Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản

- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN QUANG HUY NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN Chuyên ngành: Công nghệ vật liệu điện tử Mã số TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2012 Công trình được hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: 1.
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN QUANG HUY NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN BỘ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN Chuyên ngành: Công nghệ vật liệu điện tử Mã số TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2012 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt 1 Ab Antibody Kháng thể 2 AFM Atomic force microscopy Hiển vi lực nguyên tử 3 Ag Antigen Kháng nguyên 4 APTES 3-aminopropyl–triethoxy-silance (Chất để silan hóa) 5 Au Gold Vàng 6 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò 7 FITC Fluorescein isothiocyanate (Chất phát huỳnh quang) 8 FM Fluorescence microscopy Hiển vi huỳnh quang 9 FTIR Fourier transform infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier 10 GA Glutaraldehyde (Tên một loại hóa chất) 11 HIgG Human immunoglobulin G Phân tử miễn dịch G ở người 12 HRP Horseradish peroxidase Peroxidaza củ cải ngựa 13 IgG Immunoglobulin G Phân tử miễn dịch G 14 MeOH Methanol Mêtanol 15 SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét 16 PrA Protein A Protein A 17 TEM Transmission electron microscopy Hiển vi điện tử truyền qua 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây thường xuyên xảy ra các vụ dịch bệnh nguy hiểm như: viêm đường hô hấp cấp tính (SARS), cúm A/H5N1, cúm A/H1N1, HIV, sốt xuất huyết Dengue, viêm não Nhật Bản, tiêu chảy cấp...gây thiệt hại nặng nề đến nền kinh tế xã hội và sức khỏe cộng đồng.
- Khống chế và ngăn chặn kịp thời tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết.
- Các phương pháp chẩn đoán phòng xét nghiệm hiện có đòi hỏi sinh phẩm, hóa chất và thiết bị đắt tiền.
- Cảm biến miễn dịch được chứng minh có triển vọng thay thế các phương pháp chẩn đoán trên trong tương lai gần.
- Thiết bị này có nhiều ưu điểm vượt trội như: độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhỏ gọn, khả năng phát hiện nhanh, đơn giản và chính xác tác nhân gây bệnh tại chỗ mà không cần sử dụng chất đánh dấu hay hóa chất, sinh phẩm đắt tiền.
- Trong đó, cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực đan xen có thể cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu cao, thể tích mẫu phân tích nhỏ, thao tác mẫu đơn giản.
- Cảm biến miễn dịch thường sử dụng kháng thể tinh chế làm phần tử dò để phát hiện tác nhân gây bệnh.
- Tuy nhiên, trong những vụ dịch truyền nhiễm lớn, đặc biệt là chưa rõ nguyên nhân thì khó có thể có đủ nguồn kháng thể tinh chế hay lượng sinh phẩm, thiết bị cần thiết để đáp ứng kịp thời cho số lượng lớn mẫu bệnh phẩm cần xét nghiệm.
- Do vậy, việc nghiên cứu phát triển bộ cảm miễn dịch sử dụng trực tiếp kháng thể thu thập từ huyết thanh bệnh nhân điển hình không phải tinh chế làm phần tử dò nhằm sàng lọc nhanh mầm bệnh, ngăn chặn quá trình lây nhiễm là yêu cầu thiết yếu, từ đó có biện pháp cách ly bệnh nhân kịp thời và/hoặc đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả.
- Từ thực tiễn trên, tác giả đã đề xuất đề tài nghiên cứu cho luận án tiến sĩ: “Nghiên cứu và phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa để phát hiện virus viêm não Nhật Bản”.
- Đề tài được thực hiện với 02 mục tiêu chính: (1) phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở cấu hình vi điện cực đan xen để phát hiện virus gây bệnh.
- (2) sử dụng trực tiếp kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân thay cho kháng thể tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch để phát hiện virus viêm não Nhật Bản.
- 2 Đối tượng được tập trung nghiên cứu gồm: cảm biến điện hóa trên cơ sở vi điện cực có cấu hình đan xen, virus viêm não Nhật Bản và huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể kháng virus này.
- Ngoài ra, hạt nano vàng gắn protein A cũng được nghiên cứu tổng hợp hướng tới tăng cường độ nhạy và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa.
- Nội dung nghiên cứu chia làm ba phần: nghiên cứu các phương pháp cố định kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt vi điện cực có cấu hình đan xen.
- phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân để phát hiện virus viêm não Nhật Bản.
- thử nghiệm tổng hợp hạt vàng có kích thước nano gắn protein A để tăng cường độ nhạy và tín hiệu cảm biến miễn dịch điện hóa.
- Chương 1 LÝ THUYẾT VỀ CẢM BIẾN MIỄN DỊCH 1.1 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến miễn dịch Cảm biến sinh học là thiết bị tích hợp gồm một yếu tố nhận biết sinh học gắn trên một phần tử chuyển đổi, có khả năng dò tìm sự thay đổi từ các phản ứng sinh học và chuyển đổi thành tín hiệu điện ở đầu ra.
- Cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học được phát triển trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể.
- 3 Hình 1.2 (a) 2.937 công trình liên quan đến cảm biến miễn dịch công bố từ năm .
- (b) chỉ số đánh giá chất lượng công trình về cảm biến miễn dịch đã công bố.
- Theo thông tin nghiên cứu thị trường của Frost & Sullivan, doanh thu từ cảm biến sinh học năm 2009 đạt 6,72 tỷ đô la Mỹ và dự đoán rằng con số này sẽ tăng lên 14,42 tỷ đô la vào năm 2016.
- 1.2 Cảm biến miễn dịch phát hiện virus gây bệnh 1.2.1 Khái niệm về virus gây bệnh Virus là vật thể sinh học có kích thước rất nhỏ (khoảng 20 ÷ 300 nm) có khả năng xâm nhiễm vào cơ thể sống.
- Virus tự nhân lên bằng cách sử dụng bộ máy hoạt động của tế bào vật chủ sau khi xâm nhiễm.
- Khi người hay động vật bị nhiễm virus, cơ thể sẽ có sự đáp ứng miễn dịch (sinh ra kháng thể) để chống lại sự xâm nhập này.
- Tỷ lệ tử vong từ 0,3 đến 60% phụ thuộc vào thời gian phát hiện bệnh và phương thức điều trị.
- Phương pháp chẩn đoán phòng xét nghiệm để xác định virus VNNB như: ức chế hồng cầu, trung hòa giảm đám hoại tử, PCR và kỹ thuật MAC-ELISA.
- Các phương pháp này đều mất thời gian từ vài giờ đến vài ngày để biết được kết quả.
- 1.3 Phân loại cảm biến miễn dịch Hình 1.5 mô tả chiến lược tổng thể quá trình phát triển các kỹ thuật chẩn đoán để xác định virus gây bệnh.
- Hình 1.5 Chiến lược phát hiện virus gây bệnh.
- Cảm biến miễn dịch được phân loại dựa trên các kỹ thuật dò tìm, gồm có 4 kỹ thuật chủ yếu: đo điện hóa (đo thế, đo dòng, đo tổng trở hoặc đo độ dẫn).
- 5 Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch 1.4 Truyền điện tử trong cảm biến miễn dịch Tốc độ truyền điện tử được tính theo thuyết bán cổ điển bằng phương trình sau: ]4/2)0(exp[22/24 TBkGABHTBkhETk.
- 1.5 Động học tương tác kháng nguyên – kháng thể Lý thuyết về động học gắn kết kháng nguyên - kháng thể trên bề mặt cảm biến miễn dịch.
- Kháng thể 2 trị, kháng nguyên đa trị (v trị): Hình 1.12 Gắn kết của kháng nguyên 3 trị trong dung dịch và kháng thể hai trị gắn trên bề mặt cảm biến.
- 6 Tốc độ của phản ứng kháng nguyên – kháng thể: 01][ sfAgkdtd Trong đó, v là trị số của kháng nguyên, s là số bước của quá trình gắn kết (bước đơn hay bước kép).
- 1.6 Các phương pháp cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch 1.6.1 Kỹ thuật miễn dịch Cảm biến miễn dịch được phát triển dựa trên những nguyên lý cơ bản của kỹ thuật miễn dịch.
- Kháng thể (antibody) là phân tử globulin miễn dịch (immunoglobulin) có khả năng nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ (kháng nguyên).
- khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ có khả năng kích thích cơ thể vật chủ tạo ra sự đáp ứng miễn dịch.
- Do vậy, mỗi kháng thể chỉ có khả năng nhận diện một loại kháng nguyên nhất định.
- Kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân (serum antibody) được thu thập từ bệnh nhân trong một khoảng thời gian nhất định sau khi nhiễm bệnh.
- Phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (Ag) và kháng thể (Ab).
- Ag + Ab ↔ Ag.Ab Cảm biến miễn dịch được phát triển chủ yếu dựa theo nguyên lý của các kỹ thuật miễn dịch dị thể (heterogeneous immunoassays) và có thể được thiết kế để dò tìm trực tiếp (không sử dụng chất đánh dấu) hoặc gián tiếp (sử dụng chất đánh dấu).
- 1.6.2 Các phương pháp cố định kháng thể Phương pháp cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch được khái quát bởi 3 kỹ thuật gồm: (1) hấp phụ vật lý.
- 7 1.7 Kết luận Chương 1 trình bày tổng quan lý thuyết liên quan đến phát triển bộ cảm biến miễn hóa như: nguyên lý hoạt động, phân loại, cơ chế truyền điện tử và động học tương tác kháng nguyên – kháng thể và các khái niệm về virus gây bệnh truyền nhiễm.
- Phân tích bằng lý thuyết cho thấy cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực có cấu hình đan xen phù hợp với yêu cầu và điều kiện nghiên cứu của đề tài.
- Trong đó, phương pháp đo độ dẫn có khả năng cho độ nhạy và chọn lọc cao, còn phương pháp đo tổng trở tiện dụng khi phát hiện trực tiếp mẫu phân tích mà không cần các hóa chất, sinh phẩm đắt tiền.
- Từ tính cấp thiết của tình hình dịch bệnh truyền nhiễm xảy ra trong những năm gần đây và triển vọng của cảm biến miễn dịch điện hóa, tác giả đã đưa ra giả thuyết về việc phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa trên cơ sở vi điện cực có cấu hình đan xen sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân không phải tinh chế để phát hiện virus gây bệnh.
- Đồng thời, đề xuất thử nghiệm tổng hợp phức hợp Au/PrA kích thước nano hướng tới mục tiêu tăng cường khả năng phát hiện virus và tín hiệu của cảm biến miễn dịch điện hóa.
- 8 Chương 2 CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN CHO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH 2.1 Đặt vấn đề Trong nghiên cứu này, huyết thanh bệnh nhân chứa kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản thu thập sau 1 -2 tuần kể từ khi nhiễm được sử dụng để làm phần tử dò gắn lên các vi điện cực có cấu hình đan xen nhằm phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa.
- Nghiên cứu này nhằm tìm ra quy trình cố định kháng thể từ huyết thanh tốt nhất lên trên bề mặt điện cực.
- Thành công của nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển bộ cảm biến miễn dịch trên cơ sở kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân, có khả năng phát hiện nhanh, sàng lọc tại chỗ tác nhân gây bệnh trong các vụ dịch.
- 2.2 Vật liệu và phương pháp 2.2.1 Vật liệu, hóa chất - Vật liệu và hóa chất cần thiết đảm bảo tiêu chuẩn phân tích 2.2.2 Chế tạo vi điện cực - Vi điện cực có cấu hình 40 răng đan xen với kích thước 10µm x 10µm được thiết kế và chế tạo tại Viện đào tạo Quốc tế về khoa học vật liệu, Trường đại học Bách khoa Hà Nội (hình 2.1).
- Hình 2.1 (a) Mô phỏng cách tạo vi điện cực đan xen có cấu hình 10 m x 10 m, (b) vi điện cực thành phẩm kiểu trên dưới sau khi cắt phiến và phóng đại một phần với các thanh điện cực đan xen.
- (c) vi điện cực được gắn lên đế, sẵn sàng cho quá trình đo.
- 9 2.2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.2.3.1 Làm sạch bề mặt điện cực Trước tiên, điện cực được ngâm trong dung dịch KOH/MeOH (1:1, không pha loãng) trong 30 phút để loại bỏ chất bẩn bám dính và giải phóng các nhóm chức hydroxyl –OH trên bề mặt các vi điện cực và lớp SiO2 xen kẽ (gọi chung là điện cực).
- 2.2.3.2 Cố định kháng thể từ huyết thanh lên điện cực - Phương pháp 1: APTES – huyết thanh (APTES – serum.
- Phương pháp 2: APTES – GA – huyết thanh (APTES – GA – serum.
- Phương pháp 3: APTES – GA – antiHIgG – huyết thanh (APTES – GA – antiHIgG – serum.
- Phương pháp 4: APTES – GA – Protein A – huyết thanh (APTES – GA – PrA – serum) 2.2.3.3 Khảo sát đặc trưng bề mặt của điện cực.
- Kính hiển vi điện tử quét độ phân giải cao (S-4800, Hitachi, Nhật Bản).
- kính hiển vi lực nguyên tử (Multimode, Vecco, Hoa Kỳ.
- kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (Eclipse 90i, Nikon, Nhật Bản) Sử dụng phương pháp phân tích thống kê để so sánh cường độ phát huỳnh quang trung bình đối với mỗi phương pháp cố định.
- 2.3 Kết quả và thảo luận 2.3.1 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét Nồng độ 1 mg/ml huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB được cố định lên điện cực trong cả 4 phương pháp đều cho thấy bề mặt được bao phủ bởi một lớp các điểm sáng được sắp xếp đồng đều.
- Tuy nhiên, do giới hạn phân giải của hiển vi điện tử quét không cho phép quan sát chi tiết sự thay đổi trên bề mặt điện cực.
- 2.3.2 Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) Hình ảnh hiển vi lực nguyên tử cho thấy bề mặt điện cực có sự thay đổi rõ ràng nhất về hình thái đối với phương pháp APTES–GA–antiHIgG–serum.
- APTES–GA–PrA–serum.
- Hình 2.3 Hình ảnh hiển vi lực nguyên tử bề mặt điện cực: A) trước khi silan hóa và B) sau khi silan hóa bằng APTES: C) APTES–serum.
- C) APTES–GA–serum.
- D) APTES–GA–antiHIgG–serum.
- E) APTES–GA–PrA–serum.
- 2.3.3 Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR) Kết quả phân tích phổ hấp phụ bức xạ hồng ngoại cho thấy có sự tồn tại chắc chắn của các kháng thể cũng như protein trên bề mặt 11 điện cực sau các bước rửa.
- Hình 2.4 Phổ FTIR trong vùng số sóng cm-1 của bề mặt điện cực trước và sau khi cố định với 1 mg/ml huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB: (a) Bề mặt điện cực sau khi silan hóa.
- (b) APTES–serum.
- (c) APTES–GA–serum.
- (d) APTES–GA–antiHIgG–serum.
- (e) APTES–GA–PrA–serum.
- 2.3.4 Hiển vi huỳnh quang bề mặt điện cực Hình 2.5 Hiển vi huỳnh quang bề mặt điện cực sau khi ủ với FITC–Ab: A) APTES – serum.
- B) APTES–GA–serum.
- C) APTES–GA–antiHIgG – serum.
- D) APTES–GA–PrA – serum.
- Cột thứ nhất cố định với 1 mg/ml BSA thay cho huyết thanh bệnh nhân.
- cột thứ 2, 3, 4 tương ứng với các nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB: 0,1 mg/ml.
- 1 mg/ml.
- Giá trị các thước đo = 200 px 12 Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang cho thấy các điểm phát huỳnh quang trải đều trên bề mặt điện cực và tốt nhất ở 3 phương pháp: APTES–GA–serum.
- APTES–GA–antiHIgG–serum.
- APTES–GA–PrA–serum tương ứng với từng nồng độ huyết thanh cố định.
- Thống kê điểm ảnh phát huỳnh quang trên bề mặt điện cực đã cho thấy rằng phương pháp gắn kết sử dụng PrA (APTES–GA–PrA–serum) cho số lượng điểm ảnh huỳnh quang nhiều nhất với nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus 1 mg/ml.
- Đây cũng là phương pháp được kỳ vọng có khả năng ứng dụng để phát triển bộ cảm biến miễn dịch trên cơ sở cố định huyết thanh để phát hiện virus gây bệnh (hình 2.6).
- Hình 2.6 So sánh số lượng điểm ảnh huỳnh quang (G) trung bình/ô giữa các phương pháp theo từng nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus VNNB được cố định 2.4 Kết luận Trong chương này, tác giả đã trình bày chi tiết kết quả nghiên cứu về khả năng sử dụng kháng thể từ huyết thanh bệnh nhân kháng virus VNNB lên bề mặt điện cực làm phần tử dò để phát triển bộ cảm biến miễn dịch.
- Bốn phương pháp cố định đã được thử nghiệm bao gồm: APTES–serum.
- APTES–GA–serum.
- Các kết quả phân tích cho thấy rằng hiệu suất gắn kết kháng thể lên trên bề mặt điện cực đạt hiệu quả tốt nhất khi sử dụng phương pháp APTES–GA–PrA–serum với nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus ở 1 mg/ml.
- Nghiên cứu này đã mở ra một hướng mới cho việc phát triển bộ cảm biến miễn dịch sử dụng trực tiếp kháng thể từ huyết thanh của bệnh nhân làm phần tử dò để phát hiện virus gây bệnh.

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt