- Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất. - Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. - Phân lập các hợp chất từ cặn chiết. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 1 (ZN1. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 2 (ZN/A/7. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 3 (ZN/A/11. - Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (ZN1. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (ZN/A/7. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (ZN/A/11. - Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN1 37 Hình 4.2. - Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN1 38 Hình 4.3. - Phổ DEPT của hợp chất ZN1 38 Hình 4.4. - Phổ HSQC của hợp chất ZN1 39 Hình 4.5 Phổ HMBC của hợp chất ZN1 39 Hình 4.6. - Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất ZN1 40 Hình 4.7. - Cấu trúc hóa học của hợp chất nitidine 41 Hình 4.8. - Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN/A/7 42 Hình 4.9. - Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 43 Hình 4.10. - Phổ DEPT của hợp chất ZN/A/7 43 Hình 4.11. - Phổ HSQC của hợp chất ZN/A/7 44 Hình 4.12. - Phổ HMBC của hợp chất ZN/A/7 44 Hình 4.13. - Phổ ESI-MS của hợp chất ZN/A/7 45 Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất dihydrochelerythrin 46 Hình 4.15. - Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN/A/11 47 Hình 4.16. - Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 48 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Phổ DEPT của hợp chất ZN/A/11 48 Hình 4.18. - Phổ HSQC của hợp chất ZN/A/11 49 Hình 4.19. - Phổ HMBC của hợp chất ZN/A/11 50 Hình 4.20. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 52 Hình 4.21. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN1 và số liệu tham khảo của hợp chất nitidine 40 Bảng 4.2. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 và số liệu tham khảo của hợp chất dihydrochelerythrin 45 Bảng 4.3. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 và số liệu tham khảo của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 50 Bảng 4.4. - Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy cây Zanthoxylum nitidum có thành phần hóa học chủ yếu là các hợp chất alkaloid và lignan. - ngoài ra còn có một số hợp chất khác có khung coumarin, terpenoid và steroid. - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất alkaloid từ cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) mọc ở Việt Nam. - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất alkaloid phân lập được. - Các loài thuộc chi Zanthoxylum là nguồn cung cấp các hợp chất benzophenanthridine [29] và aporphin alkaloid. - TS Nguyễn Thị Hồng Vân HVTH: Nguyễn Đức Duy 10 Chi Zanthoxylum có chứa tinh dầu, trong tinh dầu thường chứa các hợp chất nhóm tecpenoid là chủ yếu. - Các hợp chất benzophenanthridine như nitidine và chelerythrine, các furoquinoline, skimmianine và các aporphine, berberine, magnoflorine. - Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) trên thế giới cho thấy cây này có thành phần chủ yếu là các hợp chất alkaloid và lignan. - TS Nguyễn Thị Hồng Vân HVTH: Nguyễn Đức Duy 15 Hầu hết các hợp chất benzophenanthridine alkaloid này đều có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt, điển hình như các hợp chất nitidine, chelerythrine, sanguinarine. - Hợp chất nitidine Ngay từ năm 1976, hợp chất nitidine (1) (hay nitidine chloride) đã được công bố trên tạp chí Cancer Research về khả năng ức chế sự sao chép ngược của RNA virut gây ung thư và hoạt tính chống bạch cầu, gợi ý về khả năng chống ung thư của hợp chất này [43]. - đã ngay lập tức tiến hành đánh giá về khả năng gây đột biến gen của hợp chất benzophenanthridine alkaloid này do có sự khá tương đồng về cấu trúc hóa học với chất gây ung thư 5-methylchrysene. - Khi nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính – cấu trúc, các tác giả nhận thấy rằng hợp chất dihydronitidine cũng có tác dụng gây độc chọn lọc đối với các tế bào ung thư giống như hợp chất nitidine trong khi demethylnitidine thì không. - Nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng in vivo đầu tiên về khả năng chống ung thư ít gây tác dụng phụ của hợp chất alkaloid tự nhiên nitidine [23]. - Hợp chất chelerythirine Hợp chất chelerythirine (2) có cấu trúc tương tự như của nitidine, chỉ khác về vị trí của hai nhóm thế methoxy (thế ở C-8, C-9 đối với nitidine và thế ở C-7, C-8 đối với chelerythrine), cũng có khả năng gây độc tế bào in vitro và ức chế khối u in vivo rất hiệu quả. - Hợp chất benzophenanthridine alkaloid này có khả năng gây độc in vitro đối với 9 dòng tế bào ung thư ở người và ức chế sự tăng trưởng của ung thư vảy da in vivo. - Theo các tác giả, sở dĩ chelerythrine có khả năng gây độc đối với nhiều dòng tế bào ung thư vì hợp chất này có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme protein kinaza C (PKC). - Hợp chất 8-methoxy norchelerythrine Hợp chất 8-methoxynorchelerythrine (3) có hoạt tính gây độc tế bào đối với 8 dòng tế bào ung thư A-549, BGC-823, HCT15, HeLa, HepG2, MCF-7, SGC-7901 và SK-MEL-2 với các giá trị IC50 nằm trong khoảng µg/ml [30]. - Các hợp chất norchelerythrine (4), oxynitidine (6), oxychelerythrine (7) đều có hoạt tính ức chế mạnh đối với dòng tế bào bạch cầu chuột P-388 và tế bào ung thư tuyến đại trực tràng ở người HT-29 với các giá trị IC50 < 4 µg/ml [12, 14]. - Hợp chất sanguinarine Hợp chất sanguinarine (9) cũng đã được chứng minh có khả năng chống ung thư in vitro và in vivo tốt: ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa với giá trị IC50 là 0,8 µg/ml [46], gây hoại tử và cái chết theo chương trình đối với dòng tế bào bạch cầu ở người HL-60 [52], gây ra cái chết theo chương trình đối với tế bào khối u thần kinh nội tiết thông qua khả năng kích hoạt caspase-3 [46], kìm hãm chu trình tế bào và gây ra cái chết theo chương trình đối với tế bào ung thư Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - TS Nguyễn Thị Hồng Vân HVTH: Nguyễn Đức Duy 19 Hợp chất skimmianine (22) có khả năng gây độc tế bào in vitro rất mạnh đối với các dòng tế bào P-388 và HT-29 (các giá trị IC50 < 4 µg/ml) [12], gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào RAJI, Jurkat (các giá trị IC50 tương ứng là 15,6 và 11,5 µg/ml) và có tác dụng gây độc trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7, KG-1a, HEP-2, HL-60 và HL-60/MX1 [50]. - Hợp chất gamma-fagarine (23) cũng có khả năng gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào P-388 và HT-29 với các giá trị IC50 đều nhỏ hơn 4 µg/ml [12]. - Hợp chất dictamnine (24), skimmianine (22) và gamma-fagarine (23) đều có khả năng gây độc tế bào yếu đối với dòng tế bào ung thư vú ở người MCF7 [48]. - Hai hợp chất berberrubine (26) và coptisine (27) đều là những hợp chất tiền berberine và đã được biết có khả năng gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt thông qua khả năng gây độc đối với enzyme topoisomeraza II [28], ức chế mạnh sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư gan (HepG2, Hep3B, SK-Hep1, PLC/PRF/5) và bạch cầu (K562, U937, P3H1 Raji) với các giá trị IC50 nằm trong các khoảng µg/ml và µg/ml, tương ứng [33]. - Hợp chất sesamin có hoạt tính làm giảm khả năng sống sót của các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh (SH-SY5Y), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (A549), ung thư tuyến tụy (MIA-PaCa), tế bào bạch cầu (HL-60) thông qua thử nghiệm MTT [25, 35]. - Hợp chất episesamin là dạng đồng phân lập thể của Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Ngoài ra, bằng các phương pháp HPLC, một số hợp chất có khung khác như terpenoid (alpha-cadinol, anticopalol, spathulenol), coumarin (aesculetin dimethyl ether, 5, 6, 7-trimethoxycoumarin), phenolic (syringic acid, 4-hydroxybenzoic acid) cũng đã được tìm thấy có trong loài Zanthoxylum nitidum [22, 59]. - Nhiều hợp chất trong số đó đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư rất tốt thông qua nhiều cơ chế tác dụng khác nhau. - Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. - Phân lập các hợp chất từ cặn chiết Cặn A (80 g) được được tẩm khô với silica gel (Merck mm) rồi được tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck mm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan:etyl acetat (100 % n-hexan Ethyl acetat và 100 % MeOH) thu được 12 phân đoạn (ký hiệu từ ZN/A/1 đến ZN/A/12). - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 3.3.1. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 1 (ZN1) Chất rắn màu ngà vàng. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 2 (ZN/A/7) Tinh thể hình kim màu ngà vàng. - Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất 3 (ZN/A/11) Chất rắn màu trắng. - Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được Các hợp chất phân lập được được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là tế bào ung thư biểu mô người KB (human nasopharyngeal epidermoid carcinoma cell line), tế bào ung thư phổi người LU-1 (human lung adeno-carcinoma cell), tế bào ung thư vú người MCF7 (human breast adenocarcinoma cell line), tế bào ung thư gan người HepG2 (human liver cancer cell line) và tế bào ung thư tuyến tiền liệt người LNCaP (human prostateadenocarcinoma cell line). - Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (ZN1) Hợp chất ZN1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng. - Trên phổ 1H-NMR của hợp chất ZN1 cho thấy, trong vùng trường thơm xuất hiện hai tín hiệu doublet của hai proton cặp ortho tại H 8,90 (1H, d, J = 9,0 Hz, H H, d, J = 9,0 Hz, H-12) cùng bốn tín hiệu singlet đặc trưng cho 4 proton thơm khác tại H 7,77 (1H, s, H H, s, H H, s, H H, s, H-10). - Các dữ liệu phổ 1H-NMR trên gợi ý cho thấy hợp chất ZN1 có cấu trúc khung benzophenanthridine khá đặc trưng ở các loài Zanthoxylum. - Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN1 Nhận định trên được khẳng định thông qua phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy trong cấu trúc của ZN1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN1 Hình 4.3. - Phổ DEPT của hợp chất ZN1 Trên phổ HSQC, các proton của nhóm metylendioxy tại H 6,34 (2H, s) có tương tác với carbon tương ứng tại C 102,71. - Phổ HSQC của hợp chất ZN1 Trên phổ HMBC, proton tại H 4.89 (3H, s) của nhóm N-CH3 có tương tác với carbon C-4b (132,55 ppm), C-6 (151,29 ppm) và C-4 (104,55 ppm). - Phổ HMBC của hợp chất ZN1 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN1 và số liệu tham khảo của hợp chất nitidine C ZN1 Nitidine [40] Ha,b, ppm (J, Hz) Ca,c, ppm DEPT 1H-NMR 13C-NMR 1 7,77 (1H, s) 105,76 CH 7,70 (1H, s C C H, s) 104,55 CH 8,23 (1H, s) 104,80 4a - 119,92 C - 120,19 4b - 132,55 C - 132,81 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - TS Nguyễn Thị Hồng Vân HVTH: Nguyễn Đức Duy H, s) 151,29 CH 9,71 (1H, s) 151,45 6a - 119,43 C H, s) 108,78 CH 7,86 (1H, s C C H, s) 103,26 CH 8,25 (1H, s) 103,37 10a - 132,09 C b - 124,11 C H, d, J = 9,0 Hz) 119,22 CH 8,77 (1H, d, J = 9,0 Hz H, d, J = 9,0 Hz) 130,03 CH 8,22 (1H, d, J = 9,0 Hz) 130,5 12a - 132,49 C - 132,79 O-CH2-O 6,34 (2H, s) 102,71 CH2 6,30 (2H, s) 103,06 N-CH3 4,89 (3H, s) 51,42 CH3 4,85 (3H, s) 51,73 8-OCH3 4,04 (3H, s) 56,31 CH3 4,02 (3H, s) 56,67 9-OCH3 4,22 (3H, s) 57,29 CH3 4,19 (3H, s) 57,56 aĐo trong DMSO-d6, b500 MHz, c125 MHz Như vậy, tổng hợp các dữ liệu phổ thu được trên đây, kết hợp với tài liệu tham khảo [40], hợp chất ZN1 được xác định là nitidine và có cấu trúc như hình 4.7. - Cấu trúc hóa học của hợp chất nitidine Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (ZN/A/7) Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 có các điểm tương tự với phổ của hợp chất ZN1, với một tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm metylendioxy (O-CH2-O) tại (δH 6,04, s), 2 nhóm tín hiệu singlet CH3 tại (δH 3,87. - Phổ 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 Hình 4.10. - Phổ DEPT của hợp chất ZN/A/7 Phổ HMBC của ZN/A/7 cho thấy sự tương tác của carbon C-7 (δC 146) và C-8 (δC 152,52 ) với hydro của 2 nhóm metoxy (δH 3,87 và 3,92) tương ứng. - Phổ HSQC của hợp chất ZN/A/7 Hình 4.12. - Phổ HMBC của hợp chất ZN/A/7 Phổ khối lượng ESI-MS của ZN/A/7 cho pic ion giả phân tử tại m/z 350 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C21H19NO4. - Phổ ESI-MS của hợp chất ZN/A/7 Đối chiếu các dữ liệu phổ của ZN/A/7 và các dữ liệu phổ tham khảo của dihydrochelerythrine [34] cho thấy có sự trùng khớp. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/7 và số liệu tham khảo của hợp chất dihydrochelerythrine C ZN/A/7 Dihydrochelerythrine [34] Ha,b, ppm (J, Hz) Ca,c, ppm DEPT 1H-NMR 13C-NMR 1 7,10 (1H, s) 104,34 CH 7,04 (1H, s C C H, s) 100,72 CH 7,65 (1H, s) 100,6 4a - 124,26 C - 126,2 4b - 142,75 C H, s) 48,76 CH2 4,27 (2H, s) 48,7 6a - 126,27 C C C H, d, J=8,5Hz) 111,05 CH 6,93 (1H, d, J=7,3Hz H, d, 118,65 CH 7,47 (1H, d, 118,6 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - TS Nguyễn Thị Hồng Vân HVTH: Nguyễn Đức Duy 46 J=8,5Hz) J=7,3Hz) 10a - 126,40 C - 126,2 10b - C H, d, J=8,5Hz) 120,12 CH 7,69(1H, d, J=9,1Hz H, d, J=8,5Hz) 123,76 CH 7,44 (1H, d, J=9,1Hz) 123,6 12a - 130,83 C - 130,8 O-CH2-O 6,04 (2H, s) 101,0 CH2 6,02 (2H, s) 100,9 N-CH3 2,59 (3H, s) 41,30 CH3 2,58 (3H, s) 41,2 7-OCH3 3,87 (3H, s) 61,07 CH3 3,86 (3H, s) 60,9 8-OCH3 3,92 (3H, s) 55,83 CH3 3,90 (3H, s) 55,7 aĐo trong CDCl3, b500 MHz, c125 MHz Từ các kết quả trên đây, hợp chất ZN/A/7 được xác định là dihydrochelerythrine và có cấu trúc như hình 4.14. - Cấu trúc hóa học của hợp chất dihydrochelerythrine 4.3. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (ZN/A/11) Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 có các điểm tương tự với phổ của hợp chất ZN/A/7, với một tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm metylendioxy (O-CH2-O) tại (δH 6,12, s), 2 nhóm tín hiệu singlet CH3 tại (δH 3,86. - Điều này càng được thể hiện rõ ràng khi trên phổ 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 thấy xuất hiện một tín hiệu tại δC 206,4 ppm của nhóm C=O. - Phổ 1H-NMR của hợp chất ZN/A/11 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Phổ DEPT của hợp chất ZN/A/11 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - Phổ HSQC của hợp chất ZN/A/11 Phổ HMBC của ZN/A/11 cho thấy sự tương tác qua lại của 4 nhóm carbon C-6 (δC 54,2 ppm), C-6a (δC 127,4 ppm), C (δC 206,4 ppm, C=O) và C(δC 30 ppm, CH3) với hydro của nhóm metylen (δH 2,24 ppm). - Phổ HMBC của hợp chất ZN/A/11 Bảng 4.3. - Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất ZN/A/11 và số liệu tham khảo của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine C ZN/A/11 (DMSO-d6) Tài liệu [16] (CDCl3) Tài liệu [57] (DMSO-d6) Ha,b, ppm (J, Hz) Ca,c, ppm DEPT 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1 7,3 (1H, s) 104,2 CH 7,08 (1H, s H, s C C H, s) 99,5 CH 7,51 (1H, s H, s) 99,8 4a - 126,5 C b - 138,5 C H, dd) 54,2 CH 5,03 (1H, dd H, d) 58,4 6a - 127,4 C C Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật GVHD: 1. - aĐo trong DMSO-d6, b500 MHz, c125 MHz Từ các kết quả trên đây, hợp chất ZN/A/11 được xác định là 6-acetonyldihydrochelerythrine và có cấu trúc như Hình 4.20. - Cấu trúc hóa học của hợp chất 6-acetonyldihydrochelerythrine 4.4. - Hai hợp chất dihydrochelerythrine và 6-acetoyldihydrochelerythrine có hoạt tính yếu. - Như vậy, hợp chất nitidine rất có tiềm năng trong việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo chế phẩm chống ung thư. - 3) Dựa trên các phương pháp phổ hiện đại, đã xác định cấu trúc hóa học của 3 hợp chất phân lập được, đó là các hợp chất: nitidine (ZN1), dihydrochelerythrine (ZN/A/7) và 6-acetonyldihydrochelerytherine (ZN/A/11). - 4) Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của 03 hợp chất alkaloid phân lập được. - Kết quả cho thấy hợp chất nitidine có khả năng ức chế rất mạnh cả 5 dòng tế bào ung thư (mạnh hơn cả chất đối chứng ellipticine) với các giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 0,25 đến 0,29 µg/ml. - hai hợp chất dihydrochelerythrine và 6-acetoyldihydrochelerythrine có hoạt tính yếu
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt