Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam

- 6 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI BÙI THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2013 0 Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1.
- Thư viện Tạ Quang Bửu- Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 1 MỞ ĐẦU Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố sinh học cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá nóc độc, động vật biển.
- Trong những năm gần đây, TTX đã được nghiên cứu sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê.
- Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự nghiên cứu thành công việc sử dụng TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổ truyền để làm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan (Đào Cẩm Tú, 2009).
- Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học.
- Tuy nhiên, giá thành của sản phẩm TTX tổng hợp hóa học cao, độ tinh sạch thấp, không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc độc.
- Vì vậy, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc độc hoặc động vật biển.
- Do hàm lượng TTX từ cá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao.
- Hơn nữa, trữ lượng của các loài cá nóc độc ngày càng giảm, trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng (Yu Chun-Fai et al, 2004).
- Gần đây, một số nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một triển vọng mới, cho phép chủ động sản xuất TTX trong phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô công nghiệp.
- Thu nhận TTX từ vi sinh vật có độ tinh sạch cao, giá thành giảm.
- Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên 2 cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam.
- Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình công nghệ từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định tính chất, độc tính TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam.
- Nội dung nghiên cứu.
- Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam.
- Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX.
- Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn.
- Xác định tính chất và độc tính của TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn.
- Những đóng góp mới của Luận án: Lần đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống về TTX từ vi khuẩn (từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từ vi khuẩn.
- Trong đó, phần Mở đầu (1 trang), Chương 1- Tổng quan tài liệu (27 trang), Chương 2 – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang), Chương 3- Kết quả và Biện luận (50 trang), Kết luận và kiến nghị (1 trang), Danh mục các công trình nghiên cứu của tác giả (1 trang), Tài liệu tham khảo (8 trang), Phụ lục (43 trang).
- Không bền trong môi trường kiềm và môi trường acid mạnh (Yamashita M.Y, 2001.
- Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam TTX là thành phần quan trọng trong các liệu pháp cai nghiện.
- Nhu cầu hàng năm lượng TTX để sản xuất Thiên Thanh Hoàn trong điều trị cai nghiện, trong sản xuất thuốc gây mê, gây tê là rất lớn (Đào Cẩm Tú, 2009.
- NGUỒN THU NHẬN TETRODOTOXIN * Tetrodotoxin từ động vật biển Trên thực tế, TTX có ở nhiều động vật khác nhau như: bạch tuộc đốm xanh, ếch, cua Xanthid, ốc biển, cá nóc, nhuyễn thể.
- TTX từ vi sinh vật biển Xu hướng sử dụng TTX trong y dược để sản xuất thuốc ngày càng phổ biến.
- Những năm trước đây, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc (hoặc động vật biển).
- Do hàm lượng TTX từ cá nóc không cao (1kg trứng cá nóc độc có thể tách chiết được 0,01 g TTX) nên giá thành của TTX rất cao.
- Mặt khác, nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng, trữ lượng của cá nóc cũng ngày càng giảm, nên nghiên cứu giải pháp mới để thu nhận TTX là cấp thiết.
- Một số nghiên cứu đã thu nhận được TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn ở các môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
- Các nghiên cứu trên là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật ở quy mô phòng thí nghiệm cũng như quy mô công nghiệp.
- CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TETRODOTOXIN TỪ CÁ NÓC * Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học 5 Năm 1972, Kishi và cộng sự đã tổng hợp thành công TTX theo phương pháp hóa học, đã thu nhận được TTX.
- Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy thu nhận và tinh sạch TTX từ cá nóc độc còn gặp nhiều khó khăn do chưa chủ động được nguồn nguyên liệu (sản lượng khai thác cá nóc độc ngày càng giảm, hàm lượng TTX có trong các mô cá nóc phụ thuộc theo giai đoạn sinh trưởng, mùa vụ, vùng địa lý và theo loài).
- Vì vậy, hướng nghiên cứu sinh tổng hợp TTX từ vi sinh vật là hướng đi triển vọng và bền vững, hứa hẹn đáp ứng được nhu cầu sử dụng TTX ngày càng tăng trong thực tiễn.
- THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT Các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật mới chỉ dừng ở công đoạn tách chiết, tinh sạch TTX phục vụ cho quá trình phân tích, nhận dạng TTX từ dịch nuôi cấy vi sinh vật (B.A.
- Nghiên cứu của Deng Y và cộng sự (2008), Yu Chung Him (2007) chú ý tìm điều kiện nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX hàm lượng cao nhất, chưa làm rõ các công đoạn tách chiết, công nghệ tinh sạch và hàm lượng TTX tinh sạch (Deng Y et al, 2008.
- 6 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.
- VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1.
- Cá nóc độc: Ba loài cá nóc độc Việt Nam thuộc nhóm có độc tính mạnh, sản lượng lớn: Cá nóc vằn Takifugu oblongus.
- Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus.
- Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris.
- Vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật được phân lập từ 4 mô (trứng/tinh sào, gan, ruột, da và thịt) của ba loài cá nóc độc Việt Nam: cá nóc vằn, cá nóc xanh chấm cam và cá nóc đầu thỏ mắt to.
- Thiết bị nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Hải sản, Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường ĐHBK Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Việt Nam, Đại học Kitasato - Nhật Bản.
- Hóa chất và môi trường nghiên cứu 2.1.3.1.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Các loại môi trường dịch thể: môi trường Marine, môi trường TYP, môi trường ORI, môi trường Zobell, môi trường TCBS, môi trường MT1, môi trường MT2.
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.
- Phương pháp xác định độc tố của 3 loài cá nóc độc bằng HPLC: Phân tích độc tố TTX bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Kodama và Shigeru SATO (2005) (Masaaki Kodama et al, 2005).
- Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng TTX từ vi sinh vật 2.2.2.1.
- Phương pháp tách chiết 2.2.2.2.
- Phương pháp phân tích trên LC-MS: Dung dịch thu được sau khi giải hấp khỏi than hoạt tính được định mức thể tích, sau đó lấy một lượng nhỏ đem chiết pha rắn với SPE C18 và đưa vào máy LC-MS [80].
- Phương pháp xác định tính chất của TTX: TTX kết tinh được đem hòa tan trong dung môi 4%CD3COOD/D2O.
- Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật trên 4 bộ phận của 3 loài cá nóc đã lựa chọn 2.2.3.1.
- Thu thập mẫu: Ba loài cá nóc độc biển Việt Nam thường bắt gặp là Lagocephalus lunaris, Torquigener pallimaculatus, Takifugu oblongus được thu thập tại Cát Bà- Hải Phòng, Nha Trang-Khánh Hòa.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ mô cá nóc: Theo phương pháp pha loãng tới hạn (nồng độ pha loãng 10-1, 10-2.
- Phương pháp phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 2.2.5.
- Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX 2.2.6.
- Phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX: Thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch trực giao cấp 2, tối ưu hóa khả năng sinh độc tố của chủng được lựa chọn theo phương 8 pháp lên dốc của Box-Wilson (Nguyễn Doãn Ý, 2009).
- Các phương pháp thực hiện nội dung nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi vi khuẩn 2.2.7.1.
- Tách chiết độc tố TTX từ ngoại bào của dịch nuôi vi khuẩn: Trên cơ sở phương pháp của Yu Chun-Fai và cộng sự có cải tiến [93].
- Phương pháp tách tạp chất khỏi dịch độc tố thô bằng than hoạt tính 2.2.7.3.
- Nghiên cứu tinh sạch độc tố TTX bằng sắc ký lọc gel: Tiến hành tinh sạch độc tố bằng sắc ký lọc gel Bio-gel P2.
- Nghiên cứu tinh sạch độc tố TTX bằng sắc ký lọc ái lực Bio-Rex 70: Các thí nghiệm đã được tiến hành bằng sắc ký ái lực Bio-Rex 70.
- Phương pháp phân tích định tính TTX bằng sắc ký bản mỏng (TLC): Phân tích TTX bằng TLC theo phương pháp của Chun-Fai Yu và cộng sự (2004).
- Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từ vi sinh vật 2.2.8.1.
- Phương pháp phân tích xác định tính chất TTX: Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp nối ghép khối phổ và detector tử ngoại để xác định thành phần các chất trong mẫu (Yamashita M.Y, 2001.
- Phương pháp kiểm tra độc tính cấp của TTX Xác định LD50 của chế phẩm TTX trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfiel – Wilcoxon được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Y Hà Nội (Litchfield.
- PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 3.1.1.
- Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá nóc độc Bảng 3.1.
- Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể cái ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam Hàm lượng độc tố trong các mô cá nóc cái (mg/kg), n=30 Độc tố Tên loài Ruột Gan Thịt Da Trứng Tổng TTX Loài Loài TTX Loài Loài Loài Epi -TTX Loài Loài Loài Anhy- TTX Loài Loài Loài Tổng TTX Loài Ghi chú: Loài 1: Cá nóc vằn Takifugu oblongus Loài 2: Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus Loài 3: Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris 10 Bảng 3.2.
- Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể đực ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam Hàm lượng độc tố trong các mô cá nóc đực (mg/kg), n=30 Độc tố Tên loài Ruột Gan Thịt Da Tinh sào Tổng TTX Loài Loài TTX Loài Loài Loài Epi -TTX Loài Loài Loài Anhy- TTX Loài Loài Loài Tổng TTX Loài Kết quả nghiên cứu bảng 3.1 và 3.2 cho thấy.
- Trong mùa sinh sản, tổng hàm lượng độc tố TTX ở cá thể cái của cả ba loài đều cao hơn ở cá thể đực.
- Hàm lượng độc tố TTX khác nhau ở mỗi loài.
- Loài nóc vằn, tổng hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 3,8 lần ở cá thể đực.
- Loài nóc xanh chấm cam có hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 1,4 lần ở cá thể đực.
- Loài nóc đầu thỏ mắt to có hàm lượng TTX ở cá thể cái cao gấp 2 lần ở cá thể đực.
- Tổng hàm lượng độc tố TTX ở loài nóc xanh chấm cam là cao 11 nhất và thấp nhất là nóc thỏ mắt to.
- Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Văn Lệ (2006) trong nhóm 10 loài cá nóc độc rất mạnh ở Việt Nam, loài cá nóc xanh chấm cam đứng thứ nhất sau đó đến loài nóc vằn, tiếp đến loài nóc đầu thỏ mắt to (Nguyễn Văn Lệ, 2006.
- Ở cá nóc độc, hàm lượng độc tố TTX của các mô khác nhau có sự khác biệt, phụ thuộc vào loài, giới tính theo một quy luật chung như sau: Ở cá thể cái: Trứng có hàm lượng TTX cao nhất, sau đến gan, ruột, da và thấp nhất là ở mô thịt.
- Ở cá thể đực: Gan có hàm lượng TTX cao nhất, sau đến ruột, da, tinh sào và thấp nhất là mô thịt.
- Từ kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi lựa chọn cá nóc cái để thu nhận các mô, làm vật liệu phân lập vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX.
- Nghiên cứu xác định tính chất TTX thu nhận từ cá nóc độc Việt Nam 3.1.2.1.
- Phân tích TTX từ mẫu cá nóc Việt Nam trên HPLC Phân tích TTX từ các mẫu cá nóc thu được trên hệ thống HPLC-MS, sử dụng mẫu đối chứng là TTX chuẩn (Wako).
- Sắc kí đồ thu được của dịch chiết mẫu cá nóc và TTX chuẩn có đỉnh ở thời gian lưu 4,6 phút trùng khớp với TTX tách ra được từ các mẫu cá nóc.
- Xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc Việt nam Chất tách ra được từ quy trình chiết tách là tinh thể màu trắng, chuyển màu đen ở nhiệt độ trên 220oC.
- Kết hợp các dữ kiện phổ thu được với các tài liệu đã công bố trước đây, có thể kết luận chất tách được từ cá nóc Việt Nam là tetrodotoxin ở dạng hemilactal (Yamashita M.Y, 2001.
- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM Bảng 3.4.
- Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường từ cá loại mô cá nóc độc Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên các môi trường khác nhau Loài cá nóc ORI TCBS MT1 MT2 L.lunaris T.pallicumatus 22 4 0 0 T.oblongus 13 10 8 3 Tổng số Tổng số chủng sinh TTX 13 5 3 3 Tỷ lệ % chủng sinh TTX Kết quả phân tích định lượng 24 chủng vi sinh vật sinh TTX, có đến 10 chủng sinh hàm lượng TTX cao nhất, nhưng chủng M60 không phải là vi khuẩn, nên chỉ lựa chọn 9 chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX hàm lượng cao nhất để tiến hành nghiên cứu phân loại bằng hình thái và sinh học phân tử.
- Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao Kết quả phân loại Stt Kí hiệu chủng Mô phân lập Phân loại theo hình thái Phân loại sinh học phân tử 1 M3 Trứng Chi Vibrio Vibrio rumoiensis 2 M6 Trứng Chi Psychrobacter Psychrobacter nivimaris 3 M8 Ruột Chi Micrococcus Micrococcus alkanovora 4 M10 Gan Chi Pseudomonas Pseudomonas fragi 5 M19 Trứng Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas issachenkonii 6 M28 Trứng Chi Vibrio Vibrio rumoiensis 7 M30 Ruột Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas antartica 8 M37 Trứng Chi Shewanella Shewanella baltica 9 M43 Gan Chi Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas gracilis Trong số 9 loài vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao có 4 loài phân lập được từ mô trứng (M3 và M28 trùng lặp), 2 loài từ mô gan, 2 loài từ mô ruột.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ loài vi khuẩn sinh TTX nhiều nhất là mô trứng, sau đến mô gan, mô ruột.
- Ở các mô thịt, mô da phân lập được khá nhiều chủng vi sinh vật, chưa phát hiện chủng sinh hàm lượng TTX.
- NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX 3.4.
- TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX 14 3.4.1.
- Chọn miền khảo sát Để tối ưu hóa khả năng sinh TTX của chủng M37 theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố, sử dụng kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đơn lẻ trong phần 3.3.
- Hàm mục tiêu là khả năng sinh độc tố TTX của chủng M37 trong quá trình nuôi cấy.
- Ma trận thực nghiệm được bố trí như sau: Các yếu tố ảnh hưởng khả năng sinh TTX của chủng M37 được mô tả theo sơ đồ sau: Các yếu tố ảnh hưởng Hàm mục tiêu Khả năng sinh TTX chủng M37 - Môi trường ORI - Đệm phosphate - Nuôi lắc - Chất bổ sung: mô trứng cá nóc độc pH X1: 5 – 8 Nhiệt độ X2: 20 - 300C Thời gian X3: 2-5 ngày Chất bổ sung X4: 3-Hàm lượng TTX (µM) Để tìm được thông số kỹ thuật phù hợp với yêu cầu công nghệ, tiến hành tối ưu hóa mô hình trong miền biến thiên pH môi trường, nhiệt độ, thời gian, nồng độ chất bổ sung.
- Thiết kế và phân tích số liệu thí nghiệm bằng quy hoạch thực nghiệm, tối ưu hóa thí nghiệm theo phương pháp đường dốc

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt