Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam

- 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất cứ công trình của tác giả nào khác.
- TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh Phùng Thị Thủy 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
- Tô Kim Anh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để tôi hoàn thiện Luận án này.
- Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, đồng nghiệp của tôi trong Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu luận án và trong cuộc sống hàng ngày.
- Nguyễn Thành Trung, Viện Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm đã giúp đỡ tôi khi tôi thực hiện một phần luận án tại Viện.
- Nguyễn Thu Hiền Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu Luận án tại Viện.
- Để hoàn thiện Luận án này tôi không thể không nói lời cảm ơn chân thành nhất đến bạn bè, ngƣời thân, gia đình đã luôn động viên và dành thời gian cho tôi thực hiện nghiên cứu này.
- 20 1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L.
- Dịch tễ học phân tử của L.
- Các phƣơng pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử.
- Phƣơng pháp điện di xung trƣờng (PFGE.
- Phƣơng pháp ribotyping.
- Phƣơng pháp đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD.
- Phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA (AFLP.
- Phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn sản phẩm PCR (PCR-RFLP.
- Phƣơng pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR.
- Phƣơng pháp phân tích đa hình số lƣợng các vùng lặp của nhiều locus (MLVA.
- Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST.
- Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST.
- Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà.
- Cơ sở dữ liệu về phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus (MLST.
- Một số phƣơng pháp phân tích phát hiện L.
- Phƣơng pháp nuôi cấy.
- Ảnh hƣởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh.
- Phƣơng pháp miễn dịch.
- Phƣơng pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR.
- Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP.
- Phát hiện sản phẩm LAMP.
- Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả phản ứng LAMP.
- Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LAMP để phát hiện L.
- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Địa điểm nghiên cứu.
- Đối tƣợng nghiên cứu.
- Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Phân lập L.
- monocytogenes từ mẫu thực phẩm.
- Phản ứng Real-time PCR.
- Phản ứng PCR.
- Tối ƣu hóa phản ứng LAMP.
- Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP.
- Xây dựng quy trình phân tích L.
- monocytogenes trên mẫu thực phẩm.
- Phƣơng pháp xử lý thống kê theo phần mềm excel.
- Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L.
- monocytogenes phân lập từ một số thực phẩm Việt Nam.
- monocytogenes từ các mẫu thực phẩm.
- Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L.
- monocytogenes phân lập.
- Xây dựng quy trình phân tích nhanh L.
- monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP.
- Xây dựng phản ứng LAMP.
- Tối ƣu phản ứng LAMP.
- Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm.
- So sánh các phƣơng pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trƣờng L.
- Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phƣơng pháp đối với mẫu thực phẩm tăng sinh.
- Ảnh hƣởng của lƣợng mẫu lấy tách chiết DNA cho phản ứng LAMP.
- Đề xuất quy trình phân tích.
- Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L.
- Sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.
- Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.
- Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.
- 142 7 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ tiếng anh Tên tiếng Việt AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Đa hình chiều dài các đoạn DNA ALOA Chromogenic Listeria Agar according to Ottaviani and Agosti Môi trƣờng chọn lọc Listeria có chỉ thị màu đƣợc phát triển bởi Ottaviani và Agosti UVM University of Vermont Enrichment Broths Môi trƣờng tăng sinh UVM BLEB Buffered Listeria Enrichment Broth Môi trƣờng tăng sinh BLEB HF Half Fraser Broth Môi trƣờng Half Fraser aw Water activity Hoạt độ nƣớc bp Base pair Cặp bazơ CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen Phản ứng CAMP CDC Center for Disease Control and Prevention Trung tâm phòng chống và kiểm soát dịch bệnh CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleotide Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid Axit Ethylen Diamine Tetraacetic EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide ISO International Organization for Standardization Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa USDA-FSIS United States Department of Agriculture-Food Safety Inspection Service Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm soát an toàn thực phẩm Mỹ FDA U.S.
- Food and Drug Administration Cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống 8 kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu trúc vòm MVLST Multi-virulence-locus sequence typing Phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen gây độc MLST Multi-locus sequence typing Phân loại dựa trên trình tự nhiều locus PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối phosphate PCPLC Phosphatidylcholine phospholipase C Phosphatidylcholine phospholipase C PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN PEG Polyethylene glycol Polyethylene glycol PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Kỹ thuật điện di xung trƣờng RAPD Randomly amplified polymorphic DNA Đa hình dựa trên khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA TAE Tris - Acetate - EDTA Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris - EDTA PA Positive agreement Tƣơng đồng về mẫu dƣơng tính NA Negative agreement Tƣơng đồng về mẫu âm tính ND Negative deviation Sai khác về mẫu âm tính PD Positive deviation Sai khác về mẫu dƣơng tính AC Relative accuracy Độ chính xác tƣơng đối SP Relative specificity Độ đặc hiệu tƣơng đối SE Relative sensitivity Độ nhạy tƣơng đối PCR-RFLP PCR-restriction fragment length polymorphism Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn sản phẩm PCR rep-PCR Repetitive element PCR Khuếch đại các trình tự lặp MOX Modified Oxford Agar Môi trƣờng Oxford Agar cải biến MLVA Multiple-locus variable number of tandem repeat analysis Phân tích tính đa hình số lƣợng các vùng lặp của nhiều locus PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Điện di xung trƣờng MLEE Multilocus enzyme electrophoresis typing Phân loại theo phổ điện di nhiều enzyme CC Clones complex Dòng phức hợp 9 EC Epidemic clones Dòng phức hợp gây bệnh DI Simpson's Diversity Index Chỉ số phân loại Simpson VNTRs Variable numbers of tandem repeats Đa hình số lƣợng các vùng lặp ST Sequence type Kiểu trình tự TSBYE Tryptic Soy Broth Yeast Extract Môi trƣờng dịch chiết nấm men và trypton từ đậu tƣơng 10 DANH MỤC HÌNH Hình 1-1.
- MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30%.
- Vi khuẩn L.
- monocytogenes trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm đƣợc bảo quản lạnh trong thời gian dài.
- Nhiều loại thực phẩm đƣợc bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn.
- Thêm nữa càng ngày ngƣời ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ đƣợc nguyên vẹn hƣơng vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
- Vì vậy, các sản phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L.
- Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L.
- Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L.
- monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam.
- monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam vẫn là một ẩn số.
- Phƣơng pháp ISO phát hiện L.
- monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy.
- Một số các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR, real-time PCR hoặc các phƣơng pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã đƣợc tiêu chuẩn hóa.
- Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích.
- monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới.
- 15 Ở Việt Nam, phƣơng pháp tiêu chuẩn TCVN phát hiện L.
- monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa.
- Đã có một số nghiên cứu về phƣơng pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất.
- Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”.
- Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L.
- monocytogenes phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
- Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L.
- monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP.
- Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L.
- Phạm vi nghiên cứu tập trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L.
- Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm.
- Bên cạnh đó việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L.
- monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L.
- monocytogenes hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam.
- Từ đó có thể giúp các nhà quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tƣợng vi khuẩn nguy hiểm này.
- Tính mới của luận án  Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
- monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam  Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật LAMP cho phát hiện L.
- monocytogenes xảy ra, khi đó vi khuẩn này mới đƣợc xác định là một nguyên nhân gây bệnh listeriosis từ thực phẩm [104].
- monocytogenes hiện đƣợc công nhận là một vi khuẩn có nguy cơ cao trong ngành công nghiệp thực phẩm .
- Hiện nay đã phát hiện đƣợc 17 loài (L.
- Nhiều nghiên cứu cho thấy, L.
- Sáu loài này có sự khác biệt rất rõ ràng về kiểu gen và kiểu hình, chính vì vậy các phƣơng pháp phát hiện tiêu chuẩn L

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt