loài, phân bố rộng rãi ở vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm [67].
- Điều đó tạo điều kiện thuận lợi cho biến dị loài và sự hình thành loài mới [17] Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thuớc vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đƣờng gờ hay phần lồi trên vỏ.
- 3  Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Xây dựng cây phát sinh chủng loại của 26 loài ốc cối tìm thấy ở ven biển Nam Trung Bộ - Việt Nam.
- Nắm đƣợc các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng các loài ốc cối (Conus spp.) và di truyền quần thể của loài Conus textile ở vùng biển Nam Trung Bộ - Việt Nam dựa trên đặc điểm di truyền gen 16S và CO1 của DNA ti thể.
- Những dẫn liệu về nguồn lợi, đa dạng sinh học, cấu trúc quần thể và đa dạng di truyền sẽ là những cơ sở khoa học và nguồn số liệu đầu vào cho việc tƣ vấn, đề xuất các vấn đề về quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam.
- TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 1.1.
- ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) Giống ốc cối thuộc họ Conidae là một trong những giống có số lƣợng loài lớn nhất trong ngành động vật thân mềm.
- Ốc cối là loại động vật ăn thịt, săn mồi sống và có nọc độc.
- Do vậy chúng đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu động vật thân mềm từ hàng trăm năm nay.
- Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.) Hệ thống phân loại của ốc cối đang đƣợc dùng phổ biến nhất hiện nay là [95]: Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758) Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795) Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997) Tổng họ: Conoidea (Fleming, 1822) Họ: Conidae (Rafinesque, 1815) Giống: Conus (Linnaeus .
- Đặc điểm sinh thái và phân bố Ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thƣờng phân bố ở vùng vĩ độ giữa 400 Bắc và 400 Nam, một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 nhƣ ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải.
- Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một 5 số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trƣờng nhƣ ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ.
- Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo.
- Đặc điểm hình thái của ốc cối  Đặc điểm hình thái ngoài Ốc cối có hình dạng nhƣ trái tim với các kích cỡ khác nhau, loài có kích cỡ lớn nhất có chiều cao vỏ đến 23cm [80].
- Các loài ốc cối thƣờng có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn rất đẹp mắt.
- Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống, chúng thƣờng đi săn mồi và ăn các loại giun, ĐVTM, cá nhỏ và thậm trí cả một số loài ốc cối khác.
- Để phân loại ốc cối ngƣời ta thƣờng dựa vào màu sắc hoa văn trên vỏ, các dạng khác nhau của vỏ và các chỉ tiêu phân loại về hình thái đƣợc mô tả ở hình 1.1.
- 6 Hình 1.1: Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) [92] Bên cạnh đó việc đo đạc các thông số hình thái nhƣ chiều cao tháp vỏ, chiều cao vỏ, chiều cao tầng thân và chiều rộng cũng góp phần quan trọng trong việc định danh các loài ốc cối.
- Vỏ của ốc cối thƣờng có 3 dạng hình thái khác nhau: Hình nón, hình nón rộng và hình nón hẹp (Hình 1.2).
- Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.
- Đặc điểm cấu tạo trong Vòi hút (Proboscis): là vũ khí săn mồi của ốc cối.
- Độc tố đƣợc tiêm vào con mồi bằng các răng chứa trong túi răng kitin.
- Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2 lần cơ thể ốc cối.
- Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng nhƣ mũi.
- Chân: Chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt.
- Miệng: Ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trƣớc để nuốt con mồi.
- Mắt: Ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng.
- Hiện tại vẫn chƣa biết đƣợc về khả năng nhìn của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu chúng có đủ ánh sáng khi sống ở các vùng biển sâu hay không.
- Chế độ ăn và phƣơng thức săn mồi Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), có tính chuyên hóa cao, với thức ăn chủ yếu là các loài giun biển (70.
- và ngay cả các loài ốc cối khác [71,88].
- Răng kitin của ốc cối hõm sâu và có gai, giống nhƣ những cây lao thu nhỏ.
- Ốc cối chỉ sử dụng răng kitin một lần, một khi răng kitin đƣợc sử dụng để tiêm nọc độc vào con mồi, nó sẽ đƣợc loại bỏ và ốc cối phải tái tạo lại răng mới.
- Khi ốc cối nhận ra đối tƣợng, vòi của chúng sẽ kéo dài ra, nhờ một lực co cơ những mũi tên từ ống vòi đƣợc phóng rất nhanh kèm theo một lƣợng lớn độc tố đƣợc phóng thích và làm tê liệt nhanh chóng con mồi.
- Độc tố ốc cối chứa đựng hàng trăm các hợp chất khác nhau và thể hiện sự khác biệt giữa các loài khác nhau.
- Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, độc tố ốc cối cũng thay đổi tùy theo khẩu phần ăn, tùy theo mùa, và tùy theo từng vùng địa lí khác nhau [91].
- Đặc điểm sinh sản của ốc cối Sinh sản của ốc cối vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi, nhƣng hầu hết các loài này đều có sự phân chia giới tính và thụ tinh trong.
- Ấu trùng và con non của ốc cối thƣờng có hai hình thức chính: Dạng ấu trùng Veliger (ấu trùng bơi lội tự do), và dạng con non Juvenile (có hình dáng gần giống cá thể trƣởng thành).
- Do đó, trong quá trình ƣơng nuôi ốc cối thƣờng gặp nhiều khó khăn.
- Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10 – 15 năm trong tự nhiên, cũng nhƣ trong điều kiện nuôi nhốt.
- CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) 1.2.1.
- Giới thiệu chung Đặc tính của ốc là loài di chuyển chậm nên dễ bị các loài động vật ăn thịt khác tấn công.
- Ốc cối săn mồi bằng một hệ thống nọc độc phát triển cao có thể làm tê liệt con mồi trong vài giây, nhờ vậy đảm bảo sự bắt mồi và tránh để mồi lộ ra lâu có thể bị các con cá lớn hơn giành mất.
- Mỗi loài ốc cối sản sinh ra một loại độc tố riêng, đó là một hỗn hợp của các peptide ngắn, có liên kết disunfua, có khả năng làm bất động con mồi nhanh.
- Độc tố đó tùy thuộc vào loài ốc săn mồi là cá (piscivorus species), ĐVTM (molluscivorus species) hay giun biển (vermivorus species) [56].
- Độc tố không chỉ là một vũ khí để săn mồi mà còn đƣợc sử dụng để tự bảo vệ, canh tranh và cho những hoạt động sinh học khác, vì vậy sự phân hóa của độc tố ốc cối là điểu tất nhiên.
- Mạng lƣới phức tạp của các tƣơng tác sinh học trong khu hệ sinh học biển đa dạng nhƣ vậy tạo cơ hội cho mỗi loài ốc cối tích lũy thành phần độc tố đặc trƣng, khác biệt với các loài khác trong quá trình tiến hóa của chúng [71].
- Ứng dụng y học của độc tố ốc cối Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dƣợc và sinh học tế bào.
- Trong khi nghiên cứu chất độc có thể gây chết ngƣời của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này có tác dụng giảm đau.
- Các ứng dụng độc tố ốc cối trong sinh học thần kinh và bào chế thuốc đang gia tăng nhanh chóng, nhƣ sản xuất thuốc hỗ trợ trong gây mê, thuốc giảm đau,

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt