Phân lập và xây dựng phương pháp định lượng một số xanthon trong vỏ quả măng cụt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 10 Mục tiêu của luận văn: 1.
- Nghiên cứu chiết tách và nâng cao hàm lượng xanthone trong mẫu dịch chiết vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.
- Xây dựng được phương pháp định lượng một số xanthone trong dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Tên thông dụng: Măng cụt (tên tiếng Anh: Mangosteen).
- Hình ảnh về sản phẩm thực phẩm chức năng được chế tạo từ vỏ quả măng cụt 1.4.
- Trong quá trình nghiên cứu khả năng chiết tách các hợp chất phenolic của các dung môi từ vỏ quả măng cụt, các nhà khoa học là Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên [51] đã đưa đến kết luận là dung môi tốt nhất cho việc chiết rút các hợp chất thứ sinh thuộc dạng phenolic từ vỏ quả măng cụt đó là methanol và ethanol và dịch chiết methanol và ethanol từ nguyên liệu vỏ quả măng cụt không chỉ chứa các hợp chất flavonoid mà còn có alkaloid, curmarin, tanin.
- Trong khi đó, vỏ quả măng cụt chứa trong phần tan trong nước khoảng 13,61% tanin và 15,49% không phải tanin.
- Hoạt tı́nh chống oxy hóa Năm 1994, Yoshikawa và cộng sự nghiên cứu rằng chiết xuất bằng methanolic từ vỏ quả măng cụt được các chất α và γ-mangostin có tác dụng chống oxy hóa [61].
- Mặt khác, năm 2002, Leong và Shui đã làm phép so sánh tổng thể khả năng chống oxy hóa của 27 hoa quả hiện có ở thị trường Singapore, bao gồm Măng cụt, sử Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 26 dụng thí nghiệm ABTS và DPPH đã thể hiện rằng các chiết xuất từ vỏ quả măng cụt đứng thứ 8 trong hiệu quả chống oxy hóa [22].
- Năm 2006, Weecharangsan và cộng sự đã nghiên cứu ra rằng sự chống oxy hóa và đặc tính bảo vệ hệ thần kinh của 4 chiết xuất được lấy từ vỏ quả măng cụt (nước, 50% ethanol, 95% ethanol và ethyl acetate).
- Năm 2007 Chomnawang đã chỉ ra rằng chiết xuất vỏ quả măng cụt bằng ethanolic có khả năng chống oxy hóa rất cao.
- Họ đã nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của 6 xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt và thấy rằng garcinone E là độc nhất.
- Năm 2003, Matsumoto và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 6 xanthone ( α, ß và γ-mangostin, mangostinone, garcinone E và 2-isoprenyl-1, 7-dihydroxy-3-methoxy xanthone) được cô lập từ vỏ quả măng cụt gây sự ức chế tăng trưởng tế bào của tế bào bệnh bạch cầu HL60 trên con người.
- Các chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt có hoạt động mạnh nhất với giá trị IC50 là µg/mL [27].
- Năm 2006, Jung và các cộng sự đã phân lập từ vỏ quả măng cụt được 2 xanthone mới (8-hydroxycudraxanthone G và mangostinone) cũng như 12 xanthone được biết đến trước đó.
- Cùng năm đó, Suksamrarn và các cộng sự phân lập từ vỏ quả măng cụt được ba xanthone mới (mangostenones C, D và E) cũng như 16 xanthone đã được biết đến.
- Năm 2002, Nakatani và cộng sự đã kiểm tra tác dụng của các chiết xuất từ vỏ quả măng cụt (trong ethanol-nước tỉ lệ 40%, 70% và 100% thể tích).
- Tất cả các điều trên cho thấy các xanthone được chiết xuất từ vỏ quả măng cụt có thể là một nguồn chất có tác dụng chống viêm và chống dị ứng tốt.
- Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus Một số nghiên cứu đã chứng minh tính chất kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus của các xanthone và chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 31 Tới năm 1997, Chanarat và cộng sự đã tìm thấy rằng các polysaccharides thu được từ chiết xuất vỏ quả măng cụt có thể kích thích hoạt động của các tế bào thực bào đa nhân chống lại vi khuẩn Salmonella enteritidis [3].
- Tới năm 2003, Suksamrarn và cộng sự đã nghiên cứu tiềm năng chống lao của các xanthone prenylated thu được từ vỏ quả măng cụt.
- Trong số này, các chất chiết xuất từ vỏ quả măng cụt cho tác dụng ức chế mạnh nhất, với giá trị MIC 0,039 µg/mL đối với các vi khuẩn [8].
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 33 Hình 1.4.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 34 PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.
- Quá trình chiết tuân theo định luật Nerst: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 35.
- Trong đó: KA : Hằng số phân bố của chất tan trong hai pha lỏng CA : Nồng độ chất tan trong pha lỏng A CB : Nồng độ chất tan trong pha lỏng B Quá trình chiết thực vật  Lựa chọn dung môi chiết Thông thường, các chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật có độ phân cực rất khác nhau.
- Dung môi dùng trong quá trình chiết được chọn lựa rất cẩn thận, nó cần có khả năng hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ (bằng chưng cất thu hồi dung môi), có tính tương đối trơ (không phản ứng hoặc làm biến đổi chất nghiên cứu), ít độc hại, khó cháy nổ.
- Ngoài ra, các dung môi này cũng cần được làm sạch (bằng chưng cất) trước khi sử dụng trong quá trình chiết nhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất đến quá trình chiết.
- Methanol và Ethanol là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình này, chúng có độ phân cực cao hơn các hydrocarbon có nhóm thế.
- Sau quá trình chiết, các dung môi được tách và thu hồi bằng thiết bị cất quay chân không ở nhiệt độ từ 30- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 36 40°C.
- Quá trình chiết hồi lưu dung môi sử dụng thiết bị chiết Soxhlet Đây là phương pháp chiết nóng (có gia nhiệt) bằng cách đun hồi lưu dung môi với mẫu rắn trong một thời gian hoặc một số lần chu trình bay hơi – ngưng tụ của dung môi.
- Phương pháp này có ưu điểm là nhanh chóng, tiết kiệm dung môi, có thể chiết nhiều lần hoặc với nhiều dung môi.
- Quá trình ngâm chiết Ngâm mẫu rắn vào dung môi được lựa chon trong một thời gian để các chất cần nghiên cứu phân bố từ mẫu rắn vào dung môi rồi đem lọc thu dịch chiết (chiết nguội).
- Hạn chế của phương pháp này là việc sử dụng một lượng tương đối lớn dung môi.
- Tuy vậy, điều này có thể khắc phục được bằng việc thu hồi và tái sinh dung môi bằng các thiết bị chưng cất.
- Sau đó sử dụng các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau để rửa giải từng phần cấu tử có độ phân cực tương ứng.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 39 Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng tới hiệu quả tách.
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tách mà pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được tráng lên chất mang dạng tấm mỏng (thường là bản nhôm mỏng), pha lỏng thường là một hệ dung môi có độ phân cực xác định để đưa chất nghiên cứu chuyển dịch dọc theo hệ sắc ký nhờ hiện tượng mao dẫn.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 40 2.5.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 42 PHẦN III: THỰC NGHIỆM 3.1.
- Lựa chọn dung môi ngâm chiết Vỏ quả măng cụt sau khi được sấy khô và nghiền nhỏ, lấy 50g mẫu bột tiến hành ngâm chiết với các dung môi ngâm chiết khác nhau.
- Các dung môi ngâm chiết được khảo sát là: methanol, ethanol 95% và nước.
- Quy trình khảo sát dung môi chiết để lựa chọn dung môi tối ưu cho quá trình chiết được tiến hành như sau.
- Thêm vào mỗi bình nón 500mL lần lượt các dung môi khác nhau: methanol, ethanol 80% và nước cất.
- Tiến hành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 8 tiếng đồng hồ với mỗi dung môi trên.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 43 - Tiến hành song song thí nghiệm tương tự bằng 3 dung môi trên với điều kiện có gia nhiệt ở 40°C và rung siêu âm trong bể siêu âm và cường độ 75.
- Dịch chiết sau quá trình ngâm được thu gom và cất loại dung môi trong máy cô quay chân không để thu được các cặn chiết.
- Bảng 3.1: Điều kiện khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện ngâm chiết Dung môi Methanol Ethanol 95% Nước Methanol (có siêu âm, gia nhiệt) Ethanol 95% (có siêu âm, gia nhiệt) Nước (có siêu âm, gia nhiệt) Khối lượng mẫu (g Thể tích dung môi (mL Thời gian ngâm (h Kết quả khảo sát hiệu quả chiết với các dung môi và điều kiện chiết được đưa ra trong bảng 4.1.
- Dung môi được lựa chọn là ethanol.
- Lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết Tiến hành khảo sát tương tự thí nghiệm trên với dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau của hỗn hợp ethanol – nước .
- Khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết Ethanol 50% Ethanol 60% Ethanol 70% Ethanol 80% Ethanol 95% Khối lượng mẫu (g Thể tích dung môi (mL Thời gian ngâm (h Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi cũng được đưa ra trong bảng 4.1.
- Dung môi được lựa chọn là ethanol với nồng độ 80% thể tích trong nước.
- Cặn chiết thu được sau quá trình ngâm chiết bằng ethanol được chuyển vào 2 bình chiết dung tích 2000mL, mỗi bình hòa tan với 1L nước và tiến hành chiết 3 lần với 1L dung môi n-hexane.
- Các dịch chiết được thu gom rồi cất loại dung môi trên máy cô quay chân không, thu được các cặn chiết nước (RW1) và cặn chiết n-hexane (RH1).
- Sơ đồ quy trình chết tách xanthone từ vỏ quả măng cụt bằng dung môi ethanol 80% và làm sạch bằng lỏng – lỏng được biểu diễn trong hình 3.1.
- Sơ đồ quy trình chiết tách và làm sạch xanthone từ vỏ quả măng cụt Các cặn chiết sau mỗi quá trình được kiểm tra sự có mặt của các hoạt chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với các chất chuẩn đối chứng .
- Nghiên cứu các điều kiện nâng cao hàm lượng xanthone Với yêu cầu nâng cao hàm lượng Xanthone tổng, cặn chiết Ethylacetate tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký Silicagel, với hệ dung môi n-Hexane:Acetone (gradient n-Hexane:Acetone từ 40:1 đến 10:1v/v).
- Các hệ dung môi và tỉ lệ tương ứng được giới thiệu trong bảng 3.2.
- Các hệ dung môi và tỉ lệ dung môi sử dụng trong quá trình sắc ký phân đoạn Hệ dung môi nHexane Acetone Ethanol 80% Phân đoạn H 5000mL.
- Đầu tiên cột được rửa 3 lần bằng 5L n-Hexane để loại các chất kém phân cực, sau đó tiến hành rửa giải nhóm Xanthone theo các phân đoạn bằng cách sử dụng các hệ dung môi gradient n-Hexane:Acetone với tỉ lệ tăng dần độ phân cực.
- Mỗi hệ dung môi tiến hành rửa giải 3 lần với 5L, dịch rửa giải mỗi phân đoạn được thu gom, cất thu hồi dung môi và thu cặn khô.
- Hình 3.3: Sơ đồ quy trình sắc ký phân đoạn làm giàu hàm lượng Xanthone trong dịch chiết Ethylacetate của vỏ quả măng cụt Các cặn khô thu được sau quá trình phân đoạn (sau đây gọi là các cặn phân đoạn) sau đó được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng và xác định hàm lượng xanthone trên máy sắc ký lỏng cao áp kết hợp khối phổ (LC/MS).
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 48 3.3.
- Xác định hàm lượng các xanthone bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Hàm lượng Xanthone từ dịch chiết vỏ quả măng cụt và cặn chiết được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems, sử dụng cột sắc ký tiêu chuẩn C18, pha động sử dụng hệ dung môi: Methanol (0,1% acid acetic.
- Sử dụng hệ dung môi pha động: MeOH (0,1% acid acetic.
- Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị chất chuẩn: mẫu chất chuẩn được pha trong hỗn hợp dung môi MeOH và CHCl3 thành nồng độ 2 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau để thiết lập đường chuẩn định lượng.
- Chuẩn bị mẫu cao chiết ethylacetate măng cụt: cao chiết được cô quay, cân để xác định khối lượng, sau đó được pha loãng trong hỗn hợp dung môi MeOH và CHCl3.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 50 3.3.2.
- Định lượng hàm lượng các xanthone trong các mẫu cao chiết ethylacetate vỏ quả măng cụt Tiến hành thực nghiệm với phần cặn khô sau khi loại dung môi của các phân đoạn sắc ký cột.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 52 3.4.1.
- Lựa chọn dung môi và điều kiện ngâm chiết Độ phân cực của các dung môi ngâm chiết có tác động đáng kể trong việc chiết tách các hợp chất xanthone từ mẫu thực vật.
- Bảng 4.1: Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện ngâm chiết Dung môi Methanol Ethanol Nước Methanol (có siêu âm, gia nhiệt) Ethanol (có siêu âm, gia nhiệt) Nước (có siêu âm, gia nhiệt) Khối lượng mẫu (g Thể tích dung môi (mL Thời gian ngâm chiết 8h×3 lần 8h×3 lần 8h×3 lần 8h×3 lần 8h×3 lần 8h×3 lần Khối lượng cặn chiết (g Hiệu quả chiết.
- Kết quả khảo sát dung môi ngâm chiết cho thấy, những dung môi phân cực và hòa tan tốt như methanol và ethanol đạt được hiệu quả cao trong việc hòa tan và lôi kéo xanthone khỏi mẫu bột khô (7,5% và 6,68.
- Dung môi nước cho hiệu quả chiết không cao (2,32.
- Điều này được cho rằng: do độ phân cực để hòa tan và khả năng phá vỡ thành tế bào bị gỗ hóa trong mẫu thực vật của dung môi này là không đủ đáp ứng.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 56 Mặt khác, dung môi ethanol có giá thành rẻ, ít độc hại hơn so với dung môi methanol.
- Với yêu cầu chế tạo các cao chiết cho các nghiên cứu phục vụ mục đích dược dụng, dung môi ethanol đã được lựa chọn.
- Dung môi ethanol sau đó tiếp tục được khảo sát để lựa chọn nồng độ ngâm chiết tối ưu.
- Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết Ethanol 50% Ethanol 60% Ethanol 70% Ethanol 80% Ethanol 95% Khối lượng mẫu (g Thể tích dung môi (mL Thời gian ngâm (h Khối lượng cặn chiết (g Hiệu quả chiết.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 57 Hình 4.1: Biểu đồ tương quan nồng độ dung môi ethanol và hiệu quả chiết Sử dụng dung dịch chứa 80% ethanol đạt được hiệu quả chiết khá cao: 6,64% khối lượng cặn chiết so với tổng khối lượng mẫu thực vật.
- Tuy nhiên, dung dịch ethanol 80% có ưu điểm là ít bay hơi hơn dung môi ethanol 95% trong quá trình ngâm chiết với thời gian dài và có gia nhiệt mà vẫn đạt hiệu quả tương tự.
- Mặt khác với giá thành rẻ, có thể pha chế từ dung môi thương phẩm là ethanol 95% dùng cho thực phẩm, dung môi ethanol 80% đã được lựa chọn là dung môi chiết cho quá trình.
- Quá trình chiết được tiến hành nhiều lần Ethanol 50% Ethanol 60% Ethanol 70% Ethanol 80% Ethanol 95%Hiệu quả chiết (%)Nồng độ dung môi Ethanol Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 58 sử dụng dung môi thu hồi, tổng hàm lượng xanthone sau quá trình chiết trong cặn chiết ethylacetate đạt 47,5%.
- Để nâng cao hàm lượng xanthone, cặn chiết ethylacetate được đưa hấp thụ trên cột silicagel rồi rửa giải với các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau chia thành các phân đoạn (xem hình 3.3).
- Các dung dịch rửa giải sau khi rời cột được cất loại dung môi thu cặn khô rồi định lượng trên máy sắc ký lỏng khối phổ HPLC/MS.
- Hình 4.2: Biểu đồ tương quan hàm lượng xanthone tổng trong các phân đoạn sắc ký Như vậy, với phương pháp sắc ký cột nhồi sử dụng chất liệu silicagel và rửa giải bằng hệ dung môi gradient trên, có thể thu được các cặn chiết riêng biệt của từng phân đoạn.
- Ở các phân đoạn tiếp theo là S4, S5 và S6, do đã loại bỏ hầu hết các thành phần kém phân cực và sử dụng dung môi với độ phân cực trung bình, phần lớn lượng xanthone đã được rửa giải khỏi hệ thống, hàm lượng xanthone tổng đạt mức cao.
- Định lượng hàm lượng xanthone trong mẫu cặn chiết vỏ quả măng cụt Kết quả sắc ký đồ LC/MS của các chất chuẩn và mẫu cặn khô được giới thiệu trong hình 4.2: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 60 Hình 4.3.
- và mẫu cặn chiết ethylacetate từ vỏ quả măng cụt (B), (C).
- Đặc biệt hợp chất 9-hydroxycabalaxanthone (4) có ái lực với cột Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 61 khá mạnh, do đó cần hệ dung môi pha động là methanol 100% để rửa giải hoàn toàn khỏi cột ở thời gian lưu 39,5 phút.
- Qua đó, việc phân tích hàm lượng các xanthone trong các cao chiết ethylacetate từ vỏ quả măng cụt đã được thực hiện.
- Kết quả phân tích hàm lượng xanthone trong các phân đoạn khác nhau của dịch chiết vỏ quả măng cụt được giới thiệu trong bảng 4.4.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 64 Bảng 4.4: Kết quả phân tích hàm lượng các xanthone trong các phân đoạn khác nhau của mẫu dịch chiết vỏ quả măng cụt Chất chuẩn Phân đoạn S2 (mg/g) Phân đoạn S3 (mg/g) Phân đoạn S4 (mg/g) Phân đoạn S5 (mg/g) Phân đoạn S6 (mg/g) 8-Deoxy Gartamin Gartamin α-Mangostin Hydroxy cabolaxathone Tổng Xanthone Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng cao của α-mangostin trong nhóm xanthone, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã được công bố: α-Mangostin là hợp chất chiếm tỷ lệ chủ yếu và tiêu biểu cho lớp hợp chất xanthone phân lập từ vỏ quả măng cụt.
- Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 65 DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm.
- Hình ảnh về tác động của mẫu cao chiết măng cụt lên các dòng tế bào MCF7 và SK-LU-1 được thể hiện trong hình 4.6.
- Hình ảnh tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư MCF7 và SK-LU-1 của mẫu cao chiết măng cụt so với đối chứng âm Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thành Trung 66 Kết quả tác dụng ức chế tế bào ung thư của chế phẩm cao chiết măng cụt được đưa ra trong bảng 4.5.
- Bảng 4.5: Kết quả thực nghiệm Xác định hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư SK-LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú) và Jurkat (ung thư bạch cầu) của mẫu cao chiết vỏ quả măng cụt.
- Đã Thu thập được mẫu vỏ quả măng cụt và xác định được tên khoa học là Garcinia mangostana L.
- Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sử dụng đầu dò DAD kết hợp phổ khối phun mù điện tử ESI-MS, đã xây dựng được phương pháp xác định hàm lượng các xanthone: 8-Deoxy Gartamin (1), Gartamin (2), α-Mangostin (3), 9-Hydroxy cabolaxathone (4) trong mẫu cặn chiết ethylacetate và chế phẩm cao chiết vỏ quả măng cụt.
- Với các điều kiện sau: Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems, sử dụng cột sắc ký tiêu chuẩn C18, pha động sử dụng hệ dung môi: Methanol (0,1% acid acetic

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt