- Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây. - Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học, viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn của mình. - Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch 2 1. - Bệnh dịch hạch 2 2. - Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam 3. - I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới 4. - I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam 3 3 4 5. - Biểu hiện của bệnh dịch hạch 7 6. - Dịch hạch thể hạch 7 7. - Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết 9 8. - Dịch hạch thể phổi 10 9. - Cơ chế lây lan dịch hạch và vi khuẩn Yersinia pestis 10 10. - Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch 10 11. - Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Yersinia pestis 12 I.5. - Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 4. - Phương pháp nghiên cứu 30 8. - Chương 3: Kết quả và bàn luận 9. - Tổng hợp nhân tạo gen caf1 mã hóa kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y. - Tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp gapless PCR 35 I.2.2. - Tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO 38 II. - Biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên nang F1 tái tổ hợp trong E. - Phụ lục 4: Kết quả kiểm tra mức độ biểu hiện gen caf1 sau khi đã tối ưu trên E. - Phụ lục 5: Kết quả giải trình tự gen 6 dòng plasmid của phương pháp v tổng hợp gen Gapless PCR Phục lục 6: Kết quả giải trình tự gen 6 dòng plasmid của phương pháp tổng hợp gen TBIO 20. - Phụ lục 7: Kết quả giải trình tự gen pET-52b(+)-F1 21. - Phụ lục 8: Kết quả giải trình tự gen pMAL-c5X-F1 61 64 65 vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ a.a Amino acid APS Amonium persulphate CBB Coomassie brilliant blue E. - coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtOH Ethanol IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside kb Kilo base kDa Kilo Dalton KLPT KN KT Khối lượng phân tử Kháng nguyên Kháng thể LB MBP Luria - Bertani Maltose binding protein OD Mật độ quang học (optical density) PCR Polymerase chain reaction PMSF RNA Phenyl methyl sulphonyl fluoride Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng trong luận văn 23 Bảng 2.2 : Các trình tự oligo thiết kế cho hai h pháp tổng hợp gen 23 Bảng 2.3: Thành phần gel tách 28 Bảng 2.4: Thành phần gel cô 28 Bảng 2.5: Thành phần hóa chất điện di SDS-PAGE 28 Bảng 3.1: Thống kê kết quả giải trình tự gen caf1 tổng hợp bằng gapless PCR và TBIO 40 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1: Qui trình tạo protein tái tổ hợp 18 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002 Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới Hình1. - 4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch 9 Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch 12 Hình1. - 6: Hình ảnh Yersinia pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson 14 Hình 1.7: Nguyên tắc của phương pháp tổng hợp gen gapless PCR với 2 bước là “overlap” PCR và “full length” PCR. - 8: Phương pháp tổng hợp gen TBIO 22 Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắ giới hạn của véc tơ pET52b Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắ giới hạn của véc tơ pMAL-c5X 25 26 Hình 2.3: Mô hình phản ứng Western blot Hình 3.1. - Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp gapless PCR. - Kết quả biến nạpvectơ tách dòng pJET1.2 sau khi gắn gen caf1 tổng hợp bằng phương pháp gapless PCR 36 Hình 3.4: Kết quả sàng lọc, bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen caf1 tổng hợp bằng phương pháp gapless PCR. - 37 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR-2 tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO 39 Hình 3.6. - Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO 39 Hình 3.7. - Kết quả điện di gen caf1 và vectơ pet52b. - Kết quả điện di protein của dòng tế bào E. - Kết quả điện di proteintổng số và protein tan của dòng tế bào E. - coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện pET-52b(+)-F1 trên gel SDS-PAGE 44 Hình 3.10. - Kết quả phân tích Western blot với kháng thể kháng (His)6của dòng tế bào E. - coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện pET-52b(+)-F1 45 Hình 3.11. - Kết quả điện di protein tan của dòng tế bào E. - Coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiệnpMAL-c5X-F1-His trên gel SDS-PAGE Hình 3.12. - Kết quả tinh sạch protein dung hợp MBP-F1-His bằng sắc ký ái lực Ni 47 47 Hình 3.13. - Kết quả phân tích Western blot protein tinh sạch MBP- F1-(His)7với kháng thể kháng (His)6 Hình 3.14. - Kết quả phân tích Dot blot protein MBP-F1-(His)7 với kháng thể kháng F1 48 48 1 MỞ ĐẦU Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra. - Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên. - Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc sống của con người. - Đặc biệt vi khuẩn dịch hạch vẫn được coi là một trong những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học hiện nay. - Vì vậy, yêu cầu phải chuẩn đoán nhanh, chính xác vi khuẩn dịch hạch trong các ổ dịch, trong môi trường là một yêu cầu cấp thiết. - Tuy nhiên để nghiên cứu trực tiếp vi khuẩn dịch hạch trong tự nhiên thì đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm riêng, yêu cầu qui trình sát trùng, sát khuẩn rất nghiêm ngặt lại dễ gây nguy hiểm cho người nghiên cứu. - Vì thế hiện nay các nhà khoa học thường nghiên cứu trên kháng nguyên protein tái tổ hợp thay vì nghiên cứu trực tiếp trên vi khuẩn dịch hạch. - Kháng nguyên F1 là một kháng nguyên đặc hiệu loài cao, dùng để chuẩn đoán cho vi khuẩn dịch hạch. - Kháng nguyên F1 tái tổ hợp có một vai trò rất quan trong trong các nghiên cứu để tạo kháng thể kháng F1 trong sản xuất vắc xin, sản xuất que thử phát hiện vi khuẩn Yersinia pestis… Vì những lí do trên tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng nguyên F1 tái tổ hơp từ vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis”. - Nội dung nghiên cứu chính của luận văn. - Xây dựng qui trình tạo kháng nguyên tái tổ hợp F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis. - Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch I. - Bệnh dịch hạch Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm dịch và khai báo quốc tế do Yersinia pestis gây nên. - Lịch sử loài người đã ghi nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng của nhân loại. - Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch do vi khuẩn hay vi rút. - Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp đến các quốc gia trên thế giới. - Trong đại dịch này, dịch hạch lây lan mạmh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng người.[2] Formatted: Justified, Level 2, Space After: 0pt, Line spacing: 1.5 linesFormatted: Justified, Level 3, Indent: Left: 0",Hanging: 0.49", Space After: 0 pt, Linespacing: 1.5 lines, No bullets or numberingFormatted: Font: (Default) Times New Roman,13 pt, Bold, ItalicFormatted: Font: (Default) Times New Roman,13 pt, Bold, ItalicFormatted: Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 linesFormatted: Font: (Default) Times New Roman,13 ptFormatted: Indent: First line: 0.5", SpaceAfter: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines 3 I.2. - Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam I.2.1. - Tình hình dịch hạch trên thế giới Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như : khí hậu, động đất, sự di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân. - Hiện nay, các ổ dịch hạch thiên nhiên tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ độ Nam. - Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm. - Từ Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong. - Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm Formatted: Indent: First line: 0", Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 linesFormatted: Font: (Default) Times New Roman,13 pt, Bold, ItalicFormatted: Font: (Default) Times New Roman,13 ptFormatted: Indent: Left: -0.1", First line: 0.59", Line spacing: 1.5 linesFormatted: Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 linesFormatted: Indent: First line: 0", Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines 4 Gần đây, tính đến ngày 23 tháng 6 năm 2003 đã xảy ra dịch hạch tại Tafraoui, ngoại ô tỉnh Oran, Angêria với 10 trường hợp mắc, 8 trường hợp thể hạch, 1 thể phổi và 1 thể nhiễm khuẩn huyết. - Kết quả xét nghiệm Yersinia pestis ở bệnh phẩm những bệnh nhân này dương tính. - Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp, không thể nói rằng sẽ loại trừ dịch hạch trong tương lai gần. - Cũng không thể buông lỏng sự giám sát dịch hạch. - Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các Viện Pasteur (Acip Peste). - Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ. - Những năm gần đây Hội nghị quốc tế về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được Tổ chức Y tế Thế giới tổ chức, thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự. - Tại hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore, Ấn Độ từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức Y tế Thế giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và chết), nguy cơ tác nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm quan trọng đối với quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích. - Dịch hạch có đầy đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên nghiên cứu và phòng chống.[2] I.2.2. - Tình hình dịch hạch tại Việt Nam Hơn 1 thế kỷ bệnh dịch hạch có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ Hồng Kông xâm nhập đến vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba. - Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3. - Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên, Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có 886 người tử vong. - Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002 Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở miền Nam. - Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch vẫn tồn tại với quy mô lớn. - Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải dịch trên thế giới đều là Việt Nam.[24] 6 Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số mắc - chết tăng vọt tại các vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển miền Trung, Tây Nguyên, miền Đông Nam Bộ. - Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một số vụ dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng hóa và các phương tiện giao thông. - Trong 4 năm dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc Đoa, tỉnh Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk.[24] Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk. - Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng thể kháng Yersinia pestis (kháng thể kháng F1) đều cho kết quả âm tính. - Biểu hiện của bệnh dịch hạch 1.1 Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm sàng với tỷ lệ khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch. - Dịch hạch thể hạch Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể. - Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt