GS.TS. ĐẶNG THỊ THU (Chủ biên) PGS. LÊ NGỌC TU PGS.TS. TÔ KIM ANH PGS.TS. PHẠM THU THỦY PGS.TS. NGUYỄN XUÂN SÂM Công nghệ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI GS.TS. ĐẶNG THỊ THU (CHỦ BỈÊN) PGS. LÊ NGỌC TÚ, PGS.TS. TÔ KIM ANH PGS.TS. PHẠM THU THỦY, PGS.TS. NGUYỄN XUÂN SÂM CÔNG NGH€ €NZYM NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NỘI CỈS.TS. ĐẶNG THỊ THU (CHỦ BIỂN) PGS. LÊ NGỌC TÚ, PGS.TS. TỔ KIM ANH PtỉS.TS. PHẠM THU THỦY, PGS.TS. NGUYÊN XUÂN SÂM CÔNG NGHỆ« ENZYM Chịu trách nhiệm xuất bản: Biên tập: Trình bày bìa: ĐồNG KHẮC SỬNG TS. NGUYẼN h u y TlẾN NGỌC TUAN NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trẩn Hưng Đ ạo “ Hà Nội In 400 bản khổ 16 X 24cm, tại Xí nghiệp In NXB Văn hóa Dân tộc Số đăng ký kế hoạch XB: 235 - 2012/CXB/253 ■- 13/KHKT, cấp ngày 06/3/2012. Quyết định XB số: 43/QĐXB - NX8KHKT, cấp ngày 15/5/2012. In xong và nộp lưu chiểu Quý III năm 2012. ời nối đẩu Enzym là chất xúc tác sinh học, tức là chất xúc tác được sản xuất ra do tế bào và vi tế bào. Là tác phẩm của tự nhiên, enzym có bản chất protein có cấu trúc phân tử phức tạp và tinh vi, do đó enzym có iực xúc tác cực kỳ mạnh mẽ và có tính chọn lọc rất cao. Song khi chiết xuất ra ngoài, hoạt tính xúc tác của nó có thể giảm hoặc m ất đi khi điều kiện môi trường phản ứng không được duy trì như ở trong tế bào. Bằng cách nào có thể trích ly được enzym và thu được chế phẩm enzym có độ tinh khiết cao? Bằng phương pháp nào có thể chế tác được chế phẩm enzym ở đạng không hòa tan để sử dụng được lâu bền. Enzym hòa tan và enzym cố định khác nhau về động học nhu thế nào? Đặc điểm của thiết bị phản ứng enzym và nguyên tắc làm việc của điện cực enzym như thế nào? Phạm vi và hiệu quả sử dụng của enzym trong nền kinh tế quốc dân như th ế nào? Các vấn đề nêu ưên được trình bày trong các chương sau của cuốn sách “Công nghệ enzym Chương ỉ . Công nghệ thu chế phẩm enzym - GS. Đặng Thị Thu, PGS. Lê Ngọc Tú. Chương 2. Enzym cố định (enzym không hòa tan) - GS. Đặng Thị Thu Chương 3. Động học phản ứng enzym - PGS. Lê Ngọc Tú. Chương 4. Điện cực sinh học (cảm biến sính học) - GS. Đặng Thị Thu. Chương 5. Thiết bí phản ứng enzym - PGS. Tô Kim Anh. Chương 6. úng dụng chế phẩm enzym và triển vọng của công nghệ enzym: 3 - úng đụng chế phẩm trong cồng nghệ thực phẩm - PGS. Phạm Thu Thủy - ứng dụng chế phẩm enzym trong một số ngành công nghiệp khác - PGS. Nguyễn Xuân Sâm - Triển vọng của công nghệ enzym - PGS. Tô Kim Anh Cuốn sách này là giáo trình học tập cho sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm đại học Bách Khoa Hà Nội và một sô' trường đại học khác... Cũng như làm tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành Công nghệ hóa học, Công nghệ môi trường, Dược, Thủy sản, Nông nghiộp, và cho cán bộ nghiên cứu, quản lý ở các viện nghiên cứu có ỉiẽn quan. Các tác giả xin cảm ơn và mong nhận được những ý kiến đóng góp của các bạn đọc để cuốn sách được bổ sung và hoàn thiện hơn trong những lẩn in sau. H à Nội ngày 01 tháng 2 năm 2012 TM. CÁC TÁC GIÀ Chủ biên Đặng Thị Thu 4 i v i u9 c LUC • Lời nói đ ầ u ................................... ............................................................................. 3 C hương 1. CÔNG NGHỆ THU CHẾ PHAM ENZYM 1.1. Khái quát về enzym .......................................................................................7 1.2. Các đơn vị hoạt độ của enzym.....................................................................8 1.3. Nguồn nguyẽn liệu thu enzym..................................................................... 9 1.4. Phương pháp thu chế phẩm enzym vi sinh vật........................................ 14 C hương 2. ENZYM c ố ĐỊNH (Immobilized enzymes) 2.1. Khái niệm enzym cố định........................................................................... 67 2.2. Các phương pháp điều chế enzym cố định...............................................68 2.3. Một số đặc tính của enzym cô' đ ịn h .......................................................... 82 2.4. Úng dụng của enzym cố định......................................................................85 Chương 3. ĐỘNG HỌC PHẢN ÚNG ENZYM 3.1. Động học của Enzym m onom e.................................................................92 3.2. Động học của các enzym dị không gian và sự điều hòa của các enzym oligom e...................................................................... .............................127 3.3. Động học của các enzym cố đ ịn h ........................................................... 136 C hương 4. ĐIỆN c ụ c SINH HỌC (Cảm Biến Sinh Học) 4.1. Sơ lược lịch sử phát triển của ĐIỆN c ụ c SINH H Ọ C ........................160 4.2. Khái niệm về điện cực sinh h ọ c ............................................................... 161 4.3. Một số loại điện cực sinh h ọ c .................................................................169 4.4. úh g dụng điện cực sinh h ọ c.....................................................................195 C hương 5. THIÊT BỊ PHẢN ÚNG ENZYM 5.1 Thiết bị phản ứng gián đ o ạ n ..................................................................... 218 5.2. Thiết bị phản ứng liên tụ c .........................................................................220 5.3. Thiết bị phản ứng enzym dạng m àng..................................................... 226 5.4. Thiết bị phản ứng dạng c ộ t...................................................................... 227 5.5. Thiết bị phản ứng tầng sôi........................................................................ 230 5.6. Lựa chọn thiết bị phản ứng enzym ...........................................................231 Chương 6. ỨNG DỤNG CHẾ PHAM ENZYM VÀ TRIEN v ọ n g c ủ a CÔNG NGHỆ ENZYM 6.1. Úng dụng enzym trong công nghiệp thực p h ẩ m ............ ............... „...233 6.2. ứng đụng enzym trong một Số ngành công nghiệp k h á c ....................2 8 1 6.3. Triển vọng của công nghệ EN ZY M ....................................................... 300 TÀI LIỆU THAM K H Ả O ................................................................................... 319 6 CỈỈƯƠNG 1 CÔNG NGHỆ THU CHẾ PHAM ENZYM 1.1. KHÁI QUÁT VỂ ENZYM - Enzym là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hoà tan trong nước và trong dung dịch muối loãng. Enzym có phân tử lượng lớn từ 201.000 KDa nên không qua được màng bán thấm. - Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như axit đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng,... đều có thể làm enzym bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. - Enzym có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hoá học Enzym có cường lực xúc tác rất lớn: ở điểu kiện thích hợp, hầu hết các phản ứng có xúc tác enzym xảy ra với tốc độ nhanh gấp lo ’1-10“ lần so với phản ứng khòng có chất xúc tác. - lg pepsin phân giải đuợc 5kg protein trứng trong 2 giờ. - ỉg renin làm đông tụ được 72 tấn sữa trong sản xuất pho mát. - lm ol catalase phân huỷ được 5 .l0 6mol H20 ?/phút Crong khi đó 1 mol Fe+1chỉ phân huỷ 10‘6mol H20 2/phút, Enzym có tính đặc hiệu cao: Mỗi enzym chỉ xúc tác làm chuyển hoá được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu liên kết hoá học nhât định, và một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzym,hay còn gọi là tính chuyên môn hóa cao. Enzym có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra những sản phẩm phụ. Enzym tác dụrig trong điều kiện “êm dịu Enzym thường tác dụng thích hợp ở nhiệt độ 30-50()C, pH trung tính và ở ấp suất thường, không cần nồng độ axit hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu axit, kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền. 7 Tất cá các enzym có nguồn gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong còng nghiệp thực phẩm và y học. Các chế phẩm enzym được sán xuất từ nsuón nsuyẽn liệu dễ kiếm, rẻ tiền: - Enzym prolease động vậỉ thường thu nhận lừ các phụ phẩm lò mổ như : tụy tạng, dạ dày... - Enzym protease thực vật được thu từ vỏ, lá dứa, lá, thân, nhựa sung, vả, nhựa đu đủ xanh. - Enzym vi sinh vật được thu nhận bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc bề sâu. 1.2. CÁC ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM Đơn vị hoạt độ của một enzym được coi là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hoá được m ột lượng cơ chất nhất định, trong một đcm vị thòi gian nhất định, ở điều kiện tiêu chuẩn. Theo quy ước quốc tế có m ột số đơn vị hoạt độ sau: 1. Đơn vị w ịđơn vị quốc tê) Là lượng enzym có khả nãng xúc tác chuyển hoá được một micromol cơ chất sau thời gian một phút ờ điều kiện tiêu chuẩn: II u = 1 n M cơ chất (lO^M/phút) 2. Đơn vị katal (kat) Là lượng enzym có khả nâng xúc tác chuyển hoá một mol cơ chất sau thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn: lk at = ỈM ol cơ chất / giây. II u = 1/60 x l0 6kat =16,67 nkat. Hoạt lực enzym hoặc hoạt lực xúc tác được biểu diễn bằng một số đơn vị hoạt độ enzym. 3. Hoạt độ riêng Hoạt độ riêng của một ch ế phẩm enzym được biểu diễn bằng sô đơn vị hoạt độ enzym trên đơn vị khối lượng protein: I u hoặc kat / 1 mg (ml) protein. 8 4. Hoạt độ phản tử (hoặc hoạt độ rièng phản tử) Được biểu diễn bằng số phân tử cơ châì được chuyển hoá bởi một phan tử enzym sau một đơn vị thời gian (thường là phút). 5. Ilo ạ t độ tám Xi1C tác Là số phân tử cơ chất bị chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động sau mội phút. 6. Hoạt độ kcat (hoạt độ xúc tác) Là lượng phân tử cơ chất lớn nhất dược chuyển hoá bởi 1 phân tử enzym trong 1 đơn vị thời gian (giây) ở điều kiện enzym được bão hoà cơ chất. 7. Tỷ lệ kcat/km Là hiệu năng xúc tác của enzym (catalytic efficency) biểu hiện tính đặc hiệu của enzym với các cơ chất khác nhau. 1.3. NGUỔN NGUYÊN LIỆU THU ENZYM Enzym là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợp hoá học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Trong hàng trăm enzym được sử dụng trong công nghiệp hơn một nửa được sản xuất từ nấm mốc và nấm men, trên một phần ba từ vi khuẩn, còn lại từ 8% nguồn động vật và 4% nguồn thực vật. 1.3.1. Enzym động vật Một số mô động vật chứa nhiều enzym: Dạ dày, tụy tạng, tim, gan, Lá lách... Tụy tạng: là cơ quan chứa nhiều enzym nhất như amylase, mantase, lipase, cholesterol esterase, excitinase, nuclease, trypsin, kimotrypsin, cacbocylpeptidase A, B, elastase. Tất cả các enzym này được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy. D ạ dày: Màng nhầy của dạ dày lợn, chó, gà, thỏ, chứa pepsin A,B,C,D (dạ dày lợn nhiều nhất) riêng dạ dày lợn con có gastrinsin (enzym thuỷ phân protein). 9 Ngàn thứ tư của dạ dày bò chứa loại vi khuẩn tổng hợp cellulase. Dạ dày của loài động vật có sừng non (bé, nghé) chứa renin (enzym làm đông lụ sữa trong sản xuất pho mát). R uộỉ: enzym ở ruột được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch ruột: Enterokinase, ỉactase, am inopeptidase, V V... mantase, saccarase, nuclease, phosphatase, G an: Là cơ quan chứa nhiều enzym có chung ở mọi cơ quan, còn thấy những hệ enzym chỉ riêng gan mới có: Enzym tham gia tổng hợp urẻ, chính nhờ sự phong phú về enzym này mà gan tham gia nhiều quá trình trao đổi chất. Người ta ví gan như một phòng thí nghiệm trung tâm của cơ thể. Tuyến nước bọt: Trong nước bọt ngoài các enzym tiêu hoá: Amylase, mantase, còn chứa enzym có tên Kalicrein, enzym này tác dụng lên globin a -2 Kali-dinogen để giải phóng ra kalidin là một decapeptít có tác dụng làm tăng sự tiết nước bọt. H uyết th a n h : Trong huyết thanh chứa nhiều enzym, bình thường hoạt độ các enzym này không lớn. M ột số enzym được coi như là chỉ thị để theo dõi bệnh tật đó là : - Amylase (tăng khi viêm tụy cắp). - Phosphatase kiềm (tăng khi bị còi xương, tắc mật). - Transaminase (tãng khi viêm gan, nhồi máu cơ tim). Mặc dù m ọi cơ quan động vật đều chứa enzym, song thổng thường người ta chỉ thu chế phẩm pepsin từ dạ dày lợn, renin từ dạ dày bê, pancreatin từ tụy tạng lợn. 1.3.2. Enxym thự c v ậ t Từ thực vật thượng đẳng có thể thu được một số enzym thuỷ phân: - Papain từ nhựa đu đủ. - Bromelain từ thân, lá dứa chồi và vỏ đứa. Papain và bromelain có tác dụng giống nhau: Làm mềm thịt, đẩy nhanh quá trình thuỷ phân protein và dùng để phá đục protein trong bia, rượu. - Các enzym plazmin, papain, ficin thường có trong họ Ficus như sung, si, vả (nhựa quả, lá, thàn). - Các a , [3- amylase có trong malt đại mạch và malt thóc. - Urease có trong giá đậu tương, lipase có trong mầm hạt thầu đẩu. - Polyphenoỉoxydase có trong lá chè, chuyên hoá hợp chất polyphenol thành quinol tương ứng, có màu sắc đặc trưng của chè. - Peroxydase tác dụng với tanin tạo thành sản phẩm ngưng tụ không màu. - Ngoài ra trong lá chè còn chứa một sô' enzym protease, pectinase, amylase, invertase. Dưới tác dụng của những enzym này, xảy ra sự biến đổi các cơ chất tương ứng trong lá chè ở quá trình chế biến và góp phẩn tạo nên những chất mới tham gia vào sự hình thành chất lượng của chè (màu sắc và hương thơm). 1.3.3. Enzym vi sinh vật Đây là nguồn thu enzym rất phong phú. Từ vô số loài vi sinh vật, người ta có thể thu được rất nhiều loại enzym khác nhau, trong đó có những enzym mà cơ thể động vật và thực vật khống thể tổng hợp được. - Hộ enzym vi sinh vật có khả năng thay đổi bằng cách thay đổi điểu kiện nuồi cấy và dùng các tác nhân điều chỉnh. Từ một loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh một hoặc một số loại enzym nào đó theo ý muốn. - Vi sinh vật có khả nãng sinh sản, phát triển và sinh tổng hợp enzym với tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng lớn enzym trong thòi gian ngắn một cách đễ dàng. - Enzym vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzym từ các nguồn khác. Người ta đã tính rằng, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá lượng lớn thức ăn gấp 30-40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng. Trong khi đó hệ enzym của con lợn trên 50kg chỉ có thể chuyển hoá vài kg thức ăn trong một ngày. Bảng ỉ.ỉ. Một sò enzym quan trọng và nguồn thu chúng Mã số enzym Nguổn enzym Nội bào /ngoại bào (l/E) Calase 1.11.1.6 Gan ì Chymotrypsín 3.4.21.1 Tụy tạng E Lipase8 3.1.1.3 Tụy tạng E Renet' 3.4.23.4 Dạ dày bê E Trypsin 3.4.21.4 Tụy tạng E 3.4.22.14 Quả kiwi E + Thực phẩm a.Amylase 3.2.1.1 Malt đại mạch E +++ Đổ uống lên . men (brewing) p. Amylase 3.2.1.2 Malt đại mạch E +++ Rượu, bia Bromelain 3.4.22.4 Lá, vỏ dứa E p.Glucanase9 3.2.1,6 Malt đại mạch E 3.4.22.3 Nhựa sung, vả E 1.13.11.12 Đậu tương I Tên enzym Qui mô sản xuất s ử dụng trong công nghiệp 1. Enzym động vật Thực phẩm Thuộc da _! Thực phẩm + Pho mat Thuộc da 2. Enzym thực vật Actinidin Ficirt Lipoxygenase Rưọu, bia ++ Rượu, bia Thực phẩm Thực phẩm 3.4.22.2 Nhựa đu đủ E ++ a.Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Tinh bột p.Amylase 2.2:1.2 Bacillus E + Tinh bột Asparaginase” 3.5.1.1 Escherichia Coli I Glucose isomerase'1 5.3.1.5 Bacillus Steptomyces I ++ Siro fructose Penicillinamidase 3.5.1.11 Bacillus I - Dược Protease1 3.4.21.14 Bacillus E +++ Tẩy rừa Puilulanase* 3.2.1.41 Klebsiella, bacillus E - Tinh bột 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Bánh mỳ Papain Thịt 3. Enzym vi khuẩn Sức khoẻ 4. Enzym nấm sdi a. amylase Mã sò Tên enzym enzym Nguổn enzym Nội bào /ngoại bào (l/E) Qui mô sản xuảt s ử dụng trong cõng nghiệp Aminoacytase 3.5.1.14 Aspergillus 1 - c N dược Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus; Rhizopus E +++ Tinh bột Catalase 1.11.1.6 Aspergillus 1 - Thực phẩm Celiulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Chất thài Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Thực phẩm 1.1.3.4 Aspergillus 1 - Thực phẩm Lactase' 3.2.1.23 Aspergillus E - Sữa Lipase® 3.1.1.3 Rhizopus E - Thực phẩm Rennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ Fomat Pectinase" 3.2.1.15 Aspergillus E ++ đổ uống Pectínlyase 4.2.2.10 Aspergillus E - đổ uống Protease"1 3.4.23.6 Aspergillus E + Bánh mì Raffinase° 3.2.1.22 Mortierella 1 - Thực phẩm lnvertasep 3.2.1.25 Saccharauyces l/E - Mứt kẹo Lactase1 3.2.1.23 Kluyveromyces l/E - Sữa Lipase® 3.1.1.3 Candida E - Thực phẩm Raffinase0 3.2.1.11 Saccharomyces 1 Glucooxidase 5. Ervzym nấm men Chú thick. ĩ: - Enzym nội bào E: Enzym ngoại bào Dấu : +++>100 tấn/nãm; +>1 tấn/nãm ; ++>10 tấn/năm - <1 tấn/năm Thực phẩm e: triacylycerol lipase, k: glucan 1,4 alpha glucosidase f: chymosin g: endo-l,3(4)-beta-glucanase 1: beta-galactosidase h: xylose isomerase, n: polygalacturonase i: subtilisin o: alpha- galactosidase j: alpha dextrin endo-1,6 alpha glucosidase p: betafructofuranosidase m: protease aspartic từ vi sinh vật 1.4. PHƯƠNG PHÁP TH U CHẾ PHAM ENZYM VI SINH VẬT Qui trinh sản xuất chế phẩm enzym vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu sau: - Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật; - Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym; - Tách và tinh chế enzym. 1.4.1. Phân lập tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật 1.4.1.1. Phân lập và tuyển chọn Khả năng sinh tổng hợp enzym của các vi sinh vật rất khác nhau, do đó muốn có được chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp một vài loại enzym nào đó thì cần phải tiến hành phân lập từ đất, nước, không khí, từ một số thực vật, từ một số sản phẩm ..w . Hoặc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật có sẵn của đơn vị, nhằm tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh trương phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzym cần có cao, ổn định... 1.4.1.2. Cải tạo giống vi sinh vật Vì cấu trúc của mỗi protein enzym được tạo thành trong tê' bào đều được xác định bởi tính chất đi truyền của tế bào, do đó GÓ thể dùng các tác nhân đột biến tác động lên bộ máy di truyền của tế bào vi sinh vật để tạo ra các dạng biến chủng có khả nãng sinh tổng hợp đặc biệt cao một loại enzym nào đó. Thường có hai phương pháp đột biến tạo biến chủng. 14 a. Đột biển bồng các ỉác nhân vật ỉỷ hoặc hoá học - Các lác nhàn vât lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại), tia X (rơnghen), tia y, hoặc bán phá bằng hạt nơtron, electron. Trong đó người ta thường sử dụng nhất là tia cực tím (uv) - Tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin, nitrithydroxylamin, etylametylsunfonat. b. Đột biến bâng phương pháp sinh học phân ĩử • Phương pháp biến nạp Là sự truyền ADN tìr tế bào cho đến tế bào nhận, có thể xảy ra trong ống nghiệm khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà khòng cần có sự tiếp xúc giũa các tế bào. Các tế bào nhận có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chứ không đòi hỏi phải là ADN từ các nòi có quan hệ họ hàng. Tuy nhiên tế bào có thể nhận một số đoạn ADN nhất định (thường không quá 10 đoạn). Các đoạn ADN được truyền đi trong biến nạp có phân tử lượng vào khoảng 10ft-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Dùng phương phấp biến nạp có thể truyền các tính trạng khác nhau từ vi sinh vật này đến vi sinh vật khác trong đó có ĩính chất sinh tổng hợp enzym. • Phương pháp tiếp hợp gen Khác với phương pháp biến nạp, ở đây vật liệu di truyền (ADN) chỉ được truyền đi từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy, các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì không có khả năng tham gia tiếp hợp gen. Hiện tượng tiếp hợp mới chỉ được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như: E-coli, salmonella... • Phương pháp tải nạp Vật liệu di tmyền ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage). 15 Trong quá trình tải nạp các đoạn ADN được chuyển từ tế bào cho dến tế bào nhận tiếp hợp với ADN của tế bào nhận, do đó làm biến đổi tính chất di truyền cùa tê bào nhàn. Tóm lại, có thể dùng nhiều phương pháp di truyền vi sinh vật khác nhau để tạo các biến chủng vi sinh vạt có khả nãng sinh tổng hợp enzym cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu: papain, lipase (bột giặt), cellulase (íhuỷ phân cellulose), aspactinase (dùng trong công nghệ sữa)... 1.4.2. C ác phương p h á p nuòi vi sinh vật Về nguyên tắc có hai phương pháp nuôi vi sinh vật để thu chế phẩm enzym. 1.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy bề m ặt (phương pháp rắn, phương pháp nổi: solid state ferm entation) Vi sinh vật phát triển trên bề m ặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. M ôi trường dinh dưỡng này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, khô cẩm, cám mỳ, tấm gạo, ngỏ (chiếm 90-95% ) có bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (khoảng 5-10%) để làm xốp canh trường khiến oxy không khí dễ thâm nhập, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt. v ề cơ bản các nguyên liệu trên cung cấp đủ chất dinh dưỡng như : nitơ, cacbon, vitamin, muối khoáng cho vi sinh vật phát triển. Tuy nhiên muốn có môi trường dinh dưỡng tốt hơn có thể bổ sung thêm nitơ vô cơ: amonsulfat, natri nitrat, ure, hoặc nitơ hữu cơ như cao nấm men, cao ngô, dịch chiết malt,... và các chất cảm ứng tuỳ theo từng loại enzym. Trước khi gieo vi sinh vật, môi trường cần được làm ẩm đến 50-65% và thanh trùng la t ờ I20ữc để diệt vi sinh vật lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 304Ơ’C và tiến hành gieo cấy vi sinh vật, rói nuôi ở nhiệt độ 28-32°C trong 3648 giò. Trong điều kiện này hầu hết enzym được sinh tổng hợp. Phương pháp này cho nồng độ enzym cao hơn phương pháp chim, canh trường sau khi sấy khô vận chuyển dễ dàng, tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường và ít tốn điện nãng. Phương pháp có tính gián đoạn, chiếm nhiều diện tích nuôi cấy, khó cơ giới hoá và tự động hoá. Do đó năng suất thấp, tốn nhiều lao động thủ công. Ị. 4.2.2. Phương pháp nuôi chìm (Phương pháp Ịỏng; Phương pháp bề sâu: Liquid State ferm entation) Ở phương pháp này người ta cho vi sinh vật phát triển trong mối trường dinh dưỡng lỏng, có sục khí liên tục. Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp cho mỗi vi sinh vật để sinh tổng hợp ra một enzym này hay enzym khác là không giống nhau. Nói chung môi trường dinh dưỡng phải có thành phần dinh dưỡng chính sau: N guồn cácbon (hay nguồn năng lượng): chủ yếu lấy từ các loại đường dễ đồng hoá như: glucose, mantose, rỉ đường, hoặc tinh bột đã thuỷ phàn sơ bộ, ngoài ra có thể từ nguồn phi gluxit nhu: glycerol, các axit béo V V... N guồn nitơ: có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ. - Nitơ vô cơ : (N H4)2S 0 4, NaNO „ ( NH4) NOs, ure V V... Ngoài ý nghĩa cung cấp nitơ ra, thành phần và tính chất của muối vô cơ còn quyết định giá trị pH của môi trường nuôi. Nếu nitơ dưới dạng muối amôn, thì khi ion amoni (NH4+) được cơ thể vi sinh vật sử dụng, còn lại gốc anion, sẽ gây axit hoá môi truờng, ngược lại nếu nguồn muối vô cơ là nitrat thì khi vi sinh vật sử dụng anion (N O /), còn lại ion kim loại tự do sẽ gây kiềm hoá môi trường. Do vậy việc chọn nguổn nitơ vô cơ thích hợp cho vi sinh vật sinh tổng hợp được một enzym nào đó là rất đáng quan tâm. Nitơ hữu cơ: Thường là nước chiết malt, nước chiết ngô, hoặc cao ngô, cao nấm men, pepton, bột cá, khô dẩu. • M uối khoáng và vitamin: Môi trường đinh dưỡng nuôi chìm ngay cả khi sử dụng nguyên liệu tự nhiên (bột, tinh bột, cellulose) vân phải bổ sung muối vô cơ và một sô' vitamin cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển như: M gS04, K2H P 0 4, KH2P 0 4, K2S 0 4, F eS 0 4,... VitaminBị, B12, Biotin(Bj<). Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men. Sau đó đưa trực tiếp hơi nưóc nóng vào thanh trùng ỏ nhiệt độ 118-125(lc trong 45-60 phút. Hạ nhiệt độ và bổ sung vi sinh vật, nuôi 2-4 ngày. Quá trình nuôi được thực hiện 17 irong điều kiện sục khí liên tục và vỏ trùng tuyệt đối. Nuối cáy chìm thường tạo nhiều bọt, nên có thể sử dụng một số chất hoạt động bề mặt dể phá bọt như tween 20, axit oleic... Ớ phương pháp nuôi chìm, sự tiết các enzym vào môi trường xáy ra trong suốt quá trình phát triển. Đa số enzym thuỷ phân của nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn là những enzym ngoại bào, tuy dược tổng hợp nên ở bèn trong tế bào, sau dó mới tiết ra ngoài môi trường. Do đó khi kết thúc quá trình nuôi có thể lọc, loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch enzym, dem cô đặc được chế phẩm thô, hoặc tinh sạch tiếp theo. Tuy nhiên có một số enzym nội bào (enzym liên kết với các bào quan bên trong tế bào). M uốn thu được enzym cần phải phá vỡ tế bào đé tách enzym ra khỏi phần sinh khối tế bào. Do c0,0; I l— JTfcftfee law^jdii I-----1 I - AAUtết bw46mjjm Hinh 1.1. Sơ đổ thiết bj nuôi vi sinh vậ! để thu enzym bằng phưỡng pháp chim theo AUNSTRUP, 1979. Phương pháp chìm có ưu điểm: — Có tính liên tục tiết kiệm được điện tích sản xuất. 18 ÌJk Dễ cơ giới hoá và tự động hoá, do đó năng suất cao. - Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của mỏi trường. - Enzym thu được ít lẩn tạp chất. Song phương pháp chìm có một số nhược điểm: - Nồng độ enzym trong canh trường thấp, do đó phái cô đặc, nên giá thành cao. - Tốn nhiều điện năng do sục khí liên tục. Khi không đảm bảo dược vô trùng tuyệt đối thì dễ xảy ra sự nhiẻm toàn bộ khối môi trường. - Phương pháp nuôi chìm là một phương pháp tiến bộ và hiện đại được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước phát triển. Sơ đồ nuôi cấy chìm được biểu hiện ở hình ỉ . 1: Các thông số phải theo dõi trong thiết bị lèn men nuôi vi sinh vật để thu enzym. • Các thông số vật lý: - N hiệt độ'. Lượng nhiệt giải phóng ra bởi một thùng lên men có thể đạt đến 2-10fikcal /giờ. Do vậy phải làm nguội nhờ nước chảy thành dòng trong ống ruột gà bên trong thùng lên men. - pH'. pH phải được điều chỉnh liên tục bằng các điện cực nhạy và vô trùng. pH thường được duy trì bằng kiềm (NaOH, KOH, amoniac) hoặc bằng các axit vô cơ (phosphoric, sulfuric). - Bọt: Trong môi trường thường giàu protein nên khi khuấy và sục khí sẽ tạo ra nhiều bọt, có thể thêm các hợp chất dẫn xuất của dầu thực vật và dẫn xuất silicon để phá bọt. Tuy nhiên các sản phẩm này thường có ảnh hưởng xấu đến sự vận chuyển oxy, có thể gây độc đối với các vi sinh vật. Do đó phải chọn chất đáp ứng được các tiêu chuẩn thực phẩm hiện hành. - Oxy: đây ]à một thông số khó làm chủ ở quy mô công nghiệp. Khó khăn là do các quá trình của hộ “lên men - thùng lên men” tuân theo những quy luật có bản chất khác nhau, quá trình vật lý (sự chuyển khối), quá trình sinh lý (các vi sinh vật), quá trình hỗn hợp khi có sự tương tác giữa hai quá trình trên. 19 • Các ỉhông sỏ về sinh lý: - Cán bằng năng lượng : M ột phần lớn nãng lượng phát tán ra dưới dạng nhiệt cần phải thải bỏ. Với thùng lẻn men có dung tính lớn thì có thể hạn chế bằng cách làm lạnh ở bèn ngoài. Tốt nhất là sử dụng năng lượng này vào việc sinh tổng hợp enzym. - Á p suất CO 2 : Khí COz có m ặt trong suốt quá trình lên men. C 0 2có vai trò quan trọng trong các phản ứng cacboxyl hoá. C 0 2 có vai trò dương tính đối với một số quá trình sinh tổng hợp enzym (trường hợp amylase của B. Sultilis) trong những điều kiện này nếu sục khí (hiếu khí) quá mạnh sẽ không có lợi. - Á p suất oxy: Tác dụng của oxy sẽ khác nhau tuỳ theo ở giai đoạn sinh trưòng hay giai đoạn tổng hợp enzym. Chẳng hạn trong trường hợp sinh trưởng của E.coỉi và tổng hợp enzym penicillinacylase thì tỷ lệ oxy hoà tan cao sẽ thuận lợi cho sự sinh trưởng, nhưng lại bất lọi cho sự tổng hợp enzym. Trong trường hợp glucooxydase từ A.niger thì vai ư ò của oxy còn phức tạp hơn vì ở đây oxy với danh nghĩa là cơ chất. Trong trường hợp này sự tăng áp suất oxy sẽ làm tăng sự sinh trưởng và tăng sự bài xuất enzym đến cực đại, rồi sau đó giảm, mặc dù áp suất oxy liên tục tăng. - Cảm ứng - ức chế: TrongTĩiột số qúa trình tổng hợp ertzym người ta cần một chất cảm ứng (ví dụ cellulase đối với T.vỉnide) còn trong trường hợp khác người ta phải tránh sự có m ặt của các chất ức chế (glucose, hoặc axit amin) lúc đầu hoặc tránh sự xuất hiện của chúng trong quá trình lên men. - Khả năng trích ly: Trong trưòng hợp các enzym nội bào, thì sự dư thừa các nucleotit sẽ làm tăng độ nhớt giảm khả năng trích ly. Có thể ỉàm giảm hàm lượng của nó trong tế bào bằng cách làm giảm tỷ lệ sinh trưởng. 20 1.4.3. T ách, tin h ch ế enzim 1.4.3.1. Các dạng c h ế phẩm enzym Trong thực tế sản xuất các chế phẩm enzym có thể được sử dụng dưới các dạng khác nhau: chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuật hoặc chế phẩm tinh khiết tuỳ theo mục đích và yêu cầu sử dụng. • C hế phẩm thô - C hế phẩm thó từ canh trưởng lỏng Môi trucmg nuôi vi sinh vật sau khi lọc, nồng độ enzym rất thấp, nên bước đầu người ta phải cô đặc. Dịch lọc từ canh trường có nồng độ chất khô từ 4-6g/l được cô đặc lên đến 15-20g/l ở nhiệt độ 35(lc trong thiết bị có độ chân khồng cao. Sau đó cô tiếp ở nhiệt độ 40-45°C để đạt nồng độ chất khô 30-50g/l rổi bổ sung chất bảo quản như NaCl, glycerol, sorbitol, natribenzoat... ch ế phẩm thô thu được ở dạng lỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ thường từ 1-2 năm. Hoặc có thể bổ sung thêm chất ổn định vào dịch có nồng độ chất khô 30-40g/l. Sau đó sấy phun ở thiết bị có nhiệt độ đầu 120°c và đầu ra 40(,c sẽ thu được chế phẩm thố dạng bột. - C hế phẩm thô từ canh trường bề mặt Canh trường rắn sau khi nuôi vi sinh vật được đem sấy ở nhiệt độ 40°c đến độ ẩm còn khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm thô dạng khô. C hế phẩm thô có thế sử dụng trong một số lĩnh vực mà khỏng làm ảnh hưởng đến chất lượng màu sắc, và mùi vị của sản phẩm như: công nghiệp sản xuất rượu cồn, công nghiệp thuộc da, công nghiệp giấy, xử lý môi trường,— • C hế phẩm kỹ thuật: Là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzym tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa hỗn hợp một vài enzym chủ yếu. Chế phẩm kỹ thuật thưòĩig được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để gìữ màu sắc, hương vị và chất lượng sản phẩm. • Chè phẩm enzym tinh khiết: Trong chế phẩm này đã ioại hoàn loàn các protein và enzym tạp, chí còn lại duy nhất một enzym mong muốn. Các chế phẩm này chỉ dùng trong y học, nghiên cứu khoa học và phân tích. 1.4.3.2. K hu trứ của enzym Dựa vào vị trí khu trú của enzym trong tế bào, người ta chia làm ba nhóm chính: - Enzym ngoại bào: là enzym được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rổi sau đó mới được tiết ra ngoài Ịĩiô i trường trong quá trình nuôi cấy chìm. Đó là trưcmg hợp các enzym hydrolase. - E nzym nội b à o : là enzym được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào. Nói chung các enzym loại nàý thường có m ặt hoặc dưới dạng liên hợp, dưới dạng liên kết hoặc dưới dạng bị "nhốt" trong các bào quan của tế bào. - Các enzym periplasmic (là những enzym nằm ở xoang ngoài màng sinh chất nhưng trông màng tế bào) Hình 1.2. Cau tạo mặt cắt của vi khuẩn Gram (+) vã (-) có chứa periplasmic. Thực tế việc trích ly các enzym chủ yếu dành cho các enzym nội bào và enzym periplasmic. 22 Quá trình tách một enym có thể phân ra ba eiai đoạn lớn. - Giai đoạn 1: Trích ly: Sẽ cho một hổn hợp phân tử hoà lan. - Giai đoạn 2: Phân đoạn hỗn hợp dựa vào độ hoà tan, đoạn tha được gồm một họ các phân tử. - Giai đoạn 3: Tinh sạch bằng các phương pháp hoá lý, hoặc bằng các phương pháp sinh học đặc hiệu, cuối cùng sẽ thu được một phân tử enzym sạch. 1.43.3. Trích ly và tinh chê các enzym ỉ .4.3.3.A. Cư sở chung đ ể trích ly các enzym Để trích ly các enzym ra khỏi tế bào một cách dễ dàng trước liên người ta phải phá vỡ thành tế bào, màng tế băo và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hoá học khác nhau. Năng lượng cần thiết để phá vỡ tế bào phụ thuộc nhiều vào loại tế bào và chừng mực nào đó vào trạng thái sinh lý của cơ thể. Chẳng hạn một sô' loại tế bào như tế bào động vật, tế bào vi khuẩn gram âm (Azotobacter species) có thể bị phá vỡ dễ dàng bằng gây sốc thẩm thấu. Số khác như mấm men, nấm sợi, tảo xanh (lục) và một số vi khuẩn gram dương có vách tế bào và cấu trúc màng có khả năng chống chịu được áp suất thẩm thấu tới 20 atm, đòi hỏi năng lượng lớn hơn. Thường tốc độ potein được giải phóng ra khi phá vỡ tế bào bằng cơ học tỷ lệ với tổng lượng protein có khả năng giải phóng được: dp/dt= -kp (1.1) Trong đó: P: lượng protein còn được liên kết với tế bào; t: thời gian; k: hằng số tỷ lệ Tích phân từ P-Pm (lượng protein tối đa có khả năng được giải phóng) ở thời điểm 0 đến p = p, ở thời điểm t, ta có: > - / - * * pm p Do đó: 0 ln(P„/P,) = kí <•*> (1.3) và protein đã được giải phóng ra khỏi tế bào bằng; 23 Protein = Pm -P, (1-4) Thay (1.4) vào (1.3) ta được phương trinh sau: Pm In(------------■) = kt /1 P m -P i Phương trình thể hiện quá trình phá vỡ tế bào. Việclựa chọn phương pháp phá vỡ tế (L 5) bào có vai trò quan trọng nhất nhằm tránh làm ảnh hưởng đến các enzym. Các yếu tố thường ảnh hưởng đến hoạt tính enzym khi phá vỡ tế bào được tóm tắt trong bảng 1.2. Nhìn chung, trong các yếu tố này quan trọng nhất là nhiệt và lực cát. Bảng 1..2. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym trong quá trình phá vỡ tẻ bào T.T 24 Yếu tố Ảnh hưởng 1 Nhiệỉ Tất cả các phương pháp cơ học cẩn cung cấp một lưạng lân năng lượng đểu sinh nhiệt. Do đó làm lạnh là rất cần thiết đối với hầu hết các enzym. Sự có mặt của các cơ chất, các chất tưong tự cơ chất hoặc các polyol có thể làm bền enzym. 2 Lực cắt Lực cắt cần thiết để phá vỡ tế bào có thể làm phá huỷ enzym; đặc biệt khi có mãt các ion kim loại nặng hoặc khi có bể mặt phân chia với không khí. 3 Protein Việc phá vỡ tế bào sẽ không tránh khỏi làm giảm hoạt tính enzym.Tuy nhiên có thể làm giảm thiểu bằng cách làm lăng vận tốc quá trình trong điều kiện lạnh, Cũng có the sử dụng một lượng dư các cơ chất thay thế (ví dụ protein) tioăc các yếu tấ kìm hãm trong môi trường tách chiết. 4 pH Các dung dịch đệm có vai trò quan trọng. Sự có mặt của các cơ chất, các chất tuơng tự co chất, các potyol sẽ giúp cho việc ổn định enzym. 5 Hoá chất Một số enzym có thể bị biến tính do sự có mặt của chất tẩy rửa và dung môi. Các polyphenol từ thực vật là các yếu tố kim hãm enzym mạnh có thể khắc phục bằng cách sử dụng các chất hấp phụ như polyvìnylpyrolidone và axit ascorbic để làm giảm hoạt tính của polỹphẽnoloxydase. 6 Oxy hoá Các tác nhãn khử như axit dithìothreitol, có thể rất cần thiết. 7 Tạo bọt Các mạt phân cách giữa phạ lỏng -khí trong các bọt có thề phá huỷ hình thể enzym. 8 Tính độc của kim loại nặng Cảc ion kim loại nặng (sắt, đổng, niken...) đuọc nhiễm vào do khi lọc qua các thiết bị đồng hoá. các enzym có thể được bảo vộ khỏi sự vô hoạt bất thuân nghich này bằng cách sử dung tác nhân EDTA ascorbic, mercaptoethanol, ỉ .4.3 3.B. Các phươrig pháp phá vỡ tế bào B ỉ. Phương pháp cơ học a. Phá vỡ tể bào bằng sống siêu ám Khi xử lý các tế bào vi sinh vât ở dạng huyền phù bằng sóng siêu âm sẽ làm phá vỡ chúng trong chất lỏng. Sóng siêu âm chuyển động theo hình sin, có đặc điểm là cao tần (18kHz-1MHz) bước dịch chuyển nhỏ (dưới 50jam), vận tốc vừa phải (vài m .s ') và gia tốc rất lớn (tới 80000g), sóng siêu âm tạo nên hiện tượng sủi bong bóng khi tần số âm thanh đủ lón để tạo nên vô số các vi bọt (microbubles) tại các vùng tập trung sình khối trong chất lỏng. Các bọt sẽ lớn ỉẽn trong pha đãn (rarefying phase) của sóng âm thanh và bị xẹp đi trong pha nén. Bọt xẹp đi do các sóng gây sốc mạnh xuyên qua chất lòng. Toàn bộ quá trình hình thành và xẹp đi của các bọt khí do ảnh hưởng của các sóng âm thanh, tần số cao được gọi là hiện tượng sủi bọt trong chất lỏng. Việc xẹp các bóng bọt sẽ chuyển năng lượng âm thanh thành năng lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng ngàn atmosphere (300Mpa). Năng lượng này sẽ truyền chuyển động tới các bộ phận của tế bào. Các tế bào sẽ bị phá vỡ khi động năng của các bộ phân này trong tế bào lớn vượt quá độ vững chắc của vách tế bào. Một yếu tố khác làm tăng khả năng phá vỡ tế bào đó là vi dòng (microstreaming) có các gradien vận tốc lớn, tạo nên ứng suất biến dạng (shear stress) xuất hiện gần các bọt khí tạo thành do sóng siêu âm. M ột lượng lớn nãng lượng do dịch huyển phù tế bào hấp thụ được chuyển thành nhiệt. Do đó cần phải sử dụng hệ thống làm lạnh hiộu quả. Lượng protein đuợc giải phóng ra do sóng siêu âm thể hiện ở phương trình (1.5), hằng số (k) không phụ thuộc vào nồng độ tế bào và tỷ lệ với năng lượng âm thanh gần ngưỡng cần thiết để tạo sủi bọt. Sự tan rã bọt (disintegration) khống phụ thuộc vào tần số âm thanh, ngoại trừ tần số ngưỡng sủi bọt thì phụ thuộc vào tần số âm thanh. Sóng âm thanh dễ iầm biến đổi cấu trúc của một số enzym và phá huỷ enzym do bxy hoá các gốc tự do. Việc sử dụng các chất dọn gốc (radical scavenger) như N20 có khả năng làm giảm sự mất hoạt tính enzym. Hầu hết các phương pháp phá vỡ tế bào đều tạo các mảnh tế bào nhỏ, cản trở quá 25 trình xử lý sau này. Tuy nhiên sử dụng sóng siêu âm vản là một phương pháp phá vỡ tế bào phổ biến, hữu ích, đơn giản, sử dụng ở quy mô nhỏ. b. Plìá vỡ ĩế báo bcuĩg mảy dồng hoã cao áp Hiện nay có nhiều loại máy đồng hoá cao áp được sử dụng trong công nghiệp hoá chất, nhưng máy sử dụng để phá vỡ tế bào phổ biến là dạng Manton - Gaulin APV. Loại này gồm một bơm đẩy đê' đưa dịch huyền phù tế bào (khoảng 12 W /V) qua một van kiểm tra tói xilanh bơm. Tế bào được đẩy với áp suất tới 150Mpa (10 tấn trên 1 inch vuông) và với vận tốc dòng tới 10.000 L/giờ qua một van xả có miệng hẹp (hình 1.3). Các tế bào bị va chạm nén lại rồi bị nổ vỡ và giải phóng các chất chứa trong tế bào khi làm giảm áp đột ngột qua van kiểm tra. Vậy áp suất sử dụng và sự giảm áp đột ngột qua van kiểm tra là nhân tố chủ yếu phá vỡ tế bào. Do có miệng hẹp là phần then chốt của loại máy đồng hoá này nên nó khống thích hợp khi sử dụng để phá vỡ các cơ thể dạng sợi mà thường được sử dụng để phá vỡ các cơ thể đơn bào. Sự giải phóng protein được mô tả ở phương trình (1.5), nhưng thường ở đây, người ta thay biến số thời gian bằng số lượt (N) qua máy đồng hoá: I, (Pm/ (Pm- P,))-K N. Thông thường, ở áp suất dưới 75M Pa, hằng sớ K tỷ lệ với áp suất đã luỹ thừa (ví dụ: K = K ’P29 ở Sacharomyces cerevìsiae và K ^K ’P22 ở Escherichia coii, trong đó p là áp suất sử dụng ,và K ’ là hằng sô' tỷ lê). Rõ ràng là áp suất càng cao thì quá ưình phá vỡ tế bào càng hiệu quả. Hằng số tỷ lệ giải phóng protein (K) phụ thuộc vào nhiột độ. Quá trình phá vỡ tế bào nhanh hơn ở nhiệt độ cao. Ngoài tính dẽ vỡ của các tế bào, sự khu trú của enzym trong các tế bào cũng ảnh hưởng đến các điều kiộn sử dụng máy đổng hoá. Các enzym nội bào tự do có thể được giải phóng chỉ cần m ột lượt qua máy đổng hoá, nhưng các enzym liên kết với màng cần nhiều lượt để có thể thu được hiệu suất mong muốn. Các máy đổng hoá cao áp sử dụng hiộu quả đối với các cơ thể đơn bào vốn có các enzym không bền nhiệt. Các lực làm biến dạng tế bào không gây ảnh hưởng đến các enzym tự do trong dung dịch. Thiết bị đồng hoá có thể bị mòn. Do đó cần được chế tạo chính xác và bảo trì tốt. M áy đồng hoá M anton - gaulin xử lý liên tục có thể tới 250 dm V giờ. 26 Vòng điéu chinh Van điều chỉnh I. \ kích thước khe í . : fTỊ>r 1‘ - ị t ị ỉ - • I Hinh 1.3. Mặt cắt ngang của máy đổng hoá Manto- Gaulin. c. Phá vỡ tế bào bẵng cách nghiền hoặc khuấy với các bộtl hạt thuỷ tinh hoặc thép Khi huyền phù tế bào được lắc cùng với hạt bằng thuỷ tinh hoặc bằng thép nhỏ (thường đường kính 0,2-l,0m m ) thì tế bào sẽ bị phá vỡ do lực cất của chất ỉỏng cao và do va chạm với các hạt này. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzym có thể thay đổi do thay đổi vận tốc lắc và kích cỡ các hạt cũng như đường kính của thiết bị. Bất kỳ kiểu sinh khối nào dạng sợi đơn bào đều có thể bị phá vỡ bằng máy nghiền bi này nhưng nhìn chung các tế bào có kích thước lớn dễ bị phá vỡ hơn các vi khuẩn có kích thước nhỏ. Với cùng một thể tích hạt thì sử dụng một lượng lớn các hạt nhỏ sẽ hiệu quả hơn một lượng tương đối nhỏ các hạt lớn, vì nó làm tăng sự va chạm giữa các hạt và các tế bào. Thực tế cho thấy các hạt có đường kính lm m sẽ làm giải phóng nhanh chỏng các enzym periplasmic từ nấm men, còn các hạt có đường kính 0,25 mm thì làm giải phóng các enzym liên kết với màng của vi khuẩn tốt hơn. Động học quá trình giải phóng protein bàng máy nghiền hạt được thể hiện ở phương trình (1.5). Hằng số K phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ tế bào vi sinh vật, độ chất đầy hạt và kích cỡ của các hạt. 27 Nhìn chung chất đầy hạt sẽ làm tăng tốc độ giải phóng protein nhưng cũng làm tăng nhiệt và mức tiêu thụ năng lượng. Sự nâng nhiệt là một vấn đề chính khi sử dụng các máy nghiền dạng hạt trong trích ly, đặc biệt ở quy mô lớn (20L). Các máy quy mô nhỏ có thể được làm lạnh qua các lớp vỏ áo giảm nhiệt bao quanh khoang chứa hạt, nhưng các máy lớn hơn cần phải làm lạnh qua trục trộn và các bánh (đẩy) công tác. ở quy mô phòng thí nghiệm có thể nghiền tế bào với hạt thuỷ tinh bàng cối và chày. d. Phá vỡ t ế bào bằng phương pháp lạnh đông Huyển phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm lạnh đông ở -20°c, rồi nén dưới áp suất cao (khoảng 10-15tấn/ inch vuông) qua các lỗ hẹp của máy nén Hughes thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể đá. Tuy nhiên máy Hughes chỉ có thể sử dụng gián đoạn từng mẻ nhỏ (lOkg/giờ). B2. Các phương pháp phá vỡ t ế bào không bằng cơ học a. Sốc thẩm thấu Có thể làm dung giải tế bào bằng sốc thẩm thấu khi cho một huyền phù đậm đặc các tế bào vào trong một môi trường ưu trương (20% saccarose) trong nước ở 4”c , thì sẽ làm giải phóng ra một số hợp phần của tế bào. Kỹ thuật này rất nhẹ nhàng, không làm biến tính các protein, song do có nhiều vi sinh vật chống chịu được sốc thẩm thấu, nên kỹ thuật này chỉ dành sử dụng cho các vi khuẩn gram âm (-) như E.coỉi để trích ly các enzym thuỷ phân có trong xoang periplasmic (ngoại sinh chất). Trong những điều kiện này chỉ duy nhất có enzym thuỷ phân được trích ly ra, do đó sẽ đơn giản được quá trình tinh chế sau này. Tuy nhiên có ba lý do sau đây hạn ch ế áp dụng kỹ thuật này ở quy mô lớn: thể tích làm việc lớn (400dmschò 10 kg bột nhão tế bào), nhiều giai đoạn ly tâm, và luổn phải duy ư ì ỏr nhiệt độ thấp. b. Xử ìý kiềm Xử lý kiềm (ở pH giữa 11,5 và 12,5) sẽ làm thuỷ phân màng tế bào và do đó sẽ giải phóng các enzym. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng nếu enzym bền được trong môi trường kiềm ít nhất cũng từ 20-30 phút. Người ta 28 thường dùng phương pháp này để trích ly asparaginase từ Erwinia chrysanthemi. c. Sứ clụng chất tẩy rửa Trong điểu kiện pH, lực ion và nhiệt độ xác định, các chất tẩy rửa ở dạng ion như laurylsulfatnatri hoặc như tweeen 20và triton sẽ tổ hợp với lipoprotein màng tạo ra các mixen do đó sẽ làm cho màng tế bào trở nên có tính thấm, song cũng sẽ làm biến tính enzym. Với ý nghĩa này thì các chất tẩy rửa dạng ion thường tốt hơn. Các chất tẩy rửa như triton x-100 sử dụng riêng rẽ hoặc cùng với các chất khác như guanidin-HCl được dùng để trích ly các enzym liên kết màng rất có hiệu quả (cholesteroloxydase từ Nocardỉa spescies). d. Dung giải bằng enzym Lysozim thường thuỷ phân liên kết /? ( ỉ -4) glucosid của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn gram dương và gram âm. Lysozim thường được liên kết với EDTA để tạo phức vói canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacrit và phá huỷ tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram (-). Lysozim có trong nước bọt, trong lòng trắng trứng. Lysozim từ lòng trắng trứng là enzym dung giải duy nhất có thể sử dụng ở quy mô thương mại. Tuy nhiên kỹ thuật này chỉ áp dụng được ở quy mô nhỏ do các điểu kiện thao tác tinh tế và giá thành lysozim cao. ỉ .4.3.3.c . Phân đoạn và tinh chếem ym Dịch enzym thô thu được ở trên, ngoài enzym mong muốn, còn chứa nhiều loại enzym, protein không hoạt động và các tạp chất khác. Do đó khâu tiếp theo ở giai đoạn này là phải loại bỏ các enzym và protein tạp này nếu muốn thu được chỉ duy nhất m ột enzym nào đó. Để tách và tinh che enzym nói riêng và protein nói chung thường có một loạt các phương pháp hoá lý và hoá học khác nhau. Có thể chia ba nhóm phương pháp. - Các phương pháp kết tuả. - Các phương pháp sắc ký. - Phương pháp phân tách lỏng - lỏng. 29 C l. Các phương pháp kết tủa đ ể phán đoạn enzym (1 . Kết tủa đổnẹ điện Một protein hay một protein enzym thường hoà tan ít nhất ở điểm đẳng điện (pl) vì ở pl các phân tử protein enzym có tổng điện tích bằng 0, tức là không có lực đẩy tĩnh điện, nên các phân tử protein enzym sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa. Vì vậy có thể kết tùa đẳng điện enzym quan tâm cũng như các enzym và protein tạp khác. Lọc hay li tâm để thu hoặc loại bỏ các kết tủa. b. Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (Phương pháp diêm tích). Độ hoà tan của một protein enzym tăng cùng với lực ion(fi) của môi trường: ụ = m ( 2 ) c ,z ? Cị : nồng độ của loại ion i; Z j: điện tích của loại ion i đó. Tuy nhiên khi lực (J. vượt quá m ột ngưỡng nào đó thì độ hoà tan lại giảm nhanh và protein enzym có thể kết tủa. Như vây, với mỗi protein enzym sẽ có một khoảng nồng độ muối mà protein enzym đó bị kết tủa hoàn toàn, gọi là khoảng nồng độ muối tích. Khoảng nồng độ muối tích của các protein enzym thường không giống nhau. Dựa vào cơ sở này có thể tách và tinh chế enzym nhờ phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính. M uối thường dùng là sunfat amon, hoặc natri sunfat. Thao tác đơn giản. Chỉ cần thêm vào dịch có chứa enzym một thể tích muối (trung tính) bão hoà hoặc m ột lượng muối trung tính dạng rắn có được một độ phần trăm bão hoà nào đó của muối này. D ĩ nhiên là độ phần trãm bão hoà này sẽ làm kết tủa một protein enzym này hay enzym khác. Các đoạn protein enzym thu đượcsau đó phảỉ protein được loại bỏ muối bằng phương pháp thẩm tích hoặc phươiìg pháp lọc gel. Thường các khoảng nồng độ muổi tính tương ứng với các protein nói chung và protein enzym nói riêng hay trùng nhau nên protein enzym thu được sau kết tủa phân đoạn chưa thật sạch. 30 Có hai công thức dưới đây được dùng để lính lượng V ml thể tích dung dịch muối bão hoà hoặc lượng A gam muối rắn, phải thêm vào 100ml dung dịch chứa protein đã có độ bão hoà ban đầu là s để thu được một dung dịch 1 có độ bão hoà cuối là s 2. Y- 1.00 (Sạ- Si) 1 -S2 0,1 (S2 - S ,) .G Y = ----— -— -------l - [ S 2.Vg/1000] Trong đó: G: luợng (gam) amon sulffat trong 1000 ml dung dịch bão hoà. Thường G có các giá trị sau : 515g Ở0°c, 530,7g ở 15°c, 536,3g ở20°c Vg : thể tích riêng biểu kiến của dung địch amon sulffat bão hoà : Vg/1000 = 0,271 Ở 0 “c vỹ/1000 = 0,288 ở 15 (l c Vs/1000 = 0,29 ở 20(>c c. Kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ trung tính trộn lẫn được với nước vào dung dịch enzym, sẽ làm giảm hằng sô' điện môi của dung dịch. Vì vậy làm tâng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein làm cho các phân tử protein liên hợp lại tạo thành kết tủa. Tuỳ tính chất từng loại protein enzym, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa mà mỗi enzym được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau. Ví dụ: - Protease kết tủa bằng etanol ở nồng độ 76- 78% v/ V. - ơ amylase kết tủa bằng etanol ở nồng độ: 70% hoặc bằng izopropanol 55%, hoặc bằng axeton 60% v/ V. - Glucoamylase kết tủa bằng etanol ỏ nồng độ 45% v/ V. - Cấc dung môi hữu cơ được dùng phổ biến nhất để kết tủa là: etanol, izopropanol, aceton. 31 Một sô' dung môi sau khi kết lúa có thể chưng cất và thu hồi lại được. Tuy nhiên dung môi dễ làm vô hoạt enzym, nên quá trinh kết tủa phải được tiến hành nhanh ờ nhiệt dộ thấp (- 5°C). Phương pháp này thường được sử dụng cho các enzym ít bị biến tính bởi dung môi hữu cơ, và ít được dùng ớ quy mô lớn, do chi phí cao, dễ cháy. Hình 1.4: Sự tập hợp lại của protein do tương tác trong một hỗn hợp dung môi hữu cơ -nước. d. Thay đổi thành phán hoá học của môi trường đ ể lâm sạch enzym Khi thêm vào môi trường các chất đặc hiệu, người ta có thể thu được kết tủa của một số phân tử. Chẳng hạn một số muối kim loại (Mn+2) tác dụng với axit nucleic sẽ làm dễ dàng tách biệt các enzym nội bào. Thường trong các tế bào vi khuẩn hàm lượng axit nucleic tương đối cao (ví dụ ở tế bào E.coli axit nucleic có thể đến 7%) làm độ nhớt tăng sẽ ảnh hưởng đến giai đoạn tinh chế enzym, nhất là đến quá trình siêu lọc. Có thể kết tủa axit nucleic bằng các protein kiềm tính như protamin. Các protein tích điện dương sẽ kết hợp với nhóm phosphat tích điện âm của axit nucleic. Bằng cách này ta có thể tách enzym ra khỏi hợp chất với axit nucleic, prolamin nucleat tạo thành có thể loại bỏ bằng phương pháp li tâm. 32 Có thể dùng streptomycin sulfat, protaminsulfat hoặc cetyltrimetylamin bromua để khử axit nucleic, cũng có thể sử dụng nuclease (RNase và DNase) để thuỷ phân axit nucleic. e. Sứ dụng cấc chất trợ (supports) kết tủa enzym Đ ố i ^ L g á ^ ^ y x i y i g o ạ i bào, ử qụỵ niộ^ cộiig ^nghiệp người ta có thể thêm vào các chất như kiselgua (kieselguhr), tinh bột, lactose, dextransulfat hoặc ficoll để làm cho kết tủa tạo thành ở dạng hạt. Thường người ta dùng các chất này khi có mặt rượu, natri sulfat, axit tacnic. /'. Kết tủa bắng các polyme có khởi lượng phún tử cao Các polyme như dextran, polythylenglycol được sử dụng với nhiều mục đích: chất làm bển, chất làm đặc (bàng thẩm tính) hoặc là chất kết tủa. Các chất này thường rất háo nước nên sẽ làm mất vỏ nước của các phân tử sinh học dẫn đến làm thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh do đó mà ánh hưởng đến các tương tác không gian cuả các nhóm háo nước cùa các phân tử protein. Polythylenglycol được dùng với nồng độ 50% (w/w) trong nưức có thể làm kết tủa phán lớn các protein có nồng độ từ 6- 20%. Việc kết tủa phụ thuộc vào một số các yếu tô như nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và khối lượng phàn tử của các enzym. C2. Phương pháp sắc ký a. Khái niệm về sắc ký Thuật ngữ sắc ký để chỉ một tập các kỹ thuật phàn tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau cúa một hỗn hợp. Phcp phân tích kỹ thuật sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hoà tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thá rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất (hoà tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học. 33 Trong sắc ký hấp phụ các chất hoà tan được gắn vào pha tĩnh bằng liên kết có năng lượng yếu như liên kết kỵ nước, lực Vandervan. Trong sắc ký trao đổi ion, chất hòa tan mang điện tích được giữ bởi pha tĩnh cũng mang điộn tích bằng liên kết ion giữa các điện tích này. Trong sắc ký lọc gel chất hoà tan tuỳ theo kích thước một số phân tử khuếch tán được vào trong pha tĩnh xốp, một số phân tử khác đi ngoài pha tĩnh này. Trong sắc ký tương tác kỵ nước, các liên kết kỵ nưóc có thể tạo ra giữa pha tĩnh và chất hoà tan (chất hoà tan phải có phần kỵ nước trong phân tử). Trong sắc ký tương tác đặc hiệu sinh học, giữa pha tĩnh và chất hoà tan có thể tạo ra những tương tác sinh học đặc hiệu (enzym - cơ chất, kháng nguyên - kháng thể) pha tĩnh có thể được giữ trong một cột (sắc ký trên cột) hoặc trên m ột bình. Pha động ở đây là chất lỏng có khả nãng phá huỷ dần dần các tưcmg tác giữa chất hoà tan và pha tĩnh rồi kéo theo chất hoà tan cùng với nó. b. Sắc kỷ trao dổi ion ịion- exchange chromatography) Nhựa trao đổi ion là một khung vật liộu rắn không hoà tan, trên đó có gắn bằng liên kết đồng hoá trị với các nhóm ion hoá được. Các nhóm mang điộn tích này lại được liên kết với các ion đối và các ion đối lại có thể trao đổi thuận nghịch với các ion trái dấu. M ột khung có mang các nhóm tích điện dương và ion đối tích điện âm, được gọi là nhựa trao đổi anion. Ngược lại, một nhựa trao đổi cation sẽ mang điộn tích âm. Ngoài ra, các nhựa trao đổi thường khác nhau về bản chất hoá học của giá khung (là gel polysaccarit hay nhựa tổng hợp) cũng như về lực axit, bazơ của nhóm ion hoá được. Ba nhựa trao đổi ion được trình bày trong bảng 1.3. Các protein của một hỗn hợp cần phân tích thường có các nhóm bên ion hoá khác nhau dữ đó có pH khác nhau, ở m ột pH nhất định các protein sẽ có m ột điộn tích không giống nhau, do đó chúng được giữ nhiều hay ít bằng tương tác ion trên m ệt nhựa trao đổi ion đã cho và với m ột pha di động đã cho. 34 Báng 1.3. Bản chất hoá bọc của các loại nhựa Nhựa trao đổi DEAESephadex Hãng sản xuất Bản chất hoá học giá Khung Pharmacia AMBEUTEIR120 Rohm Haas CMSEPHAROSE Pharmacia Các mạch dextran đứợc liên kết chéo và Nhóm ton hoá C*H5 -OCH2CHj N H*/ C;H5 Khá năng trao đổi Chát trao đồi anion yếu Poiystyren đuạc iiên két cheo bằng divinylbenzen - S 0'3 sulfonat Chất trao đổi cation mạnh Agarose được liên kết cheo bằng 2,3 dipromopropanol - CH 2COOcacbonxymetyl Chất, trao đổi cation yếu. Qúa trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn. 1. Hấp thụ thuận nghịch protein - enzym cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion. 2. Khử hấp phụ các protein đã được hấp thụ: - Bằng cách thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion hoá và do đó thay đổi điện tích tổng của protein. - Hoặc bằng cách tăng lực ion và tãng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein enzym nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và ngược lại. Khi sử dụng gradient lực ion hoặc/và gradient pH thường làm tăng chất lượng của phép phân tách protein. Trong thực tế người ta thường dùng các dung dịch đệm: đệm phosphat, axetat, borat, citrat. Đề chiết (kéo) protein- enzym ra khỏi cột. Các protein enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phẫn chiết (phân đoạn chiết) khác nhau, trong đó phần chiết enzym cần thu có nồng độ cao nhất. Ngoài ra hiộn nay người ta củng thường sử dụng một số nhựa trao đổi ion từ các dẫn xuất của cellulose như: Nhựa trao đổi ion cationit: 35 - Cacboxyl metyl cellulose : (CM cellulose). - Phospho cellulose. - Sulfo etyl cellulose. - Sulfo metyl cellulose. Các,loại nhụạ trao dổi caùoiu.t di..Ị^e.UuỊQiỊe này ,thượng có ion trao đổi là H+ theo sơ đồ phân li như sau: X- CH2- COOH--------- X - C H X O O + H+ X: gốc cellulose Đe tinh sạch enzym kiềm tính, người ta thường sử dụng các cellulosecationit này. Nhựa trao đổi ion anionit: - Dietylaminoetyl cellulose(DEAE- cellulose). - Trietylamino etyl cellulose. Các loại nhựa này có nhóm trao đổi ion: OH (X) - CjHjNiQHj) +H20 ------(X) C2H4N+H(C2Ht)2+OH Với các enzym axit tính, người ta thường sử dụng các cellulose anionit này để táqh và tinh chế. Các nhựa đi từ các dẫn xuất của cellulose có kích thước lỗ ớn, sử dụng rất thích hợp để tách, tinh chế enzym ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên hệ số nén cao nên phần nào gây khó khăn khi tiến hành sắc ký. Để khắc phục nhược điểm trên, người la có thể sử dụng các dẫn xuất của agarose liên kết chéo như: Sepharose CL- 6B hoặc polyme tổng hợp: Trisacrvl có công xuất cao, hộ số nén không đáng kể, không thay đổi thể tích theo pH và cường độ ion, có thể tái tạo lại nhựa mà không cần tách khói cột. Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein eiưym vào nhựa trao đổi ion s i phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của protein, cũng như trang thái ion hoá c rrrrnrnTTra^OT Đối với những protein enzym không bị biến tính ở pH cao hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể dùng DEAE -cellulose(nhựa trao đổi anion) 36 còn đối với protein enzym không bị biến tính ở pH thấp hơn điểm đẳng điện của chúng thì có thể sử dụng ở CM- celluịose(nhựa trao dổi cation). Hinh 1.5: Hệ thống thiết bị sắc ký cột tách nhanh protein enzym (FPLC). c. Sắc ky loại trừ phân tử (Molecular exclusion chromatography). Sác ký loại trừ phân tử (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay sắc ký lọc gel) cho phép phân đoạn một số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế, ngoài kích thước ra, hình dạng của phàn tử cũng có ảnh hướng.Tuy nhiên, thông số này có thể bỏ qua nếu các protein trong hỗn hợp đều là hình cầu. Pha tĩnh là các hạt gel xốp chứa đầy trong cột. Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hỗn hợp có đường kính lớn hơn lỗ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bẽn trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ di ra khỏi cột trước cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel V(). Các phân tử bé nhất, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào trong hạt iícl và thế tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột V. Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào bên trong các h ạ t.S b iể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quãng dường đi (của chúng) vào bên trong các hạt càng dài thì kích thước lại càng nhỏ. Sự hoạt động của một chất theo khối lượng phân tử trong sắc ký loại trừ không gian đươc biểu diễn như hình 1.6. 37 logM chọn lọc Hình 1.6. Các hoạt động cửa một chất theo khối lượng phân tử trong sắc ký loại trừ (lọc gel). Đường biểu diễn cho thấy có tồn tại m ột vùng khối lượng phân tử được gọi là vùng thẩm thấu chọn lọc (selective permeation). Thay vì thể tích của Ve người ta thường dùng thông số KaV: Kav= (v ,-v 0)/(v’ - v„). Trong đó: V t - thể tích tổng của cột; V c - thể tích rửa; V0 -thể tích giữa các hạt geỉ. K av không phụ thuộc vào các kích thưóc của cột. Đường cong chọn lọc của một gel phụ thuộc vào bản chất và mức độ liên kết chéo của geĩ đó. Một gel thường có độ phân giải tối đa trong vùng phân đoạn tuyến tính của nó, do đó người ta chọn một gel như thế nào để vùng này tương ứng với khối lượng phân tử của protein cần tinh chế. Hơn nữa đưa vào mối quan hệ tỷ lệ giữa Kav và logM, người ta có thể xác định khối lượng phân tử của một protein theo đường chuẩn cùa các protein hình cầu, có khối lượng phân tử đã biết khi cho qua cột gel. K»«i ỉ Hình 1.7: Môì liên quan giữa K,v và khối lượng phân tử. 38 Gel được sử dụng rộng rãi nhất là gel sephadex và polyacrylamit. Sephadex là một loại dextran có ỉiên kết ngang giữa các mạch polysaccarit với nhau tạo thành mạng ỉưới ba chiều. Sephadex trung hoà điện tích nên không có tương tác anion cũng như cation, là một loại bột khô, không tan trong nước, nhưng khi ngâm nước sẽ truơng ra và tạo thành gel. Mắt lưới của các gel sephadex thường to nhỏ khác nhau, tuỳ theo mức độ liên kết. Nếu giữa các chuỗi polysaccarit có ít liên kết thì gel sẽ có mắt lưới lớn, ngậm nước nhiều và ngược lại. Dựa vào độ liên kết người ta chia sephadex làm 5 loại: sephadex G- 25, G- 50, G- 75, G - 100, G- 200 với kích thước lỗ gel khác nhau để tách. K,tcủa protein cán nghiên cáu Hình 1.8: Đồ thj M protein chuẩn. Sephadex thích hợp với từng phân tử cẩn tách thể hiện ở bảng 1.4. Bảng 1.4. Các loại sephadex Giổi hạn của phân tử bj loại trử hoàn toàn (Thao M phản tủ) Phạm vi phản tách các ' chất CÓM từ: G - 25 5.000 100 - 5000 G - 50 10.000 5 0 0 0 - 10.000 G - 75 50.000 10.000 -50.000 G -100 100.000 50.000-100.000 G - 200 200.000 100 000-200.000 Loại sephadex 39 Sephadex bền trong môi trường axit yếu và kiềm yếu, còn trong môi trường axit mạnh và kiềm mạnh thì các liên kết glucozit trong gel sẽ bị thuỷ phân. Tất nhiên sự thuỷ phân còn phụ thuộc vào thời gian. Ngược lại gel polyacrylamit là polyme của acrylamit và bisacrylamit có cấu trúc các liên kết ngang tạo ra một mảng xốp (giống bọt biển). Các chất phải chui vào lỗ gcl mới ra được, vì vậy những chất nào có khối lựợng phân tứ nhò ra trước và lớn ra sau. Sơ đổ di chuyển của các chất qua gel sephadex và gel polyacrylamit dược trình bầy ở hình 1.9. Hỏn h<íp protein có khỏi lưưng Dhàn tử lớn và nhỏ se p lu id ex Z £ T h ể tích rử a Hình 1.9: Sơ đồ di chuyển các chất qua gel sephadex và gel polycrylamit. 40 Tuy nhiên nếu sử dụng gel sephadex và polyacrylamit có kích thước lỗ lớn để tách enzym có khối lượng phàn tứ cao thì gel kém bền, nên người ta ít sử dụng ớ quy mô sản xuất lớn. Hiện nay người ta sử dụng một số loại gel bền hơn, dề phân đoạn các protein enzym có khối lượng trên 75.000Da. Các gel này thường là dẫn xuất của agarose(Sepharose CL và Superose) và dextran (Scphacryls) (do cóng ty Pharmacia Ltd sán xuất) hoặc từ hỗn hựp dẫn xuất của agarose,polyacryamit co liên kết ngang (Ultrogel AcA) (do công ty LKB intrument Ltd sán xuất), hoặc gel từ các chất đồng trùng hợp metacrylatglycol (do công ty Toyosođa sán xuất). Các gel này có khả nãng phân đoạn các enzym có khối lượng phân d. Sắc kỷ ái lực (affinity chromatography) Phương pháp sắc ký ái lực dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một enzym với một phân tử khác có tên là phối tử, dã dược gắn bung liên kết đổng hoá trị vào một chất mang khóng hoà tan chứa t ong một cột. Khi cho mội hỗn hợp protein có chứa enzym muốn làm sạch đi qua thì chí có enzym quan tâm bị giữ lại, còn tất cả các protein khác không tương tác dược với phối tử sẽ bị trôi ra khỏi cột (hình 1.10). Tiếp đó, enzym sẽ dược rứa giải ra bằng các phương pháp khác nhau. Các nhân tô' như chất mang, phối tử, phương pháp kết gắn phôi tử cũng như các điều kiện rửa giài enzym đều có vai trò quan trọng trong sắc ký ái lực. • C h át m ang(pha tĩnh): phải có một số tính chất sau: - Hoàn toàn không hoà tan irong pha di động. - Có độ hển về hoá học và sinh học. - Có độ cứng cơ học, có tính háo nước và tính thấm. K lông có các tương tác phi đặc hiệu. - Có chứa nhiều nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hoá trong các điều kiện nhẹ nhàng. 41 Các chất mang thường là các dẩn xuất của celllulose, các gel dextran, thuỷ tinh xốp... Tuy nhiên, người ta thường dùng agarose hoặc các gel hỗn hợp agarose và polyacrylamit vì chúng có thêm cả khả năng lọc gel. Phối tử (ligand): Phối tủ thường là những chất tương tự cơ chất của enzym muốn làm sạch, chất kìm hãm hoặc là cofactơ. Phối tử nói chung phải đặc hiệu với enzym và phải có một ái lực trung bình với enzym (kđ từ 10 ‘ 41 0 '* M). Nồng độ phối tử cũng phải được chọn thích hợp, vì nếu thừa phối tử sẽ gây ra những án ngữ không gian đáng kể. C án h tay đòn. Trường hợp khi phối tử là một phân tử nhỏ hoặc khi phân tử enzym quá lớn có thể gây ra sự “cồng kềnh không gian”thì phối tử sẽ được nối đài thêm bằng một đoạn “cánh tay đòn” để phối tử tiếp cận dễ dàng với tâm hoạt động của enzym. Cánh tay đòn thường được cấu tạo từ một mạch hydrrocacbon nhị chức có chiều dài từ 6 đến 8 cacbon. Cánh tay đòn ngắn nhất là axit aminocaproic và hexametylenamin. Hoạt hoá chất mang. Phối tử và cánh tay đòn phải được gấn lên chất mang. Chất mang trước tiên phải được hoạt hoá. Hoạt hoá với cyan bromua hoặc với glutaraldelhyd là hai phương pháp phổ biến. Cyan bromua (BrCN) sẽ phản ứng vói các nhóm hydroxyl của agarose chẳng hạn, để tạo ra m ột imidocacbomat, Và imidocacbomat dễ dàng tác đụng vói một amin bậc nhất của cánh tay đòn. M ột chất mang đã được hoạt hoá bằng CNBr, đã được gắn cánh tay đòn và phối tử, là paraaminobenzyl 1,3 Ịì D-gaỉactosid agarose thường được sử đụng trực tiếp để tỉnh chế /?-galactosidase. R ửa giải enzym. Sau khi loại bỏ các protein khác, enzym có thể được rửa giải ra khỏi cột vì lẽ phúc hợp của enzym vói phối tử có bản chất là phi đổng hoá trị và thuận nghịch. Dung địch đệm rửa giải thường phải: - Hoặc có chứa một phối tử (tự do) của enzym có khả năng cạnh tranh vói phối tử đang ở trạng thái liên kết với enzym. - Hoặc do pH của mình có thể gây biến tính thuận nghịch enzym do đó làm biến dạng tâm hoạt động cuả enzym. 42 Cũng có thể làm yếu tương tác đặc hiệu sinh học bằng cách thay đổi ion. Phối tử cạnh tranh (hoặc dung dịch đệm làm biến tính) sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích. < jg E : Chất kìm hãm cạnh tranh hoặc cơ chất, hoặc tương tự cơ chất : Enzym Hình 1.10. Sơ đổ nguyên tắc linh chế enzym bằng sắc kỷ ái lực. Hiện nay, phương pháp sắc ký ái lực nhóm được sử dụng rất phổ biến. Với phương pháp này, phối tử được gắn vào chất mang không chỉ dặc hiệu cho m ột enzym mà còn đặc hiệu cho một nhóm enzym. Chẳng hạn, Sepharose- A M P sẽ có ái lực với các kinase và cả với các dehydrogenase có NAD bởi iẽ phối tử AM P có một phần cấu taọ cùa các co- substrat: ATP và NAD của kinase và dehydro-genase. Sắc ký ái lực là một phương pháp tinh sạch enzym rất hiệu quả. Nó cho phép thu được enzym có độ sạch cao (gấp 10 lần so với sấc ký trao đổi ion) chỉ bằng một giai đoạn và trong một thòi gian ngắn. 43 Một số kỹ thuật mới dưới đây có thế được coi là những biến thể của sác ký ái lực. * Sắc ký ái lực giả (Pseudo afsinito chromatogaphy) hoặc sắc ký với phối tử là ihuốc nhuộm (Dyeligand chromatogaphy). Trong kỹ thuật sắc ký ái lực giả, hoặc sắc ký với phối tử là thuốc nhuộm, người ta dùng các thuốc nhuộm sợi tổng hợp làm phối tử tinh chế 200 cn/ym và các protein khác nhau. Các thuốc nhuộm như cibaèron xanh, procion đỏ, da cam A (orange A), vert A hoặc blue B dược gắn bằng lien kết dồng hoá trị vào agarose sẽ có khà năng hấp thụ các enzym có coíactư nucleotid. Cơ chế tương tác thì chưa hoàn toàn sáng tỏ nhưng các nchiẽn cứu động học đã chứng tỏ có sự kìm hãm cạnh tranh giữa các thuốc nhuộm và các en/.ym có coíactơ này. Hon thế, người ta còn thấy có sự giốne nhau vé cấu trúc giữa các phân tử NAD và cibacron xanh. Ưu điểm phương pháp là phối tử rất rẻ tiền và chất mang có thể sir dụng nhiều lần. * Sắc ký ái lực chelat kim loại (change transfer Metal chelatc affinity chromatography). Phương pháp sắc ký ái lực chelat kim loại (sắc ký ái lực chuvên giao phức càng cua của các kim loại) dựa vào cơ sớ các gốc cystein và histidin của các protein có thể phản ứng với các ion kim loại nặng. Các ion Zn+2 và Cu : đã tạo phản ứng càng cua với axit iminoacetic vốn đã dược kct gắn vào chát mang agarose, sẽ tương tác với các nhóm imidazol và thiol cửa các protein. Việc giải hấp thụ các protein hoặc enzym tiếp đó có thể dược tiến hành bàng cách giảm pH và bằng cách tăng lực ion của dịch đệm rửa giái. Glucose ----------- ^ Gluconic acid + H20 2 H A ---------- > O, + HLO ỉắc ký kêt tủa ái lực (affinity precipitation chromatography) I'rong phương pháp sắc ký kết tủa ái lực có liên quan với hai yếu tố: ái lực và độ hoà tan. Ví dụ tinh sạch trypsin. Cho m- aminobenzamidin thay thế với acrylic để tạo ra monome N- acryletyl m- aminobenzamidin. Tiếp đó cho monome này đồng trùng hợp với axil N- acrylylp- aminobenzoic và acrylamid để tạo ra một polyme tuyến tính nhị chức. Polyme này hoà tan 44 được trong nước nhờ sự ion hoá của nhóm cácboxyl của gốc axit paminobenzoic đến pH=6 - 7. ở pH thấp hơn 4, polyme này khống bị ion hoá nên không hoà tan trong nước. Gắn trypsin lên polyme bằng liên kết đặc hiệu sinh học ởpH =8. Sau đó giảm pH này đến 4 để kết tủa polyme rồi tách ra bàng ly tâm. Sau khi rửa rồi kéo enzym ra (pH= 2), còn polyme có thể hoà tan vạ sứ dụng lại. Trypsin thu được theo cách này đến 90%. Tuy nhiên phương pháp này sẽ có hiệu quá khi enzym có độ bển ớ các pH cực trị. * Sác ký lỏng ái lực cao áp Dưới áp suất cao có thể sắc ký được các protein với năng suất phân giái cao và tốc độ phân tách rất lớn có điều là phương pháp này chất mang phái có độ bền cơ học rất lớn. Người ta thường dùng các gel silic. Khi gắn một phối tử đặc hiệu cho một protein (hay enzym) lên một gel silic đã được tạo nhánh với glyceropropylsilan nhằm tối thiểu hoá cốc tương tác phi đặc hiệu, thì có thể dùng sắc ký ái lực cao áp (HPLAC). * Sắc ký tương tác ưa béo (kỵ nước) Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra tuỳ theo tương tác của chúng với một chất mang có chứa các nhóm ưa béo (kỵ nước). Các protein chứa các nhóm ưa béo ờ trên bề mặt, chất mang ưa béo và dung môi ưa nước tạo thành một hệ 3 thành phần và tương tác được với nhau. Hệ này có thể bị rối loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH hoặc lực ion. Nói chung, các tương tác sẽ mạnh nếu la tăng lực ion (dung dịch NaCl 4M cháng hạn). Các protein bị giữ, tiếp đó, có thể được rứa giải một cách chọn lọc bằng cách giảm lực ion này hoặc bằng cách giảm độ phàn cực của dung mỏi rửa (chẳng hạn thêm etylenglycol hoặc thêm một chất tẩy rửa hoặc tăng độ pH dịch rửa). Có thể gắn các nhóm khác nhau lên chất mang.Ví dụ Octyl- sepharose (R) CL-4B và phenylsepharose Cl- 4b các nhóm octyl và phenyl đã được đính lên các đơn vị monosacarit của agarose bằng liên kết ete không tích điện và bền hoá học. Ở những chất mang khác thì có thể sử dụng những nhóm ưa béo khác. 45 C.3. Phán tách lỏng- lỏng Cơ sở của kỹ thuật này dựa vào sự phán bố khác nhau của các protein trong một dung dịch 2 polyme không trộn lẫn nhau: hai polyme này tự phân thành hai pha phân biệt nhau, mỗi pha hoà tan được một trong các protein. Sự phân tách sẽ phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ của các polyme, khối lượng phân tử của protein, nhiệt độ và lưc ion. Thường các điều kiện tối ưu phải được xác định bằng thực nghiệm. Việc phân tách giữa hai pha có thể thực hiộn bằng kết tủa hoặc bằng ly tâm. Hệ dung môi sử dụng có thể là polythylenglycoĩ/dextran hoặc polyethylenglycol/amonisulfat. Kỹ thuật này, mói đầy được đưa vào sử dụng trong lĩnh vực hoá học protein. Nó có lợi là cho phép phân tách dẻ dàng và liên tục các protein của pha rắn cấu tạo nên màng, thành và các mảnh vỡ bán hoà tan khác. Hoặc để tách và tinh chế enzym người ta dựa vào các tính chất cơ bản của enzym đé đưa ra các phương pháp thích hợp như: - Các phương pháp dựa vào sự thay đổi tính hoà tan: Thay đổi pH (kết tủa ỏ điểm đẳng điện), thay đổi lực ion (kết tủa enzym bằng muối trung tính), làm giảm hằng số điện môi (kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ),...phân ly thể lỏng - lỏng. - Các phương pháp phụ thuộc vào điện tích: Điện đi, điểm đẳng điên, sắc ký trao đổi ion. - Các phương pháp phụ thuộc vào khối lượng phân tử: Ly tâm, lọc gel, thẩm tích, siêu lọc và m ật độ (siêu ly tâm). - Phương pháp dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu bề mặt: sắc ký ái lực, chiết ái lực. - 46 Phương pháp dựa vào tính ổn định: Tác động nhiệt, axit hoặc kiềm. Hình 1.11: Các kỹ thuật tách và tinh ch ếenzym theo các đặc tính của chúng. 47 1.4.3.3.D. Thẩm tícli và làm đặc D l. Thẩm tích Trong quá trình tinh sạch các enzym, để loại bỏ các phân tứ hoà tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzym như amonisulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ cnzym trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tứ cạnh tranh trong sầe ký ái lực... người ta thường dùng phương pháp thám tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bans; một màng bán thấm (thường là màng celophan). Túi thẩm tích có chứa dịch chiết enzym, được đật vào trong một duno dịch đệm không được chứa chất hoà tan cán loại bỏ. Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ. ỏ trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hoà tan bên trong túi và bèn ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau do đó phải dùng một thê tích lớn dung dịch đệm và thinh thoảng phải thay dung dịch đệm mới. Dung dịch đệm không chứa chất hoà tan Túi Ihẩi tích Nam châm (khuấy từ Duns dịch chiếl enym Hình 1.12. Sơ đồ thẩm tích loại bỏ muôi khỏi dung dịch enzym. 1)2. Làm đặc - Trong quá trình tinh sạch enzym, có thể cần phải làm đặchdịc enzym, nhài là sau khi qua giai đoạn sắc kí dịch chứa enzim đã bị pha loãng ra nhiều. ;i hữu Cơ vốn không làm biên tính enzym hoặc muối trung tính. Tủa enzym sau khi li tàm được hoà tan trở lại trong một thể tích nhỏ. Phương pháp này thường dùng trong phòng thí nghiệm. 48 - Hoặc cho một lượng sephadex G25 vào dịch chứa enzyin cẩn làm đặc. Có điều là lượng sephadex G25 này được tính toán như thế nào dể sau khi trương lên thì gel sẽ chiếm khoảng 90% thể tích của dịch chứa enzym. Các protein - enzym quá lớn khó thâm nhập vào được trong các mắt lưới của gel thì bị loại ra vào trong 10% chất lỏng (ra phía ngoài gel). Như vậy là dịch enzym đã được làm đặc. Bàng cách này có thể làm đặc lên 10 lần. - Làm đặc dịch chứa enzym bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẩm thấu làm cho dung môi đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein enzym) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzym được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bàng ly tâm). Hình 1.13 giói thiệu sơ đồ tổng quát thu nhận một chế phẩm enzym tinh khiết. Lín men Canh tnròns iòna i.enzvm nooai bao) cơ QUAN DỘNG VẬT LÊN MEN Canh trưòns nấm —►Bò dịch lọc Chiết. tách móc 1> Dịch chiết tónữ ị Lọc Hệ sợi Nohicn 50 e n z y m n J i bào Loại xác thần kinh vsv. Sối cơ _Lọc vá.*- Dịch^iọc 1 Cố đạc Dịch cỏ đạc Kít tủa phân dcạn bâns cccton muữi...sau đó lọc hoạc ly tam 1 Kết tửa ịnzvm I Hoá tan vói duns dịch đệm Dịch chlit enzym kv thuật Loe ael. hoạc thám tjch Loai Riuoi Enz>'in cấp 1 Sác kv tién DE.\E -cellulose Loai các chất khór.s có hoạt tinh Enzj’mcap 2 Loại các chít hoa tar. * Cò đạc/ ứ.ámtich Enzvm c 'p 2 đạc -------— Sác ký ái lục Loai cảc chất khòiicr có hoạt tinh Er.zẠ'mrấp 3 ị Có dạc, thám uch hoạc lọc oel Enzvm tinh khièt Hình1.13. Sơ đồ tổng quát thu nhận một enzym tinh khiết. 49 Ỉ.4.3.3.E. Kiểm tra độ tinh khiết của enzym bằng phưm g pháp diện di E l. S ơ lược điện ảí Điện đi là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện trong điện trường. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước, và khối lượng phân tử. Điện di các chất cao phân tử (protein, enzym, axit nucleic...) thường được thực hiện bằng cách đưa một lượng nhỏ mẫu lên chất mang là một khối gel xốp. Dưới tác động của một hiệu điện thế, các phân tử khác nhau của hỗn hợp mẫu sẽ chuyển động qua khối gel xốp với vận tốc khác nhau, nên sẽ có vị trí dưới dạng các băng khác nhau khi nhuộm màu gel hay chụp phát xạ. M ạng xốp của gel có tác dụng giữ ổn định môi trưòng điện di làm cho các bãng không bị khuếch tán và trộn lẫn khi đòng điện đi qua làm dung dịch điện di bị nóng lên. Đồng thời còn có vai trò như một lưới ỉọc phân tử. aí Các gel ỉhường sử dụng trong điện di: - Gel polyacrylamit Polyacrylamit được tạo ra bằng đồng trùng hợp từ đơn phân acrylamit (CH2= CH) và tác hhân tạo liên kết ngang bisacrylamit CONH2 ( CH2= ch (N -N ’metyllen bisacrylamit) - C - NH-CH2- NH - Cj-|CH = CH2) o o Phản ứng xảy ra do sự mở các nối đôi theo cơ chế gốc. Phản ứng thưòng được khơi mào bởi các gốc tự do do amoni persulfat tạo ra khi có mặt chất xúc tác TEMED (tetrametylethylen diamin). Sự trùng hợp sẽ bị kìm hãm do oxy. 50 - Gel tinh bột. - Gel agarose. - Gel acetat-cellulose. Trong đó gel polyacrylamit và gel tinh bột thường sử dụng để tách protein và protein - enzym, còn gel agarose do có kích thước lỗ gel lcm hơn nên được dùng để tách ADN. bì Các yểu tô'ảnh hưởng đến điện di • pH và dung dịch đệm Ở một pH xác định độ tích điện của một protein phụ thuộc vào mức độ ion hoá của nhóm amin và cacbonxyl của mạch bên. Điện tích của protein sẽ phụ thuộc vào pH môi trường, vào sô' lượng và loại axit amin có trong phân tử của chúng. Vì vậy để giữ điện tích protein và độ dịch chuyển của protein được ổn định trong quá trình điện di, cần phải luôn giữ pH ổn định. Ngoài ra trong quá trình điện di để tránh tác động do sự điện ly nước, cần sử dụng dung dịch đệm thích hợp. • Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình điện di. Khi nhiệt độ cao sẽ làm chảy gel polycrylamit, gel agarose, gel tinh bột..., làm biến tính protein enzym, cũng như gây rối loạn sự phân bố các gel, hoặc làm vỡ bản kính, hỏng thiết bị... Do vậy quá trình điện di cẩn giữ ở nhiệt độ 4 - 10 ° c nhờ các thiết bị điều hoà nhiệt độ. • Ảnh hưởng mạng gel Gel polycrylamit và gel agarose có cấu trúc giống như dạng bọt biển, do có nhiều liên kết ngang. Các phân tử protein khi đi qua các lỗ của khối gel xốp dưới tác động của điện truờng thì các phân tử có kích thước lớn sẽ chuyển dịch chậm hơn các phân tử có kích thước nhỏ. Các phân tử có kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn kích thước lỗ của khối gel sử dụng thì không thể đi qua khối gel hoặc đi qua khối gel dễ dàng. Vì vậy cần thiết phải chọn nồng độ gel thích hợp với kích thưóc các phân tử protein muốn phân tích Kích thước lỗ trong mạng gel polyacrylamit được xác định bởi hai thồng số. Hàm luợng chất rắn tổng số: % T. % T = g(acrylamit + bisacrylamit)/100ml X 100 - Tỷ lệ liên kết chéo với m onom eracrylam it: % c %c = g(bisacrrylamit)/g(acrylamit + bisacrylamit) X 100 51 Khi %T cao, kích thước lỗ gel nhỏ sẽ phân tách tốt các protein có khối lượng phân tử nhỏ và ngược lại. Thay đổi hàm lượng bisacrylamit sẽ làm thay đổi kích thước lỗ gel. Bất kỳ %T nào ở 5 % c đều thu được gel có kích thuớc 16 nhỏ nhất. Thuờng, với những protein có khối lượng phân tử giữa 15.000 và 90.000Da thì người ta phải tạo một gel có tỷ lệ 10 : 0,27, nghiã là gel được tạo ra từ 10 gam acrylamit tổng số trong đó có 0,27 gam bisacrylam it cho 100ml dung dịch. E.2. Phương pháp điện di trên gel polyaryỉữmid khi có m ặt SĐS (SDS PAGE) Khi có mặt Ịì - mercaptoethanol (CH2- CHjOH) Để khử các cầu SH disulfua (- s - s -) và sodium dodecyl - sulfat (SDS) CH}(CHj)u- S 0 3Na thì các protein sẽ bị biến tính. Chuỗi polypeptit đã bị giãn ra sẽ đuợc phủ kín bằng phân tử SDS để tạo ra một polyanion (đa anion) có m ật độ điện tích trên m ột đơn vị chiều dài gần như không đổi và không phụ thuộc vào ĩrình tự của chuỗi peptit (hình 1.14). ẹ ẹ ẹ ẹ ẹ ể ề> ẻ> ề> ể ẹ ẹ ề> ế> ẹ ẹ ể ể Hình 1.14. Chuỗi poiyanion. Dưới tác dụng của một điên trường các protein đã được SDS phủ kín sẽ di chuyển trên gel acrylamid về phía anod (cực dương). Do các mắt lưới của gel, mạch poìypeptit càng dài thì càng di chuyển chậm. Vì vậy, các protein khác nhau của một hỗn hợp có thể được tách ra tuỳ theo kích cỡ (chiều dài) và điện tích ban đầu, còn hình dạng của phân tử thì không ảnh hưòng. Điộn di đứng thường được tiến hành trên m ột bản gel có kích thước 10cm X 10cm X (0,7 - lm m ). Bản gei gồm hai ỉớp gel khác nhau được đúc cừ một buồng gel bằng khung bản kính có kích thước tương ứng. 52 - Gelcô (staking gel): Có tác dụng làm đậm đạc mẫu và làm tâng sự tách các băng, gel cô có các giếng để mẫu. Gel cô thường ít liên kết ngang hơn và có pH thấp hơn gel tách. - Gel tách : Có tác dụng tách băng rõ rệt hơn, nhất là khi các chất có lốc độ vận chuyên gần nhau. a. Hoá chất đúc geỉ (A ): dung dịch acrylamit: 30,8%T, 2,7%c. (B) : dung dịch đệm: Tris-HCl ỈM ,pH=8,8. (C ) : dung dịch đệm: tris- HC10,5M, PH= 6,8. ( D ) : SDS 10% trong nước. ( E ) : amoni persulfat (APS) 10%, TEM ED xúc tác cho gel chóng đông. b. Tiến hành đúc gel. - Đúc gel tách: Buồng gel bằng bản kính có kích thước lO cm xlO cm dày 0,7- 1 mm, có khoảng 10 giếng. Trộn dung dịch A, B, c sau đó cho dung dịch E+Temed, lắc nhẹ rồi rót nhanh vào buồng gel cho đến khi cách mép trên khoảng 4cm thì dừng lại. Phủ một lớp mỏng butanol lên bể mặt lớp gel vừa rót để polyme hoá trong thời gian 30- 60 phút. - Đ úc gel cô (staking gel) trộn dung dịch A, c , D, và E+ TEMED rồi rót nhanh vào buồng gel sau khi đã đổ lớp butanol trên bề mặt gel tách cho đến đầy buồng gel. Đưa lược vào để tạo giếng (tránh bọt khí) rồi để trùng hợp trong khoảng 60 phút sau đó lấy lược ra. - Dung dịch đệm pha mẫu : - Bromo phenol blue (BPB), pH6,8. - Tris- HCL 0,1M,SDS 1- 4%, Glyxerol 10- 20 %, BPB 0,02%, P-mecaptoetanol 0,2M. - Dung dịch đệm chạy điện di: Tris 0.025M, glyxerol 0,2M, SDS 0,1%, pH8,3- Tiến hành chạy điện di: cường độ dòng điện: 15mA/bản gel dày 0,7 mm (điện di đứng), 5mA/ ống gel (điện di cột). Chạy trong buồng kín (dung dịch đệm phải đổ ngập). Nhiệt độ chạy điện di, giữ ổn định 4' C. - D ung dịch nhuộm m àu: Commasiebrilliant blue R- 250, hoặc Amiden 10B. 53 - D ung dịch tẩy m àu: Metanol: axit axetic: HjO (4:1:5). Hình 1.15: Buồng điện di protein mini. Hình 1,16: Cho mẫu vào giếng. E3. Theo dõi VÀ kiểm tra độ sạch của enzym a! Các đại lượng cần phải đo - Hoạt độ riêng: Lượng enzym được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ/một đơn vị khối lượng protein. Hoạt độ riêng sẽ tãng tên trong quá trình tinh sạch. Hoạt đô riêng đạt cực đại và khống đổi khi một enzym đã hoàn toàn sạch. - Tỷ ỉệ tinh sạch hay mức độ tinh sạch T giữa giai đoạn một và gia đoạn hai là tỷ lệ giữa hoạt độ riêng (chảng hạn :ƯI/mg). ứng với giai đoạn hai (ASj) Và hoạt độ riêng vỏi giai đoạn một (AS[). T = AS2/A Si Tỷ sô' này càng cao thì enzym càng sạch. Hiệu suất R là tỷ số (thường được biểu diễn bằng %) hoạt độ tổng giữa giai đoạn hai và giai đoạn một. Giả sử Aj và A Ul/ml. 2 là hoạt độ của hai giai đoạn, được biểu diễn bằng V,và V2là thể tích của hai giai đoạn được biéu diễn bằng ml. Hoạt độ tổng sẽ là: Đoạn 1 (chưa sạch)= A|V,ƯI. 54 Đoạn 2(sạch) = A2V2ƯI R = A jV |/A 2V2. 100 b. Các chỉ ùèu về dộ sạch Enzym được coi là sạch khi vắng mặt các protein nhiễm tạp dược đánh giá qua các phân tích: - Điện di trên gel polyacrylamit. - Phân tích điểm đẳng điện. - Phân tích siêu ly tâm. Thực tế, diện di trên gel polyacrylamit có mặt SDS (SDS- PAGE) hay được sử dụng nhiều nhất. Các chỉ tiêu vể độ sạch của một enzym: - Hoạt độ riêng cực đại và không đổi. - Khả nãng kết tinh. Ví dụ: Kết quả tinh sạch enym cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) từ Bacillus sp (EC.2.4.1.19). CGTase là enzym xúc tác cho phản ứng nối vòng (chuyển hoá tinh bột và các a-1,4 glucan thành các cyclodextrin). Sau đây là kết quả tinh sạch CGTase: Bảng 1.5. Tình sạch CGTase từ chủng Bacillus sp 1070. Hoạt độ Ac riêng (u/mg Pr) Hoạt độ Àd riêng (u/mg Pr) Ac tinh sạch (ml) Prote -in (mg) 50 3 1560 2708 0 Sắc ký ái lực trên /?- CDsep haro se 10.2 1.3 13542 7210 S ắc ký ái tực cố định ion kim loại trển Cu(ll)-IDÀ Agarose 10.5 0.15 68673 39780 Các bưóc tinh sạch Enzym thô Thể tích Ad tinh sạch Ad còn lai 100 0 100 3.0 130 2.7 116 15.0 75 14.7 73 Ac còn lại % % ‘ Ghi chú: Ac là hoạt tính dóng vòng, Ad là hoạt tính dextrin hoá. 55 1.protein chuẩn: 14,2kDa, 20.1 kDa, 24.0 kDa, 29.0 kDa, 45.0 kDa và 66.0 kDa (Sigma) 2.GTase tinh sạch 3.CGTase thô Hình 1.17. Điện di đồ tính sạch CGTase từ chủng B acillus sp 1070. (10cm X 10cm X 0,7mm) 1.4.3.4. Một số quy trình tách, tinh chế enzym ỉ.4.3.4.A. EN ZYM TH ựC VÂT * PAPAIN (EC 3.4.22.2) PAPAIN được tách từ nhựa đu đủ bao gồm hỗn hợp protease : Papain (EC 3.4.22.2), Chymopapain (EC 3.4.22.6), protease III (EC 3.4.22.30), protease IV (EC 3.4.22.25) và một it lyzozim lipase. a! Cấn tạo : s. - Papain chứa 15,5% N và 1,2% - Phân tử papain cấu tạo từ 212 axit min, trong đó không chứa methionin. - Phân tử papain gồm 1 chuỗi poỉypeptit, đầu “N” là isoleucin, đầu “C” là asparagin có 6 gốc cystein, tạo thành 3 cầu đisulíua (ỏ vị trí 22- 23, 56- 95 và 153- 200). Ngoài ra, còn chứa một nhóm SH tự đo ở vị trí 25. - Papain có M =27.000 Dalton. - Có cấu tạo gần giống hình cầu. - Trung tâm hoạt động bao gồm: Nhóm SH của cystein 25 và N bậc 3 của histidin - 159 nên gọi là protease-thiol. - Vùng trung tâm hoạt động của papain chứa chuỗi polypeptit với các axit amin: Pro- Val- Lys- Can- Gln- Ser- Cys- Gỉy- Ser - Cys- trip. 56 bỉ Tính chất: * Papain thuỷ phân protein thành peptit và các axit amin sâu hơn các protease từ động vật và các vi sinh vật. Do vậy, nó được dùng đê phân giải tiếp các liên kết peptit còn lại khi dùng tripsin hay chymotripsin thuỷ phân. Nó đóng vai trò như một endopeptidase vừa như một exopeptidase.Nên nó có thể thuỷ phân hầu hết các liên kết peptit (trừ liên kết của prolin và axit glutamic). * N hiệt độ: Papain chịu được nhiệt độ khá cao, ở dạng nhựa khồ 105°c, papain không bị biến tính trong 3 giờ, trong khi đó ở dạng dung dịch thì papain chịu được nhiệt đô thấp hơn, ở 82,5°c papain bị mất hoạt tính sau 30 phút. * pH: - Papain bển trong vùng pH tương đối rộng: 4,5 - 8,5 trong khoảng 2 giờ. - Thường bển trong môi trường trung tính và kiềm yếu (pH7- 8,5). - Bị biến tính nhanh trong môi trường axit có pH < 4,5 và kiềm mạnh pH>!2. - pH tối ưu tuỳ thuộc vào cơ chất phản ứng. VD: Với casein: pHt.u = 7- 7,5 albumin: pHt.ư =: 4,5- 7,1 gelatin: pHt.ư = 5,2- 6,0 * Chất hoạt hoá papain là những chất khử như cystein, glutation, thioglycoỉic, N a ^ O } . v,v.. Trong đó cystein là chất hoạt hoá thường sử dụng nhất, nó làm hoạt tính của papain tăng 20 lần. * Chất ức chế papain là các chất có hoạt tính oxy hoá như oxy, ozon, hydroperoxit, iod acetat, iod acetamit, P- chlomercury benzoat và các hợp chất disulfua khác. Các chất này phản ứng với nhóm SH ở trung tâm hoạt động của papaín làm kìm hãm sự hoạt động papain. 57 d Tách vò linh c h ế papain N hựa đu đủ ị ■ Hoà tan nhưa (Cystein 0,02M + EDTA 0,00 IM (hoạt hóa) + 14%(NH4)2S 0 4 (kết tủa ion kim loại) (hòa tan tốt papain) i . . Đưa pH = 9 (loại protein trơ) ' (NaOH 1 M) . . . . . . L . Kết tủa bằng (NH4)2S 0 4(60% bão hoà) ị loại chymopapain Hoà tan kết tủa bằng (K2H P 0 4- NaOH) 0,1M pH=7,5-8,0 + cystein 0,02 M +EDTA 10'1M 1 T ” 1 ....... ” Kết tủa NaCl IM hoặc etanol 70% (v/v) (loại protease III và IV) Sấy khô . . I C hê phẩm pap ain Hình 1.18. Sơ đồ thu nhận papain (B.s Bains và cộng sự, 1978 có cải tiến). * BROMELAIN {EC.3.4.22.4} Bromelain nhóm enzym xúc tác thủy phân protein (protease), được tìm thấy trong các phần cuống, chồi, thịt quả và lá của dứa. Các nghiên cứu về bromelain đã được tiến hành khá sóm, từ năm 1894 ..Một sô' công trình đã được đăng ký patent như 2009/0275105 A I (2009) : Pat.US6,803,038 Bl (2004), P at.us al Cấu tạo Thành phần axít amin ở bromelain cuống và quả thay đổi khác nhau. Bromelain cuống có Ihành phần axit amin thay đổi trong khoảng 144-321 axit amin. Bromelain quả khoảng 161- 283 axit amin. 58 Bromelin có đầu ‘N ’ là valin (Vai) và đầu ‘C ’ là glycin (Giy). Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử chỉ chứa 1 chuỗi oligosaccarit liên kết cộng hóa Irị với chuỗi peptid (Feinstein và Whiiaker,1964). Khối lượng phân tử :32-33,5 kDa (theo Yasuda và cộng sự, 1970). Bromelain thuộc nhóm protease cystein nên trung tâm hoạt động chứa nhóm SH. bi Tinh chất Bromelain có nhiệt độ tối ưu khác nhau phụ thuộc vào cơ chất tác dụng, pH, thời gian w .. Chẳng hạn, bromelain ở dạng tinh khiết, với pH 4-10, cơ chất là casein hoạt tính không thay đổi nhiểu ở nhiệt độ 50''C trong 24giờ. Còn ở nhiệt độ 55 "C, pH 6, trong 20 phút hoạt tính giảm 50 %. Biên độ pH khá rộng từ 4-10 nhưng pH tối ưu thường nằm ờ vùng 6,5-8 ở pH 3T'c,và điểm đẳng điện P I : 9,5 (Lopes et al, 2005, 2009). Dễ bị ức chế bởi các tác nhân oxy hóa như: iodacetat.hydroperxyt... c/ ứng dụng • ứ n g d ụ n g trong cồng nghiệp thực phẩm Tác dụng làm mềm thịt, đỏng tụ sữa, phá đục bia, thủy phân gluten trong sản xuất bánh mỳ làm khối bột mềm dẻo hơn, tăng hương và chất lượng bánh... Cùng với papain, bromelin là một trong những enzym phổ biến nhất được sử dụng để làm mềm thịt. Bromelin được bán ở dạng bột, được trộn vói nước ướp thịt hoặc rắc trực tiếp lên thịt chưa nấu. Enzym sẽ thấm sâu vào thịt, làm thịt mềm hơn và ngon hơn khi nấu. • ứ n g d ụ n g tro n g y học HỖ trợ điều trị ung thư cùng với xạ trị. Ngăn ngừa cao huyết áp, ức chế sự kết tập tiểu cầu, giảm phù nể. Bồi lên vết thương, vết bỏng để lăm tan các mô hoại tử, điều trị rối loạn tiêu hóa. Phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn như sưng phổi, viêm phế quản, viêm thận sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, 59 phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophyllin, ephedrin...) làm tăng tác dụng chống hen. Hình 1.19. Các loại thuốc có chứa bromelain. dì Tách,tinh sạch bromelain Đã eó nhiều cổng trình công bố qui trình sản xuất bromelain từ các bộ phận khác nhau của dứa như: * Heinicke và Gortner: chiết bromelain từ cuống đứa, dịch chiết được làm lạnh ở 0~4"C, kết tủa bằng aceton, ly tâm, sấy chân không thu chế phàm dạng bột. Hiệu suất tuy không cao nhưng hoạt độ bromelain tương đối tốt. * Devakate et al (2009) đã nghiên cứu và đưa ra qui trình tách tinh chế thu chế phẩm bromelain theo sơ đồ hình 1.20 như sau: Hình 1.20. Qui trình thu nhận bromelain từ dứa (theo Devakate.R.V, Patil.V.V.Waje s s, Thort B.KI,2009). • Tinh sạch bromelain bàng sắc ký trao đổi ion Cột sãc ký có đường kính trong 25mm, cao 300mm dược nhồi đầy nhựa trao đổi cation. Có thé chọn CM-cellulose làm yật liệu nhồi cột. Sử dụng đệm acetate (25mM, pH 4.0) gấp 4 lần thể tích cột 60 Dịch bromelain kỹ thuật đi qua cột với tốc độ 324ml/h, cùng với dệm acetat. Sau đó, enzym đã bị hấp thụ trên nhựa sẽ được rửa giải với dung dịch NaCl IN. Thẩm tích loại muối bằng đệm amoni phosphat (50mM, pH 7;0). Sấy thu chế phẩm bromelain dạng bột. 1. Sấy p h u n (Spray drying) rtf. I. ỉchemaũe or spray dryer, Hình 1.21. Sơ đồ hệ thống thiết bị sấy phun (Model: LU-22,Ando). Theo Devakate (2009) tiến hành sấy ở áp suất khí nén 2 kG/cm2 vói tốc độ địch enzym đi vào 225 mL/h, nhiệt độ vào từ 100-170(’C, nhiột độ ra 27°c, thời gian 90 phút, thu được chế phẩm dạng bột, trắng. 2. Sấy thăng hoa (Vacuum freeze drying) Hệ thống sấy thăng hoa (M/s.Ref-vac Consultancy) gồm có: khoang sấy bằng thép không ri hình trụ (L =0.4m, D=0.4m) chứa các tấm gia nhiệt (tổng bề mặt đốt nóng là 0.25m2), một bình ngưng (công suất làm đá max=1.8kg, diện tích bề mặt = 0.25m2) có khả năng làm việc ở -35"C, một bơm chân khỏng. Mẫu bromelain đã tinh sạch được đổ đầy các đĩa, đóng băng ở nhiệt độ -230C trong 6 giờ. Sau khi hệ thống đã sẩn sàng, đặt các đĩa vào khoang sấy, bật bơm chân không. Nhiệt độ của mẫu và áp suất bên trong khoang được thiết lập tại các giá trị là 25°c và 30Pa. Trọng lượng mẫu được đo cách 5phút/ lần cho đến khi đạt giá trị không thay đổi. Khi so sánh kết quả đo hoạt lực của bromelain trong 2 phương pháp sấy trên: 61 - Hoạt lực của bromelain nếu sấy thăng hoa duy tri khoảng 95% so với ban đầu, trong khi nếu sấy phun chỉ còn 78%. - Hàm lượng protein trong trường hợp sấy thăng hoa cũng cao hom (87%) so với sấy phun (73%). Khi sấy ở nhiột độ thấp, vật liệu giữ được cấu trúc và hoạt tính enzym. • Ana Maria Frattini Fileti et al (2009)đà thu ché phẩm bromelain bầng phương pháp tách lỏng - iỏng (Reversed Micelles). Mixen là những vi hạt phân tủ có hoạt tính bề mặt, kết hợp lại với nhau và phân tán trong pha liên tục là dung môi. Các mixen này có khả năng hoà tan nhiều hợp chất phân cực trong một dung mồi không phân cực,rất có lợi nếu muốn tách tinh sạch thu hồi các chất có hoạt tính sinh học như: enzym, protein, kháng sinh..., bởi nó không làm biến tính protein, có thể tiến hành thu chế phẩm theo mẻ hoặc liên tục (Kilikian et al 2000). Dung dịch chứa cation mixen được tạo thành từ BDBAC, gồm chất có hoạt tính bề mặt, isooctan và hexanol, sau đó được trộn với dịch enzym thô. Sự phân pha diễn ra, bromelain sẽ di chuyển sang pha chứa mixen, trở thành pha giàu bromelain (pha raffinate), bổ sung đệm natri phosphate và NaCl, ly tầm 8000 vòng/phút để loại bỏ pha nặng. Sau đó tiến hành xác định hoạt độ bromelain. Tách bromelain bằng phương pháp lỏng-lỏng (Reversed Micelles) theo hình 1.21. CnrsÌEHK* frtiMun nỉ fitirxijfc Er.is me 1 1 1. Đường địch bromelain thô vào (pha liên tục). 2. Đường dung dịch mixen vào (pha phân tán). 3. Đường pha nâng ra (pha chiết) 4.Đường pha nhẹ ra (pha raffinate: chứa bromelain). Hình 1.22. Hậ thống tách chiết bromelain liên tục và bán liên tục trên Micro-column. 62 • c á u tạo cột R eversed Micelles và cơ chè vận h àn h Cột tách chiết bằng thuỷ tinh với chiều cao 19 cm đường kính 2,54 cm, bên trong có 3 nón chóp đã đục lổ được gắn lẽn thanh thép ở giữa,cách nhau 4 cm, nón chóp dạng rây 24 (710^j,m) với 38% vùng chảy tự do. Thiết bị điều khiển bằng xung, làm cho thân cột chuyển động liên tục, cứ 2,8 cm lên rồi xuống. Bằng cách này một phần pha nhẹ sẽ phun thành bụi và khuếch tán đều hơn. Phần khác được giữ trên đỉnh chóp, tăng diện tích tiếp xúc giữa các pha (Biazus et al, 2007). 1.4.3.4 B. ENZYM ĐỘNG VẬT • P E PSIN (EC. 3.4.4.1) Pepsin là protease axit có trong màng nhầy dạ dày lợn. Trong màng nhầy dạ dày pepsin ờ dạng zimogel. Không hoạt động là pepsinogen, dưới tác dụng của axit có trong dịch vị, pepsinogen được hoạt hoá chuyển thành pepsin hoạt động mạnh ở pH=2, hoặc có thể hoạt hoá bằng pepsin lấy từ nguồn động vật khác. a. Cẩu tạo Thành phần hoá học: Pepsin chứa N= 14,7%. Ngoài ra còn có 1 ít s tạo thành 3 cầu disunfua và một gốc axit phosphoric kết hợp với nhóm OH của một trong .các serin. Thành phần axit min: Pepsin chứa nhiều axit amin. • Về mặt cấu trúc pepsin là một protein đơn giản toàn bộ chỉ là môt mạch polypeptit, đầu “N” là isoleucin, đầu alamin có cấu trúc hình cầu - Hoàn toàn không có cấu trúc bậc hai hoặc chỉ có một phần rất ít cấu trúc xoắn. - Do phân tử chỉ có một mạch polypeptit nên không có cấu trúc bậc 4. - Cấu trúc trung tâm hoạt động: Là nhóm COOH của axit asparctic. Ngoài ra có nhóm phenol của tyrosin tham gia vào việc kết hợp với cơ chất b. Tính chất Pepsin hoạt động mạnh trong vùng axit (pH 2- 4). pH tối ưu của enzym thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất. Thường từ pH 1,8-2,2. Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả ờ nhiệt độ thường. 63 Pepsin bị vô hoạt trong môi trường kiềm nhưng khi đưa về pH tối ưu có thế phục hồi một phần. Tuy nhiên khả nãng tái hoạt hoá phụ thuộc vào pH, nồng dộ enzym, thời gian biến tính ... Đặc tính thuỷ phân Pepsin có khả năng phân cắt 30% liên kết peptít có trong phân tử protein tạo thành chủ yếu các peptit chứa từ 5 - 8 axit amin, pepsin chỉ phân cắt các liên kết peptit do nhóm amin của axit min kỵ nước như: phenylalamin, tyrosin, leucin với nhóm COOH của gốc axit glutamic, methionin, glycin, cystein. Ngoài ra có thể cắt liên kết este. Tách, tinh ch ế pepsin: Nguyên liệu (M àng nhầy dạ dầy) Xử lý (rửa) ,1 Nghiền ▼ Tự phân (HC1 5%) Nhiệt độ = 42°c Thời gian :40- 42 giờ (1 giờ khuấy 1 lần) □ ỊC Gạn, lọc dịch tự phân Kết tủa (bằng NaCl 22%) I Tách^tủa Bổ sung chất ổn định . 1 7 Sấy (38- 40°C) C hê phẩm Pepsin Hình 1.23. Sơ đồ thu nhận pepsin (Gratrêva 1973, Teply 1980). 64 Ì.4 3 .4.C . EN ZYM VI SI NH VẬT c .l. Thu nhận c h ế phẩm invertase từ nấm men Invertase là enzym được phát hiện đầu tiên vào năm 1883, có mặt trong hầu hết các nấm men công nghiệp như men bia, men sán xuất rượu cồn, men bánh mì, .... enzym này xúc tác quá trình chuyến hoá đường saccarose thành đường nghịch đảo (glucose và fructose). Hàng nãm trẽn thế gif^ •'...... invertase để chuyển hoá khoáng 10 triệu tấn rỉ dường. Ri đường mía Kĩ đường cù cãi Khoáng ^ ------ ' 40 000 đon vị 400 000 dơn vị 800 000 đơn vị ( u tông) Hình 1.24. Sơ đồ thu nhận invertase (Neuberg et all 1946, tái bản 1985). 65 C.2. Thu nhận Coỉagenase Colagenase (E.c.3.4.24) là enzym duy nhất có thể thuỷ phân và thuỷ phân đặc hiệu các liên kết peptit dạng poly-L-prolin đặc trưng trong vùng xoắn của colagen ờ trạng thái tự nhiên của cơ chất thành các mảnh peptid ỉớn. Chỉ sau tác động của collagenase, collagen mới bị các protease khác tấn công. Collagenase không thuỷ phân các protein khác như myoglobin, actin... Colagenase thương mại phổ biến thu nhận từ Clostridium histoỉycum. Các bước thu nhận colagenase từ vi khuẩn này mô tả như sau: Hình 1.25. Sđ đổ tách tinh che Colagenase. (Bằng sáng chế, M ỹ số 5 332 503, 1994, tác giả Lee và cs). 66 CHƯƠNG 2 ENZYM CỐ ĐỊNH (IMMOBILIZED ENZYMES) __ ___ (Enzym không tan) 2.1. KHÁI NIỆM ENZYM c ố ĐỊNH Enzym cố định là enzym được định vị vật lý vào một vài vùng xác định trên chất mang mà vẫn giữ được hoạt tính và có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (Kennedy và Cabral, 1987). Hoặc có thể nói " enzym cố định là enzym được gắn lẽn các chất mang không hoà tan hoặc được gắn vối nhau bằng liên kết đồng hóa trị tạo nên đại phân tử enzym không hòa tan”. Enzym cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn enzym tự do: - M ột lượng enzym có thể sử đụng lặp đi lặp lại nhiểu lần trong một thời gian dài. - Enzym khòng tan lẫn vào ừong sản phẩm nên không gây ảnh hưởng xấu đến màu sắc, mùi vị sản phẩm. - Có thể làm ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách enzym ra khỏi cơ chất. - Enzym cố định khá bền vói nhiệt độ, pH, dung mổi hữu cơ.v.v.. - Tuy có nhiều thuận lợi nhu trên, nhưng việc sử đụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như: - Sự chuyển khối bị hạn chế. - Có thể mất hoạt tính sau khi cố định. - Không có hiệu quả đối với cơ chất rắn (inpractical for solid substrates). - Mất tính thích nghi hình thể. 67 Tuy nhiên những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định đem lại. Do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới để cố định enzym. 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ ENZYM c ố ĐỊNH Về nguyên tắc có 3 phương pháp điều chế enzym cô định: - Hấp phụ vật lý lên các chất mang có chứa hoặc không chứa điện tích. - Gắn enzym vào các chất mang không hòa tan hoặc gắn các phàn tử en/.ym với nhau bàng liên kết đồng hóa trị tạo đại phân tử enzym không hoà tan. - "Gói" enzym trong khuôn gel. Có thể biểu diễn sơ đồ các phương pháp cố định enzym như sau: En/.ym tự do (}Ịĩ 'rói trong khuôn gel ------------ Ỷ------Hấp phụ vậl lý lên chấl mang Liên kết đống hóa Ìrị 1 Gó tron g gel dạn Ẹ hại Gói trong gel dạng SỢI Gói bằng phương pháp liền polymc Gói trong bao vi thổ Hấp phu iỄn chất mang khòng chửa dién lích Hấp phụ I6n chất mang bằng liỗn kết lon CỐ dinh trên chất mang B ìc n kết các ph;ìn tứ “razym Hình 2.1. Các phưong pháp cô’ định enzym. 1: 2.2.1. Gạn enzym lên chất mang bằng phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion ,ff>íi.âa QnĩtíH * Nguyên tác: " Hấp phu enzym lên các chất mang nhờ lực tươne: tác yếu giữa chất mang và protein enzym như: lực Vandecvan, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang khòng có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang (hình 2.2). 68 Khi chất mang có lỗ xỗp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất Ví dụ enzym được điều chế bàng phương pháp này đầu tiên là: (3-D fructofuranosidase nhôm. trên s o l i d l u p p o r t hydroxyt, CM2yin *5 Nếu chất mang có chứa điện tích. liên kết giữa enzym và chất mang là liên kết ion (bền hơn so với hấp phụ). '4:. Chang hạn đã cố định thành công glucoainylase trên DEAE - cellulose hoặc trên DEAE - sephadex sử dụng để sán xuất liến tục glucose. Hình 2.2. Hấp phụ vật lý ___ _ mang. lên chất • Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion. - Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, dextran, agarose, chitin... - Chất mang vô cơ: silic, thuỷ tinh xốp, oxyt kim loại. - Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE-Sephadex, CM-sephadex, DEAE - cellulose, CM-cellulose - Polyme tổng hợp: polyamit, polyacrylamit, polystyrol, nilon, polyvinyl. • Phương pháp điều chế: Rất đơn giản. Cho chất mang và enzym tiếp xúc nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại những phân tử bị gắn yếu lên chất mang. • Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bển của liên kết cố định. - Nồng độ protein enzym: Lượng enzym cố định lên chat thường mang tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định. pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng nhóm và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ở protein enzym. Sự thay đổi pH thường ánh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. 69 Đổng thời sự thay đổi pH đột ngột có thể dản đến sự nhả hấp phụ của enzym. - Lực ion của môi trường: Sự có mặt các ion muôi tích điện trái đấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong đung dịch. Tuy nhiên sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó làm ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định. Bảng 2.1 cho thấy ảnh hưởng của pH đến hiệu suất điều chế invertase cho thấy ảnh cố định bằng phương pháp hấp phụ (Woodward 1985). Bảng 2.1. Hiệu suất cố định enzym lên chất mang bàng liên kêìt ion Hiệu suất CỐ đjnh enzym lẽn chất mang (%) pH CM-Sephadex DEAE-Sephadex trạo đổi anion trao đếi cation pH 2,5 0 100 pH 4,7 100 75 pH 7,0 100 34 - Nhiột độ: Nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym do đó làm tăng liên kết protein với chất mang. Nhưng hạn chế nhiệt độ cao để tránh làm mất hoạt tính của enzym. - Khối ỉượng phân tử và bản chất của chất mang: Enzym có khối lượng phân tử cậng nhỏ thì khả năng hấp phụ càng lớn. Những chất mang chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn. • Ư u nhược điổm cùa phương pháp: - Ưu: Điều chế dễ dàng trong điều kiện nhẹ nhàng nên giữ được hoạt tính enzym. Có thể sử dụng cho tất cả các loại reactor sinh học. Có thể tái sử dụng chất mang. - Nhược: Do lực tương tác giữa chất mang và enzym yếu nên enzym dễ bị nhả hấp pỊiụ khi khuấy trộn, hoặc tỊiay đổi nhiệt độ, pH, lực ion môi trường.v.v.. vì vậy khó áp đụng trọng sản xuất thực phẩm và dược phẩm. 2.2.2. Phương pháp gắn enzym bằng liên kết đồng hóa trị Thưcmg có hai phương pháp: 70 - Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết đổng hóa trị. - Gắn enzym với nhau bằng liên kết đổng hóa trị. 2.2.2.Ỉ. Gắn enzym lên chối mang bằng liên kết đóng hóa trị Các chất mang thường sử dụng là: - Các polyme hữu cơ: Polypeptít, polysaccarit: đextran (sephadex), agarose (sepharose). - Các dẫn xuất của cellulose: (CM -cellulose), dietylaminoetyl cellulose (DEAE-cellulose), DEAE-sephađex, CM-sephadex. - Các polyme tổng hợp: Polyacrylamit, polystirol, polyamit, polyvinyl. - Các chất vô cơ: Silicagel, bentonit, nhôm hydroxyt. Các polyme vô cơ bền với các tác nhân lý học (nhiột, cơ học) hóa học (môi truờng axit, kiềm, dung môi hữu cơ), sinh học (vi sinh vật) hơn polyme hữu cơ. Đặc biệt không bị biến đổi cấu hình của khuôn khi thay đổi môi trường xung quanh. • Các chất mang để gắn enzym phải thoả mãn m ột số điều kiộn sau: - Độ hòa tan thấp và bền vũng đối vói các tác động cơ học, hóa và sinh học. - Không gây tác dụng kìm hãm enzym. - Không hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác. - Chất mang cơ bản chất háo nớc, vì chất mang kỵ nước có thể ức chế enzym vừa được Hên kết. - Chất mang tốt nhất là chất mang có chứa điện tích trái dấu với enzym. • Các nhóm chức của phân tử protein enzym có khả năng tạo các liên kết đồng hóa trị với chất mang là: nhóm COOH (a aspartic, axít glutamít) £NH2 (lysin), SH (cystein), OH (serin), nhân indol (tryptophan), imidazol (histidin). • Các liên kết đồng hóa tậ giữa chất mang và enzym có thể phân loại như sau: - Điazo hóa - Tạo cầu amid - Alkyl hóa và aryỉ hóa : Chất mang - N = N - Enzym : Chất mang - c o - NH - Enzym : Chất mang - CH2 - NH2 - Enzym 71 - Tạo bazơ schiff : Chàt mang - CH = N - Enzym - Trao đổi tiol - disulfua - Chất mang với chất : Chất mang - s - s - Enzym : Chất mang - 0 (C H 2),CH-N- Enzym • Phương pháp gắn enzym lên chất mang bàng liên kết đồng hóa trị có hai phương pháp: một giai đoạn: Quá trình kết hợp enzym có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzym. Ví dụ, chất đồng trùng hợp andehyl maleic và các etylen đcổ liên kết đồng hóa trị giữa nhóm £ - amin của lyzin ở phàn tử enzym với gốc anhydrit malcic của polyme. + Cìắn hai giai đoạn: - Cìiai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khá năng phản ứng hơn. - c iai đoạn hai là giai đoạn kết hợp enzym. - Các chất mang có chứa nhóm amin như aminobenzoyl-cellulose, polyaminostịrol, copolyme của aminophenylalanin có thể được hoạt hóa bằng phan ứng diazo. Ví dụ, polyaminostirol trước hết được diazo hóa bằng natri niitrit trong môi trường axit thành muối diazo, sau đó mới kết hợp với enzym: r -nh 2 NaNO?/HCl ------------ ► R-Nj+X Muối diazo của chất mang. R: Gốc alkyl, aryl. X: Gốc axit R-N2+X + E- OH RH=N- Phản ứng kêt hợp với enzym được tiến hành nhanh chóng trong điều kiện nhiệt độ thường và trong dung dịch nước trung tính. 72 Chất mang có chứa nhóm amin cũng có thể hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc tiophosgen dế tạo thành dẫn xuất izonianat hoặc izotioxianat. Các nhóm izoxianat hoặc izotioxianat ở pH trung tính sẽ liên kết dề dàng với gốc N cuối và nhóm s-amin của enzym. 0 =c / C1 -► R-N=c=0 + HC1 \c i R-NH2 + 2+ C1 .* R-N =c=s + HC1 \c i R-N=c=0 + H 2N-E -> R-N H -C O -N H -E Băng phương pháp này người ta điều chế được các dẫn xu ứ enzym không tan như tripsin, kimotripsin, (X, p - amilase, glucoamilase. - Nếu chất mang có chứa nhóm COOH như CM-cellulose hoặc nhựa tổn ° hợp cần được hoạt hóa trước trước khi cho gắn với enzym 3ằng các phương pháp azit, cacbodiimit, anhydrit kép. Hoạt hóa bằng phương pháp azit: o o — o -c h ,-ÍÌ-O-H 2- — OH H2N-NH2 — --------- * hydrazin L_ — II o - c h 2- c - n h - n h 2 + H20 hydrazit CM-cellulose o o2 HC1 o - CH,- C-N-N+=N Azit E-NH, o o - CH2- C-N H-E Các enzym không tan như trypsin, DNA-ase, chymotrypsin, fixin, bromelin đã được điều chế bằng phương pháp này. 73 - Hoạt hóa bằng phương pháp cacbodiìmit: N,N-dicyclohexyl cacbodiimit enzym CM-cellulose — O-CH CO-NH-E — OH 2 + o Dicyclohexyl Vì phản ứng xảy ra trong môi trường axit yếu (pH = 5) do đó phương pháp đặc biệt thuận lợi đối với enzym có tính axit cao như pepsin. Chất mang là polysacarit thì được hoạt hóa sơ bộ bằng halogen cyanua Cyanua thường là BrCN trong môi trường kiềm, polysacarit đã được hoạt hóa có khả năng tạo liên kết đổng hóa tn với protein enzym qua nhóm amin bậc nhất. Porath và bareli lần đầu tiên đã hoạt hóa cellulose, dextran và agarose bằng phương pháp này: _0>C =N H --------- ► o — ►— O-d-NH-E — OH N-cacbamat thay thế - Đối với các chất mang chúa nhóm thiol: 74 Được hoạt hóa bằng 2,2 - dipyridyldisulfua: E-SH —SH —S-S-E Với phương pháp này mối liên kết disulfua có tính thuận nghịch, enzym có thể bị nhả liên kết (tuy nhiên cũng nhờ vây mà có thể tái hoạt hóa chất mang). * Ưu nhược điểm của phương pháp: - Ưu: Cố định enzym lên chất mang tạo độ bền cao cho liên kết giữa protein - chất mang, nên tránh được sự mất mát enzym trong quá ưình phản ứng. Do đó phương pháp rất thích hợp trong các bình phản ứng liên tục. - Nhược: + Lượng enzym cố định thường thấp hơn so vổd các phương pháp khác. + Hoạt tính enzym có thể bị giảm do sự biến đổi cấu trúc enzym trong quá trình cố định và do hình thể sựtiếp xúc hạn chế giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym. Do đó khi sử dụng phương pháp cần cân nhắc kỹ giữa hoạt tính và độ bền của enzym. Viộc lựa chọn chất mang và phương pháp hoạt hóa được tiến hành cẩn thận bằng các thí nghiệm ở đạng pilot. 2 2 2 .2 . Nguyên đồng hoá trị với nhau, tạo tử không tan chất mang. Phương pháp gắn các enzym với nhau bằng liên kết đồng hóa trị tẩc: là liên kết chéo các phân tử enzym lại thành cấu trúc đại phân mà không cần đến các GMỈU*1' Tác nhân kết gắn thưòng dung là glutaraldehyt với tỷ lệ tác nhân enzym khoảng 10% (w/w). Hình 2.3. Gắn các enzym bằng liên kết - đồng hóa trị. 75 Ví dụ: Krechcrds (1964) đã cho các tinh thể "cacbocyl-peptidase A" tác dụng với dung dịch aldehytglutaric 1%, sau khi tác dụng enzym trở nên không tan trong NaCl IM và vẫn giữ được 30% hoạt độ so với ban đầu. Habecd (1967) cũng đã điều chế dãn xuất trypsin không tan bằng cách dùng glutaraldehyt 2% để liên kết các phân tử enzym cũng như gắn enzym vào aminoetyl - cellulose. Phương pháp này chi phí cao, kém hiệu quả (điều kiện tiến lành phản ứng khát khe, hoạt tính enzym giảm do tương tác giữa các phần tử enzym) Tuy nhiên liên kết tạo ra lại rất bền trước các tác nhân pH, nhiệt độ. Vi vậy. phương pháp gắn các enzym với nhau này thường được dùng kết hợp vói một trong những phương pháp cố định khác (thường dùng làm bến liên kết cn/vni chất mang trong phương pháp hấp phụ). 2.2.3. Phưưng pháp gói enzym trong khuôn gel Nguyên tác: Phân tử enzym được giữ trong mạng lưới không gian của một polyme không tan trong nước (hình 2.4). Gel có thể được điều chế từ các • polyacrylamid, metacrylat tạo hydrocylethyl-2mạng lưới bằng etyleng ycol-dimetacrylat, polyuretan, polyvinyl, Na-alginat và caraghenan lấy từ rong biển cũng có khả năng tạo gel rất tốt. Các gel dạng sợi có thể là cellulotriaxeta , collagen, chitosan. Hình 2.4. Cố định enzym bằng phương pháp gói trong Khuôn gel. Etứỵiíỉa *.ilyiiíỉté 2.2.3.1. Enzym được gói vào khuôn gel dưới dạng hạt Erizym được hòa tan trone một dung dịch monome. Sau đó, monome này được polyme hóa với sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo mạng lưới (reticulation). Gel có thể được cắt thành màng đặt trên một chất mang rắn, 76 'Calciumaltjirati beads Y -ilh enlMpi)-' enzyme Hình 2.5. Enzym được gói trong gel dạng viên. hoặc nghiền thành bột sau khi khử nước. Nếu là gel alginat và caraghehan thì có thể tạo khối dưới dạng viên, đường kính 0,5 - 4mm, bằng cách nhỏ giọt dung dịch enzym và alginat nattri vào dung dịch giàu CaCl2 bền hạt. 22.3.2. Enzym bị "n h ấ t" trung cúc lồ nhỏ của các sợi tổng họp - E npjạ-đư ợc cho vào đung dịch phàn tán sợi collagen trong dung môil nước - metanol và có khuấy từ. Các protein đi về phía catot và ờ dó nhặn dược các mạng collagen có "nhốt" enzym. - Hoặc có thể "nhốt" enzym trong các lỗ nhỏ của sợi tổng họp bằng cách cho các dòng lỏng chảy tuần hoàn bên trong sợi. Phương pháp này hạn màng. chế dược sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở phương pháp mang. - Hoặc dùng phương pháp của Dinelli: Dung dịch nhũ tương cúa triaxetat cellulose trong metylen-clorua và enzym trong dung dịch đệm chứa glycerol được ép đùn qua một khuôn có lỗ dưới áp suất nitơ. Các sợ ra khỏi khuôn được nhúng vào bể đông tụ có chứa toluen, sau đó sấy khô sợi trong chân không. Sợi tạo ra khá bền với axit yếu, kiềm yếu, lực ion hóa cao và một sô' dung môi hữu cơ. Nhưng phương pháp này chỉ thích hợp vơi những enzym khổng bị mất hoạt tính trong các dung môi không tan lẫn nước. 2.2.3.3. Gói enzym trong bao vi thẻ (Microcapsule) Nguyêlì tác: Nhốt enzym trong một bao vi thể (M icrocapsule) giới ^ 7 ;? i hạn bời một màng bán thấm. Màng này có kích thước lỗ xốp đủ nhỏ để ngăn chặn sự khuếch tán enzym ra ngoài nhưng đủ lớn để cho cơ chất Hình 2.6. Gói enzym trong bao vi thế. và sán phẩm đi qua trong quá trình phảiíứng. • - C ách gói enzym trong bao vi thể Polime hóa ở bề mặt liên pha (Interfacial Polymezation): Hỗn hợp nước của enzym và monome háo nước (Glycol) được tạo thành nhũ tương 77 trong dung môi hữu cơ không lẫn nước. Sau đó thêm monome kỵ nước vào và khuấy. Phản ứng trùng hợp các monome xảy ra trên bề mặt liên pha giũa nước và dung mỏi hữu cơ trong nhũ tương kèm theo sự tạo thành một màng (polyamit, polyeste...) xung quanh pha nước. Kết quả là enzym trong pha nuớc bị nhốt trong màng poỉyme. Thường cho thêm các tác nhân hoạt động bề mặt để làm bển nhũ tưotng và điều chỉnh kích thước lỗ (từ 1- 100|um) theo ý muốn. - Phương pháp sấy lỏng (Liquid Drying): Trong phương pháp này, polyme được hòa tan trong đung môi hữu cơ không lẫn nước có điểm sôi thấp hơn điểm sôi của nước. Dung dịch nước của enzym được phân tán trong pha hữu cơ tạo thành nhũ tương dạng nước trong dầu (water-in-oil). Sau đó nhũ tương chứa những vi giọt lỏng được phân tán vào pha nước chứa các chất bảo vộ keọ như gelatin, và các chất hoạt động bề m ặt tạo thành nhũ tương thứ hai. Từ nhũ tương này, dung môi hữu cơ đựợe loại khỏi bằng phương pháp làm nóng cr chân không. Màng polyme được tạo ra, từ đó hlnh thành các microcapsule cộ chứa enzym bên trong. - Phương pháp tách pha (Phase Separation): H òa tan polym e có chứa enzym trong một dung môi hữu cơ và tái kết tủa, sau đó làm sạch polyme thu được bằng cách thêm m ột đung môi hữu cơ khác có thể tan lấn trong dung môi đầu nhưng không hòa tan polyme. 2.2.3.4. Phương pháp tiền polyme * enzym. Tạo liên kết chéo giữa các tiền polyme bàng chiếu quang để gói ^ Khi chiếu tia cực tím gần (360nm) lên dung dịch có chứa chất tiền polyme, enzym và chất nhạy quang (benzoin etylete, benzoin izobutylete) sẽ tạo ra liên kết chéo giữa các gốc của tiền polyme. T ữ đó gel được hình thành và bao lấy ếnzym. Các chất tiền polyme thường sử dụng là EN T (metacrylat), PEGM (polyetylenglycoiđimetacrylat), ENTP (tổng hợp từ hydroxyètylacrylat), trong đó PEGM và ENT hòa tan trong nước, còn ENTP không tan trong nước.’ 78 Phương pháp, này có thể tiến hành ớ điều kiện nhẹ nhàng tránh được các thay đổi pH quá kiểm hoặc axit trong thời gian ngắn (3-5 phút). Các tính chất hoá lý của gel (như sự cân bằng háo nước - kỵ nước bản chất ion) có thể định hướng trước bằng cách chọn các tiền polyme thích hợp. • Phương pháp tiền polyme urêtan Cố định enzym bằng cách trộn các chất tiền polyme uretan (thường là poỉypropylen glycol, polyetylen glycol) với đung dịch nước của enzym. Trong dung dịch nuớc, các gốc chức năng izoxinat ở hai đầu urêtan phản ứng với nhau tạo thành liên kết chéo ure. Gel được hình thành trong vài phút và bao lấy enzym có thể thu được các tiền polyme háo nước hoặc kỵ nước bằng cách thay đổi tỷ lệ giữa polyetylenglycol và polypropylenglycol. Nếu nồng độ polyetylenglycol cao sẽ tạo gel háo nước (PU-6, PU-9) và ngược lại, nồng độ polypropylenglycol cao sẽ tạo các gel kỵ nước (PU-3). Ư u nhược điểm của phương pháp gói enzym trong khuôn gel. • Ưu - Không đòi hỏi phải có các nhóm phản ứng của protein nên thích hợp với nhiều enzym. - Toàn bộ ỉượng enzym đểu được gói trong khuôn hay trong microcapsule và nhận được bề mặt tiếp xúc giữa enzym và cơ chất lcm trên một thể tích nhỏ. - Có thể gói đồng thời nhiều enzym trong cùng một khuôn (các enzym này phải có điều kiện hoạt động tối ưu gần nhau). • Nhược - Enzym cố định bằng phương pháp gói trong khuôn gel chỉ thích hợp cho những phản úng mậ cơ chất có khối lượng phân tử nhỏ. Kích thước của 16 xốp cần phải đủ lớn để cho cơ chất và sản phẩm đi qua, điều đó cũng đồng thời có thể làm thất thoát enzym. Nếu sử dụng các đại phân tử để cải thiện các lỗ xốp trong mạng lưới thì lại gây sự cản trở không gian, làm giảm hoạt tính của enzym. - Các điều kiện để tiến hành polyme hóa, đặc biệt là sự tạo các gốc tự do, thường làm biến tính của enzym. 79 - Gel kém bền (dễ bị đông chặt) nên khó sử dụng trong các reactor kích thước nhỏ (tuy nhiên điều này có thể cải thiện được bằng cách đặt enzym lên các tấm lưới hoặc các màng plastic). Tóm lại, mỗi phươns pháp cố dịnh enzym đều có những ưu điểm nhất định, trong đó phương pháp gói trong bao vi thể tỏ ra có ưu điểm hơn cả (bảng 2. 2). nhiên, lựa chọn phương pháp cố định nào sẽ phụ thuộc nhiều yếu tố khác 1ihau, do đó cần phải tiến hành nhiều thử nghiệm để có đưc1C phương pháp tối ưu. Có diều, dù tiến hành bằng phương pháp nào thì cũng )h ảilư u ý Ỹ đến nhữ Ig điểm sau: Enzym phải được ổn định trong điều kiện xảy ra phán ứng Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chỉ tươr Ig tác với những n ĩóm chức năng nằm ngoài tâm hoạt động của enzym, hoặc. Chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn để khôn ỉ xâm nhập được vào tâm hoạt động của enzym. Tâm hoạt động phải được bảo vệ trong quá trình cô' địr h (có thể thực hiệ n bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng dung dịch b io hòa cơ chất của enzym). Lựa chọn biện pháp cố định phải căn cứ vào phản ứng cụ hể và các ưu nhượ c điểm của phương pháp. Bảng 2.2 . So sánh các phương pháp cố định en/ym Phuong ĐI c điểm pháp hấp phụ Phuong pháp liên kết đống hóa trị Phưđng pháp gói trong khuôn gel Ph ựơng pháp gá trong bao vi thê đơr giản cac &3TỊ-' Phương pháp điều chế đơn giản phức tạp phức tạp Chi phí Lực cố dịr h Hiện tuợng nhả cố định enzym thấp thay đổi có cao mạnh không vừa phải yếu có Khả năng áp dụng rộng rãi chọn lọc rộng rãi rất rộng rãi Sự cố khi tiến hành cao thấp cao cao Ảnh hưởng của chất mang có có có không Cản trở khuếch tán lớn không không có có 80 mạ ih không 2.2.4. Cô định enzym trèn tê bào vi sinh vật Gần đây trên thế giới có khá nhiều công trình nghicn cứu sử dụng bề mặt tế bào vi sinh vật dể gắn các chất có hoạt tính sinh học: protein chức năng, enzym, thụ thể, kháng nguyên, kháng thể và ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: nhận dạng phân tử, cố định enzym, chữa bệnh sinh học, làm biến đổi sinh học, gắn tế bào vào tế bào, sán xuất vacxin. Sơ đồ công nghệ bề mật tế bào và các ứng dụng được biểu diễn trên hình 2.7. Hình 2.7. Sơ đổ công nghệ bề mặt tế bào và các ứng dụng. Trong đó việc nghiên cứu gắn enzym trên bề mặt tế bào vi sinh vật là phương pháp mới cũng được quan tâm. Cháng hạn người ta đã cố định amylase, glucoamylase, cellulase trên bề mật tê bào nấm men, chuyển hóa tinh bột và cellulose thành đường glucose một cách dễ dàng. Hoặc người ta cô định lipase để giúp chuyển hóa dầu thực vật và mỡ tạo nãng lượng... Sơ đồ cố định enzym vào nấm men thể hiện trên hình 2.8. 81 Hnh bột Olacoie ( £ ) £)a oazym unylus, glucoamylue, csllojuv ate Etanot Dằn thực vật, chit bio tộ ag vật Dicdirail finl I Alcol Hinh 2.8. Cố định enzym trên bể mặt tế bào nấm men. 2.3. Một số đăc tính của enzym cố định a/ Emym cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của enzym tự do bởi: - Có thể khi gắn enzym vào chất mang dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất mang làm cho hình thể enzym thay đổi, do đó khả năng xúc tác cũng bị thay đổi, - Với các enzym được ''gói" Ưong khuôn gel, một số cơ chất có kích thước phân tử ỉớn không tiếp xúc được với enzym, do đó hoạt lực giảm. - Cũng có thể là do tương tác protein - protein giữa các phân tử enzym đã cố định làm biến dạng m ột phần cấu trúc không gian của phân tử enzym. b! Hằng sô'động học enzym c ổ định tuân theo động học Michaeỉis -Menten. Tuy nhiên có những sai khác đáng kể do: Ái lực giữa cơ chất và chất mang quyết định hằng số K,,, cùa enzym. Thực tế, một chất mang cổ chứa các vùng phân cực trên bề m ặt sẽ hút cơ chất háo nước và đẩy cơ chất kỵ nước. Cũng như vậy khi cơ chất và chất mang cùng tích điện th i trong tn ô i trường trung gian của enzym sẽ có sự tương tác tĩnh điện (hút hay đẩy) tạo 1 gradient nồng độ. Nếu cơ chất và chất mang có điện tích cùng dấu thì Km enzym không tan lớn hơn Kmenzym hòa 82 tan (KmK+ > Km+), nếu cơ chất và chất mang tích điện trái dấu thì K m enzyin không tan nhỏ hơn Kmenzym tan (KmK+<KmJ , chất mang khống tích điện thì KmKl>Km+ (bảng 2.3). Cũng như đối với pH, lực ion môi trường tăng sẽ dẫn đến giá trị Kmcúa enzym tự do và enzym cố định gần nhau hơn. Bảng 2.3. Ảnh hưởng của lién kết đồng hóa trị ciia chất mang tích điện lên hàng sô' động học của chimotrysin đối vói N-axetyl-l-tyrosin etyl este (Goldstein 1972). Lực ion (M) (S ’) (mM) Ertzym tự do 0.05 1.00 184 230 0.74 0.55 249 418 Enzym cố định lên chất mang tích điện âm 0.05 1.00 300 280 2.50 1.93 120 145 Enzym cố định lẻn chất mang tích điện duơng 0.05 1.00 119 1.65 7.10 5.82 17 28 • Km Đô đăc hiêu Hiệu ứng khô n g gian: Sự cản trở không gian cũng ảnh hưởng đến giá trị của Km. Việc cố định enzym lên một chất mang làm cơ chất, nhất là những cơ chất phân tử lớn, khó tiếp xúc với tâm hoạt động của enzym hơn, làm giảm ái lực của enzym đối với cơ chất, do đó làm giảm vận tốc phản ứng. Tuy nhiên điều này có thể cải thiện được bằng cách kéo các protein enzym ra xa cơ chất bằng một cầu trung gian, từ đó làm tãng độ tự do của hệ thống. • H iện tượng khuếch tán: Những hạn chế về mặt khuếch tán làm ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của enzym. Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố: - Kích thưóc lỗ gel của chất mang polyme. - Khối ìượng phân tử của cơ chất. 83 CÌ Enzym cố định thường cá tính bền nhiệt cao hơn so với enzym tự do. V í dụ: Độ bền nhiệt của enzym tự do và cố định của P 'D - glucosidase (hình 2.9). dl pH tối Itỉt của enzym c ố định thường bị chuyển sang miến kiềm hoặc axií so với pH tối lỉii của enzym tự do. Sở dĩ có sự sai khác này là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện chất mang gây nên. Sự có mặt của trường tĩnh điện mạnh làm nồng độ H+ ở gần chất mang và trong dung dịch khác nhau. Nếu enzym liên kết đồng hòa trị với chất mang có điện tích âm thí pH tối ưu sẽ chuyển sang phía pH kiềm so với enzym tự do. Trái lại nếu enzym liên kết đổng hóa trị cộ chất mang điện tích dương thì pH tối ưu sẽ chuyển sang phía axit. 0 1'0 . J-. íõ [ 30 «0! J0J nMpaaỢO ° 34 * í 7 t* 99 10 u Hình 2.9. Độ bền nhiệt của enzym tự do và cố định: Hinh 2.10. Sự thay đổi pH của các loại chimotrypsin: 1- p-D glucosidase tan; 2-p-D gtucosidase không tan. 1-chimotrypsín tự do; 2-chimotrypsin cố định trên polyornitin (-); 3-chimotrypsin cố định trên polyme axit etylenmaleic(+) 11 V í dụ: Chimotrypsin gắn trên chất mang là polym e của axit etylenmaleic thì pH tối ưu bị chuyển dịch về phía kiềm gần 2 đơn vị pH. Nhưng khi gãn trên chất mang polyomitin thi pH tối ưu chuyển về phia axit 2 đơn vị pH. 84 e! Enym cô định có thời gian báo quản láu hơn và bén với các chất kìm hãm cũng như các túc nhản ạây biến tính hơn. V í dụ: trypsin liên kết đồng hóa trị với sephadex bằng bromcyanua giữ trong dung dịch ure sau 24 giờ vẫn giữ được 75% hoạt độ so với ban đầu. 2.4. ÚNG DỤNG CỦA EN ZY M c ố ĐỊNH 2.4.1. ứ n g dụng tro n g y học * Enzym cố định được sử dụng để điều trị các bệnh thiếu hệ enzym, tích luỹ các sản phẩm độc trong cơ thể. Sử dụng enzym cố định sẽ tránh được sự phá huỷ do các protease của cơ thể gây ra (do phản ứng miền dịch của cơ thể). * Enzym cố định còn đuợc sử dụng để chữa một số bệnh như: - L-asparagiuase cố định trong microcapsule điều trị bệnh bạch cầu, cũng như có khả năng ức chế sự phát triển u ác tính do sự có mặt của L-asparagin. Chimotrypin, superoxide dismutase chống viêm. - Streptokinase, urokinase,nattokinase... làm tan các cục máu đông gây tắc nghẽn động mạch, viêm tĩnh mạch. - Urokinase gắn trong microcapsul đã được sử dụng có hiệu quả để loại ure máu trong chạy thận nhân tạo. 2.4.2. ứ n g dụng công nghệ hóa học Trong công nghệ hóa học có thể sử dụng enzym để tổng hợp các chất dinh dưỡng, dược liệu như: axit amin, axit hữu cơ, kháng sinh, hoocmon (bảng 2.4). aì Sản xuất L-axìt amỉn sử dụng amỉnoacyỉase cô’định trên DEAE-sephadex Trên cơ sở tính đặc hiệu của amino acylase đối với L-axit amin đã được acetyl hóa (L-N-acetylated amino acid).Ngưòi ta sử dụng aminoacylaseDEAE-sephadex để sản xuất L-axit amin từ hỗn hợp racemic (D-L-axit amin). Dựa vào tính hòa tan khác nhau giữa các axit amin tự do và dẫn xuất N-acetyl -a x it amin, cho phép thu được dạng L- axit amin, còn acyl-D-axit amin trong dung dịch sau đó đun nóng để chuyển về dạng acyl-D-L-axit amin và quá trình trên được lặp lại.Ví dụ, muốn thu nhận L-methionin mồng độ ban đầu của acetyl-D-L-methionin là 0,2M, sau khi cho 20001it hỗn hợp 85 chạy qua côt phản ứng có chứa enzym cô định, cho bay hơi và kẻt tinh, thu được 27 kg L-methionin (đạt 91% so với lý thuyết), dịch chứa acetyl-Dmethionin được xử lý ở 60"C với anhydrid acetic (quá trình racemic hóa), sau đó axit hóa đén pH 1,8 để thu hổi acetyl-D-L methionin. Quá trình sản xuất L- axit am in thể hiện ở sơ đồ hình 2.11. Hlnh 2.11. Sd đồ sản xuất L-axit amin bằng aminoacylase -DEAE- Sephadex. Ngoài ra có thể sử dụng enzym cố định để sản xuất một số chất khác theo bảng 2.4. pảng 2.4. Mội số ứng dụng của enzym cố định trong công nghiệp Enym cố đjnh Aminoacylase Aspartate ammonialyase Asparrtate decacboxylase Cyanidase Gluco amylase Glụco-isomerase Hystidin ammonialyase Dihydropyri midinase Invertase Lactase (B-aalactosidase) Lipase Nrtril hydratase Penicillium amiòase Raffinase Thermoíysin 86 Sản phẩm L-Amino acid L-Aspartic acid L-alanin D- formic acid D-glucose Siro ngô nồng độ fructose cao (High Fructose Com Sirup - HFCS) Axit urocanic D và L - aminoaxit Đường nqhich đảo Sữa không có lactose Chất thay thế bơ cacao Acrylamit Penecillin Đườnq khônq có raffinose Aspartan Phương pháp sản xuất L-axit amin này đặc biệt phát huy ưu điểm dối với các axit amin khó thu nhận được bàng con đường lên men (như L-alanin, L-phenylalanin, L-tryptophan, L-valin). b. Sản xuất Acryỉamit Sản xuất acrylamit bằng phản ứng cộng nước vào acrylonitril: CH2 = CHCN + H20 -> CH2 = CHCONH2 Sử dụng enzym cố định nitril hydratase (thường gọi là nitrilase), thu nhận từ Rhodococus, chứa ít hoạt tính amidase nên tránh sinh ra các acrylic axit không mong muốn từ acrylamit. Enym được gói trong gel polyacrylamit/ d ímeth ylam inoe th y 1me t ac ry Iat 10% (w/w) liên kết chéo, dạng hạt. Phản ứng ở 10"C, pH 8,0 - 8,5, nồng độ cơ chất acrylonitril dưới 30% (w/w), nồng độ enzym 1% (w/w). Nồng độ sản phẩm thu được (rên 20% acrylamit, chứa các acrylic axit dưới 0,02%. c. Sán xucứ kháng sinh. 6-Aminopenicillin acid (6-APA) là một loại kháng sinh quan trọng thuộc họ ampicillin. Có thể thu nhận bằng cách thủy phân penicillin G (benzyl penicillin) hoặc penicillin V (phenoxymethylpenicillin) bằng enzym penicillin amìdase cố định. Penicillin amidase đặc hiệu với penicillin G được thu nhận từ E.coii hoặc BacUìus megaíerium. Còn enzym đặc hiệu với penicillin V thu nhận được từ penecillium chrysogenum hoặc Fusarium. Penicillin amidase từ E.coỉi có thể được cố định trên một số chất mang như sephadex hoạt hóa bởi cyanogen bromua, sử dụng thích hợp đối với các reactor làm việc gián đoạn hay liên tục kiểu STR (35l,c , pH 7,8, 2 giờ) hoặc kiểu PBR. Cũng có thể cố định bằng phương pháp hấp phụ trên DEAEcellulose, dùng PBR. 2.4.3. ứ n g d ụ n g tro n g công nghệ m ôi trường Enzym cố định được sử dụng một cách có hiệu quả trong công nghệ mỏi trường (xử lý nước thải...) bằng phương pháp sinh học. V í dụ: Sử dụng enzym cố định dể loại nitrat trong nước uống. Nguyên tắc là khử nitrat (độc tính) thành N2 (không độc) bởi 3 enzym: 87 - Nitrat Reductase (NaR, khử nítrat thành nitrit). - Nitrit Reductase (NiR, khử nitrit thành oxit nitơ). - Nitơ oxit Reductase (NoR, khù nitơ oxit thành nitơ). Sử dụng NaR tinh khiết từ thực vật, NiR và NoR bán tinh khiết từ vi khuẩn đất Rhodobacter sphaeroides. Các enzym này được cố định bằng liên kết đồng hóa trị lên các chất mang rẻ tiền và trơ hóa học. Các phân tử chứa electron cũng được cố định trên chất mang này. Sau dó toàn bộ được nhồi giữa các điện cực bằng thép khồng ri trong một buồng nhỏ tạo thành một reactor (điện cực nhằm cung cấp electron cho enzym để thực hiện phản ứng). Do NaR kém bền nên có thể trộn thêm hỗn hợp nitrat reductase ưa nhiệt và ưa muối vào reactor để mở rộng phạm vi hoạt động tối ưu của enzym. Hoặc có thể cho thêm một isozym reductase biến hình bằng phương pháp sinh học phân tử để tăng thêm khả năng phản ứng. Các thử nghiệm với các bioreactor quy mô nhỏ như trên đã cho kết quả tốt khi xử lý nước uống. Tuy nhiên, để ứng dụng khả thi ở quy mô công nghiộp, còn có hai cản trở chính đó là: - Chi phí cho enzym cao (nhất là N aR ).' - Vận chuyển electron đến tâm hoạt động của enzym khó khăn. Để khắc phục hai trở ngại trẽn, việc nghiên cứu tách tinh chế NaR từ nấm men và NiR, NoR từ vi khuẩn, cũng như nghiên cứu kỹ thuật cố định, sử dụng thử các vật liệu khác nhau, kể cả một số vật liệu mới như polytic graphit đang được tiến hành và hy vọng sẽ có những kết quả khả quan. 2.4.4. ứ ng dụng trong công nghệ thực phẩm Enzym cố định được sử dụng rộng rãi trong cồng nghệ thạc phẩm (bảng 2.4). a! Sản xuất glucose: Sử dụng glucoamylase để sản xuất dịch glucose nồng độ cao (92-96%) từ tinh bột đã thủy phàn bởi cc-amylase. Glucoamylase có thể cố định bàng liên kết acetonic đồng thời tạo liên kết chéo bởi glutaraldehyt. 88 bị Sản xuất sì ro ngô với nồng dọ fructose cao (HFCS) Dịch glucose nồng độ cao có thê được sản xuất bằng glucoamylase. Tuy nhiên dộ ngọt của glucose thấp (73% độ ngọt của saccarose). Trong khi đó đường fructose ngọt 174% so với đường saccarose và có độ ngọt gấp 2,5 lần glucose. Do đó nếu chuyển một phần glucose trong dịch thành fructose thì có thể cho độ ngọt lăng lên đáng kể ở cùng nồng độ. Kỹ thuật này có thể được tiến hành với enzym glucoisomerase cổ định. Gluco-isomerase thu nhận từ Antinoplane misouriensis, bacilluscoagulans, các chủng streptomyces. Đày là những enzym có độ bền nhiệt cao và khả nãng tác dụng ở nồng độ cơ chất cao. Có nhiều phương pháp cố định khác nhau được sử dụng cho các enzym từ các nguồn vi sinh vật khác nhau, nhưng chủ yếu là dùng phương pháp lièn kết chéo (Crosslinking) các enzym nhờ tác nhân glutaraldehyt. Hiện nay thường thực hiện phản ứng đồng phân hóa glucose thành fructose trong PBR (cho hiệu quả tốt hơn). Dịch cơ chất có nồng độ cao (3545% chất khô, 93-97% glucose), thực hiện phản ứng ở 55-60°C, pH 7,5 - 8,0 (điều chỉnh bằng Na2CO,), cho thêm M g2S 0 4 để hoạt hóa enzym (M g2+, C 0 2+ là cofactor của enzym). Sản phẩm thu được chứa 42-46% (w/w) fructose, 49-53% glucose, còn lại là các oligosaccarit. Để sản xuất 100 tấn (chất khô) chứa 42% HFCS/ngày, cần lượng enzym khoảng 4 m \ Hình 2.12. Sơ đồ dây chuyền sản xuất dịch fructose (100 tấn/ngày). 89 Sau khi đổng phân hóa, pH của dịch từ 4-5, được làm sạch bằng sấc ký trao đổi ion và xử lý với than hoạt tính. Sau đó cô đặc để thu hổi được dịch khoảng 70% chất khô. Nếu muốn thu được dịch fructose nồng độ cao hơn (ví dụ 55%-có độ ngọt bằng saccarose ở cùng nồng độ), có thể sử dụng cột sắc ký zeolit hoặc muôi canxi của nhựa trao đổi ion để hấp phụ và tách fructose ra khỏi các chất khác. Sau đó cho dòng dịch fructose 90% trộn với dòng dịch 42% sẽ cho dịch 55%. c! Sản xuất sữa và sữa whey không có lactose (LACTAID) Sử đụng P-galactosidase (lactase) thủy phân lactose (một loại disaccarit khó tiêu hóa thường gặp trong sữa) thành glucose và galactose là những đường dễ tiêu hóa hơn, độ ngọt cao hơn đồng thời ít bị kết tinh. Pgaỉactosidase được thu nhận từ Saccharomyces iactis, Kluiverotnyces ị'ragiỉỉis và Aspergillus niger. Enzym từ Saccharomyces iactỉs (có pHor, =6,6 - 6,8) và Kiuiveromyces /ragỉlỊis (có pH(ipi = 6,4 - 6,8, cố định bằng cách “gói” trong sợi cellulose triaxetat, sợi được cắt ra và sử dụng thiết bị phản ứng gián đoạn STR ờ 5°C) được dùng cho sữa và whey ngọt. Còn enzym từ Aspergillus niger (có pH = 3,5 - 4,5, cô' định trong silic dioxit rỗng đường kính 0,5m m ( sử dụng thiết bị phản ứng dạng cột PBR) được dùng cho sữa chua. d! Sản xuất đường nghịch đảo Sử đụng enzym invertase để chuyển saccarose thành glucose và fructose (đường nghịch đảo - có thể dùng trong sản xuất mút cho khả năng giữ ẩm tốt hơn) mà không tạo màu như trong trường hợp thuỷ phân bàng axit. Invertase được thu nhận từ nấm mem Saccharomyces cerevisiae hoặc Saccaromyces carỉbegensis , cô' định ưên rafle của ngố bằng liên kết đồng hóa trị hoặc dùng phương pháp tạo liên kết chéo (cross-Iinking) (thời gian bán hủy 90 ngày, pH = 5,5, t‘-5 0 °c , có thể sử dụng thiết bị phản ứng dạng cột PBR với thời gian lưu 15ph, chuyển được 95%). Một lít enzym dạng viên có thể sản xuất được 15 tấn siro nghịch đảo (tính theo chất khô). e! Sản xuất dịch đường không chứa raffinose Sử đụng raffmase (a-D-galactosidase) (thủy phân raffinose thành galactose và saccarose) được thu nhận từ nấm Mortiereììa vìnaacea 90 (raffinoseutilizer). Nấm phát triển dưới dạng hạt, được thu nhận, sây khô và sử dụng trực tiếp như enzym cố định. Enzym được khuấy với nước chiết củ cải đường, trong thiết bị phản ứng (BSTR batch). Khi raffinose đã thủy phân hoàn loàn, cánh khuấy ngừng hoạt động và nước chiết được bơm ra khỏi thùng chứa enzym. Enzym được thay mới cho mẻ tiếp theo. Galactose sinh ra bị phân huỷ trong môi trường kiềm ở giai đoạn làm trong dịch và không ảnh hưởng gì khi thu hổi đường saccarose. Raffinase cố định cũng có thể được sử dụng để loại raffinose và stachyose từ sữa đậu tương. 91 CHƯƠNG 3 ĐỘNG HỌC ENZYM ■ • PHẢN ỨNG_____ ____ 3.1. ĐỘNG HỌC CỦA ENZYM M ONOME Như chúng ta đều biết, một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng vận tốc của phản ứng. Vận tốc của phản ứng enzym là lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Thông thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn bằng nồng độ phân tử (M) và đơn vị thời gian là giây. 3.1.1. T hứ bậc của phản ứng 3.1.1.1. Phản ứng bậc nhất Một phản ứng bậc nhất thường tương ứng với sự chuyển đổi chỉ một cơ chất thành sản phẩm: k s ------- --------- *p s - hàm sô' mũ của thời gian : [S ]= [S(1]expí ku K- hằng số vận tốc. Lấy log ta được phương trình ở dạng tuyến tính : Ln[S] = -kt + Ln[S,,] (3.1) Ta thấy, vận tốc của phản ứng ở thời điểm t được xác định bằng số các phân tử p tạo thành (hoặc số các phân tử cơ chất bị mất đi) trong một đơn vị thời gian: dị dt Nêu nông độ được biêu dién bằng mol/lít hoặc M và thời gian được biểu diễn bàng giây (s) thi V= M X s'1và k là bằng s‘‘. 92 Ta thấy vận tốc V của phản ứng sẽ giảm theo thời gian và sẻ tiến đến không khi t tăng. Hằng số vận tốc chỉ phụ thuộc vào một cơ chất và nồng độ của cơ chất này liên tục bị giảm. Trong thực tế, nếu nồng độ cơ chất rất cao, thì có thể coi như là không đổi trong quá trình phản ứng, khi phản ứng được xem xét trong khoảng thời gian ngắn. Trong điều kiện này vận tốc phản ứng là không đổi, lượng sản phẩm tạo ra chỉ phụ thuộc vào thời gian phản ứng và phản ứng có thứ bậc không. 3.ỉ . 1.2. Phản ứng bậc hai Phản ứng bậc hai thường được biểu diễn dưới dạng phương trình phản ứng sau : A + B --------- *-------- * c Là một phản ứng có 2 cơ chất phản ứng với nhau để cho một (hoặc nhiều) sản phẩm. Vận tốc phản ứng có thể v iế t: v = ^ P = k [ A ] [B] dt Ở đây, ta thấy Vtỉ lộ với một sản phẩm hai nồng độ. Vận tốc V luôn được biểu điễn bằng M x s'1, còn hầng số vận tốc k được biểu diễn bằng M '1 x s 1 Nếu 1 trong 2 cơ chất chẳng hạn A rất lớn so với B thì nồng độ [A] thực tế coi như khống đổi và bằng nồng độ ban đầu [ A]„ trong thời gian phản ứng và V có thể v iế t: V = k [ B] trong đó k = k[A]0 Điểu này có nghĩa là m ột phản ứng bậc hai có thể xem như m ột phản úng bậc 1 nếu 1 trong 2 cơ chất có nồng độ rất lớn. Chẳng hạn phản ứng thuỷ phân một cơ c h ấ t: A-B + H O H ----------►AH + BOH Ở đây phản ứng là bậc nhất đối với nồng độ [ A-B] vi nước là rất lớn. Và dù thứ bậc của phản ứng thế nào thì V là một hàm nghịch biến của thòi gian vì lẽ các nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản phẩm lại tãng. 93 Vậy V là một tham số biến đổi mà người ta chi có thổ đo trong những điều kiện đậc biệt, ià điều kiện mà có V không đổi. Các điểu kiện này đuực gọi là điểu kiện ban đầu và vận tốc này được gọi là vận tốc đẩu. Vậy khi nồng độ của cơ chất thấp phản ứng xảy ra có thứ bậc 1 v = k,[SJ Còn khi nồng độ của cơ chất khá cao thì phản ứng có thứ bậc k hông: v = VmiU nồna độ cơ chất [S] bậc nhát V = k(Sj Bậc 1 1— X \ K= t a-x Hình 3.1. Ảnh hưdng nồng độ cơ chất tới thứ bậc phản úng enzym X- lượng cđ chất bị chuyển hóa trong thời gian t. 3.1.2. Động học của enzym m onom e có m ột cơ ch ất 3.1.2.1. Mô hình Michơeỉis Sự xúc tác của enzym thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzym và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận ràng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo thành chi m ột sản phẩm: k -I k .2 aí Các pha cửa phản ứng enzym Khi enzym và cơ chất của nó có mặt dưới dậng dung địch thì phức ES được tạo thành một cách nhanh chóng và tăng theo thời giãn, đặc biệt là khi 94 s có nồng độ rất lớn. Người ta nói là phản ứng ở trạng thái tiền dừng (prestalionary phase), thường pha này chỉ kéo đài trong khoảng thời gian vài phần ngàn giây. - Khi pha này kết thúc thì phản ứng bắt đầu vào trạng thái dừng (stationary phase). Ớ trạng thái dừng, cơ chất vẫn bão hòa enzym, phức hợp ES có nồng độ cực đại và ổn định. Lượng sản phẩm tạo ra tăng lên m ột cách tuyến tính. Người ta nói phản ứng đang ở trong điều kiện ban đầu. Vận tốc phản ứng lúc này không đổi và phản ứng có thứ bậc không. Vận tốc này được gọi là vận tốc đầu và đặc trưng cho pha dừng. Đôi khi người ta cũng gọi là vận tốc dừng vì nó vẫn giữ không đổi chừng nào nồng độ s còn bão hòa enzym. Điều kiện ban đầu thường có thời gian phản ứng ngắn (một số phút và có thể tới hàng chục phút) và lượng cơ chất được tạo thành sản phẩm còn rất ít (do đó có thể bỏ qua phản ứng nghịch). - Sau một thời gian dài hay ngắn phụ thuộc vào enzym (thường từ vài phút đến vài giờ) lượng cơ chất bị cạn kiệt và nồng độ phức ES cũng giảm dần theo. Vận tốc phản ứng giảm và cuối cùng triệt tiêu hoàn toàn. Phản ứng ở trạng thái sau dừng (post - stationary State). Dựa vào cơ chế và các quá trình có thể chia phản ứng enzym ra hai giai đoạn : Hình 3.2. Các pha của phản ứng enzym một cd chất. b/ Hai giai đoạn của phản ứng enzym Trong những điều kiện ban đầu, nồng độ của cơ chất là rất lớn so với nồng độ enzym: [ S]„ » [ E]u, ta có thể mô tả quá trình enzym qua hai giai đoạn kế tiếp nhau. 95 * G iai đ o ạn đ ầu : phức hợp enzym cơ chất dược tạo thành một cách nhanh chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi dồng hóa trị giữa cơ chất và các axit amin nhận biết của tâm hoạt động của enzym. E + S + = != = £ ES ÌTĨ Sự kết hợp giữa E và s là một phán ứng bậc 2, nên hằng số kết hợp k| được đo bằng M 'x s '1, còn sự phân ly phức ES là phản ứng bậc 1 nên k„| được đo bằng s *. Thường tỷ sô' kị/ k là khá cao và được gọi là hằng số ái lực kal của enzym đối với cơ c h ấ t: - G iai đoạn 2 (giai đoạn xúc t á c ) : gồm một chuỗi các phản ứng trun gian nhằm biến đổi phức ES thành trạng thái quá độ trong đó cơ chất được liên kết với các gốc axit amin xúc tác của tâm hoạt động enzym (thường bằng liên kết đồng hóa trị). Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức enzym- sản phẩm và cuối cùng phức enzym -sản phẩm sẽ phân ly thành enzym tự do và sản phẩm : ES E+P Vậy là toàn bộ chuỗi sự kiện này đều có liên quan với các axit amin xúc tác và vận tốc chung (tổng) của quá trình này thường được đặc trưng bởi hằng số xúc tác kcal. Vì phản ứng tổng là phản ứng bậc nhất đối với phức ES do đó kcal được biểu thị bằng s *. Và quá trình enzym tổng thể có thể v iế t: k I E+ s k cat ES — ► E + p (3.2) k-1 Thường thì giai đoạn xúc tác chậm so với giai đoạn tạo ra phức ES do đó hằng số xúc tác kcat (k2) nhỏ hơn hằng số kết hợp k|. • V ận tốc đầu Theo (3.2) vận tốc đầu có thể viết : 96 ■« _ r ' d [p ]'I I * u , re e l = K J E Si Vì trong pha đầu, sự hình thành mỗi mol p đều tương ứng với sự chuyển hóa một mol [ES ]. Do đó việc tính v,| có liên quan với việc tính nồng độ [ ES ]. 3.1.2.2 Gừỉ thuyết của Brigg và Haldane (v„) bằng vận tốc phân giải phức ES (V j) v. = k,[E][S] vd = k.1[ E S ] + ^ [ E S ] Vậy phương trình ở trạng thái dừng có thể v iế t: k,[E] [S] = (k , + kcal) [ES] K JE S ] = [E]{S]với Km hay (3.3) K,n được gọi là hằng số Michaelis -M enten. Kn, được đo bằng nồng độ mol (M) 3.1.2.3. Phương trình Michaelis - Menten Enzym là một chất xúc tác nên trong quá trình phản ứng số lượng enzvm tổng không thay đổi, có nghĩa : [E ]0 = [ E ] + [ ES] Thay [ E] = [ E]() -[ ES] vào trong phương trình Brigg-Haldane (3.3). ta được: K JE S ] = [E ]„ -ÍE S ][S ] CK. + [S) [ESJ = [ E]„ [S] hay m [S] - K r Vậy V - k FF51 = l o - K ca: l L J i kca:'-E]c ’-s]s]+K^ (3.4) 97 Phương trình này gọi là phương trình Michaelis —Menten. Nếu tất cả phân tử enzym đều ở trong phức với cơ chất thì nồng độ [ES] bằng nổng độ tổng của enzym [ E]„. Vận tốc đầu của phản ứng sẽ đạt đến gía trị cao nhất của nó vân tốc cực đ ạ i : V(,= V max = ktal[E]() Phương trinh Michaelis -M enlen (3.4) có thể viết : V’ma,v Ị£ì 1 ° " :s]+Jfm ✓-} rx Vậy vận tốc cực đại sẽ đạt được nếu nồng độ cơ chất là rất lớn so với nồng độ enzym. Hằng số Kro có thể xác định như gía trị của nồng độ cơ chất mà tại đó vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc cực đại. • Hằng số K„, cũng liên quan với ái lục của enzym đối với cơ c h ấ t: v _ = k \ * k w ĩ = J _ _ L ! lm m KKa1 *k 1 *1 Ở trên, ta đã thấy hằng số k^i là rất nhỏ so với k, nẻn có thể coi K m = I / kal, có nghĩa là K™ bằng nghịch đảo của hằng số ái lực. Vậy việc đo hằng số là m ột cách tốt để đánh giá ái lực của một enzym đối với một cơ chất đã cho. • Thường hiệu quả xúc tác của enzym được đánh giá qua hằng số đặc hiệu kA: k — hcat _ ft Í^CŨT _ k i +ftcar k ■> 1 ị. k-1 kcat là giới hạn trên của tỷ số này và tỷ số này sẽ đạt đến giới hạn trên nếu k.j là bé so với k^ị. k] ỉại bị giới hạn bởi vận tốc khuếch tán của enzym và cơ chất đến với nhau nên không thể vượt qua giá tộ tối đa của vận tốc khuếch tán này, thường vào khoảng 108 -lO ^M '.s'1 Với một enyim có k.,và k^, = 1 0 V ; k, =10ạM '1.s'1 sẽ có các gía trị như sau: kal =106M_1: ^ = 2 x 1 0 ^ = » — = 0 ,5 x 106M _1 K.™ m . 98 Vậy 2 Ỉỉr._ ^al - 17~ - - = 0 ,5 .1 0 5 A\, K x 3.1.2.4. Tính thuận nghich và hệ thức Haldane ở chừng mực nào đó, các phản ứng enzym đều có tính thuận nghịch, có nghĩa là các enzym có thể xúc tác cả phản ứng ngược : k-2 p + E 4- _ = > ES k-1 „ ----------- ►E + s k2 Ta có thể .viết: v ổ i K rm = (K>m+{PỴ) m ft2 Vận tốc cực đại của phản ứng thuận V mix: Vnuui = Vận tốc của phản ứng nghịch, V milx: v ù = k ÌE ]o Ta có thể suy ra : £ ? _ ÌL K*, - k .2 V JT k .| Từ đây ta có hệ thức Haldane: Kch = ■= — Km X Vro„ k (k2 = — k.,k.2 [P] [S] K ,b: hằng số cân bằng của phản ứng tổng. Hệ thúc này chỉ rõ có sự phụ thuộc lẫn nhau giữa hằng số cân bằng và các tham số động học của một phản ứng enzym thuận nghịch do đọ không thể bỏ qua phản ứng nghịch khi sản phẩm đã được tích tụ. Chú ý: Hằng số k^, là tổng hợp cùa nhiểu giai đoạn liên tiếp chuyển hóa phức M ichaelis -M eríten đến trạng thái qúa độ, rồi từ trạng thái quá độ này đến phức enzym- sản phẩm và cuối cùng phân ly phức này đến enzym tự do và sản phẩm: - 99 ES k2 ES*- ->EP k4 * E+ P Do đó, giá trị của hằng sô' kcal phụ thuộc vào giá trị của hằng số tương ứng với giai đoạn chậm nhất tức là giai đoạn giới hạn. Phái luôn nhớ rằng phương trình Brigg -H aldane và phương trình M ichaelis-M enten chỉ có giá trị khi được đặt trong những điều kiện ban đầu đã xác định trước. Ngoài ra, cũng cần chú ý rằng trong các phương trình ớ trên, người ta luôn coi nồng độ cơ chất tự do [S] bằng với nồng độ cơ chất [S](, lúc khởi đầu. Và ưong điều kiện ban đầu này thì nồng độ sán phẩm được tạo ra còn rất bé so với nồng độ của cơ chất. Khi nồng độ sản phẩm đạt đến mức có ý nghĩa thì các phương trình này sẽ không áp dụng được nữa. Phương trình Michaelis -M enten cũng có thể được biểu diễn d ưới dạng sau: [EJ k2kA[S] V= (3.6)) k2 + kA[S] m V= l / k 2 + l / k A[S] (3.7) 3.1.3. Động học của các enzym m onom e nhiều cơ chất Trong thực tế, ít có phản ứng enzym một cơ chất. Phần lớn các phan ứng enzym GÓ hai hoặc nhiểu cơ chất và tạo ra hai hoặc nhiều sản phẩm. Một số lớn enzym thường gặp có hai cơ chất. Phản ứng tổng của các enzvm có hai cơ chít và hai sản phẩm thường có dạng như sau : E A + B < í= fp + Q Trong cơ chế của phản ứng giữa enzym và cơ chất thường tạo ra nhiều kiếu tổ hưp khác nhau : - Tổ hợp hai (binary): EA, EB, EP, EQ. Tổ hợp ba (ternary): EAB, EAQ, EBP. Cleland (1963) đã biểu diễn các cơ chế của phản ứng enzym hai cơ chất như sơ đồ dưới đây, trong đó: 100 - A, B, C: là các cơ chất theo thứ tự kết gắn. - p, Q, R: là các sản phẩm theo thứ tự xuất hiện. - E : là enzym tự do ban đầu. - F, G : là dạng tạm thời của enzym trong quá trình phản ứng. - uni, bi, ter là những tiếp đầu ngữ đe chi sặ. AỊữ^MLvà số sản phẩm trong phản ứng. Trong thực tế, ít gặp những cơ chế enzym vượt quá ba cơ chất và ba sán phám(Ter Ter). Cơ chế thường gặp là cơ chế hai cơ chất và hai sán phẩm (Bi Bi) Theo Cleland, trong kiểu xúc tác Bi Bi này, thường có bốn mỏ hình lớn như bảng 3.1. Bảng 3.1 B i (? ) Bi.Bi có trật tự i EA 1 EAJB A B EB (3 ) Bi.Bi p ingpong P ) ------------► EPQXỈ___ V EP E 44 4 EA 4 FP FB E B EA EAB B p (T) Theoreli -Chance Q I ___ T / jõ \ a ) --------------- ( Q B \*___ V A EQ p í ___ 4 /e A r J) Bi.Bi bấp bénh EPQ p EQ Q „ ĩ EQ Có thể nói, trừ các enzym : isom erase, lyase và hydrolase (nồng độ nước không đổi và dư thừa) các enzym khác: oxydoreductase, transferase và ligase đều tuân theo động học hai cơ chất, cơ chất thứ hai có thể là một coenzym . 101 3.1.3.1. Phản ứng kiểu Bi B i có trật tự Trong mỏ hình này, một cơ chất A bát buộc phải gắn vào enzym ở giai đoạn đầu tiên. Cơ chất B chỉ có thể được gán thứ hai để tạo ra tổ hợp kép ba EAB. Phần tiếp theo của phản ứng sẽ dẫn đến giải phóng p (từ B) rồi sản phẩm Q (từ A). Một ví dụ có tính chất cổ điển của cơ chế này là enzym malatdehydrogenase M aỉat + NAD+ (A) ..... (B) Ẫ NADH + H+ +O xaloacetat (P) <Q) * Vận tốc của phản ứng tổng V có dạng : V ™ [A] [B] V= ■ [A] [B] + kB [A] + kAkB i ___ 1 í u hay K I k Ak „ ì [A] Vẽ đổ thi — = f (— ) vói [A] không đổi, ta đươc môt đường thẳng. Với V [B] các nồng độ [A] khác nhau, ta được m ột chùm các đường thẳng đổng qui ở một điểm. Ta cũng lầm như thế với cơ chất B, cố định nổng độ [B], vẽ đổ thị V [A] tang [A] tâng ymềi H í sô' góc (Độ ngh iín g ): V*. Hệ số ịỏ c (Độ n g h iín g í: ŨY .. Ị f*] Hình 3.3. Động học hai 102 C tf •■■ự ị Ỵirn-m, chất. Cd chế Bi Bi có trật tự. 1 Với các nồng độ [B] khác nhau ta cũng được một chùm các đường thẳng. Từ đồ thị có thể xác định được các tham số đặc trưng. 3.1.3.2. Phản ứng kiểu Bi-Bi bấp bênh Trong trường hợp này, hai cơ chất A và B có một ái lực rièng đôi với enzym. Chúng tự kết gắn với enzym một cách ngẫu nhiên để tạo ra tổ hợp kép đôi EA hoặc EB và cuối cùng thì tạo ra tổ hợp kép ba EAB. Các sản phẩm của phản ứng p và Q cũng được giải phóng ra theo một trật tự bấp bênh. Các enzym phosphotransfenase có động học theo cơ chế bấp bênh này. Chẳng hạn enzym creatin phosphokinase xúc tác phản úng : ATP + creatin 3 = * creatin.phosphat + ADP Phương trình vận tốc có dạng sau : V * [A] [B] V = ([A] [B] + kB [A] + kA [B] + kAk B) Vẽ đường biểu diễn — = f ( — ) vói [A] cố định sẽ thu được một đưòng thẳng. Với các nồng độ [A] cố định khác nhau, sẽ thu được một chùm đường thẳng cho phép xác định được k B. (fi) Kj Hình 3.4. Động học hai ctf chất - cđ chế bấp bênh. 103 3.1.3.3. Phấn ứng kiểu Bi-Bi ping-pong Cơ chế khá đơn giản : cơ chất thứ nhất kết gắn với enzym để tạo ra sản phẩm đầu tiên, rồi cơ chất thứ hai sẽ gắn vào và tạo ra sản phẩm thứ hai. Vì có sự trao đổi giữa hai cơ chất, nên hiển nhiên là cơ chất thứ nhất đã phải để lại ở tâm hoạt động của enzym một hay nhiều nguyên tử. Các nguyên tử này sau đó s | đến kết gắn với cơ chất thứ hai. Trong mỏ hình này, A và B, cả hai đều có ái lực với enzym. Các transam nase có nhóm ngoại là phosphat pyridoxal thường theo cơ chè này, trong do nhóm NH2 đóng vai trò như quả bóng bàn (ping-pong). ( 0 các enzym này, nhóm ngoại được liên kết chặt chẽ với apoenzym va được coi như là một phần toàn vẹn của enzym ). Chẳng hạn, trong phản ứng thuận nghịch sau được xúc tác bởi enzym transaminase : Axit aspartic + Axit a xetoglutaric (A) ^ (B) Axit oxalaxetic + Axit glutamic (P) (Q) Thực tế, phản ứng xẩy ra lần lượt như sau: 1) Kết gắn cơ chất thứ n h ấ t: axit aspartic. 2) Tách nhóm amin đến kết gắn với nhóm phosphat pyridoxal tạo thành phosphat pyridoxamin. 3) Giải phóng ra sản phẩm thứ nhâì : axit oxalaxetic. 4) Kết gắn cơ chất thứ h a i: axit a xetoglutaric. 5) Chuyển nhóm amin từ phosphat pyridoxamin (chất này lại trớ về dạng phosphat pyridoxal) đến a xetoglutaric tao ra axit glutamic. 6) Giải phóng ra sản phẩm thứ hai : axit glutamic. P hương trình vận tốc c ù a p h án ứng c ổ d ạ n g : v max[A] [B] V= ([A] [B] + kB[A] + kA [B]) 104 u .,., — 1 -= —— 1 í , k A Hay 1+ —4+ -k^B- Ì V [A] [B]J 1 ' V [Ạ.] [ A ]lâna [B,l ỉ VI 1BJ , iA ,r IB,J H é sri aóc m -^-ĩ- [B] tung K' H ẻsó g ó c " »•. I- I M IJ K. 1 1 (BJ K í'... L («|J Ị * . 1 M Hinh 3.5. Động học hai cơ chất - cơ ch ế ping-pong Hình dưới đây, mô tả một cách có hình ảnh cơ chế ping — pong đặc trưng cho sự chuyển động của một nhóm cacboxyl giữa mctyl malonylcoenzym A và pyruvat khi có mặt của enzym carboxylase có biotin. Vùng cùa metyl malonyl CoA Vùng của pyruval Hình 3.6. S ự di chuyên của nhóm cacboxyl giữa metylmalonyl CoA và pyruvat dê tạo ra propionyl CoA và oxaloaxetat khi có mặt enzym có biotin. 3.1.3.4. Phản ứng kiểu Theorell - Chance Trong một số phản ứng kiểu Bi -Bi có trật tự, phức kép ba EAB có nồnq độ: rất thấp và có đời sống rất ngắn sở đ ĩ như vậy là do các hăng sò phân ly của cơ chất thứ hai (B) và của sản phẩm thứ nhất (P) là rất cao so với hằng số phân ly của cơ chất thứ nhất (A) và của sản phấm thứ hai (Q). Các enzym alcoldehydrogenase và lactatdehydrogenase vận hành với NAD theo cơ chế này. Các coenzym được sử dụng vừa như cơ chất thứ hai và sản phẩm thứ hai: 105 4— ■=* aldehyt tương ứng + NADH + H+ Alcol + NAD* Lactat + NAD+ *-----* pyruvat + NADH + H+ Trong mô hình này, sự biểu hiện động học cũng tương tự như ở cơ chế bi-bi có trật tự, chỉ có khác là ở sự đối xử của các sản phẩm (ở đây Q là chất kìm hãm cạnh tranh của A và p là chất kìm hãm cạnh tranh của B, điều này làm cho nó giống với cơ chế bi-bi ping-pong hơn). A E B EA p Q EQ E Hình 3.7. Phàn úng kiểu Theorell -Chance. 3.1.4. Phương pháp xác định bàng thực nghiệm các tham số động học 3.1.4.1.Phương pháp đồ thị của Lineweaver và Burk Ở đây — = f (r^r) đô nghiêng a = - ^ in- ; b = — V [S] Vmax L J T TV m 7 ~ = — “ (điểm A ) m Hình 3.9. Hình 3.8. 3.1.4.2. Phương pháp đồ thị của Eadie-Ho/otee ịhinh 3.9) E L _ L .H i+i _ V Vmax V T max y = í§ I = f([Sl) a = ^ — ; b = -^ = 7 3.1.4.3. Phương pháp đồ thị Eadie - Scatchard v [S] _ V m» x ____ v _ Km Km v = — = /( v ) => a = — \ b = ^ ~ y ĩ S ] J Km Hình 3.10. 107 3.1.4.4. Phương pháp dồ thị Woolf-Hofstee K V V = V max - [S] (Nhân 2 vế của phương trình Lineweaver -B urk với tích (Vmaxv)) ỵ =v " a= 3.1.4.5 Phương pháp Eisenthal và MacCornish - Bowden Các giá trị của [S] được đặt ở hoành độ âm. Các giá trị của V đặt ở tung độ. y = v = f([-S]) Các đường thẳng thu được đồng qui ở một điểm có hoành độ Km và tu n g d ộ V m„ Hình 3.11. 3.1.5. Anh hưởng của các tác nhàn vật lý đến động học của các phán ứng enzym 3.1.5.1. Ả nh hưởng của nhiệt độ Tác động cuiuinim JpdeinTO iinjpcuim ^ Nhiệt hoạt hóa các phán ứng hóa học. Nhiệt làm biến tính protein và làm vô hoạt hóa enzym. 108 tượng: H o ạ t h ó a b ở i n liiẹ t iíri-1 MÒ.ib uồi< B i é n t í n h b ó i n h i< ft T ° tò i ưu Nhiội độ Hinh 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzym ai Hoạt hóa các phản ứng hóa học bởi nhiệt Ta đêu biết, vận tốc của các phản ứng enzym cũng như của tấ cá các phán ứng hóa học đều bị ảnh hưởng do sự tãng lên của nhiệt độ, theo hệ thức Arrhenius k = s X e Ei/RT (3.8) Trong đó: k - hằng số vận tốc của phàn ứng; Ea - năng lượng hoạt hóa của phản ứng; s - hằng số; R - hằng số khí lý tưởng (1,987 cal/mol độ); T - nhiệt độ tuyệt đối. Hệ thức này cho thấy vận tốc của một phản ứng hóa học tăng cùng với sự tãng nhiệt độ (tăng nhiệt độ lên 10 độ thì vận tốc của phản ứng tăng lên 2 lần). Với phản ứng enzym thì sự tăng này lớn hơn nhưng không ph ải là vô hạn, thường chỉ trong một vùng nhiệt độ nào đó. Nói chung, nhiệt độ làm 1■ , í V . \ Air () f A l l o \ * a t __ — ---biến tính enzym là từ 45° -50"c. Một số enzym bền nhiệt thì có hể hoạt dộng ớ nh ệt độ cao hơn nhiều (có thể tới 100°C). Thòng số đặc trưng cho enzym là năng lượng hoạt hóa của phản ứng E. được đo băng kJ.mol' . Xác định năng lượng hoạt hóa Hệ thức Arrhenius có thể viêt dưới dạng: 109 (3.9) Ink = —— + Ln(s) R T Đưòng biểu diễn Lnk = f (—) là một đường thẳng có hệ sô' góc là (E /R ) hoặc (Ea/2,3R) T Hình 3.13. Xác định nâng lượng hoạt hóa của phản ứng. Ea = (hệ số góc) (-4,575) (4,575=1,987x2,303) Vi phân (3.9) theo T : d ln K RdT dt d ln K = -E , dT d ln K dT E . ,, 1 ,1 R T dT í ' A/ 1 %_ dT % (mà d ( ~ ) = ụ - ) dT RT 2 Ea ~ RT2 (3.10) Tích phân (3.10) từ kj ở nhiệt độ Tị đến k2 ở nhiệt độ cao hơn T2 |d ỉn k = — |T -2dT k, R (3.11) T, r= = J . iT w _ L _- (í _- li )l =l _ U ___ 1 J L Ĩ à Ị r M T = ^ - ị j = — |T:=— |T;.=—L i -2+1 )t' -1 111 T r' T2 [ %) t % t t 2 t;t 2 t;t 2 T2 - T_1 Vậy (3.11) sẽ bằng: J d ln k = ln — = — T k( 1 V T 1) 1 2 y 110 ( 3 . 12) (3.13) Biết năng lượng hoạt hóa có thể tính được QlC| (3.14) Phần lớn các enzym của động vật có vú, giá trị của Q,(, bằng từ 2-Ỉ-4 (trung bình là 2) tương ứng với nâng lượng hoạt hóa từ 50 đến 100kJ. bl Biến tính và vô hoạt các emym bằng nhiệt Khi nhiệt độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzym sẽ thu được một năng lượng lớn hơn nên có xu hướng chuyển động nhanh hơn. Năng lượng mà chúng thu dược có thể đủ để thắng các tương tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các prôtein hình cầu, dẫn đến một sự biến đổi hình thể prọtein và do đó làm giảm hoạt tính của enzym. Phản ứng vô hoạt một enzym bởi nhiệt thường có động học bậc một: [ E ] = [E 0 ] x e k' Trong đó: k - Hằng số vận tốc cùa phản ứng; [E] - Nồng độ của enzym hoạt động ở thời điểm t; [Eo]- Nồng độ ban đầu của enzym hoạt động. Trong thực tế người ta đo hoạt độ riêng còn lại A của enzym sau các thời gian gỉa nhiệt khác nhau: A = a [E], a là một hộ số tỷ lộ dA = ad[E] ^ = - k a [ E ] = -kA dt ln — = 2 ,3 0 3 1 o g Ạ = -k t A0 A0 111 logA = — — + logA(, 5 2.303 Vẽ đồ thị logA = f(t), sẽ thu được một đường thảng có hệ số góc -k 2.303 , từ đó có thể xác định được k, A0— ]I~v«r A (Ị /iA l ‘ 'tuc Iivại uv > a íj log Ao Thói íóan Hình 3.14. Xác định hằng s ố vận tốc của phản ứng biến tính enzym ả các nhiệt độ Khác nhau. • Năng lượng hoạt hoá của quá trình biến tính enzym Có thể xác định nãng lượng hoạt hóa của sự biến tính enzym E(|. Muốn thế, n g ư ờ i ta gia nhiệt chế phẩm enzym trong một thời gian t thay đổi, ở một nhiệt độ 0 đã cho. (Sau khi đã làm lạnh chế phẩm ngay tức khắc xuống 25"c trong khoảng 20-30 phút). Người ta đo hoạt độ enzym trong những điều kiện hóa lý chuẩn. Vẽ đồ thị logA= f(0), từ đó xác định hằng số vận tốc biến tính kj. Vẽ đồ thị logkj =f(l/T) được đường thẳng có hệ số góc - E d/R. logkdf - Ed Hình 3.15. Xác định năng lượng hoạt hóa cúa biên tính enzym. 112 3.1.5.2. Tác động cùa pH Tất cả enzym đều nhạy cám với sự thay đối pH của môi trường. Có một vùng pH mà hoạt độ của enzym là cực đại. Vùng pH này là kết quá của nhiều tham số: nhiệt độ, lực ion, nồng độ cơ chất,... nghĩa là những yếu tố bèn ngoài, cũng như bản chất của enzym. Qủa vậy, enzym là protein do các axit amin trùng ngưng với nhau tạo nên. Trong số các gốc axit amin của phân tử enzym có các nhóm ion hóa được, một số gốc tham gia vào phản ứng, còn đa phần gốc được dùng để duy trì hình thể của enzym. Các gốc này cũng như cơ chất trong nhiều trường hợp, rất nhạy với pH và thường có các trạng thái ion hóa khác nhau phụ thuộc vào giá trị của pH. Ta có thê dễ dàng hiểu được khi một nhóm -C O Ơ của tâm hoạt động vốn cần thiết cho sự kết gắn cơ chất, nếu giảm pH của môi trường dẫn đến biến thành nhóm COOH thì nó sẽ không kết gắn được cơ chất nữa và enzym sẽ bị mất hoạt tính. Ở pH tối ưu, protein enzym thường có điện tích tổng cực tiểu. Nói chung pH tối ưu của enzym thường khá gần với điểm đảng ion của protein. Người ta cũng đã chứng minh rằng vận tốc của phản ứng thường phụ thuộc trạng thái ion hóa của phức hợp enzym-cơ chất, trong khi hằng số ái lực (Km) lại phụ thuộc đồng thời vào trạng thái ion hoá của enzym và của phức hợp enzym- cơ chất. Để xác định hiệu ứng của pH đến một phản ứng enzym, người ta thường có thói quen đưa phản ứng vào vùng có nồng độ cơ chất bão hoà enzym, có nghĩa là vùng để có vận tốc xúc tác gần với vận tốc cực đại. Và người ta vẽ đường biểu d iễn “ phần trăm vận tốc cực đại, v % phụ thuộc vào pH”. Sẽ có ba trường hợp xảy ra : - Đường cong A (hình 3.16 A) chỉ có một điểm uốn. Một nhóm ion hóa tham gia vào tâm hoạt động. pK của nhóm này tương ứng với điểm uốn. - Đường cong B (hình 3.16 B) có hai điểm uốn và một vai (phần đường cong có dạng hình nón) có hai nhóm ion hóa tham gia vào tâm hoạt động. pK của chúng lần lượt tương ứng với hai điểm uốn. - Đường cong c (hình 3.16 C) cũng có mật hai điểm uốn, nhung đường cong thường nhọn và không có vai. Hai nhóm ion hóa tham gia vào tâm hoạt 113 động. Và pK của chúng khó xác định hơn vì chúng khõng nàm ở các điếm uốn của đường cong. V, 1' Hình 3.16: Ảnh hưởng của pH đến vận tốc của xúc lác enzym. 3.1.5.3. Ảnh hưởng của các tác nhân hỏa học đến phản ứng enzym Các tác nhân hóa học, các chất vô cơ hoặc hữu cơ đều có khả năng làm biến đổi vận tốc của phản ứng enzym. Chúng có thể tác động như là chất hoạt hóa hoặc là chất kìm hãm. 3.ỉ . 5.3.A. Chất hoạt hóa Chất hoạt hóa có bản chất hóa học rất khác nhau. Có thể phân ra những loại như sau : - Chất hoạt hóa thực : như các ion kim loại. - Chất chống kìm hãm : như ion cyanua (CN ) có thể làm mất tác dụng kìm hãm của các muối đổng đến enzym urease. - Chất tác nhân bảo vệ : như cystein có tác dụng bảo vệ các nhóm thiol của tâm hoạt động nhiều enzym. - Chất hoạt hóa tiền enzym : như enterokínase của dịch ruột có khả năng chuyển trypsìnogen không hoạt động thành trypsin hoạt động. A .ĩ. Hoạt hóa bởi các ion kim loại Một số ion kim loại có khả năng ỉiên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc với các nguyên tử n itơ ... của các nhóm cacboxyl, imidazol, amin hoặc peptit của các coenzym hỡặc của các apoenzym. M ột số các ion rtày như cobaỉt trong các enzym có vitamin Bl2, hoặc sắt trong các enzym có 114 coenzym hem atinic.. .là những phần toàn vẹn của cấu trúc coenzym mà chưa hẳn là nhũng ion hoạt hóa. Các ion này thường làm cho tâm hoạt động cùa enzym có mật độ bền rất lớn do sự định hướng các liên kết của mình theo một hinh học hoàn toàn xác định. Định hướng tứ diện các liên kết của Cu Định hirớnọ bát diện các liên kết của Co lioăc cùa Fe Hình 3.17. Sự định hướng các quỹ đạo (orbital) trong các liên kết phối trí giữa các ion kim loại và một coenzym hoặc một apoenzym. Một sự hoạt hoá thực sự bởi các ion kim loại thường xuất hiện khi ion phân ly được khỏi enzym, nhưng ngược lại nó rất cần thiết hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiến hành xúc tác của enzym. Ion kim loại có thể góp phần tạo ra một hình thể thuận lợi cho enzym hoặc làm dễ dàng cho enzym kết gắn được cơ chất hoặc đơn giản là tham gia trực tiếp vào xúc tác như trong nhiều phản ứng oxy hoá- khử. Trong những trường hợp này, ion kim loại đóng vai trò như một cơ chất thứ hai. Vì thế các phương trình phản ứng gần giống vói các phương trình biểu diễn hệ hai cơ chất kiểu bi - bi bập bênh hoặc thường gập hơn là kiểu bi - bi có trật tự. Nếu gọi Km là hằng số Michaelis của cơ chất enzym, K m là hằng số ái lực của kim loại và [M] là nồng độ kim loại, thì ta có hệ thức : K ..K '.+ K ..[M ]+ K -..[S ] + [S],[M] hoặc Từ hình 3.18 cho thấy trong quá trình xúc tác, cơ chất của enzym sẽ kết gắn vào đầu tiên. Kim loại hoạt hóa phản ứng nhưng không làm thay đổi ái lực giữa enzym và cơ chất. Nhiều enzym được hoạt hóa bởi các ion kim loại. Gần như tất cả kinase đều được hoạt hóa bởi Mg2+; các enzym : lipase, 115 trypsin và chimotrypsin được hoạt hoá bởi Ca2+; enzym pyruvat decacboxylase được hoạt hóa bed Mn2+, còn alcoldehydrogenase thì được hoạt hóa bởi Zn2+. Tất cả những nguyên tố trung lượng này có một tầm quan trọng sinh học đặc biệt. Vì vậy, những rối loạn bệnh học do thiếu những nguyên tố này gây ra phải được cắt nghĩa bằng cơ chế enzym. Hình 3.18. Động học kiểu Bi-Bi có trật tự khi có mặt ion kim loại với nồng độ tâng dẩn. A.2. C h ứ kim hăm Chất kìm hãm các phản ứng enzym tác dụng nhiểu cách khác nhau. Những chất kìm hãm bất thuận nghịch thường tác dụng một cách đột nhiên bằng cách làm biến tính enzym. Những chất kìm hãm thuận nghịch lại tác dụng bằng cách gây nhiễu động học enzym và có thể làm ngừng phản ứng. Người ta phân ra ba kiểu chất kìm hãm : - Chất kìm hãm cạnh tranh. - Chất kìm hãm không cạnh tranh. - Chất kìm hãm phi cạnh tranh. a! Chất kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibitors) * inhibitor). Kìm hãm cạnh tranh tuyệt đối (toàn phần) (absolute competitive - Cơ chất và chất kìm hãm kết gắn với enzym tại cừng một địa điểm (một tâm) và tạo ra các phức ES và EI. - Chỉ có phức ES là hoạt động và cho sản phẩm. 116 Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym [E] » Cơ chế và phương trình: [I] ki __k: E + S *==*ES — + 1 I Ti EI {E] [S] K„ [E] = [ES] —— [S] K„ = CHS ] ÍH5 [I] K .ỊĨ] = E S ^ .— [HI] = [ES] Ki = [EI] [SJK, [S] K, K ị: là hằng số phân ly của phức enzym - chất kìm hãm. Phương trình bảo toàn : [E,] = [ E] + [ES] + [El] = [ES] (1 + KJ[S) + K J [ S U W ) [E,] = [ ES] (1 + K J [S] (1+ [I]/ Kj)) Phương trình vận tốc : _ V _ = [E S ]= _________ Ị_________ v„ V= v„ pý o + K B/[s]a+[q/K i)) [S] [S ]+ K r K; [S] 1+ [KJ. 1 1 1 —= - ^ 2L-(l + [I]/Ki) ——h—V V’ max [S] v raJ T ma - Hằng số M ichalis (K™) được nhân lên một hệ số (được gọi là hệ số kìm hãm Fi) có nghĩa là trạng thái phân ỉy của phức ES sẽ được dễ dàng tức là ái lực của E vói s sẽ bị giảm đi. - Sự kìm hãm có thể bị mất đi khi thừa cơ chất. Khi tăng nồng độ s, theo định luật tác dụng khối lượng, s sẽ đi chuyển I ra khỏi tâm xúc tác mà nó đang chiếm. 117 V m I + [!,] I [I] tăng .hông có kìm hãm V- max 1 ________________________________ ^ ’ 1 Hình 3.19. Kìm hãm cạnh tranh. Malonat (COOH -C H 2 -CO O H) là chất kìm hãm cạnh tranh của sucinat - dehydrogenase. (HOOC -C H 2-CH2-COOH). của sucinat là : 1,4.10'*M, còn K, của malonat: 0,04.10'^M. Cơ chế lác dụng điều trị của các sulfamid là một quá trình kìm hãm cạnh tranh. Qua vậy axit para aminobenzoic là một bộ phận của coenzym axil pholic. 0 nhiều vi khuẩn axit paraaminobenzoic là một yếu tố sinh trưởng. Axit paraamonophenyl-sulfonamid (hoặc sulfanilamid) có công thức cấu tạo rất giống axit para aminobenzoic. h ;n - Q - cooh Woods (1940) đã chứng minh rằng khi đưa vào trong môi trường một nồng độ sulfanilamid đủ thì chất này sẽ chiếm tâm xúc tác của các enzym bình thường vốn xúc tác sự tổng hợp axit folic. Khi không có axit folic thì vi khuẩn sẽ ngừng phát triển. Người ta gọi các sufamid là những bacteriostatic (kìm hãm vi khuẩn). * Chất kìm hãm cạnh tranh bộ phận (Partial competitive inhibitors) 118 - Cơ chất và chất kìm hãm gắn với enzym tại hai vùng khác nhau và tạo ra các phức ES, EI và ESI. - Cơ chất có ái lực với enzym tự do mạnh hơn với enzym của phức EI. - Chất kìm hăm có ái lực với enzym tự do mạnh hơn với phức ES. - Các phức ES và ESI đều hoạt động và cho sản phẩm với cùng một hằng số vận tốc. - Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym. Cơ chế và phương trình: E+s * + I Kj ĩ'!' kj E I+ s «= > E+p ki ESI — ► E + p k-1 Ta có thể v iế t: K * ES + kI Tị a Ki - [E][S] ir - Í I M [ES] với a > 1 Kết quả ta có : Vm„[S] V = (1 + m /K i) + [S] (1 + [I]/ ctKj bl Chất kìm hãm khôn? cạnh tranh (non-eompeútive inhibitors) * Chất kim hãm không cạnh tranh tuyệt đối (Absolute non-competitive inhibitors) - Cơ chất và chất kim hãm kết gắn với enzym tại hai tâm khác nhau và tạo ra những phức ES, EI và ESI. - Cơ chất có cùng ái lực với enzym tự do cũng như với phức EI - Chất kìm hãm có cùng ái lực với enzym tự do cũng như với phức ES - Chỉ có phức ES là hoạt dộng - Nồng độ của chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym [E] » [ 1 ] Cơ chê' và các phương trình ♦-E + p KilT íịaK i ki [E][S] [EI][S] Kn = — -------- = ----------[ES] [ESI] [E][I] [ES][I] K| = ------ ------- = ______ [El] [ESI] Một cách thiết lập khác : 1. E + S ^ E +1 ES + I * = 2. Ta c ó : 120 > ES -------- ► E+P EI * ESI E S -------- ► E + p [EI][S] IE][S] K* -HE] =[ES]----[S] Km= [F.S] [ESI] [E][I] [ES][I] [El] [ESI] [S] và(ÈSl]= [El] — Km Km[I] ♦[El] = [ES]— — [Sj.Kj Ki = [I] và[ESl]= {ES]— K, Phương trình bảo toàn: [EJ - [E] + [ESJ + [El] t [EIS] = IES] I M S ] +1 + K* [I]/ ịS]K, + [I]/K ,) ÍẸ ,]= IE S ](1 + K ,/|S ]){! + [ % ) Phương trình vận tốc : V _ [ES] ___________ Ị_________ v mx " [ E l] " ( l + K 1B/[S ](1 + [I]/Ki )) V= í ,1 +~-aL K mì M l [S]J ì V Ị V= 1 hoặc 1 TLX ị,-r a J K , VTmax . K«+[S] Ttì K„ 1 max V .[S] Fj với F = 1 + 111 K. 1 +'i + f l l ' K; K. [S] V,max V Vẽ đồ thị 1/v = f {1/ [S]) khi [I] thay đổi, các đường thẳng thu được sẽ cắt nhau (sau khi ngoại suy) tại một điểm trên trục 1/[S] có hoành độ bằng (-1 /K J và cắt trục tung 1/v tại điểm có tung độ : 1/ V ^ l / V ^ a + ÍIỊ/IQ Chất kìm hãm không làm thay đổi ái lực của cơ chất vdi enzym. Khi có chất kìm hãm này vận tốc cực đại Vma)t bị giảm đi một số trị Fị. Các chất kìm hãm loại này thường là : 121 - Các kim loại nặng (Hg+2, Cu+2, Ag+) tác dụng với các nhóm -SH của enzym. - Etylendiamin tetraaxetat (EDTA) tạo phức với cation M g2+ của enzym. - Tác dụng của cafein đến phosphodiesterase,... đều thuộc kiểu chất kìm hãm không cạnh tranh này. m Hình 3.20. Kìm hâm không cạnh tranh * inhibitors) Chất kìm hãm không cạnh tranh bộ phận (partial non competitive - Cơ chất và chất kìm hãm kết gán với enzym tại hai tâm khác nhau để tạo thành các phức ES, EI, và ESI. - Cơ chất có cùng ái lực với enzym tự do cũng như với phức EI. - Chất kìm hãm có cùng ái lực vối enzym tự do cũng như với phức ES. - Các phức ES và ESI đều hoạt động, song ESI kém hoạt động hơn ES. - Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ enzym [E ]» [I]. Ta có thể viết: k, 122 E + s ■*— + I k.1 ỊT F.I + S ,--- ki --- ► ES -------------- ► E + p I ịt Pk, ESI -----------►E + p Ta có : [E] [S] [EI][SJ K" = — [ES] = [E] [I] K = ——__ = [El] — — [ESI] [ES][I] ------—— [ESIJ Với P<1 Cuối cùng ta được : V „„|S ] V ----------------------------------------- -— ----------------------- (1 + m /K i) (I + M /BQ Km----- — + [S] ------------------ (1 + pm /K i) (1 + p m /K i) c! Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitors). Trong trường hợp này chất kìm hãm khồng gắn được với enzym tự do mà chỉ duy nhất kết gắn được với phức ES. - Chỉ phức ES là hoạt động. - Nồng độ chất kìm hãm là rất nhỏ so với nồng độ k( E + s enzym [E ]» [I]. k2 ES ---------► H + p k.) + I I ESI Ta c ó : [E][S] Km= — [ES] [ES][I] [ESI] = ------ — K; 123 [EJ = [ES] + [ESI] + [E] [ES] V = k2 Từ đây ta có phương trình vận tốc : V *. . [S] ( l + ra/Ki) V = Km + [S] hoặc 1 V V man . ' V [S] J ¥ max I+ Ũ 1' K „ . Trong kiểu kìm hãm này, vận tốc cực đại V max và hằng số biểu kiến K n đều bé hơn Vm#x và Ktn khi không có chất kìm hãm. Vẽ đường biểu diễn — = f với các nồng độ [I] khác nhau ta sẽ V v[S], được một đãy các đưòng thẳng song song. / II] tang / Pi]l Khổng có kìmhâm /' / ~r— / Hệ số góc = K„ V max /' -----T■K, Hình 3.21. Kim hăm phi cạnh tranh. Nếu hằng số phân ly của phức: ESI — --------►E + P + I 124 là không đáng kể so với hằng số phân ly của phức : ES —— ► E + p thì bằng thực nghiệm ta sẽ không thu được một dãy các đường thẳng mà sẽ được một dãy các đường hypecbol hoặc các đường parabol. V à ta sẽ có kiểu kìm hãm phi cạnh tranh không tuyến tính (non -lin ear incompetitive inhibitors). Người ta còn biết ít kiểu kìm hãm phi cạnh tranh đối với enzym có một cơ chất nhung rất thường gặp ở những enzym có hai cơ chất. Bảng 3.2 tóm tắt các tham số chính của động học phản ứng enzym. Bảng 3.2. Các tham số chính của động học phản úmg enzym Hệ s ố góc Kiểu ktm hãm Không có kìm hãm K TTt Hoành đỏ Tung độ -1 1 Vmax. Kìm hãm tranh cạnh K 1 m K ,; v rax Kìm hãm cạnh tranh không Km V™ hãm phi cạnh tranh Kìm Vmax m K ,J Km mÙ [ b l k J -1 1 K Tĩl Vmax 1 KJ 1 Íi3 Vmax I l+ f l Vmax Vm&x ) K, ì k J d/ Kìm hãm do thừa cơ chất Giả sử có phản ứng enzym : E + s *= = = * ES -------► E + p Ta có: K m= [E][S] [ES] Km — ► [E] = [ES] — [S] 125 Giả sử có một phân tử cơ chất thứ hai có khả năng kết gắn vào phức ES và làm cho ES trở thành không hoạt động. Phân tử này sẽ kết gắn vào một tâm khác với tâm xúc tác, được gọi là tâm kìm hãm. Phân tử này dược coi « _IX _A I a ', i n 1 ■» như là một chất kìm hãm. ES + s ESS Ta có: [ES][S] [S] ->- [ESS] = [ES] ----K; Kí = [ESS] [ ^ ] = [E] + [ES] + [ESS] = [ES] (1 + K J[S) + [S]/K,) Ta có thể viết đuợc : V [ES] v m„ [Ei ] và phương trình vận tốc : V V= 1 + K ^ S ] + [S]/Ki 1 hay V K, 11 + —^K m+ — [S] [S] K i / — -K j [S] Hình 3.22. Kìm hãm do thừa cơ chất. 126 [S] Vẽ đường biểu diễn 1/v = f (1/[S]) sẽ được một hypecbol mà tiệm cận xiên của nó có hệ sô' góc là K J VmiWvà cắt trục hoành ở điểm: - l/K m. Còn đường biểu diễn của 1/v = f[S] cũng là một hypecbol mà tiệm cận xiên của nó có hệ số góc là l/(V miXKj) và cát trục hoành ở điểm (-K,) Trong cả hai trường hợp V qua một cực đại khi [S] = 3.2. K m.Kj ĐỘNG H Ọ C CỦA CÁC ENZYM DỊ K H Ô N G G IA N VÀ S ự Đ lỂ U HỎA CỦA CÁC EN ZY M O L IG O M E Hiệu ứng đị không gian và các enzym dị khồng gian thường có vai trò quan trọng trong các quá trình trao đổi chất cũng như trong sự vận hành của các receptor và các protein điều hòa. 3.2.1. Một số khái niệm 3.2.1./. Khái niệm về hiệu ứng dị không gian • Trong một chuỗi phản ứng trao đổi chất thường có một enzym và một phản ứng có tính đậc biệt. Enzym này thường là enzym đầu tiên của chuỗi trao đổi chất. Người ta gọi enzym này là enzym điều hòa (regulator enzyme). Ví dụ: Trong chuôi phản ứng trao đổi chất sau: H| Ej E3 E4 ( A ) ------ (B) -------------— ►(Q ------ — ► (D)-— ► (X) E| là enzym điều hòa của chuỗi trao đổi chất dẫn đến (X). • Enzym điều hòa này thường bị kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của phản ứng và chỉ bởi sản phẩm cuối cùng này mà thôi. Trong ví dụ trên enzym E] chỉ bị kìm hãm bỏi X mà không bị kìm hãm bởi B, c hoặc D. • Enzym điều hòa này là enzym duy nhất của chuôi bị kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của phản ứng. Trong ví dụ trên enzym Ej nhạy cảm với X, còn các enzym Hj, Ej, E4 thì không nhạy cảm với X. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng, bằng tác dụng đặc hiệu và duy nhất của mình đến enzym điều hòa đã kiểm ưa được toàn bộ động học phản ứng. • Theo quy luật chung, sản phẩm cuối cùng của phản ứng có một cấu trúc hoàn toàn khác với cấu trúc của cơ chế khởi đầu. Sản phẩm cuối cùng 127 này chưa bao giờ tác dụng đến enzym điều hòa bằng cơ chế kìm hãm cạnh tranh với cơ chế bình thường và chuẩn mực của enzym n ày .ơ ví dụ trên, X có cấu trúc khác cơ bản với cấu trúc của A. X không tác dụng với enzym điều hòa E, bằng cơ chế kìm hãm cạnh tranh với cơ chất A. Tác động này của sản phẩm cuối cùng đến enzym điều hòa không phải trong cùng một không gian (isosteric effect) mà là khác không gian. Vì vậy mà Monod, Changeux và Jacob (1963) gọi là hiệu ứng dị không gian (allosteric effect). Còn sản phẩm cuối cùng có tính chất điều hòa đặc hữu được gọi là chất hiệu ứng điều hòa (allosteric effector). 3.2.1.2. Khái niệm về sự chuyên tiếp dị không gian (allosteric transition) Trong các cấu trúc protein của enzym điều hòa thường có ít nhất là hai vùng chức năng: • Một vùng là tâm hoạt động, đảm bảo cho enzym hoạt động. Hình thể không gian của tâm này thích ứng được với hình thể không gian của cơ chất phản ứng và chỉ với cơ chất của nó mà thôi. • Một vùng khác là tâm dị không gian (allosteric site). Hình thể không gian của tâm này lại thích ứng với hình thể không gian của chất hiệu ứng dị không gian và chỉ với chất này thôi. Chất hiệu ứng dị không gian này có thể thích ứng một cách đặc biệt và thuận nghịch với tâm dị không gian. Khi chất hiệu ứng dị không gian kết hợp với tâm dị không gian thường dẫn đến một sự biến hình cấu trúc rất nhẹ nhàng trên toàn bộ protein enzym. Tuy nhiên sự biến hình này có tính rời rạc (discrete) và thuận nghịch. Người ta gọi là sự chuyển tiếp dị khống gian. Tàm (lị kliỏng gian (a) Tảúi líoạt d ụ m íb) Cư chát bị "lừ chói" ụ ớ tro n g là m h lioo ạ li d ộ niig g <lxợc kết g á n tro n g l â n ứng với cơ chất i l ị k h ủ n g g ia n Hình 3.23. Sơ đồ chuyển tiếp dị không gian: ( a ) : Enzym điêu hòa trước khi có sự chuyển tiếp dị không gian; (b ): Enzym điều hòa trở thành không hoạt động sau khi co sự chuyển tiếp dị không gian. 128 Một trong những hậu quả quan trọng nhất cúa sự chuyển tiếp dị không gian này là sự biến đổi hình thể cuả tâm hoạt động nên sẽ làm ánh hưởng trực tiếp đến động học của phản ứng được xúc tác bởi enzym và do đó đến hoạt tính sinh học của enzym này: 3.2.1.3. Enzym điều hòa có tâm dị khỏng gian nhạy cảm với chất hiệu ứng dị không gian. Sons, độ nhạy cảm này có thể mất đi dưới ảnh hưởng cùa các tác nhân lý học (nhiệt) hoặc hóa học (như urê, hoặc các dẫn xuất t ủ a thủy ngân) mà người ta gọi là hiệu ứng hãm nhạy (desensitization effect). Trong trường hợp này người ta nhận thấy: Vail tồn tại một hoạt độ enzym nào đó, có nghĩa là tâm hoạt động chưa bị phá huỷ. Enzym khống còn nhạy cảm với chất hiệu ứng dị không gian nữa . Có thể giải thích hiệu ứng hãm nhạy theo hai cách: Cách thứ nhất, ta phải thừa nhận rằng trong quá trình xử lý băng các yếu tố hăm nhạy,tâm dị không gian (không phải tâm hoạt động) đã bị tổn thương do đó chất hiệu ứng dị không gian sẽ không kết gắn được vào dây nữa. Kết quả là sự chuyển tiếp dị không gian sẽ không thể xảy ra và cn/ym điều hòa sẽ khổng "đảm nhận" được chức nãng điều hòa của mình. Cách thứ hai, cũng phải thừa nhận rằng, sự vận hành tốt của enzym điều hòa không những phụ thuộc vào tính toàn vẹn của tâm dị không gian mà còn phụ thuộc vào sự duy trì cấu trúc không gian của protein ờ trong một trạng thái hình thể xác định đủ đảm bào cho khả năng tương tác được giữa tàm dị không gian và tâm hoạt động. 3.2.1.4. Khái niệm vé tính hợp tác của các tâm Khi nghiên cứu động học tác dụng của enzym điều hòa threonindesaminase, người ta đã chứng tỏ rằng chỉ một phân tử protein enzym có the kết hợp với nhiều phân tử cơ chất và nhiều phân tử chất hiệu ứng dị không • » I. IV 1 V /> t • Jỉ .A f . 4A *a' __ 1 ....._' L ! ì.. i * gian. Vậy là ở enzym này có nhiều tâm hoạt động giống nhau và nhiều tâm dị không gian giống nhau. Tuy nhiên động học chung của phản ứng enzym lại không tương ứng với một sự cộng đơn giản các hoạt độ đơn của nhiều 129 tâm hoạt động của enzym này, vì bậc của phản ứng lớn hơn một. Cũng nhu vậy, động học của hiệu ứng kìm hãm của isoleucin (là chất hiệu ứng dị không gian của enzym threonin-desaminase) không tương ứng vói số cộng đơn giản các hiệu ứng đơn của nhiều tâm dị không gian về động học kim hãm cùng có thứ bậc lớn hơn một. Vậy là do tương tác hỗ trợ giữa các tâm hoạt động mà tiềm năng phản ứng của chúng đã được nhân lên. Nói cách khác, các tâm hoạt động đã hợp tác với nhau. Tuy nhiên dưới tầc động của các tác nhân hãm nhạy, các tâm hoạt động của cùng một protein enzym sẽ khổng còn hợp tác với nhau nữa m à "vận hành" riêng rẽ theo động học bậc 1. Như vậy hiệu ứng của m ột tác nhân hãm nhạy bao gồm: - Huỷ bỏ các tương tác giữa tâm hoạt động và tâm dị không gian do đố sự chuyển tiếp dị khổng gian sẽ không xảy ra nữa. - Huỷ bỏ sự hợp tác giữa nhiều tâm hoạt động trong cùng một enzym. - Huỷ bỏ sự họp tác giữa nhiều tâm dị không gian trong cùng một enzym. Mộỉ hợp chất như thế có thể coi là một tác nhân phân ly phân tử. 3.2.2. Bản chất oligome của các enzym được điều hòa bằng các chuyển tiếp dị không gian Có thể coi enzym điều hòa cổ tất cả các chúc năng của mình như là một tập hợp các dưái đơn vị riêng liên kết lại với nhau. Các dưới đơn vị này sẽ hợp tác với nhau một cách chuẩn xác nhằm có cùng m ột chức năng. Tuy nhiên, trong cấu trúc của protein enzym, người ta đã biết có m ột trạng thái kết hợp các dưới đơn vị cơ sở như thế: <JÓ là cấu trúc bậc 4. Trong quá trình chuyển tiếp dị không gian, cấu trúc bậc 4 này sẽ bị biến đổi. Nhưng sự biến đổi là tối thiểu, vì sự chuyển tiếp dị không gian m ói làm thay đổi các lực liên kết vốn có tác dụng kết hợp các dưới đơn vị lại với nhau trong m ột protein enzym mà chưa dẫn đến trạng thái phân ly hoàn toàn. V à phân tử enzym xuất hiộn hoặc ở trạng thái chặt (contraint) hoặc ở trạng thái lỏng lẻo (relaché). 130 Có thể tóm tắt các quan điểm cơ bản về các enzym dị không gian bằng ba mệnh đề Changeux (1965) như sau: 1- Các protein enzym dị không gian là những oligome do một số protome hạn chế kết hợp lại vối nhau bằng cách như thế nào để phân tủ có ít nhất một trục đối xứng. 2- Mỗi protome của phân tử dị không gian đều có mang m ột vài và chỉ một vùng tiếp nhận có không gian đặc hiệu bổ trợ được cho một loại phối tử (liganđ) và enzym sẽ tạo lập nên với phối tử này những phức thuận nghịch. 3- M ột phân tử dị không gian có thể có nhiều trạng thái hình thể khác nhau càn bằng thuận nghịch với nhau. Các trạng thái này thường khác nhau: - Bởi số lượng và sự phân bố các protome hoặc bởi năng lượng của các liên kết giữa các protome. - Bởi ái lực của chúng với một hoặc nhiều phối tử có không gian đặc hiệu. Như protein chuyển tù một trạng thái hình thể này sang một trạng thái hình thể khác thì tính đối xứng của nó vẫn được bảo toàn. Như vậy sự điểu hòa dị không gian là sự chuyển giao các tín hiệu nội phân tử (inưamolecular signals). 3.2.2.1. Các mô hình phân tử Trong điều hòa dị không gian, chất hiệu ứng dị không gian thường khác với cơ chất và ta có sự điều biến dị huớng (modulation heterotrophe). Trong m ột số trường hợp, chính cơ chất lại là chất điều biến (modulator); nhưng lại có hai tâm kết gắn khác nhau, trường hợp này ta có sự điều biến đồng hướng (isotropic modulation). Các cơ chất và các chất hiệu ứng được gọi là các phối tử của enzym dị không gian. T e n se (T) inactive Trạng thái chặt (T) Relaxed (R) Trạng lỏng lẻo (R) Hình 3.24. Mô hình sự kết gắn hợp tác của các phối tử. 131 Có hai mô hình khác nhau nhằm giải thích sự kết gắn hợp tác của các phối tử. Hai mô hình đểu dựa trên một giá thiết đã được kháng định bằng thực nghiệm: với dị không gian có tồn tại hai hình thể không gian khác nhau: một hoạt động và một không hoạt động. Hình thếhoạt động được gọi là hình thể lỏng lẻo (R) vì các liên kết giữa các protome ờ đây rất yếu. Hình thể khônạhoạt động được gọi là hình thể chật (T). Hình thế R sẽ kết gắn cơ chất và chất hoạt hóa, còn hình thể T thì kết gắn chất kìm hãm. Giữa hai trạng thái R và T chỉ cách biệt nhau bằng một hàng rào năng lượng tháp. Hiệu năng lượng tự do giữa R và T phải khá thấp để có thể dễ dàng dược bù trừ bằng các liên kết giữa protein enzym và các phối tử của nó. 3.22.2. Mô hình cuaJKosland và Atkinson Mô hình này được gọi là mô hình hợp tác dãy hay chuyển tiếp dãy (sequential co-operation hoặc sequential transition) cho rằng, khi kết gắn phối tử đầu tiên vào một dưới đơn vị này thì sẽ dẫn đến sự biến dạng nối tiếp các dưới dơn vị khác với các hằng số ái lực (k|, k2, k„ k4) khác nhau nhưng tuân theo đẳng thức sau: I, V —L- \r ▼ k, s L s . 1 ;'s i s) -tr-rirr Ik: J ( J it) □© 1 iu (sY?j io n Hinh 3.25. Mô hình chuyên tiếp dãy của Kosland và Atkinson. u* >y l-ua Mỏ hình này được biểu diễn bằng sơ đồ hình 3.25. 3.2.2.3. Mô hình của Monod, 'Wyman VÀ Changeux Mô hình này có tên gọi là mô hình sắp xếp (Concerted model). Các quy tắc cùa mô hình này như sau: - Vổ phương diện chức năng thì các dưới đơn vị không thể khác nhau. cách thường xuyên. một - Các biên đổi hình thê (kiểu chuyển tiếp Rc==>T) đều đụng chạm tới tất cả các dưới đơn vị cùng một lúc. 132 - Phối tử có thể gắn kết với dạng R hoặc T nhưng với ái lực khác nhau cho những hình thể R hoặc T này. - Chính sự kết gắn của phối tử sẽ làm biến đổi cân bằng giữa các dạng R và T và ị í J + 4S 4S + u ( s 'O LU 3S + sẽ hướng các protome về phía các dạng có ái lực cao (điều biến dương). r ti tịfc is 0 0 Ụ J 2S + tlk, - Các enzym tuân theo sự điéu hòa dị không gian thường được cấu tí ih từ một + 2S số chẵn các protome. ti < 3 $ +s (Si ì s+ Một cách khác, theo mỏ hình xếp dặt này, các protome được coi là ti Ìg đương nhau trong không gian, có nghĩ là chúng được phân bò' như thế nào để Ìg với ít tị 0 ĩjs ) QSẮ!) ịs |s Ị nhất một trục đối xứng, mỗi prc )me luôn được bao quanh bời cùng một sô protome như thế bên cạnh. Hình 3.26. Mô hình sắp xếp của Moned, Wymam và Changeux. Mô hình sắp đặt có thể coi như trường hợp riêng hay trường hợp giới hạn cùa mô hình dãy. 3.2.3. Động học của các enzym dị không gian Các enzym dị không gian không tuân theo động học cổ điển của Michaelis-Menten, mà theo đường cong hình sin vốn thể hiện hiện tượng hợp tác Cho đến nay. các enzym dị khỏng gian đã được nghiên cứu có ít nhiéu giống với mô hình này hay mô hình khác của hai mỏ hình lý thuyết trên. Áp dụng những giả thuyết đã được công thức hóa đối với một mô hình này hay khác và bằng những tính toán tương đối phức tạp người ta đã chứng m inh rằng vận tốc đầu không tương ứng với công thức Michaelis-Mcnten mà theo cô n g thức thực nghiệm của Hill: v nBXf s r Hòạc vK + v fS f 5 THaxPT K + [S ]n V... - V = vK [S]n V ... - V [ST K 133 hay lo g ------—— =nlog[S J - logK V max - V Khi vẽ đường biểu diễn V = f([S]), với enzym dị không gian ta được đường cong hình chữ s thể hiện hiện tượng hợp tác. Vẽ đường biểu điễn lo g -----------= f(lo g [S ]) ta được đồ thị Hill. Hệ V max - V số góc n của đường thẳng được gọi là hệ số hợp tác (hay chỉ số hợp tác), n phụ thuộc vào [S]. Tuy vậy có một vùng nồng độ [S] có n không dổi: trong vùng này lo g -—- — là một hàm bậc nhất của log[S], hộ số góc của đường Vmax - V thẳng tương úng là n . Trong vùng nồng độ này, n là cực đại nhưng nó vẫn luòn luỏn nhỏ hơn số duới đơn vị của enzym (nếu nó bằng số dưới đơn vị có nghĩa là sự hợp tác sẽ là toàn bộ). Hình3.27. Biểu hiện động học khi không có hợp tác (n=1), khi có hợp tác dưong (n>1) và khi có hợp tác âm (n<1) theo Michaelis-Manten, theo Lineweover-Burk và theo Hill. Ở ngoài vùng này, n sẽ biến thiên vối [S]: đường: thẳng sẽ khồng tuyến tính nữa mà bị uốn cong, Với các giá ư ị của [S] rất thấp hoặc rất cao hệ số góc của đường cong tiến tới 1, có nghĩa là sự hợp tác bằng không. Và ta lại có động học Michaelis cổ điển. 134 Các enzym dị không gian thường được phân thành ba nhóm: - Eznym hệ K. - Eznym hệ V. - Eznym hệ phức hợp. ơ/ Các enzym hệ K. Đó là các enzym mà với chúng, chất hiệu ứng chỉ làm thay đổi ái lực biểu kiến (K,,,) của enzym đối với cơ chất. Chất hiệu ứng của enzym hệ này cũng được gọi là chất hiệu ứng kiểu K. Vậy chất kìm hãm là chất làm tăng Km, còn chất hoạt hóa là chất làm giảm Km. Điều này đuợc thể hiện bằng các phương trình sau: (1 + ^ ) K, n' và n" là số Hill tương ứng đối với chất kìm hãm và chất hoạt hóa. Các số Hill này lớn hơn 1 và bé hơn hoặc bằng số tâm kết gắn I và kết gắn A trên mỗi phân tử enzym. Ở hình (3.29) cho thấy ở đây cơ chất và chất hoạt hóa làm dịch chuyển cân bằng vể phía có lợi cho trạng thái R, ưong khi đó chất klm hãm lại làm chuyển dịch cân bằng theo chiều ngược lại, về phía trạng thái T. Tình trạng này gợi nhớ lại, trong sự kìm hãm cạnh tranh thì sự cạnh tranh giữa s và I không tiến hành ở tại cùng một tâm, trên cùng một phân tử enzym mà bằng những sự chuyển dịch đối nhau của cân bằng giữa hai hình thể R và T. y Y [S] K bl Km Km H ệK Hinh 3.28. Biểu diễn động học các enzym dị khòng gian hệ K và hệ V. 135 bl Các enzym lìệ V. Đó là những enzym mà với chúng, chất hiệu ứng chỉ làm biến đổi vận tốc cực đại (Vmax) của phản ứng. Và chất hiệu ứng của hệ enzym này được gọi là chất hiệu ứng kiểu V. Trong trường hợp này, cơ chất cổ cùng ái lực dối với hai hình thể R và T do dó không cảm ứng đến sự chuyển tiếp dị không gian. Bằng tính toán, người ta có thê chứng minh rằng sự biến thiên của vận tốc đầu theo nồng độ cơ chất là tuân theo định luật Michaelis-Menten: v . - v ’- J 3 " “ [S] + K „ Vậy là ở đây, sự kết gắn s là không có tính hợp tác. Khi có mặt chất kìm hãm kiểu V, trạng thái T được ưu tiên và VIP1> bi ) do đó bị nhỏ đi. chia cho hệ số (1+ # . ' HÊ. ■ '■ \ ■ 1^ '/ '2 K( Khi có mặt chất hoạt hoá kiểu V, thì trạng thái R sẽ chiếm lĩnh và V ÍA1" được nhân lên vói thừa sô' (1+ — — ) do đó đươc tãng lên. Trường hơp thứ Ka hai này gợi cho ta nhớ lại sự kìm hãm không cạnh tranh. Tóm lại, tuỳ theo enzym dị không gian là thuộc hệ K hay hệ V, mà đường cong v„ = f([S]) là một đường hình chữ s hay một đường hvpecbol. Nhưng trong tất cả mọi trường hợp, các chất hiệu ứng đều làm cảm ứng sự chuycn tiếp dị không gian về phía có lợi cho trạng thái có khả năng kết gắn chúng. Các đường cong v0 = f([I]) hoặc v„ = f([A]) cũng có dạng hình chữ s. Các đưừng hình xích ma này thường biểu diễn cho các phương trình Hill tức là những phương trình có nồng độ phối tử được luỹ thừa lên n, n’ hoặc n". 3.3. Đ Ộ N G H Ọ C CỦA CÁC E N Z Y M C Ố Đ ỊNH Việc cố định enzym dẫn đến tạo ra một pha rắn dị thể. Và trong môi trường phản ứng lúc này thường có mặt: - Một pha lỏng chứa cơ chất, dung dịch đệm và các chất hiệu ứng. 136 - Một pha rắn chứa enzym, thường ớ dưới dạng khối, màng, màng mỏng hoặc hạt tròn. Ngay cả pha rắn này của quần thể enzym cũng dị thể: Các phân tử enzym phân bô không đồng đều, bị biến dạng không giống nhau và bị giữ vào chất mang cũng khác nhau. Vì vậy khi nghiên cứu động học của enzym cố định phái tính dến hai dạng mới so với động học của enzym đồng thể: - Một mặt có liên quan với chính enzym: Sự biến đổi các tính chất nội tại của enzym do sự cô' định tạo ra. lặt khác có liên quan với sự có mặt của một pha rắn, điều này sẽ dẫn đến những hiện tượng lý học đặc thù phải xem xét. E - Ĩ - . ▼ 1 Enz vm hòa tan í $ Eiưym CÍI (tìuli Biến (loi iunn tne Án ngũ khỏng gian Hình 3.29. Sơ đồ biến đổi các đặc tính của các enzym do c ố địnhrì. 3.3.1.1. Biên đổi các tính chất nội tại của enzym Khi enzym được kết gắn vào chất mang sẽ gây ra những biến đổi về hình thể không gian của enzym, cũng như sẽ tạo ra những án ngữ không gian giữa chất m ang và tâm hoạt động hoặc giữa chất tác động và tâm cùa I1Ó, do đó cũng làm biến đổi các tính chất động học của enzym. Quả vậy, toàn bộ các phân tử enzym lúc này sẽ không giông nhau: chúng có thể được liên kết với chất mang bằng một sô' liên kết khác nhau (đồng hóa trị hoặc phi đồng hóa trị) và hình thể của chúng có thể bị mất cân đối nhiều hay ít. Các phân tử enzym không dược phân bô' một cách đồng đều trong pha rắn. thường ở phía ngoài, mật độ các phân tử enzym cao hơn ở phía trong. Vì vậy khá năng tương tác của tàm xúc tác sẽ phụ thuộc vào sự 137 định hướng của phân tử enzym so với chất mang, vị trí của phân tử enzym trên bề mặt hoặc trong các lỗ của chất mang. Vì những lý do đó, các tham số động học của một enzym có thể rất thay đổi từ phương pháp cố định này sang phương pháp cố định khác. 3.3.1.2.Các hiện tượng vật lý liên quan với sự có mặt của pha rắn Trong xúc tác đồng thể tất cả các tham số có ảnh hưởng đến hoạt động của enzym ([S], [P], pH, nhiệt độ, chất tác động...) ở tất cả mọi điểm của dung dịch phản ứng đều có một giá trị đổng nhất. Trong xúc tác dị thể các tham số đặc trung cho hỗn hợp phản ứng ở tất cả mọi điểm sẽ không có cùng một giá trị là đo: - M ột mặt, là do các tương tác giữa các chất phản ứng và pha rắn: các chất phản ứng thưòng dược tập trung vào pha rắn nhiều hoặc ít rất khác nhau. Người ta nói là có hiện tượng phân bố và các chất phản ứng tự phân bố một cách không đồng đểu giữa pha lỏng và pha rắn. - Mặt khác, sự khuếch tán của các chất phản ứng từ pha lỏng tới enzym đang nẩm ở trong hoặc ở trên một tưới rắn thường khó khăn, do đó phản ứng enzym có thể bị giới hạn bởi những lực cản khuếch tán (diffwsional resistances). Nói chung, ỏ trong lòng pha lỏng (môi trường lổn) và ở gần enzym (vi môi trường) nồng độ cơ chất sẽ không giống nhau. Nếu như trong môi trường đồng thể sự diễn biến của các nổng độ chỉ phụ thuộc vào thời gian thì trong môi trường dị thể, sự diễn biến nồng độ còn phụ thuộc vào cả không gian nữa: nồng độ của các chất phản ứng biến thiên theo vị trí trong không gian, có nghĩa Ịà nồng độ triển khai thành các gradient nồng đô. Hình 3,30. Vi môi trường và môi ỉrưòng lón. 138 Người ta thường gặp hai kiểu gradient nồng độ: - Ở trong các gradient gián đoạn, nồng độ không thay đổi một cách tuần tự mà thay đổi một cách dột ngột. Sự khác nhau về nổng độ trong trường hợp này là do hiện tượng phân bố. - Ở trong các gradient liên tục, nồng độ thay đổi dần dần và gradient sẽ càng lớn khi sự biến thiên nồng độ càng nhiều. Sự khác nhau về nồng độ trong trưòng hợp này là do hiện tượng khuếch tán. aì Hiện tượng phân bố. Hiện tượng phân bổ là (dữ) kết quả tương tác của các phân tử: phân tử cơ chất, phân tử sản phẩm hoặc phân tử tác động với các nhóm của chất mang enzym. Các tương tác có thể là tĩnh điện, kỵ nước hoặc háo nước. Hậu quả là chúng có thể làm tâng hoặc làm giảm nồng độ của các chất phản ứng ở trong chất mang so với ở bên ngoài. Có lẽ quan trọng nhất là các tương tác của các cơ chất, của các sản phẩm hoặc các chất tác động có mang điện tích với một chất mang cũng mang điện tích. Giả sử chất mang là một màng tích điện âm thì ở gần chất mang một chất phản ứng tích điện dương R+! sẽ được tập trung vào nhiều hơn ở trong dung địch (bên ngoài), trong khi đó chất phản ứng tích điện âm R‘2 lại được tích tụ ít hơn. Hiệu ứng phân bố này sẽ thể hiện ra bằng m ột gradient nồng độ gián đoạn. Hiệu ứng phân bố có thể làm thay đổi pH tối ưu biểu kiến cũng như các hằng số động học của enzym cố định. • pH tối ựu của enzym cố định pH tối ưu có thể khác nhau tới hai đơn vị tuỳ theo enzym được nghiên cứu ở trạng thái cố định hay trạng thái hòa tan. Có hai trường hợp xảy ra: - Chất mang tích điện âm: ở gần các hạt rắn sẽ tạo ra một sự tập trung các proton của môi trường. pH ở vi môi trưòng của enzym sẽ axit hơn pH của dung dịch bên ngoài. Mặc dù irong thực tế, pH tối ưu thực vẫn không thay đổi và pH đo được ở môi trường lớn (của dịch) đà có một sự chuyển địch về vùng bazơ. 139 - Chất mang tích điện dương: Các ion H4 bị đẩy ra nên enzym dược bao bọc trong một môi trường kiềm hơn mỏi trường trong thiết bị phán ứng và pH tối ưu biểu kiến sẽ chuyển dịch về phía axit hơn. Chẳng hạn như enzym chimotrypsin hòa tan có pH tối ưu 8,4 sẽ giảm xuống 7,0 sau khi cố định nó trên một polyme cation (polyomitin) và sẽ tăng lên 9,6 sau khi cố định nó trên một copolyme etylen/anhydrid malic. Thực tế, sự suy iuận này chỉ đúng đối với những môi trường có lực còn yếu. Khi lực ion tàng lẻn, các điện tích của chất mang có thế bị trung hòa bới các ion muối trái dấu nên các khác biệt về pH giữa vùng lân cận chất mang và dung dịch ngoài sẽ ít đi. Trong một số trường hợp pH tối ưu là bằng pH tối ưu của enzym dạng ban đấu nhưng đáy của đường cong được nới rộng ra, điều này cho phép enzym làm việc trong một phổ pH rộng hơn. H àng sô Kmcủa enzym cố định lực mà cơ chất với chất mang sẽ quy định giá trị Kmcủa enzvm. Quá vậy, một chất mang thường trên bề mặt có chứa nhiều vùng có |:ưc nên sẽ hút cư chất nếu cơ chất cũng háo nước, hoặc sẽ đẩy cơ chất nếu cơ chất kỵ nước. Bằng cách như thế, khi chất mang và cơ chất cả hai đều tích điện thì trong môi trường cận sát với enzym, sẽ tạo ra những tương tác sinh diện hút hoặc dẩy và kết quả là thiết lập nên một gradient nồng độ cơ chấ và một sự thay đổi của ái lực biểu kiến: Km sẽ tăng lên nêu các điện tích của chất mang và của cơ chất là cung dấu. Km sẽ giảm xuống nếu các điện tích của chất mang và của cơ chất à trái dấu. Cũng như với pH, sự tăng lực ion của môi trường sẽ có xu iướng làm cho giá trị Kmcủa enzym ban đầu và enzym cố định gần nhau. • Hiệu ứng không gian giá trị của Km mà các hiện tượng cồng kềnh không gian cũng đóng một vai trò rất quan trọng. Việc gắn kêt enzym vào một chất mang cứng thường làm giảm sự tiếp cận của cơ chất, đặc biệt khi cơ chất là cao phân tử thì sẽ dẫn 140 đến làm giảm ái lực biểu kiến của enzym với cơ chất. Các hiện tượng cồng kềnh không gian đôi khi cũng dẫn đến những điểm phân cắt khác nhau trên cơ chất cao phân tử bới cùng một enzym ở trạng thái tự do và ở trạng thái cố định. Nhiều dẫn chứng về sự hạn chế không gian đến hoạt tính của các enzym cố định đã được mô tả. Chẳng hạn, ribonuclease được cố định trong nhũng viên bi agarose bị giảm hoạt độ 10-20% so với enzym tự do nếu cơ chất là citidin-monophosphat vòng (CMP-vòng), và giảm đi 50-75% nếu cơ chất là một ARN có khối lượng phân tử cao. Hoạt độ của glucoamylase cố định trên CM -Cellulose chỉ bằng 77% hoạt độ của enzym ban đầu nếu cơ chất là amỵlose có khối lượng phân tử là 8000Da và sẽ giảm xuống chi bằng 15-17% hoạt độ của enzym ban đầu nếu amylose có khối lượng trên 500.000Da. Tuy nhiên, có thể cải tiến tính hiệu quả của xúc tác bằng cách đè cách xa protein enzym với chất mang của nó qua một "cánh tay" trung gian để làm tãng độ tự do của hộ thống, do đó sẽ làm cho enzym được vây quanh bủng mỏi trường phản ứng b/ Hiện nrợng khuếch tán. Các hiện tượng vận chuyên vật chất đóng vai trò rất quan trọng trong xúc tác dị thể. Ở đây vật chất phải được chuyên từ pha lỏng sang một pha rắn có nghĩa là phải vượt qua một bề Ph Ịono 3 Parai mật liên pha, bao gồm: - Vận chuyển ngoài (hay khuếch tán ngoài): từ dung dịch tới bề mặt của chất mang và ngược lại ị bằng khuếch tán và bằng đối lưu. - Vân chuyển trong (khuếch tán trong): vận chuyển vật chất ở bên trong một chất mang có lỗ, bên trong một gcl hoặc bên trong một màng bằng khuếch tán. Trở lực cho sự vận chuyến vật chất là do thiết lập nên một gradient nồng độ của các loại phân từ hòa tan u Hình 3.31. Khuếch tán trong và ngoài. I4l trong môi trường giữa dung dịch bên ngoài và bề mặt liên pha rắn-Iỏng của chất mang và dung địch. Trở lực này sẽ phụ thuộc vào khôi lượng và nồng độ của các chất phản ứng, vào độ nhớt của môi trường và vào các đặc tính của chất mang (kích thước các hạt, độ xốp...). Có thể làm tàng tốc độ vận chuyển bằng cách tăng lưu lượng cung cấp của thiết bị phản ứng, bàng cách khuấy môi trường mạnh hơn hoặc bằng cách giảm kích thước của các hạt, sẽ góp phần làm giảm chiều dày của lớp giới hạn. Sự giới hạn (quá trình) khuếch tán bởi các hiện tượng vận chuyển vật chất bên trong hoặc bên ngoài sẽ phụ thuộc chủ yếu vào mối tương quan giữa tốc độ phản ứng enzym và tốc độ vận chuyển. - Nếu nổng độ cơ chất ở bể m ặt liên pha lòng-rắn là bé hơn hẳn nồng độ cơ chất trong dung dịch; Sm! Sjrt, ta sẽ thấy có sự tăng biểu kiến của enzym. Trong trưòng hợp này, sự vận chuyển vật chất sẽ là giai đoạn giới hạn của phản úng. Người ta nói là quá Ưình đang trong ch ế độ khuếch tán. - Nếu vận tốc của phản ứng được xúc tác là bé hơn vận tốc vận chuyển thì nồng độ cơ chất ở lân cận enzym thục tế sẽ bằng nồng độ trong dung dịch: Sm = Su- Trong trường hợp này, chính sự xúc tác của enzym sẽ là giai đoạn giới hạn. Người ta nói là quá trình đang ở trong cơ phế động học (hình.3.32) Hình 3.32. Diện nổng độ cơ chất ỏ lãn cận bể mặt liên pha lồng-rắn theo bản chấỉ của giai đoạn giói hạn. 3.3.2. Ảnh hưởng của sự phân bố chất hòa tan đến động học các enzym cố định Khác với ở enzym hòa tan, dung dịch ở gần bề m ặt của m ột enzym cố định thường bị ảnh hưởng bởi cả điộn tích và độ kỵ nước của bề mặt. Do tính chất lưỡng tính của các enzym nên trên bề mặt của các hạt enzym cố định luôn có mặt các điện tích. Sự tích điện b ê mặt còn được tạo ra do khi sử 142 dụng các chất trao đổi ion hoặc các chất mang điện tích để cố định. Khi các điện tích dương và âm không càn bằng nhau thì điện tích thực trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đáng kể đến các tính chất của vi môi trường. Chính sự tích điện này sẽ có tác dụng đẩy lùi các phân tử chất tan có điện tích cùng dấu và hút các phân tử có điện tích trái dấu. Lực hút hoặc đẩy do sự tích điện này là đáng kể đối với khoảng cách phân tử nhưng sẽ suy giảm nhanh chóng theo bình phương khoảng cách từ bể mặt xúc tác. Vì vậy, giữa dung địch và vi môi trường luôn xảy ra sự phân bố các phân tử tích điện (các cơ chất và các sản phẩm). Các phân tử ngược dấu với các phân tử của bề mặt enzym cố định thì được phân bố vào trong vi môi trường, còn các phân tử có điện tích cùng dấu với các phân tử của bể mặt enzym cố định thì bị đẩy ra vào dung dịch. Có thể định lượng sự phân bố trong dung dịch bằng cách đưa vào hệ số phân bố tĩnh điện (A): A Ị O [A ”- ] = [C"*] IK Ì (3 1 5 ) Trong đó [ C Ỵ ] và [ AJJ ] - nồng độ mỗi cation và anion trong dung dịch [ C n+] và [ A " '] - nổng độ của cation và anion trong vi môi trường, n : số điện tích của mỗi ion, A nằm trong khoảng từ 0,01 đến 100. A> 1 đối vứi các bể mặt enzym tích điện dương. A < 1 đối với các bề mặt enzym tích điên âm. Hiệu ứng của sự phân bố đến các phân tử tích điộn âm và dương là như nhau nhưng ngược nhau. Đối với m ột chất mang tích điộn dương thì các cation được phân bố ra khỏi vi môi trường, trường hợp ngược lại, nồng độ các anion trong vi môi trường này lại lớn hơn ồ trong dung dịch. A thường phụ thuộc vào m ật độ điện tích ở trên và ở trong mỗi hạt enzym cố định. A bị ảnh hưởng manh bởi lựcion của dung địch. Khi lực ion lán thì nồng độ các phân tử chất hòa tan tích điện tăng lên sẽ trung hòa điện tích trên các hạt do đó làm giảm lực tĩnh điện và khiến A tiến tới 1. Theo động học Michaelis -Menten, vận tốc của phản ứng đuợc xúc tác bed enzym cố định có thể viết: 143 V V= (3.16) 1+ [S] trong đó nồng độ cơ chất là nồng độ trong vi môi trường. - Nếu cơ chất tích điện dương, thì (theo 3.15) ta có: A = [S J (3.17) [S] (3.18) Do đó: V = 1 + K - / [ S 0] (3.19) Trong đó: K^k = K mA K bk là hằng số Michaelis biểu kiến, thường được xác định hằng thực nghiệm với nồng độ cơ chất của dung dịch đã biết. Nếu cơ chất tích điện âm, ta có: A =■ [S] ' (3.20) [S.] bk _ K -m (3.21) Ta thấy Kmcủa một enzym đối với một cơ chất bị giảm rõ rệt nếu nống độ cơ chất ở vùng lân cận tâm hoạt động của enzym cao hơn ở trong dung dịch. Ben vì một nồng độ cơ chất trong dung dịch thấp hơn là cần thiết nhàm tạo cho nồng độ cơ chất cục bộ cao hơn để bán bão hòa được enzym. Các hiệu ứng tương tự đến nồng độ cục bộ của các sản phẩm, các chất kìm hãm, các coíactơ và các chất hoạt hóa có thể làm thay đổi các hằng sô ídộng t n n (7 hhọc n r hbiểu i ể l l lci p n rcủa n á rát* n K ^ n t.íV à \y P h ẳ n r r lhạn ian K u n a số kìm L’i m ^lãlĩl b i ê u kiến các phân tử nnày. Chảng hằng kiến cúa một chất kìm hãm cạnh tranh tích điện dương như sau: Kí* = K ịA (3.22) Nếu enzym cố dịnh chứa một số nhóm có khả năng tạo phức càng cua với các cation thì sự phân bố của các cation như thế nào vi mối trường sẽ lớn hơn so với sự phân bố được mô tả theo hệ số phân bố tĩnh điện A ở trên. Chẩng hạn enzym glucoisomerase hòa tan cần một nồng độ các ion M g+' cao hơn so với nồng độ mà enzym cố định đòi hỏi. 144 Một sự tập trung các nhóm ion hóa cao cũng có the làm phân bô các khí khỏi vi môi trường do đó sẽ có ánh hướng đến các tham sô động học biểu kiến của chúng. Đó cũng là phương pháp hay dùng để báo vệ những enzym nhạy cám với oxy bằng cách "muối tích" để tách oxy khỏi vùng phụ cận của enzym. Sự phân chất hòa tan. dịch nếu các khung enzym bố các ion H+ là một trường hợp quan trọng của sự phân bố pH của vi môi trường có thể khác đáng kể với pH của dung ion H+ được phân bô vào phía trong hoặc ra phía ngoài của cố' định. Khả năng liên kết với cơ chất và hoạt độ của enzym cố định đều phụ thuộc vào pH của vi môi trường, trong khi đó pH đo được bằng máy đo pH là pH của dung dịch. Bên cạnh ảnh hưởng đến việc phân bố các chất hòa tan, gradient tĩnh điện cục bộ còn có thể ảnh hưởng đến cả Km và Vmax bằng cách hỗ trợ hoặc ngăn cản sự tiếp cận giữa các nhóm tích điện trong phân tử enzym hoặc trong phức cơ chất - enzym trong quá trình xúc tác. Bảng 3.3 cho thấy ảnh hưởng của sự gắn kết chimotrypsin bằng đồng hoá trị với chất mang tích điện đến các hằng số động học của enzym đối với cơ chất N-acetyl-L.tyrosin - etyleste: Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất mang tới dộng học cùa chimotrypsin cố định Nồng độ ion (M) ^CJt Km (s-1) (mM) Tính đặc hiệu (kJ kJ 0,05 184 0,74 249 1,00 230 0,55 418 Enzym gắn với một chất mang tích điện ảm 0,05 300 2,50 120 1,00 280 1,93 145 Enzym gắn kắ vớ một chá mang fch dện duang 0,05 119 7,10 17 1,00 165 5,82 28 Enzym tư do Các tương tác kỵ nước thường có vai trò quan trọng đối với độ hoà tan tương đối của các phân tử hữu cơ trong các dung môi nước - hữu cơ. Do các* tương tác này mà làm cho các phân tử nước sắp xếp lại một cách có trật tự khi tiếp cận với các bể mặt kỵ nước. Lực hút giữa các bề mặt kỵ nước sẽ 145 giảm theo số mũ với khoảng cách giữa chúng. Các tương tác kỵ nước làm giảm hằng số điện môi của vi môi trường kèm theo làm thay đổi các hàng số axit của các nhóm axit và kiểm trong enzym, trong cơ chất, trong sản phẩm ; và trong các đệm do đó m à ảnh hưởng đến Kmcủa enzym cố định. Các tương tác kỵ nước thường không bị ảnh hưởng bởi lực ion hoặc pH của dung dịch nhưng có thể bị m ất tác đụng do có mật các nhóm háo nước ở bên cạnh. Vì Ị ! th ế các tương tác kỵ nước có thể gây ra sự phân bô' các phân tử giữa dung 1 dịch (pha lớn) và ví môi trường. 1 Nếu bề m ặt của các hạt enzym cố định có tính kỵ nước là chủ yếu thì các phân tử kỵ nước sẽ phân bố vàồ trong vi môi trường của enzym còn các phân tử ưa nước sẽ bị đẩy vào ưong dung dịch. Trường hợp ngược lại sẽ xảy ra nếu bê mặt có tính ưa nước. Sự phân bố sẽ làm thay đổi nồng độ cục bộ của các phân tủ do đó ảnh hưởng đến các hằng số dộng học biểu kiến của enzym. Chẳng hạn, enzym alcol-dehydrogenase cố định, với cơ chất ỉà butanol, sẽ có Kn, = 0,1 mM nếu chất mang là acrylamid, nhung nếu chất mang là chất đổng trùng hợp giữa metacrylat và acrylamid có tính kỵ nưóc hơn thì K,,, sẽ giảm xuống còn 0,025mM. Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra ưong trường hợp các chất kìm hãm cạnh tranh. Chẳng hạn ảnh hưởng của sự cố định enzym invertase trên chất mang kỵ nước đến hàng số kìm hãm (Kj) của enzym đối với các chất kìm hãm cạnh tranh. Bảng 3.4. Ảnh huửng của chất mang kị nước và háo nước đến hằng số kìm hâm của Invertase Invertase Hằng số kim hăm Kị(mM) Dạng tự do Dạng liên kết với polystyren (ky nước) Anilin (CbH5-NHj) (kỵ nước) 0,94 0,39 Tris (hydroxy metyl amino metan) (ưa nuớc) 0,45 1,10 K; sẽ giảm khi cả chất kìm hãm và chất mang đều kỵ nước. Các khí (như oxy) được phân bố vào trong m ôi trường khi chất mang (là) kỵ nước. 146 3.3.3. Ảnh hưởng của sự khuếch tán chất hòa tan đến động học cua các enzym cố định Để một enzym cố định xúc tác cho một phản ứng thì cơ chất phải có khả năng khuếch tán khắp dung dịch tới tâm hoạt động và sản phẩm phải có khả nâng khuếch tán vào dung dịch. Quá trình khuếch tán xảy ra do gradient nồng độ: các chất hòa tan chuyển dịch từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn. Các cơ chất tiếp cận với bề mặt các hạt enzym qua một lớp dung dịch mỏng bao quanh, sau đó mới khuếch tán vào các lỗ hạt và tiếp xúc với enzym ở đây. Sự chuyển dịch của các chất hòa tan thường xảy ra theo hai bước: - Khuếch tán bên ngoài: ờ đây, sự chuyển dịch các cơ chất hướng tới bề mặt, còn các sản phẩm tạo thành thì chuyển dịch ra khỏi bề mặt đó. Bước này thường xảy ra ở trên bề mặt và gồm một chuỗi các chuyển dổi cơ chất thành sản phẩm. - Khuếch tán bên trong: ở đây sự vận chuyển các cơ chất và sản phẩm ở bẽn trong các lỗ của các hạt ertzym - cố định xảy ra song song với phản ứng được xúc tác. Vận tốc của một phản ứng được xúc tác bởi một enzym cố định (v) thường thấp hơn vận tốc phản ứng đuợc xúc tác bởi cùng một lượng enzym tự do trong dung dịch (vtựdo) là do có sự kiểm tra bởi quá trình khuếch tán cơ chất từ đung dịch tới bề mặt xúc tác. Do cơ chất trong vi môi trường đã tham gia vào phản ứng, nên nồng độ cơ chất trong vi môi trường [S] thường thấp hơn nồng độ cơ chất [SJ ở trong dung dịch. Có thể biểu hiện định lượng sự thay đổi vận tốc phản ứng bằng cách đưa vào hệ số hiộu quả (r|) (effectiveness factor): ĩ) = v/vlíKjR (3.23) Nói chung, ĩì nằm giữa 0 và 1, phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong dung địch và phụ thuộc vào các yếu tố khác nữa. Đối khi, T| > 1 do quá trình không đẳng nhiệt, do các hiệu ứng phản bổ hoặc kìm hãm, hoặc nếu enzym cố định được làm bẻn tương đương với enzym tự do trong suốt thời gian sử dụng. Có thể thấy được ảnh hưởng của sự khuếch tán ngoài đến vận tốc của một phản ứng có enzym xúc tác nếu giả thiết rằng : 147 I - Phản ứng tuân theo động học Michaelis - Menten. - Enzym được cố định vớí một chất mang trơ - phẳng. - Không có mật các hiệu úng phân bố hoặc tĩnh điện. Nếu phản ứng xảy tra trong các điều kiện ổn định thì vận tốc tăng của sản phẩm trong dung dịch phải bằng vận tốc của ba quá trình nối tiếp : vận tốc của quá trình khuếch tán cơ chất tới bề mặt xúc tác, vận tốc xúc tác của enzym và vận tốc của quá trình khuếch tán sản phẩm khỏi bề mặt xúc tác. Giả thiết trên là hợp lý nếu thể tích của dung dịch là đủ lớn và không tính đến sự thay đổi của [SJ theo thời gian. Ta đều biết, enzym cố định cũng là những hệ thống m ở nên có thể trao đổi cả năng lượng và vật chất qua bề mặt giới hạn với m ôi trường. Điểu này cho phép quá trình hoạt động ở trạng thái ổn định ngay cả khi "mật độ” enzym rất cao. Rõ ràng, trong bất kỳ tmcmg hợp nào, nồng độ cơ chất ở bể mặt xúc tác không thể tăng hoặc giảm liên tục ở tốc độ đáng kể so với tốc độ của phản úng. Từ phương trình M ichaelis - Menten, ta có thể viết được: V= — (3. 24) Km+[S] Trong đó: A : là tổng diện tích bề mặt xúc tác; tốc độ tối đa của phản ứng được xúc tác bởi một đơn vị diộn tích bề mặt. Kết hợp với phương trĩnh (3.23) ta có: v = ( 3 ' 2 5 ) Bằng phương pháp đồ thị Eadie-Hofstee, có thể chuyển phương trình (3.25) thành dạng tuyến tứửi: 7T ~ - *1A T- (v / )(Km/[SD]) (3.26) Nếu thừa nhận tất cả bề mặt tiếp xúc đều có khả năng tiếp xúc bằng nhau thì tốc độ đòng cơ chất tới bề mặt tiếp xúc sẽ tỷ lệ với cả diện tích bề 148 mặt và với hiệu nồng độ cơ chất giữa dung dịch và vi môi trường xung quanh sát bề mặt. Vân tốc này được thể hiện trong phương trình sau: v = k,A([SJ-[S]) (3.27) Hằng số tỷ lệ (kL) được gọi là hệ sô chuyển khối (đơn vị m s'1), thường phụ thuộc vào hệ sô khuếch tán của cơ chất và khoảng cách hữu hiệu giữa bể mặt và dung dịch: D k, = — 0 (3.28) Trong đó: Ds - hệ số khuếch tán của cơ chất trong dung dịch tự đo (đơn vị là m V ). 6 - Bề dày hữu hiệu của lớp đọng (unstiređ layer) bao quanh bề mặt xúc tác mà cơ chất phải khuếch tán qua nó. Theo định luật Fick, hệ số khuếch tán được coi là tốc độ của một đơn vị khối lượng (m) của một hợp chất đi qua một đơn vị diện tích bể mặt (A) nhờ một gradient nồng độ của sự thay đổi một đơn vị tỷ trọng (P): ặ = - D .A r dt dx (3.29) Ds phụ thuộc vào khối lượng phân tử và kích thước của cơ chất cũng như vào nhiệt độ, độ nhớt và thành phần của pha lỏng (bảng 3.5). Nhìn chung, khối lượng và độ nhớt của dung dịch càng lớn thì hệ số khuếch tán càng thấp (bảng 3,5) 5 có thể coi như một khoảng cách hữu hiộu, mặc dù không xác định chính xác được s bằng bề dày của lớp đọng (vì ở khoảng cách bé hơn 8 người ta còn phát hiện được sự chuyển động của chất lỏng). Bảng 3.5. Hệ số khuếch tán của các phân tử trong dung dịch nước ở 20°c. Khối lượng phàn tử Hệ số khuéch tán (mVl X 10") Qlucose Saccrose Inulìn 32 180 342 5.200 21,0 6,7 AHbumin Urease Vinus 67.000 480.000 10.700.000 Các chất Oxy 4,5 2.3 0,7 0,3 0,1 149 Trong các điều kiện có dòng đọng thì 5 bằng bán kính của các hạt hình cầu. Thường ô phụ thuộc vào các điều kiộn thuỷ động lực học, ô giảm khi tăng tốc độ khuấy và 5 giảm lại làm tãng hệ số chuyển khối k L. Phụ thuộc vào các điều kiện, ẽ có thể biến thiên theo hệ số khuếch tán, tỷ trọng và độ nhớt của chất lỏng; tàng với sự tăng hệ số khuếch tán và độ nhót nhưng lại giảm khi tăng hiệu tỷ trọng giữa các enzym cố định và môi trường, ồ giảm đi một nửa khi sử dụng sóng siêu âm (với các hạt có kích thước lớn hơn có thể sử dụng sóng siêu âm). Với cáo hạt xúc tác sinh học nhỏ thường được sử dụng thì có thể làm giảm tối đa ỏ bằng cách làm tãng sự cuốn xoáy của dung dịch quanh enym cố định lên khoảng 10 lần. Vận tổc khuếch tán thường bị ảnh hưởng đáng kể khi có sự phân bố. Đối với các phân tử tích điện thì vận tốc khuếch tán sẽ phụ thuộc vào gradient thế tĩnh điện và gradient nồng độ. Gradient thế tĩnh điện thường gầy nên các thay đổi biểu kiến ồ cả s và Ds trong vùng lân cận của bề mặt (nghĩa là ở khoảng cách nhỏ hem 5 nhiều). Do tính chất nối tiếp của quá trình, nên vận tốc của phản ứng enzym (v trong phương trình 3.24) phải bầng vận tốc khuếch tán của cơ chất tới bể mặt xúc tác (v trong phương trình 3.27), ta có: V ^ ml = k L ([S J-[S ]) (3.30) J Phương trình này là bậc hai đối với nồng độ cơ chất [S] trong vi môi trường do đó rất khó xác định được giá trị của phương trình bằng các cách độc lập nhau. Phương trình này có thể được đơn giản hóa vói các cực trị của [S] liên quan vái của enzym đối vối cơ chất. - Nếu [S] » Km thì vế trái của phương trình (3.30) chỉ còn Vm#x, do đó: VmM= kL([ S J -[S ]) = vA (3.31) Ở đây, VA là vận tốc phản ứng được xúc tác bởi m ột đơn vị điện tích bề mặt của enzym cố định. Do đó mà vận tốc phản úng được xúc tác bởi enzym cố định bằng vận tốc cực đại của phản ứng được xúc tác bằng enzym không cố dịnh khi [S] và đo đó [SJ » K T u y nhiên, thường thì người ta nhận thấy [S] « K^. Trong điều kiện này phương trình (3.30) trờ thành: 150 [S ](V „ „ /K J = M [S „ )-[S ]) (3.32) Nhóm [S] vào một vế, ta cỏ: [S] —----- --------------- (3.33) hay [S] = ----------- ---------------1+ V ^ / K J l / k J (3.34) Từ phương trình (3.24) khi [S] « K m: V A= [ S ] ^ (3.35) Thay [S] từ phương trinh (3.34) vào (3.35), ta có: V. = ■ ^ -V"g " ~ : - T A l + C V ^ /K J O /k J (3-36) [S J , ■ oj - — (3-37) V 1 1+ ^ - + — Km m k,L Các giá trị tương đối của hai số hạng ở mẫu số trong phương trinh (3.37) quyết định phản ứng được điều khiển chủ yếu bằng sự khuếch tán của cơ chất (kL) hay bằng khả năng xúc tác của enzym cố định (giá trị Vmax/Km). Có thể so sánh bằng cách đưa vào modun ỊJ. của cơ chất bên ngoài (|A còn Do dó: VA = được gọi là số Damkohler, là tỷ số không thứ nguyên của vận tốc phản ứng/vận tóc dịch chuyển): n (3.38) k LK m L m Trong đó: v ^ . - vận tốc cực đại của phản ứng được xúc tác bằng một đơn vị diện tích hề mặt. Thạy ^ vào (3.36), ta có: v - ■[ $ > - / * . ! l+ụ Khi ku » (3.39) (nghĩa là tại n=0 khi sự chuyển khối xảy ra với vận tớc nhanh hơn vận tốc của phản ứng được enzym xúc tác) thì vận tốc chung 151 của quá trình là do xúc tác enzym quyết định và phương trinh (3.37) được đơn giản hoá thành: v . = [S J .-^ = - Tuy nhiên khi kL « (3.40) V —— (nghĩa là tại modun cơ chất cao), khi vận tốc chuyển khối chậm hơn nhiều so vói vận tốc của phản ứng có enzym xúc tác thì vận tốc chung của quá trình là do vận tốc khuếch tán quyết định. Khi đó phương trình (3.37) được đơn giản hóa thành: vA=kL[ s j (3.41) Từ phương trình này, ta thấy tốc độ phản ứng độc lập với hoạt tính của enzym. Điểu này có nghĩa, phản ứng khồng bị ảnh hưcmg bởi các thay đổi về pH, nhiệt độ (ngoại trừ nó có thể bị ảnh hưởng bỏi độ nhớt) hoặc lực ion của dung dịch, cũng như không bị ảnh hưởng bải các chất kìm hãm hay các chất hoạt hóa. Tuy nhiên nếu tỷ số Vmax/Km bị giảm do thay đổi các điều kiện này để tiến tới giá trị kL, thì m ối quan hệ trong phương trình (3.41) sẽ không còn đúng nữa. Khi sự khuếch tán bị kìm lại thì nồng độ cơ chất trong dung dịch để cho vận tốc phản ứng bằng m ột nửa vận tốc cực đại ([S1/2] tương ứng vói K" biểu kiến) cao hơn Km của enzym tự do. Còn nồng độ cơ chất ở vi môì tnròng để cho vận tốc phản ứng bằng m ột nửa vận tốc cực đại vẫn bầng KmVA có thể được thay thế bằng V ^ / 2 trong phương trình (3.27) khi [S] bằng Kjn, lúc này ta có: VA Do đó hay = Vroax/2 = kL ( [ S j/j ] - K„,) (3.42) [SwJ s KB1+ V11J 2 k L (3.43) ..[Sw]s ,-K J l » K m.(l.+ n/2) (3.44) Rõ ràng, K™ tăng theo môđun cơ chất bên ngoài. Điều này cũng có nghĩa tà làm giảm tính đặc hiệu biểu kiến. Đưa các nồng độ cơ chất không thứ nguyên p ( = ^ ) và pQ(=^“ m ) vào phương trình (3.30) ta đươc: m y “ £ = k ,K J P .-P ) 152 (3-45) Thay lừ phương trình (3.38) vào ta có: iặ - p .- p (3.46) Phương trình này có thể được đơn giản hóa ở giá trị pt) thấp, khi p tiến tới 0, ta có: và 0 = (1+n) 7 ~ T <3 -47> [S] = — — - (3.48) (l +n) Do đó nếu biết giá trị |i thì có thể tính được nồng độ cơ chất ở bề mặt cùa enzym cố định. Thông thường người ta cần phải xác định các tham số động học của một enzym cố định khi có mặt các hiệu ứng khuếch tán ngoài nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của việc cố định đên độ bển (thục) hoặc tới hoạt độ của enzym. Có thể xác định được Vmax thực nếu tạo được nồng độ cơ chất ở vi môi trường đủ cao. Còn xác định Kn, thực sẽ nhờ vào nồng độ Cd chất đả biết ở vi môi trường. Có thể xác định các tham số động học này bằng phương pháp đổ thị nếu biết được hệ số chuyển khối. Hình 3.33. Sơ đố minh hoạ một phương pháp xác định các tham số động học thực (Vmăx và Km): - Đường a - Giá trị kL có thể đuạc xác định từ đường tiếp tuyến của đường cong thực nghiêm, - Đường b- Tốc độ phản ứng với nồng độ cơ chất trong dung dịch. - Đường c- Tốc độ phản ứhg vối nồng độ cơ chất trong vi môi trường. Từ đây có thể xác định các tham số động học. 153 Các enzym cố định thường bị ảnh hưởng bởi các chất kìm hãm khác với ở enzym hòa tan. Với enzym cố định, ta cũng có thể biết được ảnh hưởng của các chất kìm hãm cạnh tranh, không cạnh tranh và phi cạnh tranh bằng cách xem xét sự thay đổi của các hằng sô' động học biểu kiến K^k và thu được. Từ phương trình (3.38), gọi n, là giá trị của modun cơ chất bên ngoài khi có chất kìm hãm. Và từ các giá trị tương ứng K,,, và Vma, của enzym hòa tan khi có chất kìm hãm cạnh tranh, khổng cạnh tranh và phi cạnh tranh (bảng 3.2) ta có thể viết được đối với enzyra cố định: - Với chất kìm hãm cạnh tranh, ta có: M. = ------T r f - (3.49) 0 +— ) V - Vói chất kìm hãm không cạnh tranh, ta được: ịi, = ịí - Với chất kìm hãm phi cạnh tranh, ta được: ------7 ( 3 . 5 (3.50) 1 ) (1 + — ) K / Từ đây ta thấy cả hai chất kìm hãm cạnh ừanh và phi cạnh tranh đều có |I, giảm so với |A. Vậy là sự cản khuếch tán cơ chất ở hai quá trình bị kìm hãm này sẽ ít hơn so với ở enzym cố định không bị kìm hãm. Đ iểu này là do các phản ứng bị kìm hãm vốn đẵ chậm hơn và ít có khả nảng được kiểm soát bởi tốc độ khuếch tán cơ chất. Còn trong trường hợp kìm hãm không cạnh tranh thì không có ảnh hưởng nào đáng kể nhất là khi ở nồng độ cơ chất thấp. Trong hai trường hợp trước, thậm chí ảnh hưởng của mức độ kìm hãm sẽ trở nên không đáng kể ngay cả khi ởm ođun cơ chất bên ngoài cao (n > 50). • Trong trường hợp các enzym cố định, sự kìm hãm bởi sản phẩm có thể còn nghiêm trọng hơn do sản phẩm khuếch tán khỏi tâm phản ứng, do đó làm cho nồng độ sản phẩm ở trong vi m ôí trường eó thể cao hơn ở trong 154 dung dịch nhiều. Ỏ giai đoạn đầu của phản ứng, nồng độ sản phẩm sẽ tích lại cho đến khi tạo được gradient nồng độ đối với dung dịch đủ lớn để cho phép sản phẩm khuếch tán ra ngoài với tốc độ ngang bằng với tốc độ tạo thành nó từ phản ứng. Nếu gọi ksL và kpL là hệ số chuyển khối cơ chất và hệ số chuyển khối sản phẩm, [P] và [PJ là nồng độ sản phẩm trong vi môi trường và nồng độ sản phẩm trong đung dịch, từ phương trình (3.27) ta có: VA = k ĩ ( [ S J - [ S ] ) = k [ ( [ P ] - [ P J ) (3.52) Do sự kiểm soát của khuếch tán nên [P] và [SJ lớn hơn [P J và [S] rất nhiều: [P ]» [P J và [SJ » [S], do đó: IP] = [SJ £ (3.53) ở phần trước, ta đã thấy chất kìm hãm cạnh tranh có cấu tạo giống cơ chất và thường là sản phẩm của một phản ứng (kìm hãm bải sản phẩm, như trường hợp galactose kìm hãm lactase). Tương tự như phương trình vận tốc của phản ứng có kìm hãm cạnh tranh, ta có thể viết được phương trình vận tốc của phản ứng có kìm hãm bởi sản phẩm. V -----------V™*I§ Ĩ---------- (3.54) K„(l + [P]/Kp) + [S] Thay [P] ở phương trình (3.53) vào đây và giả thiết tầng K,„ » V -[S ] VA = -- ----- -K m + K .k í[S ]/(K „ k [ ) [S], ta đuợc: (3.55) Từ đây ta thấy, ảnh hưởng của sự kìm hãm bởi sản phẩm (số hạng thứ hai ở mẫu số) phụ thuộc vào nồng dộ cơ chất trong dung dịch và tỷ số K JcV iK pk^), thể hiện sự cạnh tranh giữa cơ chất và sản phẩm đối với bề mặt enzym. Việc tích tụ sản phẩm ở bề mặt enzym sẽ tăng theo tỷ số này và sẽ làm giảm cả vận tốc phản ứng và hệ số hiệu lực. ảnh hưởng này sẽ lớn hơn khi K JK p hoặc k \/k pL lớn và n nhỏ (<50). k \ thường xấp xỉ kpL nhưng có thể lớn hơn khi phản ứng tạo ra sản phẩm có trọng lượng phân tử lớn hơn nhiều một phân tử cơ chất hoặc thấp hơii trong phản ứng khử trùng hợp (hay phản ứng thuỷ phân). 155 • Kìm hãm bởi cơ chất là một quá trình phức tạp hơn. Và la đã có phương trình vận tốc: V = --------- X asIẼÌ--------K m+[S](1 + [ S ] / K s) (3.56) Kết hợp phương trình (3.56) với phương trình (3.37) ta được: va = M [ S , ] - [ S ] ) = ------V " » [S] -i (3.57) K m + [S ] + ^ Ks Đây là phương trình bậc 3 đối với nồng độ cơ chất [S] ờ trong vi môi trường. Do đó có thể có các trạng thái bền vững miễn là sự khuếch tán của cơ chất đến enzym đủ châm. Cùng m ột nồng độ cơ chất trong dung dịch có thể cho hai nồng độ ổn định khác nhau trong vi môi trường: 1 - M ột nồng độ cơ chất thấp vừa tạo được một vận tốc phản ứng tuơng đối nhanh không có sự kìm hãm cùa cơ chất, vừa tạo được một vận tốc khuếch tán cơ chất vào bên trong nhanh đều nhờ một gradient nồng độ cao. 2 - M ột nồng độ cơ chất rất cao vừa tạo đuợc một vận tốc phản ứng tương đối chậm nhờ có sự kìm hãm bải cơ chất vừa tạo được một vận tốc khuếch tán cơ chất vào trong chậm đều do (dưới) một gradient nồng độ tương đối thấp. Một khả năng thứ ba là có một nồng độ trung gian, thể hiện một trạng thái không bển, không được hình thành một cách tự nhiên và không có hiệu quả thực tế. • Các phản ứng thuận nghịch được xúc tác bằng các enzym cố định có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng do sự khuếch tán của sản phẩm khỏi bề mặt xúc tác khá chậm. Ngay cả khi nồng đổ sản p h ả n được tích tạ ở vi môi trường còn thấp cũng làm tăng vận tốc phản ứng nghịch do đó làm giảm mạnh hiệu suất của enzym. Sự cản khuếch tán có thể làm tăng biểu kiến độ bền của các enzym cố định. Hiộu suất của enzym cố dịnh sẽ duy trì không đổi cho đến khi hoạt độ riêng của enzym bị suy giảm và phản ứng khi đó sẽ không còn bị kiểm soát bởi khuếch tán nữa. M ột trường hợp đặc biệt của quá trình kiêm chế các phản ứng có enzym cố định bằng khuếch tán là trường hợp cặe ion hydro. Nhiều phản 156 ứng do enzym xúc tác có thể giải phóng ra hoặc tiêu thụ ion H + (chẳng hạn như dehydrogenase, peptidase và esterase). Điều này có thể xảy ra ở bất kỳ phản ứng nào có sự tham gia của các phân tử chứa các nhóm ion hóa được, giá trị pKa của các nhóm này trên các cơ chất và sản phẩm có thể khác nhau. Đôi khi, phản ứng có thể tạo ra hoặc tiêu thụ ion H+ tuỳ thuộc vào pH của phản ứng. Chẳng hạn urease: urease H2N-CO-NH2 + H20 + 2H+ pH = 6,0 * 2NH+4 + C 02. H2N-CO-NH2 + H20 + pH - ’5 » 2NH, + HCO 3 + H+. Các ion H+ khuếch tán tương đối chậm, tương tự như các ion một hóa trị khác khi không có một điện trường, là đo bốn nguyên nhân sau: 1- lon H+ thường được hydrat hóa (RịO+, H yO /) do đó Làm tăng khối lượng phân tử biểu kiến và làm giảm hệ số khuếch tán của mình. 2- Yêu cầu một sự trung hòa điện địa phương đòi hỏi phải khuếch tán đồng thời các phần tử mang điện tích dương và âm, cũng làm tăng khối lượng phân tử ỉên đáng kể (vì mổi ion H+ khuếch tán với một anion). 3- Các ion H+ được đệm bằng histidin và những nhóm khác ở trên các hạt enzym cố đinh sẽ làm giảm khả năng khuếch tán của chúng vào dung dỊch. 4- Thường, nồng độ ion H+ trong dung dịch thấp (pH = 7 tương ứng với 10'7 M H+) đo đó tạo nên các gradient nồng độ rất nhỏ, nhất là khi sự chênh lệch pH chỉ bằng một hoặc hai đơn vị. Vì thế nhiều phản ứng có thể được kiềm chế bằng sự khuếch tán các ion H+ tới bề m ặt enzym cố định hoặc tách khỏi bề mặt enzym cổ định. Ảnh hưởng của sự kiềm chế khuếch tán này có thể thấy rõ khi kết hợp phương trình: V = ------- ------------------------ ------- (3.58) với phưang trình (3.37) đối vói 1 phản ứng giải phóng H+, ta được: — -------- Y 1 --------- --------= k f ( [ H +] - [ H : i ) ([H +] / K sl) + l + (K a2 /[H +]) (3.59) 157 Trong đó: V*- Vân tốc cực đại của phản ứng nếu pKal và pKa2 tách biệt rõ ràng. ' k “ “ Hệ sô' chuyển khối của H+. [H+]- Nồng độ của ion H+ trong vi môi trường. [ H +]- Nồng độ của ion H+ trong dung dịch. Nếu phản ứng xảy ra sự tiêu thụ ion H+thì nó sẽ tuân theo phương trình sau: ( [ H * ] /K âl) + l + ( K i2 /[ H +]) Độ lớn của sự cản khuếch tán được xác định bởi m odun proton (ịiH): Chú ý ỉà khái niộm modun proton tương tự khái niệm mođun cơ chất ngoài (phương trình 3.38). Người ta nhận thấy rằng các ion H+ tích lại trên bề mặt xúc tác khi modun proton lớn hơn 10'4. Các phản ứng như thế (này) có thể xảy ra tương đối nhanh ờ một pH cách xa giá trị pH tối ưu cho enzym tự do. Điều này rất có ích trong trường hợp ở m ột pH khiến cơ chất có tính tan cao hơn hoặc tạo ra một môi tnrờng thuận lợi hơn cho phản ứng. Sự khuếch tán của các ion hydro có thể được dễ dàng thậm chí ò các nồng độ thấp hơn đáng kể so với nồng độ cần thiết cho tác dụng đệm thông thường cũa chúng bằng cách liẻn kết các cặp axit-bàzơ. Bởi lẽ các độm có thể có các gradient nồng độ cao hơn nhiều so với các ion hydro mà không làm ảnh hưởng đến pH trong dung dịch (hình 3.34). Trong trường hợp này phương trình (3.59) cần được m ở rộng để bao gổm được cả sự vận chuyển và khuếch tán của các ion hydro do các axit liên hợp. Để một phản ứng sinh ra được các ion H+, phương trình (3.59) được biến đổi thành: = k ĩ ([H*] - [ h : ]) + k » ([H B] - [HB„ ]) (3.62) 158 Trong đó: k “B- Hệ số chuyển khối của HB. [HB]- Nồng độ của acid liên hợp trong vi môi trường. [ H B 0 ]- Nổng độ của HB trong dung dịch. o pH của dung dịch bàng 7, các ion H+ được vận chuyển bằng đệm milimol (10 *M) có pKa = 7 hàng ngàn lần lớn hơn so với các ion hydro tự do. Sự có mặt của các ion đệm này có thể có ảnh hưởng đáng kể đến diện pH hoạt động của các phản óng có sự khuếch tán của ion H+. Hình 3.34. Giản đồ chĩ rõ sự vận chuyển nhọ nhàng của các ỉon hydro ra khỏi một enzym cố định lại xúc tác cho một phản ứng sản sinh ra các ion hydro. - Gradient nồng độ ion H+ rất nhỏ do nồng độ ion H+ ưong dung dịch thấp nên không thể tạo ra một nồng độ ion H+ thực trong vi môi trường. - Cặp đệm HB/B" sẽ làm di chuyển proton khỏi bề mặt và phân bố chúrìg trong vi môi trường và trong dung dịch. 159 CHƯƠNG 4 ĐIỆN cực SINH HỌC (CẢM BIẾN SINH HỌC BIOSENSORS) 4.1. s ơ LƯỢC LỊCH s ử PHÁT TRIỂN c ủ a đ iệ n c ự c SINH HỌC Nãm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr-người khai sinh về khái niệm cảm biến sinh học (biosensors) đã cõng bô' về điện cực oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của mình ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể. Năm 1962, tại hội nghị khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông có bài diễn thuyết “Làm thế nào để các điện cực điện hoá (phương pháp pH, phương pháp cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn”.Trong đó ông trình bày cách làm điện cực điện hóa thông minh bằng việc thêm enzym vào máy chuyển đổi như những chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng. Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện của hydropeoxyt. Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa trên một điện cực sinh học (DCSH). Năm 1975, điện cực sinh học tiến thêm một bước nữa đó là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng etanol. Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser - LA640) trong đó có tác nhân trung gian hexacyanoferrat hoà tan được sử dụng để chuyển các điện tử từ lactatdehydrogenase tới một điện cực. Mặc dù không thành công trên thương trường nhưng là bước đột 160 phá quan trọng cho một thế hệ điện cực sinh học mới được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng. Nãm 1987, điện cực enzym screen-printed được công bố bới Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sát lượng glucose trong máu tại nhà. Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụng hơn và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ được Abbott mua lại. Hiện nay hãng Boehringer, Mannheim và Bayer đang cạnh tranh nhau rất gay gắt về điện cực sinh học và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trường điện cực sinh học của thế giới tới 85%. 4.2. K H Ả I N IỆM VỂ Đ IỆN c ự c SINH HỌ C Một bộ điện cực sinh học thực chất là một thiết bị phân tích chu yen đổi các đáp ứng sinh học thành các tín hiệu điện, nhiệt, hoặc quan (Theo Enzyme Technology,Cambridge University press). Từ các tín hiệu đóó người ta có the đo được nồng độ các chất cần phân tích. Điện cực sinh học dựa trên việc kết hợp các chất có hoạt tính lỉinh học dã được cố định với một thiết bị chuyển đổi tín hiệu (signal transdu cer) và ít bị đầu một bộ k mếch đại điện tử. Ngoài ra, còn có thể có thêm một số ra như thiết bị phân tích, xử lý (computer). Điện cực sinh học có thể sử dụng các hệ thống sinh học (biological system) ở các mức độ khác nhau. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của một điện cực sinh học dược thè hiện ớ hình 4. 1 và bảng 4.1. iH W V rl Hình 4.1: Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của một ĐCSH: S: cơ chất cần đo (glucose, ure..); a: màng sinh học: là màng đã được cố định các chất có hoạt tính sinh học n h ư : enzym, ADN, vi sinh vật hoặc phân tử miễn dịch (kháng nguyên, kháng thể). I6l b: Thiết bị chuyển đổi (transducer): là một thiết bị chuyển đổi tín hiệu nhằm chuyển đổi đáp ứhg sinh học thành tín hiệu (điện áp, đòng điện, điện thế, nhiệt, quang.,.) c: Bộ khuếch đại tín hiệu: thường sử dụng với các trưởng hợp tin hiệu điện hoặc đơn giản chỉ là thu các tín hiệu gốc để đưa vào bộ xử lý tín hiệu, d: Bộ xử lý tín hiệu: xử lý Ưn hiệu để đưa ra kết quả, thông qua việc so sánh với cảc mức chuẩn hoặc cõng thức tính toán, e: Biểu hiện kết quả Bảng 4.1: Các nguyên lỷ của điện cực sinh học 1. Điện cựt ái lực sinh học (bioaffinity sensor) s +R <-> SR 2. Điện cực chuyển hoá (metabolism sensor) s+R Thay đổi mặt độ electron ReceDtor R Tín hiẻu hoá hoc s Lectin Sacarit Glycoprotein Enzym Cơ chất Chất ức chế Kháng thể (Ab) Kháng nguyên (Ag) Receptor Hormon Các chuyển dổi (transducer) - Điện cực đo điện thế - Điện cực đo dòng điện - Điện cực do nhiệt - Điện cực đo quang. - Điện cực chọn lọc ion sử đụng transitor có hiêu ứng trường (1SFET) SR —> p + R Tiêu thụ cơ chất và tạo thành sản phẩm ReceDtor R Tin hìẻu hoá hoc s Enzym Cơ chất Bào quan Cofactor Vi sinh vật Chất ũte chế Lảt mô Hoạt tfnh enzym 3. Các hệ thống cặp đôi và lai Các chuỗi Cạnh tranh Khuếch đại 4, Điện Cực nhại (bắt chũớc) sinh học ReceDtor R Enzym T(n hiêu vât M s Ấm thanh Áp lực Ánh sáng Một điện cực sinh học khi đưa ra sử dụng phải thoả mãn m ột số yêu cầu sau: Chất xúc tác sinh học phải có tính đặc hiệu cao, ổn định trong điều kiện bảo quản thường. 162 - Phản ứng sinh học không phụ thuộc và các điều kiện vật lí như khuấy, pH, nhiệt độ... - Đáp ứng sinh học phải chính xác, rõ ràng, thời gian hồi đáp tín hiệu không quá dài và phải sử dụng lặp lại được nhiều lần. - Điện cực hoàn chỉnh phải có kích thước nhỏ, phát hiện được các chất ở nồng độ thấp và rẻ tiền. Nguyên lý chung của m ột điện cực sinh học được biểu diễn hình 4.2. Thành lõ' sinh học Màng bán thấm Môi trường ngoài Màng trong Hình 4.2. Nguyên lý chung của một cảm biến sinh học: • o : chất cần phản tích; : tác nhân kích thích (tạo ra tính hiệu). Các chất cần phân tích (được mô tả bằng những vòng tròn đậm ) ở trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực. Màng ngoài (external membrane) của điện cực cho các chất cần phân tích thấm qua. Thành tố sinh học (biological element) của điện cực sẽ phản ứng với chát cần phân tích và tạo ra các đáp ứĩìg mà các thiết bị chuyển đổi (transducers) có thể phát hiện được. Các thành tố sinh học tại đây có thể làm: - Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hoá học khác (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ thông qua các phản ứng sinh hoá). - Giải phóng ra các sản phẩm hoá học rổi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích. - Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học. - Tạo ra m ột sô' các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được. 163 Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài. Tín hiệu ra cùa điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng (transducer) mà nó sử dụng. Trong bảng 4.2 giới thiệu một số điện cục enzym thường sử dụng. Bảng 4.2: Các điên cưc enzym thường sứ dung s tt Chất dể xác định Sàn phẩm Điện cực Enzym 1 GI ucose Glucooxydase và catalase h 20 2. 0 2 2 S ỉiccarose Invertase, glucooxydase h 20 2 3 Lactose p -galactosidase, glucooxydase H A 4 AI ;ohl Alcol oxydase h 20 2 5 Ur Urease N H /, 6 Pe nicillin Penicillinase H* co 2 Dựa theo mức độ các mạch của điện cực sinh học có thể chia điện cực sinh học ra làm ba thế hệ (thể hiện ở hình 4.3). ♦♦♦♦♦♦♦♦ DIA LY ZER RECEPTOR TRANSDUCER ELECTRONICS THẾ HỆ 1(1 ST GENERATION) THẾ HỆ II (2 ND GENERATION) THẾ HÊ m (3RD GENERATION) Hình 4.3. C ác th ê h ệ đ iệ n c ự c sin h h ọ c (b io s e n s o r). 164 - Thê hệ đầu ì: Các chất xúc tác sinh học được gói hoặc liên kết với màng xảy ra trên bề mặt transducer. - Thê hệ thứ II: Các cấu tử có hoạt tính sinh học được liên kết với bc mặt transducer bằng liên kết cộng hóa trị hay liên kết hấp phụ mà khỏng sử dụng màng bán thấm. - T h ế hệ thứ III: Các chất xúc tác sinh học được liên kết trưc tiếp với một thiết bị điện tử và thiết bị này có khả nãng chuyển đổi và khuếch đại các tín hiệu, VI dụ như cổng của một FET (field effect transitor). 4.2.1. C ác phần biến đổi sinh học (biological tran sd u cers) Như đã mô tả ở phần trên, các thành tố biểu hiện sinh học là bộ phận nhất định phải có trong một điện cực sinh học. Nó là nhân tô' quyết định và chịu trách nhiệm phát hiện chất cần phân tích một cách có chọn lọc. Việc tạo ra các tín hiệu hoá lý được theo dõi bơi các transducer vật lý. Các thành tố biểu hiện sinh học được chia thành hai phần: Loại xúc tác: Điển hình là xúc tác bằng enzym, vi sinh vật. Loại có ái lực: Điển hình là kháng thể, receptor. Đôi khi còn có loại thứ 3 là loại kết hợp của hai loại trên. Loại xúc tác bao gồm hộ thống đơn enzym, đa enzym, các bào quan, các lát IĨ1Ô động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó enzym được sử dụng phổ biến và có hiệu quả nhất do những ưu điểm của nó như: cường lực xúc tác lớn, tính đặc hiệu cao, không độc và dễ điều chế. Theo quan điếm phân tích, các enzym được coi là quan trọng nhất gồm: - Oxidoreductase: là các enzym sử dụng oxy hay NAD+ đfc oxy hoá các hợp chất. - Hydrolase: các enzym xúc tác thuỷ phân các hợp chất. Ví dụ: Glucooxidase xúc tác oxy hoá glucose thành axit gluconic. Đây là cơ sỡ cho việc theo dõi hàm lượng glucose ở các bệnh nhân tiểu đưừng. Tuy nhiên các hệ đơn enzym chưa hẳn là lý tưởng vì chúng thiếu ổn định do biến tính vì nhiệt hoặc tương tác với sản phẩm hoặc với các chất trung gian. Chúng cũng có thể bị mất hoạt động trong giai đoạn cô định. Để khắc phục những hạn ch ế đó, hệ thống đa enzym được sử dụng để chuyên 165 đổi và tạo ra những sản phẩm mà các đơn enzym không có được. Việc sử dụng các lát mô thực vật, động vật hoặc toàn bộ tê' bào cho phép các chuỗi phản ứng phức tạp xảy ra, vì các coenzym và các cofactor có m ặt trong một môi trường ổn định và tự nhiên hơn. Mặc dù tính đặc hiệu của các hệ thống trên sẽ kém hơn so vói hệ thống đơn enzym nhưng trong một số trường hợp thì việc sử dụng chúng sẽ thuận lợi hơn. Không giống như loại xúc tác, loại ái lực đặc trưng hon VI sự liên kết có tính tự nhiên. Các cấu tử sinh học này thường dễ dàng phát hiện ra một chất rất đặc hiệu trong suốt quá trình, bởi lẽ các tương tác ái lực không thay đổi. Các thụ quan m iễn dịch (kháng nguyên - kháng thể) ỉà loại nổi bật nhất trong các receptor ái lực và thường được sử dụng rộng rãi trong các điện cực sinh học. Các Ịoại khác có mức đỏ ái lực và đặc hiệu cao nhu glycoprotein, lectin cũng được sử dụng nhiều. Dưới đây là sơ đồ tóm tắt các loại điện cực sinh học. Hình 4.4. Hệ thếng phản loại của điện cực sinh học dựa vào vật liệu sinh học. 4.2.2. C ố định các th à n h tố sinh học tro n g điện cực sinh học Việc cố định các thành tố sinh học nhất là enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận hơn trong việc ứng dụng như: ~ Làm cho enzym trong nhiều trường hợp được bền hơn. - Tách phức enzym - chất mang ra khỏi mẫu rất dễ đàng. - Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong m ột thời gian dài. Người ta thường cố định các thành tố sinh học này trên m ột giá thể rắn bằng nhiểu cách khác nhau. Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu 166 cầu nhất định, nhất là khi các điện cực sinh học được đưa vào sử dụng trong thực tế. - Các cấu tủ sinh học phải được giữ hoạt độ khi gắn trên bề m ặt điện cực (cảm biến). - M àng sinh học phải được gắn chạt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ dược cấu trúc và chức nãng. - M àng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong m ột thời gian dài. - V ật liệu sinh học cần có túih đặc trưng riẻng đối với từng cấu tử sinh học. Để cố định các thành tố sinh học trong ĐCSH người ta thường sử dụng các kỹ thuật như: hấp thụ vật lý, bao gói ưong khuôn gel hoặc trong polyme, liên kết đồng hoá trị với chất mang và liên kết chéo các protein. Các phương pháp cố định được minh họa qua hình 4.5. b a c d Hình 4.5. Một số phưỡng pháp cố định thưdng dùng trong ĐCSH: o : phầntửenzym; • : phân tử liên kết; a/ phương pháp hấp thụ; b/ phương pháp bao trong gel; ci liên Kết cộng hoá trị vối bể mặt ngoài; d/ liên kết chéo. Nhược điểm của phương pháp ]à làm giảm hoạt lực do làm thay đổi các vị trí xúc tác thiết yếu của protein. 4.2.3. C ác bộ p h ậ n chuyển đổi v ậ t lý (physical tran sd u cer) Trong toàn bộ công nghệ ĐCSH có thể chia làm bốn phương pháp chuyển đổi túi hiệu, bao gổm: quang, khối, điện và nhiột. Chính sự khác biột 167 của tính chất bề mặt của ĐCSH, khả nãng đo lường trong thời gian thực (real time) hay khả năng sử dụng lại ĐCSH phụ thuộc vào từng phương pháp chuyển đổi tín hiệu trên. Những đặc điểm cơ bản của bốn phương pháp đó được mô tả dưới đây. uyển đổi quang (optical transducer) huyển đổi tín hiệu do những thay đổi đặc tính quang học có thể đo : huỳnh quang, lượng ánh sáng bị hấp thụ, chi số khúc xạ. sự nhiễu ự phân cực. Thiết bị chuyển đổi quang học được chia làm hai phần: i (extrinsic) và bên trong (intrinsic). Trong loại extrinsic á n h sáng yên qua mảu và phản ứng trực tiếp với mâu. Trong loại “ intrinsic”, sáng không trực tiếp qua khối mẫu mà truyền theo mộ t bộ phận g. Nó chỉ tương tác với mẫu tại bề mặt và nhanh chóng b iê n m át. 4.23.2. Chuyển đổi khối (mass transducer) Phương pháp áp điện hay àm thanh bể mặt của sự chuyển hướng tín hiệu hãng khối chủ yếu dựa trên việc đo tia của các thiết bị. Loại ĐCSH này nhạy với sự thay đổi tỷ trọng, độ đàn hồi hay tính bán dẫn của bề mặt có các sóng âm truyền qua. Hệ thống áp điện nhất thiết phải cân bằng và dựa trên tính chất của các tinh thể thạch anh. Nhữn« tinh thế này sẽ bị biến dạng cơ học khi cho qua một điện thế. 4.23.3. Chuyển đổi điện (electrical transducer) Coin sáu loại sau: đo điện thế, đo dòng điện, đo độ bán dẫn. đo công suất, đo, trờ kháng và đo trạng thái oxy hoá. Trong các phương pháp này, phưưng pháp đo điện thế (theo dõi sự thay đổi pH trong môi trường) và phương pháp đo dòng điện là các phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất tro n g Đ C S H . 4.23.4. Chuyển đổi nhiệt (thermal transducer) L> phóng nhiệt, nên các thiết bị chuyển đổi nhiệt được sử dụng để theo dõi sự thay đổi nhiệt độ. Trong còng nghiệp thực phẩm thì loại thiết bị này được sử dụng rộng rãi hơn cả. 168 Một số transducer được sử dụng trong ĐCSH được tóm tắt ớ bảng 4.3. Bảng 4.3. Một sô thiêt bị chuyến đổi (transducer) được sử dụng trong điện cực sinh học Thiết bị chuyên đổi Tác nhân sinh học ___ itransdiLcer] Điên CƯC dòng điên Các yếu tô để đo (amperometrỉc) Enzym, khảng thể, bào quan, vi sinh vật HjO j, O ị , 2» NADH Hiệu ứng trường chọn lọc ion Emzym, kháng thể CN-, COo, l2. H \ N H /. í ! ý h 3 Điện cực đo quang Enzym, khảng thể H*. H2, NK I3 Điện cực đo nhiệt Enzym, kháng thể, vi sinh vật Nhiệt của phàn ứng enzyr i Điện cực tinh thể áp điện Enzym, kháng thể Hấp phụ 1«hối (lon selective field effect transitor ISFET) 4.3. MỘT SỐ LOẠI ĐIỆN c ự c SINH HỌC 4.3.1. Điện cực điện hoá (electrochem ical biosensor) Nỵuyên tắc: Điện cực enzym được chế tạo dưới dạng một màng emzym mà một mặt của màng tiếp xúc với môi trường nghiên cứu (cơ chất), còn mặt kia tiếp xúc với vùng đo. Phản ứng oxy hoá khử cơ chất do enzym xúc tác sẽ xảy ra trên lớp màng enzym. Kết quá sự thay đổi năng lượng tự do dược điện cực thu nhân rồi truyền qua hệ thống đo dưới dạng dòng điện hoặc điện thế. .. 4.3.1 1 Điện cực đo điện th ế (potention metric biosensor) Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau vé điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh (là điện cực có diện thế không đổi). Sự khác nhau về điện thế giữa hai diện cực là hàm cùa hoạt độ các ion trong dung dịch điện phân nơi đặt điện cực (điều kiện hoạt động của diện cực điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thê người ta gọi nó này được xác định theo phương trình NERST: ^ RT E - E„ + nF X 1ln — ai a. 169 E(, : điện thế oxy hoá - khử tiêu chuẩn; R : hằng số khí; T : nhiệt độ tuyệt đôi; F : hằng sô Faraday; n : số điện tử trao đổi của cơ chất; a t,a2 : hoạt độ trong đung địch và trong lớp màng điện cực. Các điện cực màng đo điện thế như điện cực pH, điện cục polyme, điện cực nhận biết khí, điện cực cacbondioxit đã được sử dụng rộng rãi như các bộ phận nhận biết bên trong của biosensor. Điện cực do điện thế dựa trên cơ sở điện cực màng nhận biết khí, bao gôm màng thấm khí kỵ nước và điện cục pH phân cách bởi lớp màng mỏng của dung địch điện phân. Điện cực loại này có tính chọn lọc cao, màng của nó chỉ cho các chất khí thấm qua m à thôi. Các mẫu phân tích phải hoàn toàn ờ dạng nước lỏng. Một khi tính kỵ nuớc của màng bị tấh công bởi đung môi hữu cơ thì sẽ làm hỏng màng. Hình 4.6. Sd đồ cấu tạo điện cực đo diện thế. Ví dụ: - Xác định gỉucose D-glucose 170 GụỊẹọMỊủKt-------- ►D-gluconat + H + Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau khi giải phóng H+) sẽ xác định được hàm lượng D-glucose. - xác định ure: NH2CONH2+ H20 --eH=9- > 2NH, + HC o ; + H+ NH2CONH2 + H20 + 2H+ 2NH4+ + C 0 2 - xác định Lysin: Lysin — LDC ► cadalverin + C 0 2 (lysin decacbocylase) Đo lượng N H / giải phóng ra thông qua đo pH sẽ xác định được hàm lượng ure ban đẩu. Khi xác định ure hay lysin qua C 0 2 thì điện cực enzym sẽ được kết hợp với điện cực C 0 2. Sơ đồ cấu tạo điện cực C 0 2 như hình 4.7. Điện cục thuỷ tinh Điẻn cực calomel chuẩn Dung dỊch điện phân COj được do Màng thấm kỵ nước Hình 4.7: Điện cực màng chọn lọc khí CO}. Trong trường hợp các điện cực C 0 2 và điện cực NH, tín hiệu phát ra là điện thế thì thường gồm: một điện cực thuỷ tinh đo pH của một dung dịch điện phân đượe phân cách vối dung dịch đo bằng một màng thấm khí kỵ nước. Sau khi cân bàng, thl pH bên trong là hàm của áp suất phần của khí đo như hình 4.7. 171 4.3.2. Điện cực E N FE T (en/ym linked field effect tra n sito r) Điện cực ENFET được chế tạo dựa trên cơ sở của loại điện cực chọn lọc ion sử dụng transitor có hiệu ứng trường ISFET (ion-selected field effect transitor) gồm có một màng chọn lợc ion tiếp xúc với transitor và một điện cực so sánh. Nguyên lý hoạt động của nó cũng giống như điện cực đo điện thế. ISFET là loại điện cực duy nhất không tiếp xúc với dung dịch cần đo. Đây là loại điện cực dùng vật liệu cách điện để đo hoạt độ ion trong dung dịch điồn phân. Các biosensor dựa trên cơ sở ISFET bao gồm một ISFET với màng polyme có gắn enzym lên trên bề mặt màng chọn lọc ion. Các enzym có vai trò xúc tác cho phản ứng thuỷ phân hoặc oxy hoá dung dịch cơ chất làm cho pH của dung dịch thay đổi. Sự thay đổi này lập tức được xác định bời 1SFET. Tức là ta sẽ xác định được mối tương quan giữa nồng độ cùa dung dịch cơ chất (dung dịch phân tích) và tín hiệu ra (điện thế) của ISFET. Điện cực so sánh M àng bao Hình 4.8. Điện cực ENFET. Ngày nay thiêt bị ENFET được sử dụng rất rộng rãi, người ta có thể dùng nó đê xác định dư lượng thuốc trừ sâu hay sự có mặt của penicilin. của thuốc trừ sâu trong dung dịch làm giảm tín hiệu lối ra của ISFET. Dựa vào độ giảm tín hiệu (so sánh tín hiệu được đo với dung dịch kiểm chứng không có mặt của thuốc trừ sâu) ta có thê đánh giá được % hoạt tính xúc tác còn lại của 172 enzym tức là có thể xác định sự có mặt của thuốc trừ sâu một cách định lượng. Người ta cũng dùng ENFET để đo nồng độ penicillin. Penicillinase Penicillin + H20 --------------------*■ axit penicilloic Peniđillinase đóng vai ưò là chát xúc tác cho phan ứng này. Nếu chúng ta cố định penicillinase lên màng và ngâm nó vào trong dung dịch có penicillin thì ion H+ sẽ được sinh ra, bởi penicillin là một axit mạnh. Sự thay dổi pH dược đo bằng thiết bị FET nhạy ion H+. Điện cực này cũng có thể đo được lượng ure dựa vào phàn ứng phân huỷ ure nhờ urease: urease Ure + 2H20 + H+ -------------►2NH4+ + HCO,Khi ure bị phân giải, NH4+ được sinh ra và pH tãng lên. Do đó nồng độ urc có the tính được qua xác định sự thay đổi pH nhờ ISFET. Hình 4.9 là thiết bị ENFET để đo ure. Trong thiết bị này bề mặt cổng của ISFET là lớp Si,N4 đã xử lý với y-amino-propyltriethoxylane (y-APTES). Nhóm ethoxy của Ỵ -A ITES được liên kết với bề mặt của Si3N4 và nhóm amin được lộ ra ở trên bề mặt. Hình 4.9. Điện cực sinh học đo ure kiểu FET. 173 Màng cố định urease được xử lý với aldehytglutaric vì vậy có sụ hình thành liên kêt hoá học giữa nhóm amin này và nhóm c o của aldehytglutaric. Điện cực điện thế FET đo ure, có thể đo được trong khoảng 0.05-10 mg/ml.Tín hiệu đầu ra là điện áp và sự thay đổi đồ thị từ vài mi li von đến khoảng 50mV. Điện cực FET có khả năng thu nhận các đáp ứng tín hiệu tốt khi sử dụng m ột lần trong một ngày trong m ột tháng. Đối với người bình thường,hàm lượng ure ừong máu là 0,l-0,2m g/m l. 4.3.1.2. Điện cực đo đòng điện (amperometric biosensor) Điện cực đo dòng điện hoạt động nhờ một dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu diện thế giữa hãi điện cực, thường là m ột điện cực kim ỉoại và một điện cực so sánh. M ật dô của các hạt tích điện tỷ lê với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực. Cường độ đòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai đìộn cực. Trong những điều kiện xác định, sau khi chuẩn có thể xác đinh được nổng độ từ phép đo cường độ dòng điộn. Trong đa số trường hợp người ta thường tiến hành oxy hoá hoặc khử m ột loại hạt tích điện trên điộn cực chỉ thị, còn điện cực thứ hai là điện cực so sánh. Nếu đặt vào điện cực chỉ thị một điện thế(E)biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I =f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nổng độ của hạt bị oxy hoá (hoặc bị khử) trẻn điện cực chỉ thị. I 1- E quá thấp để sự oxy hoá có thể xảy ra; Oi Q 10 I 2* Vận tốc oxy hoá điện hoá và do đó cưởng độ dòng điện sẽ tâng với sự tăng hiệu điện Hình 4.10. Đổ thị ỉ =f(E). vào hiệu điện thế nữa và I = K. C *. ■ AE 174 Hiện nay các điện cực đo dòng điện đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực hydroperoxyt. Oxy và hydroperoxyt (H2O ị ) đểu là những chất được sinh ra trong một số phản ứng có enzym xúc tác, cũng như trong phản ứng có các chất trung gian oxy hoá - khử nhân tạo: ferocyanua, ion N-methylphenazinium (NMP), benzoquinon và chúng có thể được xác định nhờ đo dòng điện. Các điên cực đo đòng điện thường sử dụng các enzym oxidoreductase để gắn vào màng. Oxy, NAD+, N A D F được dùng như là chất nhận điện tử để phục hồi enzym sau khi phản ứng xúc tác các cơ chất. Các enzym sử dụng oxy như là chất nhận điện tử được gọi là oxydase, còn enzym đùng N A D \ NADP* được gọi là dehydrogenase hay reductase. Trong hai nhóm này thì oxydase được dùng nhiểu nhất, nhu là m ột thành tố sinh học gắn vào lớp màng của điện cực. Các điện cực đữ dòng điện được sử dụng để xác định các cơ chất của enzym như: glucose, monosaccarit, hypoxantin, lactat, axit amin, sulffit, salicylat, oxalat, và pyruvat. Điện cực enzym để đo lượng glucose bao gổm một anod Pt và một catod bạc phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định glucooxydase (GOD). Cả hai đều được đặt trong dung địch điện phân KC1. Điện áp phân cực được đặt vào giữa hai điện cực. Dưới tác động của điện áp phân cực này H20 2 được giải phóng ra sẽ bị oxy hoá ở mặt phân cách giữa anod và màng theo phản úng: Glucose -GOP----- ► axit glucomic + H20 2 H A --------------- ► 0 2 + 2 H + + 2 e- Dòng điện đo được sẽ tỷ lệ với lượng H20 2 bị oxy hoá và do đó tỷ lệ với lượng glucose có trong môi trường nghiên cứu. 175 Điẹn cực A g /A g C l ( c a tjx r chuẩn) Điện c (anud thị)) Dung dịch diện phán kC I Màng thẩm thấu Màng e M àng ngãn Hình 4.11. Sơ đồ nguyên tắc của điện cực do dòng điện. Cũng như đo glucose để đo lượng lactat, dùng điện cực có gắn lactatoxydase (LOD) từ pediscoccuspecies xúc tác phản ứng : Lactat + O, LOD -> pyruvat + H20 2 Để đo cholesterol thì gắn enzym cholesteroloxydase (o , OD) từ Rhodococcus erythrópolìs, xúc tác phản ứng : Cholesterol + 0 2 —- hot) ► Chlest-4-ene-3-one + H2() ■2Y2 Đế đo lượng lactose thì gắn enzym /5-galactosidase (J3 -GAL) ừ E.Coli và Glucooxydase (GOD) từ A.niger, xúc tác các phản ứng: Lactose + H20 2 B CiAL p -D glucose + 0 2 + H20 -> J3 -D glucose + D-galactose GOD gluconic acid + H20 2 Có điều là điện áp phân cực phải như thế nào để phản ứng oxy hoá điện hoá ớ ancxl tiến hành được. Vận tốc của phán ứng này thường bị giới hạn bới 176 quá trình chuyển khối của H20 2 đến điện cực. Trong trường hợp này, cường độ dòng điện ở anod tỷ lệ thuận với nồng độ H20 2 trong môi trường tiếp xúc với anod. Ia = K.[H20 2] Cũng có thể xác định lượng glucose qua đo nồng độ oxy hoà tan trong dung dịch nhờ điện cực oxy hay điện cực Clark. Đầu đo oxy cấu tạo từ hai điện cực có khả năng phân cực: một catod bằng platin (Pt) và một anod bằng bạc phủ clorua bạc (Ag/AgCl). Cá hai điện cực được đặt vào chất điện phàn là Ka li clorua. Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước (bàng teflon hoặc bằng polypropylen) cho oxy thấm qua. Dưới tác dụng của điện áp phân cực 650mV đặt vào giữa hai điện cực, oxy khuếch tán qua màng sẽ bị khử tại catod theo phản ứng: 0 2 + 4e' + 4H+----- —► 2H20 Dòng điện chạy giữa hai điện cực do phản ứng điện hoá tỷ lệ với lượng oxy bị khử và do đó tỷ lệ với lượng oxy và lượng glucose. Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ oxy hay áp suất riêng phần của oxy. Biên thế Hình 4.12. Điện cực oxy của Clark. 177 Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau: - Phản ứng enzym sẽ phụ thuộc vào tốc độ khuếch tán của cơ chất qua màng. - Khi phản ứng oxy hoá-khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm đần, đo đó tớc độ chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ vững vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là phải điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ,đến vài micromét). - Vận tốc phản ứng oxy hoá-khử phụ thuộc vào nồng độ oxy hoà tail. Để hạn chế ảrih hưởng cùa nồng độ oxy hoà tan trong dung dịch đến kết quả phân tích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tủ m à sử dụng các chất trung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực. Các chất vận chuyển điện tử trung gian có thể là ion Fe+, N-methylphenazinium (NMP) hoặc telracyanoquinodimethan (TC NQ), hexacyanoferat. - Điện cực có gắn enzym lysin decacboxydase (LDC), enzym xúc tác phản ứng: Lysin ■— —— ► cadaverin +■CO; thì enzym sẽ được Hên kết với một điện cực C 0 2. - Ngược ỉại một điện cực urease xúc tác phản ứng: Ure + H20 H£2ĩề- » C 0 2 + 2NH, thì có thể chọn giữa ba cách: - Sự phát hiện C 0 2 tạo ra bởi m ột điện cực C 0 2. - Sự phát hiện ion NH4 (nếu pH đủ axit) bởi một điện cực thuỷ chọn lọc. tinh - Sự phát hiện NH3 tạo ra bởi m ột điện cực NH, ở pH>12. Điểu này không thực hiện được do enzym sẽ bị biến tính. 4.3.2. Điện cực đo nhiệt (caỉorimetric biosensor) Các phản ứng giữa cơ chất và chất xủc tác sinh học thưòng giải phóng ra nhiệt năng và ngưcd ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đo nhiệt (điện cực đo nhiệt) sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu. 178 Nhiệt lượng toả ra của một số phản ứng có enzym xúc tác biểu diễn ở bảng 4.4. Bảng 4.4: Entanpi của một sò phản ứng có enzym xúc tác Mã sỏ' EC Cơ chất -flH (kj/mol) Catalase 111.1.6 HjOj 100,4 Cholesterol- oxydase 1.1.3.6 Cholesterol 52,9 Glucooxydase 1.1.3.4 Glucose 80,0 Hexokinase 2.7.1.1 Glucose 27,6 Lactat- -dehydrogenase 1.1.1.27 Pyruvate 62,1 Ị ì -Lactamase 3.5,2.6 Penecillin G 67,0 Trypsin 3.4.21.4 Benzoyl-Larginineamide 27,8 Urease 3.5.1.5 Urea 6,6 Uncase 1.7.3.3 Uric acid 49,1 Chymotrypsin 3.4.21.1 Ester 4-16 Penicillinase 3.5.1.11 Penicillin G 67 Amylase 3.2.1.1 Tỉnh bột 8 Invertase 3.2.1.25 Saccarose 20 Enzym Khi nhiệt lượng toả ra càng ỉớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn. Do đó để tăng nhiệt lượng toả ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tói 4 đến 5 ènzym) V í dụ: sù dụng đồng thời enzym glucooxydase oxy hoá đường glucose và enzym catalase để oxy hoá hydro peroxyt. Hai phản ứng xảy ra cùng một lức. Lượng nhiệt toả ra nhiều hơn. Glucose — g>nc?ọxyda.se---- ^ H20 2 Gluconic acid + H20 2 catalase ._» H20 + 0 2 Qua nghiên cứu người ta thấy cứ 0,1 juM cơ chất chuyển hoá hoàn toàn thành sản phẩm thì sẽ sinh ra 100 kJ/mol. Các thiết bị này phải luôn dược đặt trong hệ thống cách nhiệt để giữ môi trưòng ổn định nhiệt độ. 179 Có bai loại điện cực đo nhiệt: - Điện cực enzym - cặp nhiệt (còn gọi là điện cực enzym nhiệt dây dần đo dòng điện). Loại này ít được sử dụng. - Điộn cực enzym-nhiệt điện trở, thường được sử dụng rộng rãi. Điện cực enzym cặp nhiệí: Trong loại điện cực này, bộ chuyển đổi vật lý là cặp nhiệt điện. Trên cặp nhiệt người ta phủ một lớp màng chứa enzym. Cặp nhiột có cấu tạo gồm hai đây dẫn nối với nhau nhờ mối hàn. Suất điện động E của mạch phụ thuộc vào bản chất vật lý của dây dẫn và vào nhiệt độ Tj, T2. Thông thường nhiệt độ của một mối hằn được giữ ở giá trị không đổi và biết trước, gọi là nhiệt độ chuẩn T |—Tref. Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra đo phản ứng xúc tác bởi enzym. Mảngmyaicỏpnhỉỷt Ef Hinh 4.13. Sơ đổ điộn Cực enzym-cặp nhiệt. Viộc sử dụng cặp nhiệt điện có ưu điểm là kích thước cặp nhiệt nhỏ nên có thể đo nhìột độ ờ từng điểm của đối tượng cần nghiên cứu và tăng tốc độ hổi đáp (do nhiệt dung nhỏ). Trên cơ sở này, Bataillard đã đưa ra cải tiến là sử dụng một cặp nhiệt bán dẫn (intergrated silicon) để định lượng glucose, Uịe và penicillin. Do tính chất của cặp nhiệt và lớp tiếp xúc enzym-cập nhiệt có tính truyền nhiệt cao cho phép không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ của môi trường xung quanh, do đó có thể thu nhỏ kích thước của thiết bị để có thể cấy vào dưới da đo trực tiếp nồng độ các chất trong máu. • Điện cực enzym-nhiệt điện trở: Loại điện cực này còn có thể gọi là điện cực áo nhiệt vì buổng đọ nhiệt hoàn toàn bị cô lập với môi trường xung quanh nhờ lớp áo nhiệt, quá trình 180 này gẩn giống với quá trình đoạn nhiệt. Loại thiết bị này có cấu tạo đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất. Hinh 4.14. Sơ đồ điện cực enzym-nhiệt diộn trà: 1- ống mao dẫn ; 2- cột enzym; 3- nhiệt điện trở so sánh; 4- bộ tản nhiệt; 5,6- lớp cách nhiệt; 7- nhiột điện trở. m Cơ chất đi vào bộ tản nhiệt (4) thì sẽ đi dến (3) và (2), để phản ứng với enzym và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt trở (7). Kết quả đo được đi ra qua bộ xử lý. Ngoài cách chế tạo cột vật ỉiệu sinh học như trên, người ta còn có thể bao bên ngoài nhiệt điện trở một lớp vỏ Silicon và đặt màng cố định enzym ờ trên, nhờ đó thu nhỏ được kích thước thiết bị. Hình 4.16. Điện cực enzym - nhiệt điện trỏ có vỏ bọc Silicon: 1: Nhiệt điện trỗ; 2: Khung cố định enzym; 3: Dây đẫn. Cũng có thể tích hợp nhiều điện trở tạo ra điện cực nhiệt định lượng đồng thời nhiều chất. Chát cẩn phân tích (multiple analytes) / Ettzym 2 Mi KrnH din Hình 4.17. Điệrỉ c ụ t nhiệt đỉện trỏ tích hợp. 182 Các nghiên cứu về loại điện cực nhiệt độ cho thấy ngoài những ứng dụng trong các lĩnh vực: y tế, môi trường, thực phẩm, chúng còn có thể có những ứng dụng đặc hiệu như: - Xác định các hằng sô Kị, K^Vn, của enzym cố định (Stefuca,1990) - Định lượng ADP, ATP bằng cách sử dụng pyruvatkinase và hexokinase đồng thời cố định trên aminopropyl CPG (Kirstein,1989). 4.3.3. Điện cực đo q u ang (optical biosensor) Điện cực quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ ưong mẫu phân tích. Các diện cực này hoạt động theo nguyên tắc dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu. Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản úng xúc tác bởi enzym. R Hình 4.18. Các kiểu điện cực sinh học quang điện dựa trên cơ sả quang sợi phip: a/ điện cực quang sợi rẽ nhánh; b/ quang sợi đơn với bộ tách chùm tia dể phân tảch tia tới và tỉa phàn xạ; cỉ quang sợi đơn mà ỏ đố pha phản ứng được phủ láp quang anh sáng; R- chất phản ứng (thuốc nhuộm) nhạy hoá học. Cơ sò của kiểu điện cực quang điện là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phếp trắc huỳnh quang hoặc phép đơ phản xạ quang. Nó có khả năng chỉ báo nhũng thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ 183 trong mỏi trường đo bao quanh sợi dẫn. Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng sẽ được đo. Các thiết bị điện cực quang có thể được phân loại như sau: - Thiết bị đo hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (surface plasmon resonance-SPR) - Thiết bị phản xạ bên trong toàn phần (total internal reflection-TIR) và thiết bị phổ tương quan photon (photon correlation spectroscopy-PCS). 43.2.1. Điện cực đo phản xạ quang Điộn cực này hoạt động theo nguyên lý: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân theo phương trình: R = — .,R<|.% K Trong đó: R: năng suất phản xạ; R q: hàng sô' phản xạ của môi trường chuẩn; I: cường độ của tia tới; It,: cường độ của tia phản xạ. R có quan hệ với nồng độ chất hấp thụ màu theo phương trình: c K Ị E = (1-R)2/2R C- nồng độ chất hấp thụ; K- hằng số hấp thụ; £ - hắng số tán sắc. V í dụ nhự kỹ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH (3-metyl 2-benzothiazolinon) và DMAB (3dimetylaminobenzoic acid). Hai enzym glucooxydase (GOD) và peroxidase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nén đã phũ thuốc nhuộm. Khi mẫu phân tích tiêp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau: Glucosemíu + 0 2 — ^ 2 2 -------- p. Gluconic acid + H20 2 H20 2 + MBTH + DMAB -S6—1da!^ ► M BTH-DM AB(màu xanh) Nếu H2Ó2 có nồng độ cao thì phải đùng enzym catalase. 184 Mẫu phân tích sau đó được đem đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp. Và từ đó ta sẽ tính được hàm lượng glucose. Với điện cực sinh học dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection: TIR) thì bể mật dây dẫn được phủ các kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích. Khi sóng ánh sáng đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vào trong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dẩn dần nguồn sáng bị suy giảm. Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phân tích. Dung dịch mảu Bộ lọc ^Jih sáng pnản xạ Hình 4.19. Điện cực sinh học dựa trẽn cỡ sỏ của TIR. 4.3.2.2. Điện cực đo phất quang Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: cơ chất tác dụng với enzym cố định để tạo thành sản phẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu. Đo ánh sáng màu đó ở một bước sóng nhất định sẽ suy ra được nồng độ cơ chất. Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong thực phẩm. Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và Dluciferin dưới tác dụng của enzym luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP, pyrophosphat, C 0 2 và ánh sáng vàng đo được ở bước sóng 562nm. Từ đó xác định được lượng vi khuẩn có mặt trong thực phẩm. 4.3.4. Điện cực điện áp (piezoelectric biosensor) Nguyên lý cũa loại điện cực này dựa vào sự dao động của các tinh thể, và sự đao động sẽ gia tẫng khi có tạp chất hấp thụ trên bề mặt của tinh thể. M ột sô' chất điện môi tự nhiên như: thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như: 185 sulfatliti, thạch anh tổng hợp...dưới tác đụng của một lực nhất định, chúng sẽ bị biến dạng tạo nên tần số dao động của tinh thể. Đo tần số dao động đó sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo. Tần số dao động được tính theo công thức: *1,-? 1/2 Trong đó: f: tần số cộng hưởng; ^ đ ô nhớt của dung dịch; Pj, Pq: khối lượng riêng của chất lỏng và tinh thể; jaq: áp suất biến dạng của tinh thể. Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, metan, sulfuadioxit và các chất phosphat hữu cơ (Guilbault,1980). Ta có thể dùng điện cực này để xác định nồng độ formaldehyt nhờ formaldehyt dehyrogenase, hay xác dịnh dư lượng thuốc trừ sâu cơ phospho vốn kìm hãm enzym cholinesterase. Kim loại Màng sinh học Hình 4.20. Sơ đổ cấu tạo điận cụt điện áp. 4.3.5. Điện cực mỉễn dịch (immuno-bỉosensor) Điện cực miễn dịch hoạt động dựa trên tính chất kháng nguyên-kháng thể. Tức là kháng thể phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên sinh ra nó. 186 Phản ứng kháng nguyên - kháng thê được xác định bằng nhiều cách, trong đó có kỹ thuật ELISA (Enzym linked Immunosorben assay: kỹ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzym). Nguyên lý của việc sử dụng điện cực miễn dịch ELISA kết hợp với sử dụng một điện cực điện hoá hoặc điện cực đo nhiệt độ để định hướng sự biến đổi nồng độ cơ chất trong các phản ứng xúc tác bởi enzym đánh dấu. Tốc độ chuyển hoá cơ chất tỷ lệ thuận với lượng kháng thể đã gắn vói enzytn. Nhờ đó định lượng được kíiáng nguyên cẩn phàn tích. Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA được trình bày ở hình 4. 21. c ^ Kháng nguyên ^ Kháng thể (ệ-ỊTKháng thể đã gắn enzym Hình 4.21. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật EUSA. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật Elisa như sau: a): Kháng thể dặc hiệu với kháng nguyên được cố định trên bề m ặt của một ống. M ột hỗn hợp gồm một lượng đã biết phức kết enzym - kháng nguyên và m ột lượng chưa biết kháng nguyên của mâu được đặt vào ống; b): Sau m ột thời gian thích hợp kháng thể, phức enzym - kháng nguyên và kháng nguyên tự do có thể gắn kết hoặc vằn ở trạng thái tự do, phụ lhuộc vào nồng độ của chúng; 187 c): Các kháng nguyên tụ do được rửa trôi và loại bỏ. Lượng phức kết enzym - kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định bầng tốc độ phản ứng enzym theo sơ đồ (I) và (II) hình 4.22. II B b c Hinh 4,22, Nguyên lý hoạt động của điện cực miễn dịch. Nguyên lý hoạt động của điện cực m iễn địch như sau: Ia) ống được phủ kháng nguyên cộ định. M ột lượng dư phức kết enzym-kháng thể được đặt vào ống và xảy ra sự gắn kết. b) Sau một thời gian thích hợp, những phân tử nào khồng được gắn kết sẽ bị rửa trôi. c) Dung dịch chứa kháng nguyên phấn tich được đưa vào ống, phụ thuộc vào nồng độ kháng thể mà xảy ra sự gắn kết và loại m ột số phức kết enzym-kháng thể. Lượng phức kết enzym-kháng thể lồại ra được xác định bằng tín hiệu đáp ứng từ 1 điện cực sinh học. 188 IIa) Bộ chuyển đổi được phủ kháng thể (cố định) đặc hiệu vái kháng nguyên phân tích. Bộ chuyển đổi được ngâm trong một đung dịch chứa một hỗn hợp gồm m ột luợng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và nồng độ chưa biết kháng nguyên phân tích. b) Sau một thời gian thích hợp, kháng nguyên và phức kết enzymkháng nguyên được gắn kết với kháng thể. c) Những phân tử nào không được gắn với kháng thể bị rửd trôi và loại bỏ. Lượng phức enzym-nguyên gắn với kháng thể được xác định trực tiếp từ tín hiệu chuyển đổi. ELISA được sử dụng để phát hiện và khuếch đại một phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Lượng kháng nguyên liên kết enzym gắn với kháng Ihể cố định được xác định bẳng nồng độ tương đối giữa kháng nguyên liên kết và kháng nguyên tự do và được định lượng bằng tỷ lệ của phản ứng enzym. Để có được đáp ứng nhanh chóng, người ta sử dụng các enzym có khả năng sử dụng lại nhiều lần. Độ nhạy của phương pháp này cũng có thể tăng lên bằng cách sử dụng các phản úng có xúc tác enzym. Các phản ứng này cho đáp ứng nhanh hơn: chẳng hạn tạo ra các sản phẩm phát quang, hoặc huỳnh quang hoặc có màu đậm hơn. Kỹ thuật này hiện nay được sử đụng rộng rãi trong các phòng thí nghiêm phân tích. Gần đây, để tảng phạm vi úng dụng, tóc độ và độ nhạy, kỹ thuật ELISA được kết hợp với các bộ điện cực sinh học hình thành phương pháp sử dụng điện cực miễn dịch (immunosensor). Cấu hình của một immunosensor đơn giản được thể hiện ờ hình 4.22{I), ở đây, điện cực sinh học chỉ thay thế cho hệ thống giám định màu truyền thống. Tuy nhiên các điện cực miễn dịch hiộn đại đang được phát triển hình 22 (II). Chúng dựa vào khả năng giám định trực tiếp các kháng nguyên gắn bề mặt được phủ kháng thể của điện Cực sinh học- Phượng pháp này rất thích hợp khi sử dụng với: điện cực điện áp và các điện cực đo điện thế. 4.3.5. Điện cực vi sinh vật (microbial biosensor) Điộn cực vi sinh vật được chế tạo để phát hiện các chất hoá học, dựa vào sự hô hấp và trao đổi chất của vi sinh vật. 189 Điện cực này có hai loại: - Điện cực dùng để đo sự thay đổi hoạt lực hô hấp của vi sinh vật cố định với một thiết bị đo điện thế. - Điện cực dùng để đo các chất sinh ra từ vi sinh vật và phản ứng dễ dàng đuợc vói điện cực. Các vi khuẩn hiếu khí sử dụng oxy và sản sinh nãng lượng. Nhờ việc đo lượng oxy tiêu thụ thông qua điện cực 0 2, la có thể đánh giá được hoạt lực hô hấp. Oxy thấm qua màng teflon và bị khử trẻn điện cực platin. Nếu vật liệu trong dung dịch thử nghiệm có ảnh hưởng đến hoạt lực hô hấp, thì nồng độ của nó có thể được định lượng thông qua việc xác định nồng độ oxy. Người ta thường dùng điện cực này để xác định chỉ sổ, BOD. COD là thước đo lượng chất hữu cơ gây ô nhiễm nước và nó được sử dụng để đánh giá chất luợng nước. Các chất gây ô nhiễm có thể bị phân huỷ bời vi sinh vật nhờ tiêu thụ oxy. Vì vậy mức độ ô nhiễm có thể được xác định thông qua việc đo lượng oxy. Điện cực được chế tạo bằng cách cố định trichosporon cutaneun vào màng celllulose và gắn với điện cực oxy. Nguyên lý của điện cực đo BOD có thể diễn giải như sau: Oxy khuếch tán từ dung dịch bão hoà không khí qua màng thẩm tích đi vào màng có chứa các tế bào vi sinh vật rồi qua màng teflon và cuối cùng chúng bị khử trên bề mặt catod của điộn cực oxy. Dòng của điện cực oxy dần dần ổn định, bởi vì tốc độ khuếch tán của oxy qua mạng cân bằng với tốc độ tiêu thụ ơxy đo hô hấp nội sinh của cơ thể vi sinh vật cố định trên màng. Người ta gọi dòng này là đòng cơ bản (base current). Nếu ta cho chất đồng hóa hữu cơ vào dung địch đo, chúng thấm qua màng thẩm tích rồi được vi sinh vật sử dụng. Kết quả là tốc độ hô hấp tăng dần còn nồng độ oxy hoà tan thì giảm dần, dẫn đến dòng giảm dần cho tdi khi đạt đến trang thái ổn định mới và người ta gọi đòng này là đòng đỉnh (peak current). Sự khác nhau giữa dòng cơ bản và dòng đỉnh được gọi là dòng ra (output), tín hiệu của dòng ra tỷ lệ thuận với nồng độ của các chất hữu cơ bị phân huỷ sinh học của mẫu đo. Vì vậy ta có thể biết được nông độ BOD dựa trên kết quả đo của điện cực vi sinh. Hình 4.23 là sơ đổ cấu tạo hai loại điện cực vi sinh vật. 190 Màng có dính Màng cố (lịnh H Pt do các chất ho«( dốnf| điện Hình 4.23. s a đổ nguyên lý hoạt động của hai loại điện cực vi sinh vật. 4.3.6. Điện cực DNA DNA sensor sử dụng bioreceptor là các acid nucleic nhằm phát hiện đặc hiệu các DNA mục tiêu.Đáp ứng sinh học đặc hiệu của DNA sensor là phản ứng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung giữa các trình tự DNA sợi đơn (mục tiêu) và DNA dò (probe). Các base nito liên kểt với nhau bằng liên kết hydro tạo sợi đôi DNA bền. DNA sensor gồm nhiều loại khác nhau, được phát triển dựa trên các kỹ thuật thu nhận và chuyển đổi tín hiệu khác nhau: điện hóa; quang... \ Lớp nhân DNA mục tiêu Tín hiệu ra Hinh 4.24: Nguyên tắc chung của DNA sensor. 191 Khi quá trinh “lai" giữa DNA mục tiêu và DNA đầu dò xảy ra. tín hiệu “lai” sẽ được DNA sensor thu nhận và chuyển đổi, tùy theo loại transducer dược sử dụng. Ví dụ - DNA điện hóa (Electrochemical DNA sensor): DNA dược cấu tạo từ các base nito Purine (A.G) và Pyrimidine (T,C). Ờ điện thế phù hợp, các base nito purin dễ dàng tham gia phản ứng oxi hóa khử trực tiếp hay thông qua các chất trung gian. Sự trao đối điện tích chính là tín hiệu đáp ứng của phàn ứng bắt cặp đặc hiệu DNA. Lợi dụng tính chất này để phát hiện quá trình “ lai” của DNA. • DNA sensor điện hóa trự c tiếp: Các DNA mục tiêu “lai” với DNA probe trên lớp nhận biết. Ở điều kiện điện thế phù hợp base (G) của DNA, mục tiêu bị oxi hóa gây ra hiện tượng tích điện trên bề mặt điện cực.Sự biến đổi điện tích được đo bởi điện cực đo dòng điện. Hinh 4.25: DNA sensor điện hỏa trực tiếp. 192 Kỹ thuật này đạt độ nhạy khá cao nhờ tạo ra sự tích tĩnh điện của các chất phân tích trên bề mặt điện cực trước khi tiến hành phát hiện. Các base purin cua DNA có thê bị oxi hoá diện hoá học, và quá trình này có thể dược tiến hành trên điện cực cacbon, vàng, hay indiumtin oxide (ITO). Tuy nhiên phương pháp này thường bị nhiễu nền (do G của DNA tạp cũng bị oxy hoá).Đe loại trừ hiện tượng này, người ta thường dùng từ tính dế hút DNA tạp ra khỏi hỗn hợp phân tích. • DNA sensor điện hóa gián tiếp: Oxi hóa DNA mục tiêu gián tiếp thông qua các phần tử điện hóa trung gian.Đây là phương pháp sử dụne phức hợp polypyridin cùa Ru (II) và Os(ll) đề giản tiếp oxi hoá guanidin, các phần tử trung gian sẽ lấy e từ các base G trên DNA mục tiêu và chuyển tới điện cực, gây nên hiện t trạng tích điện ở điện cực.Đo mật độ điện tích bằng điện cực đo dòng điện. eHình 4.26: DNA s e n so r điện hỏa gián tiếp. * DNA sensor điện hóa sử dụng chất oxi hoá-khừ đặc hiệu. - Nguyên lý : 193 Sử dụng hai loại probe có trình tự bổ sung lai với hai đầu của DNA mục tiêu: probe bắt giữ và probe tín hiệu. - Probe bắt giữ được cố định trên bề mặt điện cực. - Probe tín hiệu có thể cố định trên bề mặt điện cực hoặc tự do trong dung dịch. - Chất Oxyhoa-khử : Ferrocen. Probe tín hiệu được đánh dấu bằng chất oxi hỏa khử (ferrocen) hoặc gắn với hạt nano. DNA mục tiêu “lai” với cả probe bát giữ và probe tín hiệu trên bề mặt điện cực. Dưới điện thể phù hợp, probe tỉn hiệu trao đồi ion với bề mặt điện cực tạo tín hiệu ”lai”. Dưới đây là sơ đồ DNA sensor sử dụng chỉ thị oxy hoá khử đặc hiệu (sandwich). Target nucleic acid Hình 4.27: DNA sensor diện hóa sử dụng chát oxl hoá-khừ đặc hiệu. Vùng sợi xanh (trên): sợi OLIGOPHENYLHTHYNYL-làm nhiệm vụ truyền điện từ giữa phần đánh dấu ferrocen và điện cực. 194 - Vùng sợi xanh (dưới): sợi POLYETHYLENGLYCOL - là lớp cách điện, ngăn càn ferrocen trong dung dịch tiếp xúc với điện cực.Đìện từ truyền từ ferrocene tới điện cực được ghi dưới dạng dòng điện bởi detector. - Kỳ thuật DNA sensor điện hoá có gẳn hạt nano đánh dẩu Wang và cs đưa ra kỹ thuật DNA sensor điện hóa có sử dụng các hạt nano đánh dấu bằng cách gắn các DNA probe lên các hạt từ tính lai với DNA mục tiêu và được phân tách trong từ trường. Sau đỏ các DNA probe này lai lần thứ hai với các sợi tín hiệu đánh dấu bang các hạt nano.Sản phẩm lai sẽ được tách ra,khi đó các hạt nano bị hoà tan trong dung dịch và có thể phát hiện bang AVS (Adsorption Stripping Votanmetry).VỚì kỹ thuật này có thể phát hiện cùng một lúc ba DNA mục tiêu với ba hạt nano đánh dấu : CdS, ZnS,PbS. Hình 4.28: DNA sensor điện hoá vớ i các hạt nano đảnh dâu. 4.4. ỨNG DỤNG ĐIỆN c ự c SINH HỌC 4.4.1. ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Trong công nghiệp thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa trên các phương pháp truyền thống thường đòi hỏi nhiều giờ hoậc thậm chí nhiều ngày. 195 Trong những nãm gần dây, hệ thống quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm đã dược phát triển trong ngành công nghiệp thực phẩm. Đây là những hoạt động đi trước và mang tính chất phòng ngừa. HACCP (Hazard Analysis critical control point) là một công cụ quản lý được nhiều nước sử dụng trong quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Nó cũng là cơ sở cho các tiêu chuẩn sải ì phám thực phầm khi buôn bán trẽn thị trường quốc tế. Đê HACCP có hiệu c|uả và thành công, các phương pháp kiểm tra nhanh để th eo dõi là rất cần thlết. Kỹ thuật điện cực sinh học có thể m ans đến cho ngành còn g nghiệp thực phẩ TI một thiết bị theo dõi và d o lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so với các phương pháp truyền thống, Mộ số ứng dụng của điện cực sinh học trong phân tích thực ph ẩm được tóm tắt ở bảng 4.5. Bảng 4.5: ứng dụng của ĐCSH trong còng nghiệp thực phẩm Hợp chất cẩn do Các axit min ứng dụng Alanin, arginin, asparagin, aspartic acid, cystein, glutamin, glutamic acid, glutathion, histidin, leucin, lysin, methionin, N-acetyln lethionin, phenylalanin, sarcosin, serin, tyrosin, tryptophan, valin Các hợ p chất Aminopyrin, cholin, anilin, amin (hơm, acetylcholin, amin, a ■nid, dị phosphatidylcholin, creatin, guanidin, guanosin, penicillin, spermin, vòng creatinin, uric acid, ure, xanthin, hypoxanthin Hydratcac:bon Amygdalin, galactose, glucose, maltose, saccarose, tinh bột Axit hữu cơ acid Acetic, acid formic, acid gluconic, acid isocitric, acid ascorbic, acid lactic, acid malic, acid oxalic, acid pyruvic, acid succ inic, acid nitrilacetic Các rượu và các phenol Acetaldehyd, bilirubin, catechol, cholesterol, cholester Di ester, ethanol, glycerol, glycerol ester, methanol, phenol Các hợp khác Chất kháng sinh, độ tươi của thịt cá vitamin... 196 chất glucose-6-phosphat, lactose, Báng 4.6: Một sỏ ĐCSH ứng dụng trong thương mại ĐCSH Chất xác định Điện cực enzym Glucose, saccarose, fructose, tinh bột, etanol, glycerol Điện cực enzym Độ tươi của nucleotid/nucleosid Công ty sản xuất cá(bằng Enzo Biochem (Mỹ); Fuji, Kyoto, Omeron, Toyoba (Nhặt Bản); Solea-Tacssel (Pháp); Eppendorf (Đức) Pegasus Biote chnology (Canada), Oriental El( ictric Co (Nhật Bản) Điên CƯC H2Ò2/ĐC SH dòng điệ n Glucose Control Equipment NEC (Nhật Bàn) FET Glucose, cồn, lactat, glycerol Ajinomoto Co., Mitsub shi, NEC c 0. (Mỹ), (Nhật Bản) Cực dò 1\DN Salmonella trong thực phẩm Integrated Genetics Mỹ Cực dò (\DN Chlamydia Enzo Biochem (Mỹ) Cực d ò ,\DN Vi khuẩn Hybritech Industries (Mị ) Đo nồng độ glutam in và nồng độ glutam at Sử dụng điện cực đo dòng điện có gắn màng cố định glutamai oxidase dược ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm để định lượng glutamat vì: nồng độ glutamat trong thực phẩm không những chỉ ảnh hưởng đến mùi vị M habpham mà còn liên quan đến khía cạnh an toàn thục phẩm. Các loại như nước xúp, dầu giấm, nước sốt được bổ sung một lượng mono sodiumnatri glutamat (MSG) có tác dụng làm tăng mùi vị nhưng một lượng lớn glutamat có thể gây ra những phản ứng nghiêm trọng ờ một số người như: tim đập nhanh, đau dạ dày. Cilutamat oxidase cũng được đồng cố định với glutaminase đẻ đo nồng độ glutamin dựa trên cơ sờ của phản ứng: Glutaminase Glutamin « — Glutamat + NH, Glutamat oxidase ơtũầhlất Việc đo nồng độ glutamin có ý nghĩa rất quan trọng bới đó là chỉ tiêu đánh giá nguồn nitơ của môi trường nuôi cấy vi sinh vật công nghiệp. 197 Điều đáng chú ý ở đây là glutamat oxidase có hoạt tính tối ưu tại pH=7,8 còn glưtaminase từ E.coli lại hoạt động tại vùng pH axit. Nếu thay thế bàng glutaminase trung tính từ Bacillus cho thấy: cả hai enzym đều có hoạt tính tối ưu tại pH=7 và có tính chịu nhiệt tốt. Màng enzym tạo thành rất ổn định và có hoạt tính tốt để đưa vào sản xuất thương mại. Màng enzym cho kết quả đo đạt tuyến tính đến 8mM glutamin, không đáp ứng với các chất khác (trừ glutamat), và giữ được ổn định ở trạng thái khô trong thời gian ít nhất 6 tháng, ở 4"C. Các kết quả thu được khi sử dụng thiết bị điện cực enzym YSI-2700 và phương pháp HPLC (sắc kí lỏng cao áp) cho thấy những lợi th ế rõ rệt khi sử dụng phương pháp ĐCSH: kết quả đua ra chính xác chỉ sau 30 giây, trong khi phương pháp HPLC đòi hỏi thcâ gian phân tích rất dài. • Đo nồng đô cholin Trong cơ thể cholin là thành phần của phospholiqiđ cấu thành nên màng tế bào và màng của nhiều bào quan trong tế bào, mật khác cholin còn là tiền chất để tổng hợp nên acetylcholin (chất có vai trò chuyển sự kích thích thần kinh) đồng thời cũng là nguồn cung cấp các nhóm metyl trong cơ thể. Choỉin thường được bổ sung vào thức ăn cho trẻ em và các sản phẩm dinh dưỡng cho người lớn. Việc xác định nồng độ choỉin có thể thực hiện bằng phương pháp theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên m ôi trường cơ chất, bằng phương pháp đo quang hoặc sắc kí. Tuy nhiên các phương pháp này thường ít chính xác, thời gian đài và giá thành cao. Điện cực enzym để định lượng cholin được chế tạo dựa trên cơ sở phản ứng oxi hoá cholin xúc tác bởi cholin oxidase: Cholin + 0 2 —> H20 2 + betain aldehyd Betain aldehyd + 0 2 —>■ H20 2 + betain Giá trị của phép đo đạt tuyên tính trong khoảng từ 5mg/l đến ít nhất là 160mg/l khi sử đụng đung địch cholin hydroxyd nồng độ 1Ị lm g/l làm chuẩn. Thời gian thu được kết quả phỉ sau 30 giây và giá rẻ. Giá thành của mỗi phép đo càng giảm khi số lư ợ n g thử nghiệm tăng ỉên. 198 • Đo hàm lượng cồn Hàm lượng cồn được xác định bằng cách sử dụng alcohol oxidase: Alcohol + 0 2 -» H20 2 + aldehyd Tuy nhiên một hạn chế của loại điện cực này là tính không bển của alcohol oxidase ở dạng khô vì vậy cần có biện pháp bảo quản thích hợp dê giữ được tính ổn định của enzym. • P h á t hỉện sự có m ậ t của vi k h u ẩn tro n g thực p h ẩm Loại điện cực này gọi là điện cực sinh học phát quang, nó phát hiện sự có mặt của vi khuẩn trong các loại thực phẩm khi các vi khuẩn này tác dụng đặc hiệu với ATP và chất D-luciferin để giải phóng ra ánh sáng phát quang nhờ tác dụng xúc tác của enzym luciferase: Luciferase ! ATP + D-luciferin -------- ► oxi luciferin + AMP + pyrofrhosphat + C 0 2 + X (562 ran) ánh sáng vàng Đo ánh sáng vàng tại bưóc sóng 562nm, biết được lượng vi khuẩn cần phân tích. • Điện cực miễn dịcb đo hàm lượng albumin, insulin - Điộn cực miễn địch kết hợp với điện cực đo dòng đíộn để xác định insulin hoặc albumin. Cho kháng thể kháng insulin đã biết (lấy từ huyết thanh lợn) lên trẻn một lớp màng đã gắn điện cực oxy để các kháng thể có thể bám vào lớp màng đó, sau đó cho insulin cần kiểm tra lên trên màng và cho tiếp kháng nguyên (insulin) đã gắn cataỉase và bổ sung cơ chất là H20 2, lúc đó sẽ xảy ra phản ứng: E-in$u!in HA _ ------—- — ► H20 + 1/2 0 2 Hậm lượng 0 2 tạo thành được định lượng nhờ điện cực 0 2, từ đó xác định được hàm lượng insulin. - Điện cực miẽn dịch kết hợp với điện cực đo quang. Hình 4.24 minh hoạ một điện cục miễn dịch sử dụng bộ chuyển đổi quang học. Trong đó biến đổi sinh học tạo ra đáp úng quang học thông qua một màng điện cực (sensor chip). 199 Làng kính Nguón sáng A A Bộ lách sóng Sensor ClHf^ Kháng thê D òng đệm S ụ thav diỉi góc ' phán xạ W W K háng nguyên ầ Sơ B đố nguyên ễ Êlý phân S tíchS kháng Ê nguyên ẵ của ẫ điện L cựcT miên Ẽdịch Hình■4.24. kết hợp diện cực quang. ĐiCn cực này được cấu tạo bời ba phần: 1- là hệ thống chiếu sáng VÌ thu nhận ánh sáng phản xạ bởi một bộ tách sóng (detector array), 2- là một màng có gắn kháng thể, 3- là ống bơm mẫu. 1 Khi mẫu có chứa kháng nguyên đi qua, sẽ phản ứng đặc hiệu vói kháng the trên bề mặt sensor chip và do đó làm thay đổi bước sóng và góc phán xạ của ánh sáng chiếu vào mặt bên kia của sensor chip. Đo các thông sô quang học sẽ cho ta nồng độ kháng nguyên có trong mẫu. • Kiểm tra hàm lượng chloram phenicol trong sản phẩm thuý sán Một ứng dụng khác của điện cực miễn dịch đang được ứng dụng vào việc kiểm tra hàm lượng chloramphenicol trong thuỷ sản vốn đang được Cộng đồng Châu Âu (EU) và một số thị trường khác như Mỹ, Canada, Hàn ..........— .. í* 200 I •- Nguyên tốc phương pháp ELISA dựa trên phản ứng kháng nguyênkháng thể. Các giếng được phủ lớp kháng thể kháng kháng thể kháng chloramphenicol (chloramphenicol chuẩn hoặc dung dịch mẫu). Chloramphenicol gắn enzym và kháng thể kháng chloramphenicol được bổ sung vào giếng. Chloramphenicol tự do và chloramphenicol gắn kết enzym sẽ cạnh trạnlvcác, vị ịị £ kẹi i d ^ á n o ^ kMi^gM £|i|o^»T|pF|enico1 (phản ứng miễn dịch enzym cạnh tranh). Đồng thời các kháng the kháng chloramphenicol cũng được cố định lại bới các kháng thể phủ trén thành giếng. Chloramphenicol kết gắn enzym thừa ra sẽ dược loại bỏ bằng cách rửa. Bố sung vào giếng cơ chất của enzvm (ure peroxit) và chất tạo màu (tetrametyl benzidin) và ủ. Enzym gắn kết sẽ chuyển hoá chất tạo sác vốn không màu thành sán phẩm có màu xanh. Khi bổ sung chất kết thúc phán ứng sẽ chuyển từ xanh sang vàng. Đo cường độ màu trên máy đo màu quang điện ở bước sóng 450 nm. Cường độ màu tỉ lệ nghịch với hằm lượng chloramphenicol có trong mẫu. Cơ chế phản ứng sử dụng thiết bị ELISA để kiểm tra chloramphenicol dược minh họa trong hình 4.25. Trên khay có phủ sẩn lớp kháng thê kháng kháng thê chloram phenicol 1. Pha loãng mau có chứa chloramphcnicol dom ú với sự có mặl khang Ihd, nó sẽ gắn 2. Bổ sung enzym kết gắn chloramphenicol và kháng thể kháng chloramphenicol dcm ú. Xáy ra sụ cạnh Iranh 3. Bổ sung cơ chất của enzyme vã chất tạo màu. dem ú. c n io n tm p r K enzym với I chloramphenicol tự do ớ I vị trí gắn kháng thế màu. Đo màu biết hàm lượng chất cần đo. Hình 4.25. Cơ c h ế phản ứng sử dụng điện cực miễn dịch kiểm tra hàm lượng chloram phenicol. 201 Giai đoạn ủ được thực hiện trong máy ủ ổn định nhiệt độ. Kết quả phan ứng được đọc bàng máy đọc theo nguyên tắc so màu và so sánh với đồ thị chuẩn để xác định nồng độ kháng sinh. Phương pháp này có thể phát hiện chloramphenicol ở nồng độ 0,05 ppb. Tuy nhiên đây cũng chỉ là một phương pháp bán định lượng. Loại thiết bị này còn được sử dụng để kiểm tra một số chất khác bằng các loại chất chuẩn khác nhau (các kit chuẩn) với giới hạn phát hiện rất thấp như nêu trong bảng 4.7. Bảng 4.7 Loại kit Giới hạn phát hiện •Chloramphenicol - Mầu sữa 0,15 ppb ' Mẫu thịt, trứhg 0,10 ppb • Mâu tôm 0,05 ppb 'ClenbLrterol - Mẫu nuớc tiểu 0.1 ppb - Mẫu thịt 0,04 ppb *Diethyjstilbestrol 0,02 ppb 'Histamin • -Cá tuyết 20 ppm •Bột cá 125 ppm Xác định hàm lượng mycotoxin trong ngũ cốc và thực phẩm Mycotoxin là độc tố sinh ra trong quá trình phát triển của nấm mốc có mặt trong các sản phẩm như: lạc, ngũ cốc, hoa quả. Chúng cũng có thể xuất hiện trong thức ăn gia súc. Gia súc khi ãn các thức ăn này, độc tố mycotoxin có thể đi qua quá trình trao đổi chất rồi có mặt trong các sản phẩm của chúng như: trứng, sữa, thịt. Có nhiều phương pháp xác định mycotoxin ưong đó có phương pháp xác định bằng điện cực miễn địch đang được sử dụng rộng rãi. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên, kháng thể. Một nồng độ cố định của kháng thể được trộn với mẫu 202 cần phân tích có chứa hàm lượng mycotoxin chưa biết. Kháng thể và mycotoxin sẽ tạo thành phức. Điện cực sẽ xác định nồng độ kháng thể tự do (không tạo phức với mycotoxin). Dựa vào đồ thị mycotoxin chuẩn có thể định lượng được mycotoxin có mặt trong mẫu cần phân tích.: Các kháng thể được sử dụng trong phương pháp này là kháng thể đơn dòng. 4.4.2. ứ n g dụng trong môi trường Các điện cực enzym sử dụng trong phân tích môi trường có thể chia thành ba nhóm dựa vào đặc điểm của m ột phản ứng enzym: - Nhóm thứ nhất: các chất được định lượng là cơ chất của phản ứng enzym. - Nhóm thứ hai: các chất đuợc định lượng là các chất kìm hãm hoạt tính xúc tác của enzym. Ví dụ: Các hợp chất cơ phospho và cacbamat, Nhóm thứ ba: Nồng độ các ion kim loại được phát hiện nhờ vào việc chúng liên kết với phần “apoenzym” do đó phục hồí hoạt tính của enzym. • Định lượng ion kim loại nặng Các enzym thuộc nhóm metalloenzym cần có các ion kim loại tham gia vào trung tầm hoạt động để duy trì đuợc hoạt tính xúc tác của enzym, do đó khi các ion kim loại này bị tách ra khỏi enzym (ví dụ: do tác dụng của tác nhân tạo phức) thì sẽ làm mất hoạt tính xúc tác của enzym. Hoạt tính xúc tác của enzym có thể phục hồi khi cho enzym tiếp xúc với môi trường chứa ion kim loại thì ion kim loại sẽ thu hút lại vào trung tâm hoạt động của enzym. Do đó có thể định lượng được nồng độ kim loại nặng trong mẫu thông qua việc xác định hoạt độ xúc tác cỏa enzym tạo thành sau khi cho phần “apoenzym” đã được cố định tiếp xúc với mẫu. Ư u điểm của phương pháp này là có thể phát hiện các kim loại ở nồng độ rất nhỏ (/smol) và có thể phát hiện được bất kỳ một kim loại nào có mặt trong nhóm metalloenzym. 203 Báng 4.8: Giới thiệu một số diện cực xác dịnh ion kim loại (m m ol/l) Điện cực NH3 Urease Hg(H) Nống độ Điện cực Enzym Kim loại 0-150nm/l Tác giả Orgen và Johansson, 1978 Zn(ll) so 2,3%) OCUUI1VC Atoki, 1990 0 ,01 - 1,0 Satoh, 1991 0 , 1- 1,0 (sai Satoh, 1991 R M SFfcT kiềm Zn(ll) Apoenzym: Điện cực nhiệt phosphatase điện trở kiểm Cu(ll) Cu(ll) Apoenzym: điên Galacto oxidase PƯAg/AgCI CƯC số 7%) Apoenzym: điện cực 0 2 < 0 ,5 Mattiass on, 1979 Tyrosinase Đ ịnh ; lư ự n g phenol ộc phân tíc h nồng đ ộ các hợp c h ấ t phenol dựa trên các phản ứng: tyrosinase (polyphcnoloxvda.se) Pì lenol + 0 i + 2H+ --------------- --------------- > ortodiphenol „ or odiphenol + 02 0 - q u in o n + F e ( C N )6 B ả n g 4.Í>: tyrosinase ------------------------► orto-quinon --------- -— --------- ► o rto diphenol + F e (C N )6V Điện cực dùng tyrosinase Điện cực Nống độ phát hiên (nmol/l) Điện cụrc graphit với TCNQ 0,23-0,65 Điên curcOj (Clark)’ 1-46 (trong hexan) 5-190 (trong dd đèm) Sai số 4,4% (trong hexan) 7,2% (trong dd Thời gian Tá : giả 12-35 giây Kulys VJ Schmid (1990) < 2 phút Campar ella (1992) đệm) Điện cực 0 2 (Clark) 204 0,1-5 (trong dd đệm + cloroform) 3 phút Schubert (1992) • Đ ịnh lượng phosphat, n itrit, n itraỉ, sulphat Các hợp chất này ngày càng có mặt nhiều trong mòi trường, đặc biệt là trong nước uống. Sự gia tăng nguồn nitơ, phospho trong nước có thế gây ra hiện tượng phì dưỡng, gây mất cân bằng sinh thái (Theo tiêu chuẩn EC, nồng độ cho phép của phospho là: 5mg/l P20 5). Nồng độ của phospho thông thường được xác định bằng phương pháp đo màu. Tuy nhiên, nồng độ của phospho trong nước cũng có thể được định lượng bằng các điện cực en/.ym. Theo Kubo (1991), nồng độ phospho có thể xác định bằng cách sứ dụng điện cực pyruvatoxidase: pyruvatoxidase từ PedịococciiS xúc tác sự oxi hoá pyruvat trong điều kiện có mặt phosphat và 0-, đểtạo thành acetylphosphat, hydro peroxid và C 0 2. Lượng0 , tiêu thụ được dùng đế định lượng phosphat: OH i-o, // o CI ỉ -CO COO H + o = P < J-O H + — ► CH,C \ + H20 2 + c o , \0 H p khử Các hợp chất nitrat, nitrit có thể định lượng theo phản ứng oxi hoá I xúc tác bới nitrat và nitritreductase: Nilraireducta.sc N O /+ 2 H + + ---------------------- ► N 0 2 + H 20 Nilriircductasc N H / + 2HọO N 0 2- + H+ i OH NH, Bảng 4.1C . Định lượng nitrit, nitrat, sulphat Chất Enzym Điện cực chỉ thị Giới hạn phát hiện (mmol/l) Tác già Nitrit Nitrit reductase Điện cực NH3 50 Kiang (1 975) Nitrat Nitrat reductase và Nitritreductase Điện cực NH„ 50 Kiang (1975) Sulphat arylsulphatase Điện cực Pt 100 Cserfalvi và Guilbaut (1976) 205 Bảng 4.11. Điện cực enzym định lượng phosphat Thời Tính ổn định Nồng độ (ịiíĩiol/l) Sai số % Điện cực chỉ thị gian đáp ứng (phút) Phosphotase kiềm {EC 3.1.3.1) và gluco-oxidase (EC 1 1.3.4) Thấp nhất: 10'4 M 5,9 h20 2 5-10 Nuclosídphosphorylase và Xanthin-oxydase 0,3-1,0 mmol/l 10 02 3 >70 TN/30 ngày Watanab e 1988 10-250 Nuclosid phosphorylase (EC 2.4.2.1) và Xanthiri oxidase (EC 1.2.3.22) 5,9 điện cực 2 30 thí nghiệm Haemme rli 1990 Pyrưvat oxidase (EC 1.2.3.3) 5.9 7 ngày Kubo (kha nâng đáp ứtìg giảm 50%) 1991 Enzym 12-80 0,5-100 Nuclosid phosphoiylase (EC 2.4.2.1)và Xanthin >100 TN/3 tháng h 20 2 điên CLfc 7 o2 5 điện CƯC 02 ' 1,5 Tác già Gưilbault và Nanjo 1975 >8 Wollenbe ngày/300 rger 1992 oxidase (EC 1.1.3.22) • Đ ịnh lượng các c h ất độc Các loại thuốc trừ sâu cơ phospho có độc tính rất cao, ngoài tác dụng độc sơ cấp, chúng còn làm biến đổi các quá trình trao đổi chất của tế bào bằng cách tác dụng lên các enzym thiết yếu như esterase, oxidase, phosphorylase, dehydrogenase. Theo tiêu chuẩn EC, nồng độ tối đa cho phép của dư lượng các chất này trong nước uống là 0,1 |Ẩg/l đối với mỗi loại riêng biệt và 0,5 Ịig/1 đối với hỗn hợp. Việc xác định nồng độ các chất này thưòng được thực hiện qua hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLG) hoặc sắc ký khối phổ (GC/MS) đòi hỏi thiết bị phức tạp, đắt tiền và trình độ kỹ thuật cao. Dựa vào đặc điểm các chất này thường kìm hãm enzym cholinesterase do đó có thể định lượng được nồng độ của chúng bằng cách xác định hoạt độ của enzym sau khi cho tiếp xúc vối mẫu nước, kết quả thu được có thể xác 206 định được nồng độ các chất này đồng thời có thể đánh giá được khả năng gây độc của chúng. Quá trình thuỷ phân cholin bởi cholinesterase như sau: CH?-CO-S-(CH2)2-N+-(CH,), Axetylthíocholin CH,COO + HS-(CH2)2-N+-(CH,), axetat thiocholin HS-(CH2)2-N+-(CH*)3 * = £ -S-(CH2)2-N+-(CH.,).,+ h + Phản ứng oxi hoá tạo thành ìon H+, trẽn cơ sở đó có thể dùng điện cực pH hoặc dùng phương pháp oxi hoá thiolcholin tại điộn cực Pt để xác định hoạt độ enzym. Bảng 4.12: Giới tbiệu một sổ điện cực dùng cholinesterase Giới hạn phát hiện (iig/l) Tác giả 1ppm carbofuran 4ppm carbaryl 0,2ppm paraoxon Kumarand Trần Minh 1992 - Acetylcholin - Bưtyrylcholin clorua 8ppm methylpáraoxon Durand 1984 - AChE -Acetyícholín clorua 3,2 parathion SchwedtHauck 1998 . Điện cực thuỷ tinh hoâc Pd/Pdò (pH) -AChE (EC 3.1.1.7) -Acetylcholín clorua 10 9M paraoxxon, methyl parathion 1ữ10M malathìon Trần Minh 1990 Điên cưc Pt (H À ) -AChE (EC 3.1.1.7) -ChO (EC 1.1.3.17) - Acetylcholirv chotin 2 paraoxort Bernebei 1991 Điên CƯC Pt <HaOi) -AChE (EC 3.1.1.7) - ChO {EC 1.1.3.17) - Acetylcholin clorua - Cholin clọrua 10nM paraoxon Marty 1992 Điện cực chỉ thj Enzym Điện cực thủy tinh - BuChE (EC 3.1.1.8) - Bưtyrylcholin clorua Điện cực pH - AChE (EC 3.1.1.7) - BuChE (EC 3.1.1.8) Điện cực pH Cơ chất ỉ 207 Trong các ứng dụng trên, sử dụng ĐCSH đe xác định tiư lượng thuốc trừ sâu hay xác định vi sinh vật có trong nguyên liệu hay sản phẩm thực phẩm là những ứng dụng rộng rãi nhất. • Sứ dung kỹ thuật ELISA trong xác định dư lượng thuốc trừ sâu Kỹ thuât ELISA dược sử dụng phổ biến trong phân tích các phân tử nhỏ như thuốc trừ sâu là competitive ELISA (ELISA cạnh tranh) theo hai phương thức trực tiếp (cd ELISA-competitive, direct ELISA) và gián tiếp (ci HI.ISA- competi ive, indirect ELISA). Hình 4.26 và 4.27 sẽ minh họa hai kỹ thuật trẽn. - Trong cd ELISA, kháng thể dược cố định trên bề m ật các giếng giá thể rắn, cho mẫu thuốc trừ sâu có hàm lượng nhất định đã được gắn enzym và thuốc trừ sâu cần phàn tích vào các giếng này,chúng sẽ cạnh tran 1 để hám vào kháng thể. Sau một thời gian phản ứng. các chất còn dư sẽ bị rửa trôi.Cuối cùng,cơ chất được cho vào,cơ chất này sẽ bị enzym xúc ác và tạo ra các san phẩm có màu sắc. Cường độ màu tỷ lệ nghịch với lượng thuốc trừ sâu cần xác định trong mẫu thí nghiệm. Nếu thuốc trừ sâu nhiều thì lượng cộng hợp enzym do tính cạnh tranh kém hơn sẽ bị giữ lại ít, màu yếu và ngược lại. Tính toán theo phương pháp sau sẽ tìm ra được h un lượng chính xác. • T ính toán kết quả Két quả cho thấy nồng độ chất cần phân tích càng tăng thì mật độ quang càng giảm. Người ta chọn cách dung dường chuẩn cho phương pháp ELISA như sau: trục X sẽ thể hiện nồng độ chuẩn, chia độ theo logarit. Trục y sẽ thế hiện phần trăm ức chế được tính theo công Ihức dưới đây: C1 úc che = 1- 100 Trong đó: A- mật độ quang của mẫu (hoặc chuẩn); Au,nm không có ■ninii,i rnật mật độ quang của cùa đối chứng âm, nghĩa là kl chất cần phân tích, đây là mật độ quang cao nhất; AWankmật độ quang của giếng blank. 208 Nồng độ Hình 4.26. Đường chuẩn điển hình của Elisa. Trong kỹ thuật ciELISA, các giếng được phủ một lớp thuốc trừ sâu liên kết protein, còn thuốc trừ sâu cần xác định được thêm vào với một lượng kháng thể (antibody) cố định. Để một thời gian, thuốc trừ sâu cần phân tích (kháng nguyên) và thuốc trừ sâu liên kết sẽ cạnh tranh bám vào các kháng thể,lượng thuốc trừ sâu càng nhiều thì lượng kháng thể bị thuốc trừ sâu liên kết protein giữ lại càng ít. Sau rửa trôi các chất còn dư,dùng một lượng kháng thể thứ hai có gắn enzym để phát hiện lượng kháng thể ban đầu được giữ lại bằng cách cho cơ chất vào,chuyển hoá tạo ra các sản phẩm có màu.Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng chất cần xác định trong mẫu ban đầu. Phương pháp này có ưu điểm là giá thành rẻ và dễ tự động hoá. Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp này là trong một thời gian chỉ phát hiện được một loại thuốc trừ sâu (one pesticide at a time). • Điện cực đếm vi sinh vật Theo các phương pháp truyền thống, số lượng và loại vi sinh vật được xác định bằng các thí nghiệm vi sinh. Một sô' phương pháp trong các phương pháp đó thường tốn nhiều thời gian, đặc biệt khi xác định các vi sinh vật gây bệnh, như xác định Salmonneìỉa và Listeria sp. Ví dụ, khi xác định Salmonella, trước tiên cần 24 giờ để làm môi trường, làm cho vi sinh vật cần xác định từ trạng thái tĩnh trong thực phẩm trở thành dạng hoạt động. Sau đó canh trường được ủ để Salmonella phát triển. Sau 24 giờ phát triển, cấy môi trường có chứa vi sinh vật sang đĩa thạch. Một hoặc hai ngày sau, xác định 209 lượng Salmonella. Nếu cần xác định các đặc tính sinh học khác thì phài cấy sang một số môi trường khác nữa. Kẽì quả tìm ra được các loại như kháng thể somatic (O) hay flagellar (H). L*«••••»»4*< •••«••«• *«•« Kháng thể itặu hiệu dược phú Irén ị;iẽng giá Ihc Chùi phản tích ■> dã kết hơp tnzym (cộng hợp enzym) ......... ....... .......... .... cíĩât oán phsri tích và cọng hiipenzyni cạnh Iranh dể bám vào giá_thể 9 (£ M Rửa Ĩĩtii Kháng thể thứ n h íl các chất còn dư Polyslyrcn 4. Cho ei* chất cùa enzym © Chit phân lích chưa biết (Antigen) Síiti phám màu Enzym xúc tác tạo sán phẩm màu © Co chat Hình 4.27. Giổi thiệu thí nghiệm ELISÀ cạnh tranh trực tiếp (cd ELISA). 210 ! .Cộng hợp khán*-; nguycnpru te in dược phu trèn giá thó răn ỚCị ớ ữ 2. Kháng nguycn tự do và liên két cạnh tranh bám vào kháng thê 3.Bồ sung kháng thề thứ 2 gấn enzyme dé phát hiện lượng kháng thé đầu đưực giữ lại 4. Bổ sung cơ chất cùa enzym dé tạo sán phẩm màu ý ^ i Mò phỏng chát cán phân tích Ổ1 Kháng nguyÊn liên kết protein Ị Ị Enzym liên kết vào kháng ihể Ihứ hai Polystyren d V Kháng thể Ihứ nhất Cơ châ’1tạo sản phẩm màu Hình 4.28. Giới thiệu thí nghiệm ELÍSA cạnh tranh gián tiếp (ri ELISA). 211 Phương pháp trên chính xác nhưng để xác định cần khoảng 5 ngày và kết quả đua ra chỉ mang tính chất định tính. Các dụng cụ phân tích nhanh hơn thuộc loại “phân tích miễn dịch enzym” (EIA) đã được sử dụng để xác định Salmonella, Staphylococcus và các nội độc tố. Một phương pháp nhanh hơn để xác định vi sinh vật có thể đạt được bằng cách thay đổi môi trường chọn lọc. Mẫu thực phẩm được xử lý bằng enzym để đạt tới một kích thước nhất định, sau đó nó được lọc trên màng lọc kẻ ô kỵ nước HGMF (hydrophobic grid membrane filter) để chuẩn bị cho bưóc xác định tiếp theo. Các hệ thống thu nhỏ như API, Enterrotek hay M initek spectrum 10, Micro ID được sử dụng để xác định và đang được bán trên thị trường. Một hướng tiếp cận khác là thay đổi các bước làm dịch mẫu, trang trên đĩa thạch. Từ đó phương pháp dễ tự động hoá và do đó sẽ nhanh hơn. Loại spiral Plater (Spiral System, Bethesda, MD) và các thiết bị đếm tế bào vô tính điện tử (Fisher Scientific, Biomatic, artek, Biotran) là những tiến bộ của các thiết bị tự động. 4.4.3. M ột số công nghệ mới của điện cực sinh học Trong những năm gần đây, một số dụng cụ thiết bị hiện đại đã được nghiên cứu và chế tạo dựa trên nguyên lý của ĐCSH. Những ĩhiết bị đó đã được ứng dụng có hiệu quả hoặc sẽ có những ứng dụng rộng răi hơn, hiệu quả hơn ưong công nghiệp thực phẩm, cũng như trong các ngành công nghiệp khác trong một tương lai gần, như kỹ thuật điện tử, Flow Cytometry, kỹ thuật cực dò ADN hay in mẫu phân tử (molecular imprinting), trong đó kỹ thuật cực đò ADN và kỹ thuật in mẫu phân tủ được sủ dụng hiệu quả hơn cả. • Cực dò ADN Các kỹ thuật tái tổ hợp ADN và cấc chuẩn đoán đựa vào cực dò ADN ngày càng đóng vai trò quan trọng trong xác định vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Các kỹ thuật này dựa trên sự phân cắt có chọn lọc ADN bằng các endonuclase giới hạn và dựa trên sự địa phương hoá các chuỗi nucleotide đặc trưng sau khi kết hợp với các đoạn ADN hoặc ARN đã được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ (ví dụ như ?2P, !2Ì , ” s, 'H), bằng đánh dấu huỳnh quang (như sử dụng các chất florexen, rodami, ethidi, phức càng cua của đất hiếm), bằng đánh đấu phát quang (như các dẫn xuất của luminol, acridinium 212 ester, luciferen) hoặc các enzym đánh dấu (như phosphatase kiềm, peroxidase cây cải ngựa) và cũng có thể sử đụng kết hợp hai hay nhiều cách trên. Như vậy, các hộ thống phát hiện sinh học được sử dụng trong lĩnh vực miễn dịch cũng có khả năng sử dụng trong cục dò ADN. Cực dò ADN được chế tạo từ các chuôi đơn và có thể liên kết với các ADN hoặc ARN bổ sung. Chuỗi xoắn kép có thể dễ dàng được tách ra bằng nhiệt độ hoặc pH cao, sau đó nó được cho iai để tạo ra một chuỗi xoắn kép mới dưới những điều kiện nhất định. Sự lai này không phụ thuộc vào toàn bộ thành phẩn của ADN (phần trăm của từng bazo nitơ trong ADN) mà phụ thuộc vào sự sắp xếp của chuỗi các bazơ nitơ. Sự lai hay kết hợp đó của các chuỗi ADN đơn mang tính đặc trưng riêng cao và biểu hiện tuơng tự như biến đổi gen. Để phát hiện các chất, kỹ thuật sử dụng các chất đánh dấu và phương pháp phát hiện các đầu dò. Các phương pháp đánh đấu dược sử dụng như sử đụng đồng vị phóng xạ, phát quang hay enzym đánh dấu. Thiết bị phát hiộn dấu có thể là các thiết bị đếm các đốm phát sáng. Một chuỗi ADN đầy đủ sử dụng làm một cực dò có được bằng cách sinh sản vô tính một gen đặc biệt trong vi khuẩn, mà loại vi khuẩn đó ta cần xác định. Đây là việc khó thực hiện và thường tìm ra bằng các thử nghiệm. Có trường hợp các chuỗi ADN không liên kết với các chuỗi ADN khác. Công nghệ này cần tìm ra một hướng tiếp cận mới để có thể có khả nãng phát hiện có tính đặc trưng cao các vi sinh vật trong bất cứ một môi trường nào. Quá trình chung được thể hiện trong sơ đồ sau (trang 214). Cực đò ADN cũng có thể được tạo ra từ mARN bằng cách sử dụng một enzym phiên mã ngược. Sau khi một cực dò ADN thích hợp được chọn lựa, axil nucleic được chuẩn bị cho việc lai. Một gen vô tính hay một chuỗi ADN đã đựợe phân lập từ tế bào bời enzym giới hạn được đưa tới và chúng trở thành các cục để phát hiện ra các đoạn ADN của các chuỗi tương tự. Các vi khuẩn vô tính được tái tạo trên bộ lọc nitrocellulose và bị phân giải bằng NAOH 0,5 M vạ N A Ơ 1,5M đổ biến tính ADN, tiếp đó lắc trong 2 giờ ở 8Ơ’C để đảm bảo ADN vẫn gắn trên bộ lọc. Bộ lọc được gắn với các cực đò đã được đánh dấu phóng xạ. Các chuỗi ADN liên kết với cực dò ADN và được phát hiện bởi .phóng xạ. 213 Ị Mẫu (đoạn ADN hay gen vô tính) ■ Cố định lên màng hoặc giá thể (ví dụ: nitrocellulose) ..... — ị------------------------1 ị....... Giải phóng mạch kép ADN hay biến tính ADN để t ao ra ADN đơn (dùng NalĨ)H 0,5 M) Sắp xếp các chuỗi đơn, cho qua bô lọc, lắc ở 80 c . Ị Liên kết ADN với S2P đã có gắn chuỗi đcm ADN đánh dấu - -J *--------------- 1 Rửa để loại bỏ Cííc phần không liên kết và phát hiện c ác liên kết đã được đánh dấu trên rrlàng bằng thiết bị chụp phón g xạ tự động • Cồng nghệ ỉn mẫu phân tử Công nghệ in mẫu phân tử có thể giúp giải quyết một sô' vấn đề liên quan đến các yếu tố phát hiộn sinh học. Công nghệ này cung cấp các polyme tổng hợp có đặc tính phát hiện phân tử có chọn ỉọc. Sở dĩ các polyme có được đặc tính này là do trên phân tử polyme cỏ các vị trí phát hiện, có hình dạng và các nhóm chức bù trừ được cho các chất cần phân tích. Một số polyme còn có độ chọn lọc cao và ái lực không đổi, có thể so sánh được với các hệ thống phát hiện tự nhiên như các kháng thể hay các thụ thể. Vì vậý các polyme này tương hợp được với các cấu tử trong điện cực nhái sinh họe (biomimetic) Sự nhận biết của các phân tử giữa một phân tử chất tiếp nhận hay chất chủ và một cơ chất hay chất khách chỉ cổ thể xảy ra vị trí liên kết của các 214 phân tử “chủ và khách” bổ sung cho nhau về hình dạng kích thước và nhóm chức hoá học. Trong tự nhiên thì đó chính là các hệ thống sinh học như enzym - cơ chất, kháng thể - kháng nguyên, hay boocmôn - chất tiếp nhân. Như chúng ta đều biết, các quá trình phân tích phụ thuộc nhiều vào độ tin cậy và độ nhạy của các yếu tố phát hiện sinh học như các kháng thể, thụ thể hay các enzym. Vì vậy, bàng cách tổng hợp để tạo ra các bản sao của các yếu tố irẽn có tính ổn định cao là một tham vọng có thể thực hiện được. Đó là sự chế tạo các polyme đã được in mẫu phân tử (Molecularly Imprinted Polymers - Mips). In mẫu phân tử là một phương pháp tổng hợp đã biết trước các vị trí phát hiện cũng như độ chọn lọc đối với từng chất khác nhau. Thường có thể đi theo một trong hai hướng sau: Hướng J: Bao gồm các phức: “chủ - khách” được tạo ra bằng các tương tác yếu (như tương tác ion, tương tác kỵ nước hay liên kết hydro) giữa chất phân tích và monome tiền thân. Các phức này được tạo ra trong pha lỏng, sau đó được polyme hoá để tạo nhiều liên kết ngang. Sau khi loại bỏ các phân tử in khỏi khuôn, các vị trí phát hiện khuyết đặc trưng vói các phân tử in đã được tạo ra. Hình đạng của các vị trí đã tạo được trên polyme và sự sắp xếp của các nhóm chức trong các vị trí phát hiện sẽ tạo ra ái lực với các chất cần phân tích. Hướng 2: Các liên kết đồng hoá trị mạnh như liên kết este min... được tạo thành giữa các monome và các phân tử in trước khi polyme hoá. Do đó trước khi thực hiện in cần phải tạo dẫn xuất giữa các phân tử in với các monome. Sau khi phân cắt các liên kết đồng hoá trị giữa các phân tử in trên khuôn thì các vị trí phát hiện bổ sung với các chất cần phân tích đang ở trên polyme. Kỹ thuật Mips đã thực hiện thành công đối với các chất như: protein, dẫn xuất axit amin, đường và các dẫn xuất của đường, các vitamin, các nucleotit thuốc trừ sâu và một lượng lớn các dược phẩm. Liên kết của mội số polyme có thể so sánh với các liên kết tự nhiẻn của một số kháng thổ. Ưu điểm của Mips là có thể tạo ra đuợc ái lục cao giống như các kháng thể, độ bén lâu và có khả năng chống chịu với các môi trường hoá học. Hơn nQa đặc tính phát hiện của chúng không bị ảnh hưòng bởi axit, bazơ hay nhiột. 215 Hạn chế của Mips là khả nãng đáp ứng châm, thời gian dài (15-60 phút). Điều này có thể khắc phục bằng cách tối ưu hoá độ chọn lọc của polyme. Tuy nhiên độ nhạy của chúng kém hơn nhiều so với hệ thống <ự nhiên. Mặc dù vậy, với những cải tiến của Mips sẽ tăng độ nhạy và sẽ ứng dụng rộng rãi hơn trong tương lai. Hiộn nay, Mips đã được ứng dụng để phân tích m ột số chất sau. Bảng 4.13. Một số ví dụ của cảm biến nhại sinh học dựa trên Mips. Chất phân tích Morphin Vitamin K1 Phenylalanin anilid Dansyl-L-phenylalanin Atrazin Sialic acid Phạm vi phân tích (iig/ml) 0-10 0-4 33-3300 0-30 Ọ-0,5 0-3 Thiết bj chuyển đổi Đo dòng điên Đo điện thế Huỳnh quang Đo độ dẫn điện Huỳnh quang 4.4.4. ứ n g dụng trong Y tế Điện cực enzym có rất nhiều ứng dụng trong việc phát hiện, chẩn đoán và theo dõi sức khoẻ người bệnh. Ngày nay, nó còn được xem như một công cụ hữu hiệu trong lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ tại nhà với rất nhiều những tính năng hứa hẹn trong tương lai. • Đo nồng độ glucose: Hàng nãm trẽn thế giới có hàng triệu ngưòi mắc bệnh tiểu đường. Đây là chứng bệnh mà người bệnh mất khả nãng kiểm soát nổng độ glucose trong máu dẫn đến sự quá tăng đường huyết, có thể gây tử vong do quá ít glucose đến được não. Việc điều trị bệnh tiểu đường đòi hỏi người bệnh phải được theo dõi thường xuyên hàm lượng glucose trong máu. Do đó yêu cầu đặt ra là phải phát triển một thiết bị cho phép ngưòi bệnh có thể tự theo dôi được ở nhà. Chỉ có điện cực sinh học vói khả năng chính xác, rẻ, có thể sử dụng lại và đáp úng được các yêu cầu trên. Các loại điện cực đo nồng độ glụcose hiện nay rất (ỉa dạng có thể hoạt động theo các nguyên tắc như điện cực đo dòng điện, điện cực đo quang, 216 nhưng đều dựa trèn phản ứng xúc tác oxi hoá glucose của glucooxidase (GOD). Trong đó đáng chú ý là loại thiết bị cầm tay với loại chip chế tạo tròn cơ sở cua điện cực chọn lọc ion và điện cực đo dòng điện, kích thước nhỏ, dễ mang theo, tiện sử dụng. _ SOO-silicon polycarbonate 5000-protein, buffers, GOD 40-Silaceous glass 350-iridium __________ 1000-titanium_________ Silicon dioxide Silicon Hình 4.27. Cấu tạo điện cực màng i-STAT glucose biosensor. • Đo nồng độ ure Việc kiểm tra nồng độ ure trong máu, đặc biệt đối với những người mắc bệnh thận có ý nghĩa quan trọng. Thiết bị này hoạt động trên nguyên tắc điộn cực đo điện thế, ure bị thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của urease: (NH3)2CO + 3H20 -► C 02 + 20H- + 2 N H / Nồng độ ion NH4+ tỷ lệ với nồng độ ure được đo bằng cách dùng một lớp màng thấm chọn lọc ion NH4+. 2 Ỉ7 CHƯƠNG 5 THIẾT BỊ« PHẢN ỨNG ENZYM _______ Thiết bị phản ứng enzym là nơi diễn ra các phản ứng chuyển hoá các hợp chất nhờ sự xúc tác của enzym. Thiết bị phản ứng enzym gồm một hay nhiều binh phản ứng nối tiếp nhau với các bộ phận hỗ trợ như cánh khuấy hay khối vật liệu đệm. Các thiết bị phản ứng được lựa chọn và sử dụng tùy theo đặc điểm của từng phản ứng hoặc quá trình sử dụng. Chúng ta sẽ xem các dạng cơ bản và phương thức hoạt động của thiết bị enzym: thiết bị phản ứng dạng bình, dạng cột, dạng màng, thiết bị cho enzym tự do, enzym cố định, thiết bị hoạt động liên tục hay gián đoạn. 5.1. T H IẾ T BỊ PH Ả N ỨNG G IÁ N ĐOẠN Thiết bị phản ứng enzyme gián đoạn (stirred tank reactor - STR) thường gồm một bình phản ứng có trang bi bộ phận khuấy và các tấm ngăn làm tăng hiệu quả khuấy. Nguyên tắc hoạt động chung của các thiết bị là dung dịch cơ chất được đưa vào bình phản ứng theo từng mẻ. Sau một thời gian khuấy, phản ứng enzym kết thúc, toàn bộ dung dịch phản ứng enzym được lấy ra khỏi thiết bị. Như vậy, cả enzym và cơ chất đều có một thời gian lưu như nhau trong thiết bị. Trong một số trường hợp, người ta có thể bổ Hềnh 5.1. Sơ đố thiết bị phản ứng gián đoạn. 218 Sling thêm enzym hóậc cơ chất để phản ứng diẻn ra triệt để (fed-batch operation). ư u điểm lớn nhất của thiết bị gián đoạn là thiết lập và vận hành quá trình đơn giản. Thiết bị gián đoạn thích hợp cho sản xuất ở quy mô nhỏ các sản phẩm có giá trị cao, đặc biệt là cùng một thiết bị có thể dùng cho nhiều giai đoạn phản ứng chuyển hoá các vật liệu khác nhau. Thiết bị gián đoạn cho phép tiến hành các phản ứng trong điểu kiện môi trường gần giống nhau, thích hợp cho các phản ứng chậm, với các thành phần phản ứng được kiểm soát chật chẽ trong điều kiện phản ứng thay đổi theo thời gian(pH, nhiệt độ, nồng độ coenzym). Dạng thiết bị phản ứng gián đoạn thích hợp sử dụng khi các quá trình liên tục không thể thực hiện được do độ nhớt dịch phản ứng quá cao hoặc bản chất hỗn hợp phản óng không thích hợp. Thiết bị gián đoạn thường dùng cho các phản ứng sử dụng enzym dạng tự đo và ảnh hưởng của việc tạp nhiễm là không lớn. Phản ứng ưong thiết bị gián đoạn có đặc điểm là vận tốc phản ứng enzym giảm dần do nồng độ cơ chất giảm dần. Nống độ sản phẩm tăng lên theo thời gian phản ứng sẽ ảnh hưởng kìm hãm vận tốc các phản ứng enzym bị ức chế bởi sản phẩm cuối. Năng suất phản ứng trong thiết bị gián đoạn có thể tính loán khi coi phản ứng enzym là không thuận nghịch và tuân theo mô hình MichaelisMenten trong trường hợp enzym không bị ức chế hoặc không bị biến tính: v = v ~ = -Ymn^L v - V‘d t ~ K m+ S (5 với Vs - thể tích dung dịch cơ chất. Tích phân vái diều kiộn biên s = S(, tại t=tfl ^ T ‘ t = SRX - K mln(l-X ) (5.2) vs với X = - phân đoạn cơ chất được chuyển hóa tại thời điểm kiểm soát. Động thái phản ứng enzym trong thiết bị phản ứng gián đoạn được trình bày trên hình 5.2. 219 Thời g ian p h ân ứ n g tiâu ch u ẩ n Hình 5.2. Động thái phản ứng enzym trong thiết bị phản úmg gián đoạn. Các thiết bị gián đoạn có nhiều nhược điểm. Chi phí vận hành của thiết bị gián đoạn cao đo các khâu đưa vào hoặc lấy dịch phản ứng ra khỏi thiết bị. Ngoài ra, khi vận hành thiết bị gián đoạn, điều kiện phản ứng thay đối suốt trong quá trình phản ứng cũng như có thể thay đổi theo từng mẻ. Điều đó làm cho khả năng điều khiển và nâng cấp thiết bị trở nên khó khăn. Phản úng chuyển hóa s -> p với điều kiện S,/Km= 10. Thời gian phản ứng tiêu chuẩn là thời gian cần thiết để tất cả cơ chất được chuyển hóa thành sản phẩm với vận tốc phản ớng Vmai. Trong thực tế, thời gian phản ứng sẽ dài hơn do nồng độ của cơ chất giảm dần 5.2. T H IẾ T BỊ PH Ả N ÚNG L IÊ N TỤ C Thiết bị phản ứng lièn tục (continous flow reactor) có cấu trúc như thiết bị gián đoạn nhung vận hành liên tục với vận tốc đòng cơ chất vào ‘thiết bị bằng vận tốc dòng sản phẩm + cơ chất ra khỏi thiết bị. Thiết bị phản ứng liên tục chỉ vận hành với enzym cố định. Trong thiết bị phản ứng liên tục, thời gian lưu trung bình của cơ chất trong thiết bị (bằng V/F, với V Dồng cơ chát Dửng sàn phẩm là thể tích của thiết bị, F là vận tốc dòng cơ chất) ngắn hơn rất nhiều so với thời gian lưu của cơ chất trong thiết bị phản ứng gián đoạn sử dụng enzym tự do. Đặc điểm này làm cho thiết bị có năng suất lớn hơn nhiều lần so với 220 Hỉnh 5.3. Thiết bị liền tục có khuấy thiết bị gián đoạn khi sử dụng cùng một lượng enzym. Thiết bị dạng này cũng cho phép sử dụng cơ chất có độ hoà tan thấp trong dung dịch phản ứng khi có thể cho một thể tích lớn dung dịch cơ chấl nồng độ thấp tiếp xúc với một lượng enzym cố định. Ngoài ra, thiết bị liên tục còn tạo ra điều kiện phản ứng không đổi trong suốt quá trình cho phép dễ dàng điều khiển quá trình. Hệ thống phản ứng liên tục có thể hoạt động theo hai phương thức khác nhau: có khuấy trộn và không khuấy trộn Trong thiết bị không có khuấy trộn, enzym sẽ tiếp xúc với dung dịch phản ứng có nồng độ cơ chất cao và nồng độ sản phẩm thấp. Người ta cũng có thể sử dụng một hệ thống gồm nhiều thiết bị phản ứng nối tiếp nhau, dòng sản phẩm ra khỏi thiết bị thứ nhất sẽ là dòng cơ chất vào thiết bị thứ hai. Như vậy, hiệu suất chuyển hoá của toàn bộ hệ thống sẽ được nâng cao. Trong thiết bị liên tục có khuấy trộn, dòng phản ứng được trộn lẫn hoàn toàn và tức thời với toàn bộ dung dịch có nồng độ cơ chất thấp và nổng độ sản phẩm cao. Trong điều kiện vận hành ỉý tưởng, toàn bộ đung dịch trong thiết bị được đảo trộn đổng đều. Dòng sản phẩm có cùng thời gian lưu với pha lỏng trong khi một vài phân tử cơ chất có thể được lưu lại trong thiết bị ngấn hơn hoặc lâu hơn do hiện tượng đảo trộn ngược của dòng chảy. Thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn có thể bắt đầu vận hành như một thiết bị gián đoạn cho tới khi đạt được mức độ chuyển hoá cơ chất mong muốn, thiết bị sẽ chuyển sang vận hành liên tục. Thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn có cấu trúc đơn giản, tác dụng da năng và giá thành rẻ, cho phép nạp hoặc thay đổi enzym dễ dàng. Khả năng đảo trộn đồng đều của thiết bị cho phép kiểm soát pH và nhiệt độ phản ứng dễ dàng, cấp hoậc tách khí đơn giản. Thể tích của thiết bị thường được thiết kế gấp 5 - 10 lần thể tích khối enzym cố định cần sử đụng. Tuy nhiên do thiết bị khống tạo ra một cản ư ở đáng kể nào đối với dòng cơ chất, các cơ chất không tan hoặc tạo keo trong dung dịch ít có khả nãng tiếp xúc với enzym. Ngoài ra, các chất mang làm từ vật liệu dễ phân tách cũng không được sử dụng cho thiết bị liên tục có khuấy do chúng có thể vỡ thành các mảnh nhỏ trong quá trình khuấy trộn và đi theo dòng sản phẩm. Thông thường, các hạt enzym có kích thước đến I0|am cần đủ bền vững để tổn tại trong dòng khuấy, khi đó quá trình khuếch tán cơ chất vào hạt enzym sẽ thuận lợi hơn. 221 Một thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn lý tưởng sẽ đảm bảo sự đảo trộn đồng đều toàn bộ dịch, và do vây nồng độ cơ chất được giữ ở mức tối thiểu còn nồng độ sản phẩm tạo ra đạt tới tối đa. Hiệu suất chuyển hoá tại mọi điểm trong thiết bị là đồng nhất. Thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn là thiết bị phản ứng thích hợp cho các quá trình chịu ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế cơ chất hay hoạt hoá sản phẩm. Ngoài ra, nhờ sự pha loãng cơ chất trong dòng phản ứng, thiết bị này còn thích hợp khi dòng cơ chất có chứa các chất kìm hãm enzym. Điều này rất có ý nghĩa trong trường hợp nổng độ chất ức chế lớn hơn K, và tỷ lệ s ,/ K™ thấp trong trường hợp ức chế cạnh tranh và cao hơn trong trường hợp ức chế không cạnh tranh khi mức độ pha loãng chất ức chế lớn hơn sự pha loãng cơ chất. Động học quá trình chuyển hoá trong thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn lý tưởng sẽ bị sai lệch khi không đảm bảo được chế độ khuấy ưộn đồng đều. Có thể cải thiện động học phản ứng bằng cách tăng vận tốc khuấy, giảm độ nhớt, giảm nồng độ cơ chất hoặc tãng hiệu quả cánh khuấy trong thiết bị. Quá trình truyền động lượng, truyền nhiệt và chuyển khối Là các quá trình rấí quan trọng trong thiết bị liên tục. Nó quyết định khả năng vận chuyển các phân lử, dòng chất lỏng trong thiết bị và chế độ thuỷ động của đung dịch phản ứng. Thông thường, các quá này được biểu diễn bời hàng loạt các mối quan hộ phức tạp, trong đó có các thông số không phụ thuộc kích thước thiết bị. Một trong các thông số đó là chỉ số Reynolds (Re), liên quan tói lực quán tính gây bởi dòng chất lỏng và lực nhớt chống lại dòng chảy. Giá trị Re thấp mô tả chế độ chảy dòng của đòng chảy, giá trị Re cao chỉ ra chế độ chảy rối của đòng chất lỏng. Tổn tại trị số Re tói hạn phụ thuộc vào cấu hình thiết bị, tại đó dòng chảy chuyển từ chảy dòng sang chảy rối. Re được xác định theo: Re = L.fm/ĩ] hoặc Re = L .f /V (5.4) Trong đó: L -chiều dài đặc trung của hệ thống (m); fm - vận tốc chuyển khối của dòng chảy (g.m‘2. s'1); f - vận tốc dòng chất lỏng (m .s'1); T) - độ nhớt động lực học (g.m '\ S 1); V - đ ộ nhớt động học ( m 2. s '). 222 (5.3) Trong thiết bị phản ứng enzym, chiều dài đặc trưng cùa hệ thống ]à đường kính cùa thiết bị. Gía trị L ./củ a một hệ thống có khuây có thế tính báng (vận tốc khuấy) X (dường kính cánh khuấy)2. Trong các thiết bị có dòng chảy vận tốc cao và độ nhớt thấp, chỉ số Re thường cao. Bên cạnh chỉ số Re, chỉ số Goff (Lr) được sử dụng để mõ tả và so sánh các thiết bị enzym liên tục. Chỉ số Lf biểu diễn hiệu suất năng lượng dòng chảy dùng vận chuyển vật liệu hoặc nhiệt tới các bể mặt xúc tác. Giá trị L, thấp mô tả hệ thống cần chi phí năng lượng lớn để có thể đạt tới trạng thái xúc tác của bề mặt các enzym cố định và cơ chấl. Trị số Lr cao thường dạt tới trong các thiết bị có áp suất thấp, vận tốc dòng lớn và vận tốc chuyển hoá cao. Quan hệ giữa Lf và Re trong thiết bị liên tục có khuấy được mô tả trong hình 5.4 phản ánh nhu cầu khuấy trộn trong thiết bị ngay cả ở vận tốc dòng thấp. Hình 5.4. Quan hệ giữa L ị và Re trong thiết bị liên tục có khuây trận Vận tốc phản ứng trong thiết bị liên tục có khuấy trộn được tính theo công thức: V = F(S» - S) = v„ Km s+S (5.5) = Kmí ẳ j 1 1 + (S i,-S ) (5.6) Do vậy: Với (S,-S)_ X s “ 1-X Vm i = s y + J L 2 L F _S('A + (1 - X ) (5.7) (5.8) Nâng suất phản ứng enzym thay đổi do tác động các điều kiện của dòng chảy lới phàn ứng enzym. Trong trường hợp phản ứng bị ức chế bới cơ 223 (5.9) T rư ờ n g h ợ p p h ả n ứ ng bị ức c h ế bới sán p h ẩ m : c Y + K ------— ----- ( I + ^ F - SoX+Km(1 _ X ) (1 + Y nrnt ) (5 .1 0 ) ) T r o n g trư ờ n g h ợ p bị tác đ ộ n g c ủ a p h ả n ứng th u ậ n n g h ịc h : F (5 .1 1 ) = XS+KĨ T x T h iế t bị p h ả n ứng liên tụ c k h u ấ y trộn lý tư ở n g tạ o ra s ự đ ồ n g đ ề u tuyệt đố i về n ồ n g đ ộ c ơ ch ấ t e n z y m v à cá c s ả n p h ẩ m tro n g s u ố t th ờ i g ia n v ận hành n h ờ s ự đ ả o trộ n h o à n to à n tro n g thiết bị. T u y n h iê n , m ô t v ài p h â n từ c ơ chất c ó th ể bị lấy ra kh ỏ i th iết bị n h a n h h ơ n , m ộ t v ài p h â n tử c ó th ể c ó thời gian lưu lại tro n g th iết bị dài h ơ n. M ô h ìn h p h â n bô th ờ i g ia n lưu c ủ a cá c ph ân tử c ơ c h ấ t tro n g d ò n g c ơ c h ấ t đ ư ợ c trìn h b ầy tro n g h ì n h 5.5. 2 3 _ 4 Thời gian lưu tiéu chuẩn Hình 5.5. Phản bô thờ i gia n lưu tro n g th iế t bị liê n tụ c có k h u ấ y trộ n . N- số phản tử cơ chất trong thiết bị tại thời điểm t, (- - -), thời gian lưu của cơ chất; (_ ..J thời gian lưu của cơ chất không phản ứng; (___ ), thời gian lưu của sản phẩm. Thời gian lưu tiêu chuẩn được tính bằng t.FA/ là thời gian cần thiết để một thể tích cơ chất bằng thể tích thiết bị đi qua thiết bị. M ô h ìn h p h â n b ố thời g ia n lưu c ủ a c á c p h â n tử c ơ c h ấ t k h ô n g bị c h u y ể n h o á tro n g p h á n ứ ng tro n g d ò n g c ơ c h ấ t tu â n th e o c ô n g thức sau: 224 M, = M„e 1.17V (5.12) với M, là nồng độ phân tứ cơ chất trong môi trường tại thời điểm t. Thời gian lưu bán phán cùa các phàn tử cơ chất trong thiết bị: V V T = ln2.p = 0,7. ị (5.13) Nếu g i ạ thiết m ọ i phân từ c ơ chá t đ ề u được c h u y ế n h o á th àn h sàn phám , khi áy cá c p h à n lử c ó thời g ian lưu d ài hơn trong thiết bị c ũ n a dược c h u y ê n hoá. D o v ậy thời lưu tru n g bình c ù a sán p h ẩ m sẽ lớn h ơ n thời íiian lưu tru n gI bhình ìn h c ú a c ơ cch h ấ t tron tro ngg thiết bị. T h à n h p hhán ầ n cù a d ò n g sả n p h ấ m là d ồ n g n hất ít tro n g toàn to àn bbộ ộ thiết bị vvàà có thể tính toán từ d iệ n tích c ủ a cá I c vù ng trong d ồ thị trên h ìn h 55.5, ìnhh là 9 0 % (P /S u thiết bị v ậận .5, trẽn trên h ìn /$ ). N ếếu n íh à n h liên V tục (giả thiết tro n g thời g ian > 4 ■p ), vé lý thu yết, thời g ia n lưu tri , . ... y của các p hẩn lử c ơ chấ t t ro n s thiết bị là 'p . T u y n h iên , h ình 5.5 c h o thày răng, thực tế chi có một số ÍI phán lử có thời gian lưu gần với eiá trị rèn (7% V . .. t rong k loáng 0 ,9 - 1,1 P ), còn lại là cơ châl có thời gian lưu hoặc là ít hơn V V (20% 0.1 P ) hoặc là cao hơn (2,3 P ). Thôntĩ thường trong thiết bị phán ứng liên tục có khuấy trộn, liệu úng tail” áp ngược hầu như không có hoặc có nhưng ớ mức không đáng kể. Thiết bị dạna nà y thường k h ône dược sử dụng trong quá trình yêu cầu vận tốc chuyến loá cao. Cũng có thế vận hành các thiết bị nối tiếp nhau tạo thành m ột c h u ỗ i thiết bị liên tục c ó h iệu suất chuyên h oá tổ ng thế ca o . C h u ỗ i thiết bị. này_ ^cóv thế bao gồm từ ba thiết bị lẽn, *-----liên-------kết theo từngc cặp . r hoặc một ĩ trở -----bì nh phan ứ ng được c h ia thành c á c k h o an g c ó thể v ận h ành đ ộ c ip n h á m trán h lnèn tư ợ n g d á o trộ n ngược. C ác thiết bị liên tục c ó k h u ấ y trộn có th e sứ d ụ n g được với e n z y m tự do ờ cửa ra cùa thiết bị. Khi đó có thể gặp một số khó khãn như nồng độ enzym không dồng dểu trong thiết bị hoặc có sự bất hoạt en/ym trên bề mặt màng. Tuy nhièn dạng hệ thống thiết bị này thích hợp khi có nhu cầu gắn kết phán ứng enzym khi thiết bị c ó g ắ n kết m ộ t m à n g siêu lọc n h ằ m tách sán p h á m 225 và việc phân tách sản phẩm trong cùng một hệ thống, hoặc khi không thực hiện được phản ứng với enzym cố định. 5.3. T H IẾ T BỊ PHẢN ỨNG ENZYM DẠNG MÀNG Thiết bị dạng màng (membrane reactor - MR) được trang bị một màng bán thấm cho phép các phàn tử sản phẩm đi qua mà không cho phép các phàn tử enzym đi qua (hình 5.6). Dạng màng đơn giản và rẻ nhất là màng bán thấm selophan dùng trong kỹ thuật thẩm tích enzym. Loại màng thông dụng sử dụng cho thiết bị màng được tạo bởi hàng trăm sợi xốp nhỏ có đưcmg Dỏng sàn phẩm *■ kính 200^im, độ dày của màng 50jj.ni. Thiết bị phản ứng dạng màng có thể hoạt động gián đoạn hay liên tục. Sau phản ứng, sản phẩm được tách ra khỏi enzym và cơ chất dư. Thiết bị dạng màng có thể dùng cho enzym tự do hoặc cố định. Thiết bị sử dụng cho enzym hoà tan giúp giảm các chi phí và các vấn đề Màng(khôi ụtxổp) ■<p Hình 5.6. Thiết bị phàn ứng màng thường gặp phải khi sử dụng enzym cố định. Nếu cơ chất có thể khuếch tán qua màng, có thể đặt cơ chất và enzym ở hai phía khác nhau của màng. Nếu cơ chất không khuếch tán được qua màng, enzym và cơ chất phải được đặt trong cùng một khoang của thiết bị, khi ấy cần có sự kiểm soát chặt chẽ về vận tốc dòng trong trường hợp thiết bị vận hành líèn tục. Trong trường hợp thiết bị sử dụng màng siêu lọc nhằm tách các sản phẩm phản úng, sử dụng enzym tự do có thể tránh được các khó khăn như sự phân cực nồng độ hay vô hoạt enzym trên bề mặt màng. Thiết bị dạng màng được thiết lập một cách đề dàng nên thường được sử dụng ò quy mô nhỏ cỡ vài gam đến kg cơ chất/sản phẩm, đặc biệt các trường hợp phản ứng nhiêu giai đoạn hoặc cần tái tạo CoE. Thiết bị phản ứng đạng màng chò phép đễ dàng thay thế enzym, đặc biột khi enzym không bền. Ngoài ra, thiết bị này có thể dụrig ưong các phản ứng hai pha. Tuy nhiên, thiết bị màng có giá thành cao do màng đắt và thường phải thay thế sau một thòi gian hoạt động rihất định. 226 Động học phản ứng enzym trong thiết bị màng giống như trong trường hợp thiết bị gián đoạn đã mô tả ở trên nếu thiết bị vận hành gián đoạn (mục 5.1), hoặc giống như trường hợp thiết bị liên tục nếu thiết bị vận hành liên tục (mục 5.2). Sự khác biệt của động học phản ứngenzym trong thiết bị màng với thiết bị gián đoạn hay liên tục là do sự khuếch tán hạn chế của enzym và của các sản phẩm qua màng bán thấm. Như vậy, phản ứng enzym trong thiết bị dạng màng sẽ chịu ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế bởi sản phẩm cuối hơn so với phản ứng enzym trong các thiết bị khác. 5.4. T H IẾ T BỊ PHẢN ỨNG DẠNG C Ộ T Thiết bị phản ứng dạng cột (packed bed reactor) có dạng hình trụ, được lấp đầy chất mang có gắn enzym bằng một trong các nguyên tắc cố định enzym. Đặc điểm của thiết bị phản ứng dạng cột là cơ chất chảy qua khối enzym cố định theo chiều từ trên xuống song song với trục dọc của thiết bị và không bị khuấy trộn ngược. Trong điều kiên lý tưởng, dòng cơ chất cộ vân tốc - ,7, không dổi trong suốt chiều caọ cột. Cơ chất Sàn phịm ra Cochẩivào y Hình 5.7. Thiết bi phần ứng dang cõt ■5 tại mọi khu vực trong thiết bị đều có cơ hội tiếp xúc với enzym như nhau, sản phẩm tại mọi vị trí trong thiết bị đều CQ thời gian lưu như nhau. Hiệu quả chuyển hoá cơ chất cùa thiết bị phản ứng dạng cột tương đương với thiết bị gián đoạn có khuấy có cùng thời gian iưu. Có thể xem mỗi phân đoạn chiều cao cột thiết bị như một thiết bị phản ứng gián đoạn (hình 5.1). Mức độ chuyải hoám ong ĩĩìaốn có thể đạt được bằng cách sử dụng cột phản ứng có độ cao thích hợp. Vận tốc dòng trong thiết bị phản ứng dạng cột tương đương với vận tốc dòng trong thiết bị gián đoạn tính theo thể tích. Vì vậy, phương trình 5.2 có thể chuyển đổi để mô tả thiết bị phản ứng dạng cột lý tưởng khi giả định không có hạn chế về khuếch tán (ít khi gặp trong thực tế): ^ = ự -K Jn (l-X ) ' ( 5. 14) 227 Đế có thể tạo ra chế độ cháy lý tướng trong thiết bị cột, chất lỏng trong thiết bị cần giữ ừ chế độ chảy màng để ổn định mức độ dáo trộn và truyền nhiệt bình thường của dòng cháy, hạn chê sự đảo trộn ngược của dòng chất lỏng. Khó có thế đạt được giá trị Re cao trong thiết bị do khó đạt được vận hi dang cột thích hợp cho các quá trình bị ánh hướng cùa sự ức chế hoi san pham cuối, bới sự hoạt hoá cơ chái và tính thuận nghịch của phân ứng. Trong th iố t bị dạng cột lý tướng, 100% phân tử cơ chất có thời gian lưu hàng với thời eian lưu trung bình của cơ chất trons thiết bị. Đây là điếm khác biệt lớn cùa thiết bị dạng cột so với thiết bị liên tục có khuấy. Tại giá trị Re thấp, vận tốc dònq tỷ lệ thuận với sự eiảm áp trong thiết bị. Thông thường sự aiám áp trong thiết bị tỷ lệ thuận với chiều cao ứp chất mang, vân tốc dòng, độ nhớt động học của dòng cơ chất và thể tích của dung dịch choán trong thiết bị (tính theo (1 - s)2 / s 1 với e là độ rỗng cùa thiết bị) và tý lệ nghịch với diện tích cắt ngano của hạt enzym cô' định. Thông thường thiết bị dạng cột được sử dụng với các hạt enzym cố định trên chất mang có độ ben tương đối. kích thước 1- 3 mm. Sự tăng vận tốc dòng có thế dán đến hiến dạng vật lý và độ chắc cua các hạt enzym cố định trẽn chất mang mém. Sự hiến dụng các hạt enzym có thế dẫn tới giảm bể mặt tiếp xúc cùa các hạt en/.ym vói dòng cơ chất, giảm vận tốc chuvển khối, hạn chế dòns chày và gày giám áp lớn trong thiết bị. Ảnh hường nối tiếp của các hiệu ứn g iãn s áp suất ngược, biến dạng hạt enzym, hạn chế dòng cháy có thế dẫn tói hoàn toàn không có dòng chảy trong thiết bị. Thiet bị phán ứng dạng cột giống như một giá lọc cố định đối vơi dòng cơ chat. Do vậy cần sử dụng giá lọc sao cho thiết bị khỏno bị các hạt enzym nho bịt kín. Ngoài ra, cần tính đến khá nàng lớp lọc bị bịt kín bới sự tao keo hoặc két tủa cùa cơ chãt. Các thiết bị phán ứng dạng cột có kích ihưức lớn (đường kính lớn hơn 15 cin) thường gập khó khăn trony kiểm soát nhiệt độ và kiếm soát pH bằng cách bố sung axit hav bazơ. Hiện tượng đáo trộn ngược trong thiết bị phán ứng dạng cột làm sai lệch mô hình dòng cháy và làm cho thời gian lưư cứa cư chất trong thiết bị 228 thay đổi. Trong những trường hợp thiết bị chịu ánh hưởng lớn của hiện tượng đảo trộn ngược, cơ chất có thể chảy qua thiết bị nhanh hơn ờ một sỏ' kênh được tạo ra do sự đảo trộn. Ngược lại, vận tốc dòng cháy lại làm giám ớ một sỏ’ vị trí khác. Các kênh này chi dược tạo ra trong trường hợp có sự giảm áp lớn, lớp dệm không dồng đều, hoặc dòng cháy cơ chất thay dổi. tạo ra vận tốc dòng khác nhau trong toàn bộ khối dệm. Khi đõ, động học phán ứnu trong thiết bị phàn ứng dạng cột cố định giống với tron° trường hợp thiết bị liên tục khuấy, dần tới khó có thế đạt .dược mức dộ chuyển hoá cơ chất cao trona thiết bị. Các ảnh hướng kế trên có thế dược hạn chế nếu sử dụng các hạt en/ym cố định có kích thước dồng đều. Nâng suất phàn ứng enzym thay đổi khi phán ứng enzym bị han chè' bới cơ chất, sản phấm hoặc do tác động của phản ứng thuận nghịch. Trong trườns hợp phàn ứnơ bị ức chế bởi cơ chất, năng suất phán ứng dược tính theo: •= SI(X - Kmln(l - X) + ........................... F s,r (2X - X2) 2K s (5.15) Trong trường hợp phản ứng bị ức chế bới sản phẩm: (5.16) 1+K„ Trong trường hợp bị tác động cùa phán ứng thuận nghịch: ỵ T i = X S - K > ( l -X ) ■ 7 ) Trong đó: X - nồng độ các phân đoạn chuyển hoá trong phàn ứng thuận nghịch và được xác định bởi: X= s, - s, S() - So (5. 8 ) ác công thức này giúp tính toán và so sánh năng suất thiết b ị dạng cột với thiết bị phán ứng liên tục trong việc lựa chọn thiết bị phản ứng t-n/ym. Trước đây, quá trình sản xuất mật tinh bột (sirô fructose) từ tinh bột được thực hiện bàng cách thùv phân tinh bột nhờ glucoamylase và bước izome hoá glucose thu được thành fructose được thực hiện nhờ glucoizomerase cố định trong thiết bị phản ứng gián đoạn. Phương pháp này 229 Ị có chi phí cao do thời gian lưu của hỗn hợp phản ứng trong thiết bị lớn, hàm lượng sản phẩm phụ cao. Ngoài ra, rất khó tách các ion Mg 2+ và Co 2+ (bổ sung để ổn định hoạt tính enzyme) cũng như khó thu hồi enzyme sau phản ứng. Hiện nay, để giải quyết các vấn đề tổn tại, hầu hếl các quá trình này được thực hiện trong các thiết bị dạng cột. 5.5. THIẾT BỊ PHẢN ỨNG TẦNG SỒI Đây là dạng thiết bị trung gian giữa thiết bị dạng cột và thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn. Thiết bị này bao gồm một lớp hạt enzyme cố định được thổi nguợc lên phía trên nhờ dòng cơ chất, có hoặc không kết hợp với dòng khí (oxy hay khí trơ) hoặc các chất cần thiết cho phản ứng diễn ra Ưong th iế t.b ị phản ứng. Thường thì dòng khí không làm thay đdi nổng độ cơ chất và enzyme trong thiết bị. Trong suốt phản ứng enzym, các hạt enzym được giữ ở trạng thái lơ lửng trong dòng cơ chất nhờ vào vận tốc của dòng cơ chất và/hoặc dòng khí. Vận tốc dòng nhò nhất củạ hỗn hợp hạt enzym và cơ chất để duy trì trạng thái tầng sôi trong thiết Sản phẩmra Hinh 5.8. Thiết bị phàn ứng tầng sói bị phụ thuộc vào kích thước, dạng, độ xốp và tỉ trọng của hạt enzym cô định cũng như tỉ trọng và độ nhớt của dung dịch phản ứng. Vận tổc tối thiểu của dòng sôi tương đối nhỏ, khoảng 0,2 - 1 cm/s do hầu hết các enzym cố định có tỉ trọng xấp xỉ tỉ trọng các dịch phản ứng. Như vậy, độ phân tán của các hạt enzym tỉ lộ thuận với vận tốc bề mặt của khí và tỉ lệ nghịch với 4 d (d là đưòng kính thiết bị), Khi bắt đầu khởi động thiết bị, cần cung cấp một lượng năng lượng lớn để tạo “trạng thái sôi” của các hạt enzym. Nhung một khi trạng thái tầng sôi đuợc thiết lập, chỉ cần một lượng năng lượng nhỏ để (duy tri thiết bị hoạt động, trừ khi cần tãng vận tốc dòng cơ chất trong thiết bị. Thiết bị có đường kính nhỏ và vận tốc dòng lớn thường có đặc tính của một thiết bị tầng Sòi lý tưởng. Còn nhìn chung, động học phản ửng trong thiết bị dạng này thường là dạng trung gian giữa thiết bị dạng cột và thiết bị 230 liên tục do vận tốc dòng nhỏ trong thiết bị tạo ra một mức độ đảo trộn ngược cục bộ. Dạng động học quá trình sẽ do hình dạng cùa thiết bị quyết định. Thiết bị dạng này đặc biệt phù hợp trong trường hợp cơ chất sử dụng hoặc sản phẩm quá trình ở dạng khí. Enzym cố định sử dụng trong thiết bị dạng này cẩn có kích thuớc hạt nhỏ 20 - 40 (.im, (và vì thế có bề mạt tiếp xúc/ phản ứng lớn) và cần có mật độ hạt enzym đủ lớn để không bị rửa trôi khỏi thiết bị. Trong trường hợp mật độ hạt enzym thấp, kích thuớc hạt enzym có thể lớn hơn. Để thiết bị hoạt động hiệu quả, các hạt enzym nên có kích thước đồng đều tránh tạo ra sự khác biệt về nồng độ enzym trong thiết bị. Thiết bị tầng sôi không hoạt động được ở vận tốc dòng lớn do có thể tạo ra các khu vực rỗng trong thiết bị hoặc có thể rửa trôi enzym. Nhược điểm lớn nhất của thiết bị tầng sồi là khó khăn khi nâng cấp thiết bị do đặc tính thuỷ lực dòng chảy thay đổi rất lớn khi thay đổi kích thước thiết bị. Hệ số nâng cấp thiết bị trên thực tế chỉ cho phép lới 10-100 lần. Ngoài ra, sự thay đổi dòng cơ chất cũng tạo ra sự thay đổi phức tạp không dự đoán được của dòng chảy trong thiết bị, và do vậy cũng ảnh hưỏng tới vận tốc chuyển hoá enzym. 5.6. LỰA C H Ọ N T H IẾ T BỊ PHẢN ú n g ENZYM Để lựa chọn thiết bị phản ứng enzym, các yếu tố quạn trọng cần quan tâm là đặc tính của phản ứng enzym-phản ứng thuận nghịch hay không, có bị ức chế bởi cơ chất hay các thành phần của cơ chất không, có bị ức chế bởi sản phẩm cuối khống..., đặc tính sản phẩm, dạng enzym sử dụng (tự d o hay cố định), động học phản ứng enzym và các tính chất lý-hoá học của các chất mang (đêm) trong trường hợp sử dụng cô' định. Ngoài ra, việc lựa chọn thiết bị phản ứng enzym còn phụ thuộc vào nãng suất và quy mô eủa quá trình, mức độ kiểm soát phạn ứng và khả năng kiểm soát tự động quá trình phản ứng enzym như kiểm soát pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất hay sản phẩm. Cuối cùng, việc lựạ,chọn thiết bị cho phản ứng enzym phụ thuộc vào chi phí của bản thân thiết bị và phương thức vận hành chúng. 231 CHƯƠNG 6 ỨNG DỤNG CHẾ PHAM ENZYM VÀ TR1EN VỌNG CỦA CÔNG NGHỆ ENZYM Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùne với sự phát triển mạnh mẽ cua còng nghệ sinh học, các chế phẩm enzym được sán xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzym đã dần từng bước lùm thay dổi và nâng cao một số các quá trình cóng nghệ trong chế biến thực phám, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế... đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng cùa xã hội. Hàng năm, lượng enzym được sản xuất ra trên thế giới đạt khoansi trẽn 300 000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD được phàn bổ trone các lĩnh vực khác nhau. Hiện nay trên thị trường có khoána 12 hãng sán suất enzym hình với trên 60 nhà cung cấp lớn. Châu Âu với hai hãng sán xuất lớn nhất Ihè ui ới là No vo Nordisk vàG ist Brocades chiếm Irên 60% lượng eiưym thị trườn” , các chế phàm enzym của Mỹ chỉ chiếm 15% trong đó 2/3 lưựng enzym được sư dụng nội địa, chủ yếu cung cấp cho quá trình sản xuất cồn và đườrm nshịch dáo. Nhật bản với các chế phẩm enzym khá da dạng chiếm khoán 15% thị trường thế giới. Trung quốc và Nga các chế phấm enzym dược sán xuất ra chù yếu được dùng cho nhu cầu trong nước. Phẫn lớn enzym được sử dụng ớ mức độ công nghiệp dều t 1UỘC l o ạ i cn/ym đơn cấu tử, xúc tác cho các phán ứng phân huỷ. Khoán" 75% chê phấm la những enzym thuỷ phân được sử dụna cho việc phân huv các cơ chất tự nhiên. Các protease là các enzym được sứ dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đỏng tụ sữa làm pho mat, làm 232 mềm thịt), sán xuất các chất táy rửa, thuộc da...Tiếp đến là các hydratcacbonase được ứng dụng nhiều trong kỹ nghệ chế biến thực phám, trong công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp giấy và bột giấy, chế biến thức ăn gia súc như các enzym amylase, glucoizomerase, cellulase, pectinase. Một số enzym khá phức tạp và đặc hiệu cũng dược đưa ra sứ dụng tron Sỉ lĩnh vực ihực p h á m . phân tích, dệt nhuộm, trong chuán đoán và d i é u trị bệnh như glucooxydase, catalase, pepsin, trypsin, chimotrypxin 6.1. ỨNG DỤNG p ;n z y m t r o n g c ỏ n g n g h i ệ p t h ự c p h ẩ m 6.1.1. Vai trò của en/ym trong công nghiệp thực phẩm Trong cóng nghiệp thực phám các chế phẩm enzym dược sử dụng với trình chuyển hoá, từ đó cho phép nhận các sản phẩm mới hay sán phám có chát lượng cao hơn. Đặc biệt, enzym cũng có thể can thiệp vào chính quá trình chế biến và đóng vai trò công cụ công nghệ. Nhờ tác dụng cùa enzym chú nu ta có thể nhận được các sản phẩm trung gian hay cuối cùng khác nhau. Trong thực tế sản xuất, các c h ế phám được sử dụng nhiều rong hay cuối quá trình chế biến nông sán nhàm nâng cao chất lượng sàn phàm cuối cùng, dặc biệt trên khía cạnh cám quan. Đối với một số nguyên liệu nông sản thực phẩm, hoạt độ enzym trong nguyên liệu được coi là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng chính. • En/.ym còng cụ điều điéu chinh những khiêm khiếm khi khuyết tự nlìién cùa E n /y m - công nguyên liệu cua công nghiệp thực phám phẩm là các sản ph‘ Nguyên liệu cùa nguồn gốc thực vặt và động vật. Chúng được hình thành q tổng vào các yếu tố bên trong như giốrm loài, các yếu tô bên ngoài như các điều kiện canh tác, khí hậu trong thời gian phát triển. Các yếu tố này có thể làm thay đổi thành phần chung cùa nguyên liệu và chuyển hoá nó. Các chế phám 233 enzym có thể được sử dụng như một chất phụ gia nhằm lấp đầy những Ihiếu hụt tự nhiên. Trong công nghiệp chế biến tinh bột, sản xuất đường, bánh mì, bia, người ta thường bổ sung amylase vào cổng thức để bù lại hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc. Trong công nghiệp sản xuất phomat, các chế phẩm enzym lipase và protease được sử dụng thay thế các enzym tự nhiên của sữa bị vô hoạt bởi thanh trùng. • Enzym - cồng cụ công nghệ của chuyển hoá Khả nãng xúc tác chuyển hoá của các enzym được khai thác trong nhiều quá trình sản xuất thực phẩm : bánh bisqui, phomat, nước uống. Protease cho phép cải thiện tính chất lọc của bia và tăng tính ổn định của nó ở nhiệt độ thâp. Amylase, pectinase và hemicellulase tạo điểu kiện cho việc tách chiết và ỉọc nước quả. Pectinase cần thiết cho quá trình lên men rượu vang ở nhiệt độ cao để làm trong rượu. Trong Cổng nghệ sản xuất bánh bisqui, protease trung tính dùng để làm mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bánh bisqui. Trong cổng nghệ phomat, sử dụng pretease làm đông tụ sữa ở giai đoạn đầu tiên của quá trình sản xuất, còn protease và lipase cho phép thúc đẩy quá trình chín của phomat. • Enzym - công cụ làm tăng giá trị của nguyên liệu tự nhiên Enzym có thể tham gia vào việc đa dạng hoá sản phẩm nhận được từ nguyên liệu tự nhiên. Tiêu biểu nhất ỉà quá trình đề polỳme hoá tinh bột. Cho tới những năm 70, sirô glucoza nhận được từ ngữ cốc đẵ trở thành sản phẩm quen thuộc. Sự phát triển của ngành Công nghệ enzym cho ra đời một loạt các chế phẩm enzym đã c h a phép tạo ra nhiều sản phẩm như : chất làm đặc, tiền chất và dẫn suất của chất thơm, chất tạo ngọt acariogenes, chelatants, chất tạo chua. Chính việc cải thiện đặc tính của enzym vể tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là nguồn gốc của việc sản xụất các, chế phẩm enzym mới. Sản xuất các chất xúc tác thích ứng hơn với các điểu kiện vật lý của môi trường (nhiệt độ, độ nhớt môi trường) Vd đặc hiệu hơn đòi hỏi phải kéo theo sự đa dạng của các sán phẩm trung gian nhận được từ nguyên liệu tự nhiên. 234 • Enzym - công cụ cảl thiện chất lượng của sản phẩm Trong trường hợp này enzym phải có tác động để thay đổi trực tiếp sản phẩm cuối cùng. Tác động của nó đặc biệt quan trọng trên khía cạnh cám quan của thực phẩm. Các enzym được sử dụng để loại bỏ các chất tự nhièn có ảnh hưởng xấu tới chất lượng cảm quan của thực phẩm. Ví dụ naringinase, kết hợp vớí rhamnosidase và beta-glucosidase có thế thuỷ phân rhamno-glucozit của trihydroflavon, chất làm đắng nước agrumes. Enzym cũng cho phép tạo ra hương vị mới. Lipase được bổ sung vào giai đoạn đông tụ sữa bò cùng với renin tham gia vào việc tạo hương cho phomat. Hương vị đặc trưng của các sản phẩm phomat chủ yếu nhờ tác đụng của nhóm enzym này. Vị bổ sung cũng có thể nhận được bởi enzym. Vị ngọt có thể được tạo nên trong sữa nhờ tác dụng của enzym lactase, hay được tăng lên nhờ tác dụng đồng phân hoá glucose thành fructose dưới tác dụng của enzym izomerase. Enzym cũng có thể tham gia vào cải thiện cấu trúc của sản phẩm. Colagenase và papain bằng cách thuỷ phân protein của cơ bắp làm tâng độ mềm của thịt. Protease trung tính làm yếu mạng gluten nên tãrtg được độ giòn của bánh bisqui. Enzym cũng có vai trò trong việc tạo ra màu sắc của sản phẩm : Pectínase giúp cho việc tách chiết màu trong rượu vang đỏ. Lipoxygenase oxy hoá các chất màu caroten của bột làm trắng ruột bánh mì. Proteinase tạo ra các axit amin tự do tạo điều kiện cho phản ứng Mai Hard, đóng vai trò chính trong việc tạo màu cùa các sản phẩm nướng, bánh bisqui, thịt ... 6.1.2. Tiêu chí chọn enzym trong công nghiệp thực phẩm 6.1.2.1. Độ hoạt động của enzym Mối quan hệ siữa các điểu kiện sử dụng và đặc tính cua chê phẩm enzym sử dụng: 235 - pH của mỏi trường phán ứng phái tương ứng với pH hoạt động của enzym. - Ảnh hướng của nhiệt độ tới hoạt độ cùa enzym phái được tính đến khi lựa chọn enzvm. Mối liên quan giữa nhiệt độ và hoạt lực enzym được đặt ra phức tạp hơn : + Nếu thời gian tác dụng cùa enzym nhanh, chất xúc tác sẽ phán ứng tòi đa với khá năng xúc tác cúa mình, sau dó phải nhanh chóne bị vỏ hoạt. + Nếu thời gian tác dụng lâu nên sử dụng enzym có độ bển hoạt lực cao. - Không được bỏ qua sự có mặt của các chất hoạt hoá hay k ìm hãm enzym trong mỏi trường phán ứng. Chọn lựa enzym cũng cần phái tính đến các chất ảnh hướng có thế sứ dụng trong qui trình để thúc đẩy hay đình chi một phản ứng xác định. Các chất này cần có tính dặc hiệu và giá phái rẻ tiền. 6.1.2.2. Tính đặc hiệu Các enzym được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm có t lể có tính đặc hi Cu chật chẽ hay ngược lại rất rộng, chính vì vậy đặc trưng hoá trước hoạt đo enzym mong muốn là vấn đề thiết yếu. Tính đặc hiệu là một trong các đặc tính xúc tác có thể được thay đối qua biến đổi của các vi m ôi trường, Nén kiểm tra lại tính dặc hiệu của enzym Irong các mòi trường phan ứng gần giống với mòi trường thực tế sứ dụng về thành phần và tính chất lý hoá học. lơn nữa không nên bỏ qua các hoạt tính phụ của các chế phám enzym, vì các hoạt tính phụ này có thẻ không mong muốn hay ngược lại rất có yiá trị. ong thực tế không có chiến lược lựa chọn chung. Giải pháp duy nhất hành các phép thử so sánh nhiều enzym trong các điều kiện thưc của trình công nghệ. ỉ. Điểu kiện ứng dụng enzym ột khi một hay nhiều chất xúc tác đáp ứng được các phán ứng, thì cần lựa chọn dựa trẽn tính chất lượng và số phám enzym. Nếu việc bổ sung enzym làm thay đổi lớn tới xuất cần phải xây dựng các nhà máy lớn thì việc cung cấp xuyên và ổn định đóng vai trò quan trọng. 236 liêu tlu ián của lượng của chế công nghệ sản enzyrn thường Giá enzym tác động rất ít tới giá cua sản phám. Do đó tốt hơn nên lấy tỷ lệ giữa giá/ chất lượng là tiêu chuẩn cần xem xét trong việc lựa chọn nhà cung cấp. 6.1.3. Các en/ym được đưực phép s ử dụng Sử dụng các chế phám enzym phái tuân theo một luật chung. Các chế phàm cn/.yin chi dược sứ dụng khi dã đưực các chuvên gia xét nghiệm và cho phép. Danh sách các chế phẩm enzyin dược phốp không dừng lại mù luôn dược bổ sung. Liên quan tới các chế phẩm enzym dùng trong sán xuàt thức ăn VÌ1 nước uống cho người, luật quan trons nhất ra đời 5/ 9/ 1989 dược ban hành tại Cộng hoà pháp (JORF, 1.10.89) ngoài ra còn có các luật khác như: - Luật 20/ 6/ 1985 (JORF, 13.07.85) cho phép sử dụng lactase dế thuý phân lactoza. _uật 21/ 12/ 1988 phám en/ym protease thực (JORF, 7.01.89) đưa ra một danh sách các chế vật, động vật và vi sinh vặt cho phép được sử dụng đê thuỷ phân protein đùng làm thức ăn đặc biệt cho người. - Luật 24/ 3/ 1993 (JORF, 27.03.93) cho phép sử dụng /?cyclodextrin và cho phép sử dụng cyclodextrin - glycozyl- transferase cùa Bacillus maceran và cùa Bacillus árculans. lột loạt các luật 15/6/1993 (JORF, 10.07.93); luật 27/8/1993 (JORF. 4.09.93); 1/2/1994 (JORF, 25.02.94) và 18/8/1994 (JORF. 11.09.94) vừa mới ban hành bổ sung cho luật 5/9/1989 cho phép sử dụng một loạt en/.ym mc 6. í .3.1. Luật 5/ 911989 đưa ra các tiêu chuẩn vé độ tinh khiết :hi tiêu tinh khiết hoá học, trong đó chủ yếu đé cặp đen các dm loại nặng: Arsen < 3 mg/ kg Chì < 10 ma/ ko 237 • C hỉ tiêu vi sinh vật - Các mầm hiếu khí <50 0 0 0 /g - Salmonelles không có trong 25 g - Coliformes - Các mầm yếm khi - Staphylococcus aureus < 30 trong 1 gam < 30 trong 1 gam không có trong 1 gam Sự vắng mặt của mycotoxin và hoạt tính kháng sinh phải được đảm bảo trong chê' phẩm. 6.1.3.2. Luật 5/ 9! 1989 đưa ra một loạt ènzym được phép sả đụng Các chế phẩm enzym này được xếp loại theo các nhóm sau : - Enzym phân cắt các liên kết a -1,4 và a -1,6 glucozit (a -amilase và enzym cắt nhánh). - Enzym phân cắt các liên kết jS -J ,3 và -1,4 glucozit 0 -glucanase). - Disacaridase (invectase và sacarase). - Gluco-izomerase - Pectinase - Protease và izozym cỉohydrat. Danh sách các chế phẩm enzym đầu tiên được bổ sung bởi các luật sau này: - Qf-amylase, pulĩulanase, glucơ izomerase - Cellulase và phức hợp cellulase - hemicellulase -beta-glucanase - inulilase, j8-fructofuranosidase. - Pentosidase. - Photpholipase A2. - af-acetolactat decacboxyỊase. Bốn enzym tiếp theo nhận được từ việc tái tổ hợp gen : ữ -amilase của Bacillus Ucheniformis được biến đổi bàng cách tổ hợp với chủ thể tương tự. 238 - a -amilase của Bacillus Ucheniformis chứa gen của Bacillus stearothermophilus. - Một enzym maltogenase của Bacillus sublillis chứa gen của Bacillus brevis. Bảng sau đây đưa ra danh sách các chế phẩm enzym dược phép sử dụng. Trong danh sách này enzym được xếp thành các nhóm hoạt độ lớn. Khi cần thiết phải kiểm tra điều kiện hoạt động, vì giấy phép sử dụng không phải tồn tại vĩnh viễn, nó có thể được thay đổi tuỳ theo yêu cầu của thực tế. Bảng 6.1. Các enzym được phép sử dụng theo luật cua Pháp (danh sách được đưa ra tháng 4 năm 1996) Enzym 0Í -am ylase a -am ylase sử dụng Luật 8. subtilis Thuỷ phân tinh bột, bisqui, bia 05.09.89 B. licheniformis Nuỡc qíia, rau, bánh ngọt A. niger Thuỷ phãrí tinh bột A. oryzae Bisqui, bia, nuổc qua, rau, bánh ngọt, bánh mi B. subtilis Bánh mì đẽc biệt 15.06.93 B. licheniformis Thuỷ phân tinh bột, bia, ruọu 01.02.94 N guỗn gốc (tổ hợp dạng) với 05.09.89 đổng B. licheniformis {Bacillus stearothermophiìus) Nước qủa, ráu, bánh ngọt A. niger Thuỷ phân tinh bột A. oryzae Bisqui, bia, bánh ngọt A. niger Nưốc qủa, rau m altogenase B. subtilis (,Badilusstearothermo philus) Bánh mì, sirô maltoza 01.02.94 Pullulanase B. acidopullulyticus Thuỳ phân tinh bột, bia, 05.09.89 bánh mì đăc biệt 27.08.93 Klebsiella planticola Thuỳ phân tinh bột, bia 18.08.94 Streptomyces violaceaniger Sirô glucoza có hảm lượng fructoza cao 05.09.89 amyloglucosidase Gluco izom erase 05.09.89 16.8.94 239 sử dụng Nguốn gốc Enzym Luật S. olivochromogenes S. rubiginosus Actinoplanes missouriensis B. coagulens Streptomyces murinus 1í>.06.93 0£5.09.89 Invectase Saccharomyces cerevisiae Mứt quả Lactase Kluyveromyces lactis K. fragilis A. niger; A. oryzae Lactoza thuỷ phản Cyclodex trin glucozyl transfers B. macerans B. circulans /ơ-cyclodextrin 0-glucaniise B. sublilis; A.niger Disporotrichum dimorphosporum Bia Endogluc anase Humicola insolens Bánh m i; bia 1íỉ.08.94 Pectinasi A. ưentii; A. niger Fructo-oligosacarit 0Ỉj.06.93 Cellulase Trichoderna reesei Fructo-oligosacarit 0fj.06.93 A. niger Fructo-oligosacarit 0Íj.06.93 Inulase A. niger Fructo-oligosacarit 1í i.06.93 0 A. niger Fructo-oligosacarit 2 ' ■.08.93 Hemicenl ulase A. niger Bisqui, bánh ngọt, bánh mi 1f 1.08.94 Gf-cetolac at B. subtilis (B hrpvi^) Bia, rượu 0 ' .02.94 decacbox Photpholipase A2 dịch tuỵ lơn nước sốt được tạo nhũ 15.08.94 Papain Cocica papaya Bia, dịch thuỷ phân protein 05.09.89 Protease B. subtilis Bisqui, bánh ngọt, nước quả, 05.09.89 J.06.85 21í.03.93 j.09.89 v- Pentozan ase Phức hợp Xellulase Xellobias hemicenl ulaseí3-glucanõ fructofura nozidas e 240 Enzym Nguồn gốc oryzae, A. Ưentii B. licheniformis s ử dụng Luật rau Thuỷ phàn protein 05.09.89 Protease axit Endothia parasitica Mucor pusillus, M. miehei Phomat 05.09.89 Protease Micrococcus cazeolyticus Phomat 05.09.89 Dịch thuỷ phân protein dành cho các thực phẩm đặc biệt 21.12.88 Pepxin, trypxin, chimotrypxin tách tuỵ chiết dịch papain protease xerin protease kimloạị protease axit 6.1.4. Sử dụng các chê phẩm en/.ym trong công nghệ thịt cá 6.1.4.1. Một số c h ế phẩm enzym thường được sử dụng trong ché biên các sản phẩm giàu protein 111 Các ch ế phẩm enzym có nguồn gốc thực vật • P apain và chym opapain Hai loại chế phẩm enzym này chứa chú yếu các protease và đều nhận được từ nhựa đu đủ. Hàm lượng chymopapain trong nhựa du đú cao hơn papain. Chế phẩm papain có hoạt tính cao trong phân giải amit và este. Papain thực hiện thuỷ phân sâu sắc hơn so với những protease của vsv. So sánh với những protease khác thì papain có khả năng chịu nhiệt cao hơn. Nhiệt độ hoạt động tới hạn là 80"C. Chymopapain xúc tác thuỷ phân các mối liên kêt peptit và este. Tốc độ thuỷ phân hemoglobin và cazein của enzym này nhỏ hơn papain 2 lần, nhưng ốn định ở pH thấp hơn. • Phyxin Phvxin thu được từ mủ nhựa quả sung. Trung bình quả xanh trọng lượne từ 10 -15 g có thể chiết được 100 - 200 mg phyxin. Tinh thể phyxin 241 thu được ở pH = 5 và giữ được độ bền hoạt lực trong ihời gian vài tháng ở 5Ơ'C. Phyxin tương đối giống nhiều với papain nhu được hoạt hoá bằng hợp chất tiol và bất hoạt bằng tác nhân sulfuahydrin. Phyxin ổn định ở pH = 6 - 8. • Bromelin Enzym này có nhiều trong lá và vỏ dứa. Enzym tách từ dứa cũng thuỷ phân cazein tốt như papain, nhưng đối với hemoglobin tốc độ tăng lên 4 lần. Khi tách bằng sắc ký thu được bromelin không thuần khiết. Hỗn hợp bromelin gổm 5 phần khác nhau vể tính chịu nhiệt và khoảng dịch chuyển trên điộn dí, Điểm đẳng điện của các bromeỉin không thuần khiết tà 9,55. C hế phẩm không thuần khiết thuỷ phân đuợc este của arginin và amit, nhưng không thuỷ phân được L-ỉeucin. Bromelin được hoạt hoá bằng cystein và KC1, còn HgCl2 có tác dụng làm bất hoạt. bỉ Các ch ế phẩm enzym có nguồn gốc vi sinh vật - Alcalase 2,4L ; Neutrase 0,5L ; Esperase 7,5L ; Protamex ; Novozyme FM 2.0L chúng là các chế phẩm enzym chứa chủ yếu là endopeptidase thu nhận từ vi khuẩn. Các chế phẩm này được sử dụng để cải thiện các tính chất công nghệ, dinh dưỡng và hương vị của protein. - Flavourzyme MG ; Kojizyme đây là hỗn hợp của enzym exo- và endo- peptidase thu nhận từ nấm mốc. Các chế phẩm này dùng để tăng cường thuỷ phân protein. 6.1.4.2 S ử dụng các chế phẩm enzym trong công nghệ chế biến thịt Các chế phẩm enzym có thể được bổ sung dưới nhiều dạng : Muối làm mềm, tiêm vào gia súc trước hay sau khi giết mổ. a! Muối làm mềm Muối làm mềm chứa 30g papain trong 1 kg muối ăn. Sự có mặt ciìa NaCl cho phép khuếch tán tốt han enzym và phân giải m ột phần cấu trúc protein, do dó ỉàm cho cơ chất lại gần protease hem. Hoạt độ xúc tác của protease đưa từ ngoài vào bị hạn chế khi bảo quản thịt ở nhiệt độ thấp, nhưng trở nên cực đại vào giai đoạn đầu khi nấu. Hiệu quả của chúng càng cao khi nâng nhiệt độ chậm. Đối với papain hoạt độ tối đa ở 40 - 5Ơ’C, vầ bị vô hoạt 242 bởi nhiệí ở nhiệt độ vượt quá 75 - 80‘'C. Muối làm mềm thịt được đưa vào ngay trước khi nấu bằng các phương pháp : Ngâm thịt vào dung dịch có chứa hỗn hợp protease, giữ ớ pH và nhiệt độ xác định. Hiện nay, phương pháp này được dùng phổ biến và thuận lợi hơn cả. - Tẩm bột làm mềm thịt (protease, muối, mì chính) trên bề mặt thịt. » Bảng 6.2. Chế phẩm enzym protease sử dụng trong công nghệ chế biến thịt Enzym Papain Phyxin Bromelin Nguồn gốc Thực vật cây đu đủ quả sung dứa Hiệu quả phân huỷ Sợi cơ Colagen ++++ +++ + ± ± Hiệu quà làm mềm Cd bắp giàu tế bảo chức năng Các dạng cơ bắp khac ++■ +++ ++ + Vi khuẩn Colagenase Colagenase Protomesen terin Protosubtìlin Clostridium histoliticum achromobacter iophagus Bacillus mesenterícus Bacillus subtilis ++++ ++++ ... ++++ ++ ++ ++ ++ Nấm mốc Protease asp aspergiffus oryzae Trypsin Pancrealin Các động vật khác Dịch vị dạ dày Dịch tụy +++ +++ - ± ± +++ +++ . bị Tiêm chẽ'phẩm enzym vào trước khi giết m ổ Dung dịch đậm đặc của papain được tiêm vào ven tĩnh mạch của động vật 10 - 30 phút trước khi giết mổ để Í Ổ có thể theo máu vào các tế bào cơ bắp {đảm bảo chắc chắn sự phân bố đồng đều trong các bộ phận con vật). Dung dịch 5% enzym được tiêm vào ở dạng không hoạt động, trong enzym 1 243 này mạch bên Cys-25 bị oxy hoá tới dạng dẫn suất disulfit. Papain tồn tại dưới dạng bị oxy hoá này trong động vật sống. Nếu động vật không bị giếi enzym sẽ bị thải ra. Sau khi giết mổ sự phân huỷ glucose vẫn tiếp tục nên loại bỏ các cơ chứa oxygen, đo vậy các chất lưu huỳnh và các tác nhàn khử khác tích tụ và papain trở nên hoạt động. Quá trình hoạt hoá xảy ra chậm ờ thịt ướp lạnh, nhưng nhanh ở thịt ấm. Tiến hành vô hoạt enzym bằng sự oxy hoá trước khi tiêm vào vật là hết sức cần thiết, vì enzym hoạt động sẽ gây sốc thần kinh nghiêm trọng trong hô hấp. Lượng papain được tiêm vào dao động từ 1 - 3mg Ị kg vật sống tuỳ theo độ tinh khiết của ch ế phẩm. Sau khi giết con vật được xử lý bình thường, nhưng thời gian chín của thịt giảm đi 2 lần (5 ngày thay cho 10 - 12 ngày đối với thịt bò). Tiêm enzym vào tĩnh mạch trước khi mổ cho phép tăng được độ mềm và tỷ lệ thịt sử dụng làm bít tết hay quay, nhưng nó cũng ỉàm tích tụ enzym trong gan và thận, điều này gây ra mùi khó chịu. c/ Tiêm chế phẩm enzym vào sau khỉ giết m ổ Tiêm dung dịch enzym vào sau khi mổ cũng rất hiệu quả để làm mềm miếng thịt. Công nghệ này hứa hẹn một tương lai tốt hơn vì nó được người tiêu thụ dễ chấp nhận hơn. Tuy nhiên sự khuếch tán enzym trong tế bào cơ bắp sau khi động vật chết đòi hỏi phải có xử lý kèm theo (làm mềm cơ học hay xử lý bởi muối). Mặt khác phải sử dụng chế phẩm enzym tinh khiết để kiểm tra được lượng enzym thực tế tiêm vào, do đó giá thành cao hơn. Liều lượng sử dụng thay đổi tuỳ theo loại động vật (gà, cừu, bò ...) và công nghệ sử dụng enzym. Các cơ bắp có thể được tiêm hay nhúng chìm trong thùng chứa dung dịch enzym với nồng độ 0,1 - 0,001% tuỳ theo kích thước của miếng thịt, thời gian tiếp xúc và hiệu quả của enzym. dì Sử dụng enzym đ ể làm tăng giá trị các sản phẩm phụ của thịt • Sản phẩm thuý phân làm chất độn giống thịt Sử dụng các loại protein động vật có giá trị thấp để thuỷ phân thành các sản phẩm có giá trị cao. Khi các chất thuỷ phân này được đưa vặo khối thịt thì hình dạng và vị của các sản phẩm đã trộn tương tự như Ịoại chưa trộn (thịt lợn muối, bít tết, thịt xay, giò xúc xích). Việc ứng dụng này của enzym protease ngoài lợi ích vê kinh tế, nó còn mang lại một số cải thiện về mặt công nghệ như sau : 244 - Trường hợp protein không được phân bố động đểu trong thịt, việc đưa thêm chất thuỷ phân vào sẽ nhận được loại thịt có hàm lượng protein đồng nhất hơn, đáp ứng được yêu cầu của khách hàng. - Nhờ đặc tính keo dính của chất thuỷ phân, sau khi phối trộn thịt nhận được sẽ không tiết nước, chấc hơn, dể cắt miếng hơn. - Việc phân bố hương vào thịt đã ngâm tẩm sẽ tốt hơn. Trong ứng dụng này người ta thường dùng chế phẩm enzym protamex. Nguyên liệu ban đầu là các sản phẩm phụ của thịt, xương gia súc, gia cầm trong các lò mổ. Nguyên liệu thô phải được nghiền trước khi thuỷ phân trong thời gian khoảng 30 phút tới 4 giờ tuỳ thuộc vào lượng enzym sử dụng và mức độ thuỷ phân yêu cầu. Hỗn hợp sau thuỷ phân gồm 3 phần : m5, dịch lỏng và protein không hoà tan. Chúng sẽ được tách ra bằng phưcmg pháp ty tâm hay gạn lọc. Dịch thuỷ phân thu được phải bảo quản bằng muối, thành phần của nó bao gồm : Protein : 66% Muối, tro ; 33% Mỡ : 1% Chất thuỷ phần dạng lỏng có chứa 33% protein được cho thêm vào thịt, tỷ ]ệ bổ sung ỉà 6 - 10%. Chất thuỷ phân có thể bổ sung vào cùng với các chất ngâm tẩm khác, đo đó không đòi hỏi phải thay đổi qui trình sản xuất. • Sản phẩm thuỷ phân như nước hầm xương thịt Nước hầm xưcmg thịt được sử dụng cùng với các loại rau thơm để tăng hương vị của các loại nước súp sấy khô, đóng hộp, các loại nước sốt, các sản phẩm đóng lọ, các sản phẩm thực phẩm đông lạnh, các sản phẩm thực phẩm cao cấp. Nhằm mục đích sử đụng này thường dùng chế phẩm enzym flavouzyme vì nó có những ưu điểm sau : - Hiệu suất thuỷ phân cao hơn chế phẩm enzym protamex. - Hương và vị của sản phẩm tốt hem. - Có thể nâng cao hàm lượng chất khô của sản phẩm. Các loại nước hầm này đặc sánh hàm lượng chất khô đạt tới 80% (thông thường 35 - 40%). 245 • Tâng giá trị của máu Máu là một sản phẩm giết mổ. Ngược với các sản phẩm khác từ động vật, máu rất ổn định về thành phần, nó chỉ thay đổi tuỳ theo từng loài. Trong thực tế chỉ có 73% máu được sử dụng, trong đó chỉ khoảng 12% thực sự có giá trị do sự hư hỏng của nó diễn ra nhanh, giá thành bảo quản đắt. Máu từ động vật nuôi là nguồn gây ô nhiễm lớn BOD > 67 g/1 đối với bò, > 207 g/1 đôi với lợn con. Thuỷ phân hemoglobin bởi ẹnzym cho phép nhận được các peptit có giá trị cao hơn. Protease lựa chọn là pepxin, bởi vì pH phản ứng là 1,8, do đó hạn chế đáng kể nguy cơ nhiễm tạp vi sinh vật. Các thực nghiêm trong thiết bị phản ứng cho phép nhận được ổn định peptit. Các peptit kích thuớc < lOkDa không có màu, còn peptit hem do có trọng ỉượng phân tử gần 20 kDa nên có màu rõ rệt. X ử lý khử màu với magiê nồng độ 40 g/1 ở 50°c trong Ỉh30 là cần thiết. Sản phẩm sau đó được loại muối bằng điện di rồi cô đặc và sấy khô. Các peptit nhận được có thể sử dụng làm m ôi trường nuôi cấy v s v nhiễm ỉạp của thực phẩm, làm giàu sữa mẹ. Hơn nữa một số peptit thể hiện hoạt tính sinh học. 6.4.I.3. Sử dụng các chế phẩm enzym trong sản xuất protein thực vật thuỷ phân aỉ Sản phẩm thuỷ phân dùng thay cho sữa mẹ Sử dụng chế phẩm enzym Hayouzyme để thuỷ phân cazein và protein của lúa mì với mức thuỷ phân trên 50% protein thưòng được đưa vào công thức sữa đặc biột cho trẻ em. bl Sản xuặt nước chấm magi Nguyên ỉiệu được sử dụng là đậu tương tách chất béo, gluten của iúa mì và ngô. Các sản phẩm thuỷ phàn có hương vị thịt và có màu nâu sẫm. sử dụng enzym Flavouzyme, Alkalaza và Protamex, thuỷ phân qua 2 bước trung tính và axit. Protein thực vật thuỷ phân bằng enzym đát hơn so với phương pháp thuỷ phẩn bằng axit nhưng cố các ưu điểm sau: 246 - Tạo ra các sản phẩm muối thấp hoặc không muối. Điều này rất khó thực hiện khi sử dụng phương pháp axit. Sản phẩm nước chấm đậu tương chứa 12 - 14% muối, do đó thường nước chấm đậu lương được pha chế với protein thực vật thuỷ phân 10% protein theo tỷ lệ 1 : 1 để đạt nước chấm đậu tương có chứa 6% muối. - Tạo ra sản phẩm phụ có giá trị cao. Flavourzyme và Kojizyme được bổ sung vào giai đoạn lên men với các thông số công nghệ: Thông 50 Flavourzyme Kojizyme 30-60 30-60 pH 5-7 4,5-6,5 Liều lượng (% protein) 1-2 1-2 Nhiệt độ (°C) \ Vô hoạt enzym: Chỉ cần tiến hành thanh trùng là đủ loại bỏ sự có mặt của enzym trong sản phẩm cuối cùng. Sử dụng chế phẩm enzym mang lại nhiều ưu điểm : Thòi ậian lên men ngắn nên tăng được năng suất, sản xuất được nuớc sốt có hàm lượng muối thấp. Có thể kiểm tra được mức độ thuỷ phân, do vậy tránh được nguy cơ tạo thành các sản phẩm phụ (vị đắng). Độ thuỷ phân 5% protein hay gây ra vị đắng và vị đắng sẽ mất khi độ thuỷ phân đạt trên 40%. sử dụng Flavourzyme và Kojizyme có thể đạt được độ Ihuỷ phân 1à 55%. Tăng được hàm lượng nitơ tổng số trong sản phẩm cuối cùng 20%. c! Chấi thơm tồng hợp từ thuỷ phân đậu tương bằng emym Tổng hợp e n z y m các sản phẩm thuỷ phân đậu tương đã được phát triển. Hỗn hợp các protease đặc hiệu khác nhau đã được sử đụng để cho phép phân huỷ mạnh protein. Phương pháp bao gồm 3 giai đoạn : * Đầu tiên endoprotease được sử dụng ò 60"C và pH = 8. Các protease kiềm tính của vi khuẩn không được sử dụng ưong giai đoạn này để tránh tạo nên các peptit đáng. pH không được điều chỉnh và giảm xuống tới pH = 5, đầu ũẽn tạo ra các peptit đắng, sau đó chúng được thuỷ phân. 247 - Hỏn hợp endoprotease - exopeptidase hoàn chỉnh việc thuỷ phán protein. - Cuối cùng hỗn hợp exopeptidase cung cấp những cơ chất cần thiết cho phản ứng Maillard. Mức độ thuỷ phân protein khoảng 40%. Bổ sung NaCl, đường, lipit vào hỗn hợp nhận được, sau đó sấy phun. Một số chất thơm có thể được tạo thành tuỳ thuộc vào lượng đường và sản phẩm thuỷ phân lipit bổ sung. 6.4.1.4. Sử dụng các chê phẩm enzym trong công nghệ chẽ biến cá Trong phần này chúng tôi đề cập tới việc sử dụng enzym làm phụ trợ trong chế biến thực phẩm nguồn gốc biển. a! Các sản phẩm ĩhuỷ phân của cá và tôm cua Phần lớn các sản phẩm cá được tiêu thụ trực tiếp, chỉ có một lượng nhỏ được chế biến thành dạng bột. Khoảng 50% lượng cá bị mất đi dưới dạng chất thải (phủ tạng, đầu, vụn cá) tói 70% đối vói tôm. Bột cá thô là những sản phẩm phụ có trữ lượng protein lớn có thể được tiêu thụ sau khi thuỷ phân bằng enzym. Các dạng sản phẩm được chuyển hoá, một phần là sản phẩm truyển thống (tự phân tự nhiên), hay tự phân công nghiệp mà mục đích của nó là biến đổi các chất protein có sẩn nhằm tăng thêm giá trị dinh dưỡng và kinh tế. Trên thị trưởng nhiều nhất là sản phẩm thuỷ phân enzym cá. • C á lên men tru y ề n thống Kỹ thuật lên men các sản phẩm biển đã được biết đến từ lâu như là một phương tiện bảo quản cá. Ở các nước Đông nam Á, hàng trãm triệu Lít nước mắm và mắm tôm được sản xuất ra hàng nảm. Hầu hét tất cả các loậi cá và tôm cua đều có thể được sử dụng làm nguyên liệu. Phương pháp sản xuất nước mắm rất đơn giản : cá được trộn với 20 - 40% muối và bảo quản ở nhiệl độ môi trường trong thời gian 6 - 1 2 tháng. Dịch thuỷ phân protein thu được có màu sẫm được lây ra, lọc và đóng chai. Nói chung một nửa nitơ amin có mặt ban đầu trong nguyên liệu nằm trong phần địch ỉỏng này. Trong quá trình chế biến cá truyền thống, phần lớn chuyển hoá là do enzym nội bào, các protease tiêu hoá. Lượng và hoạt độ của enzym cần thiết cho sự chín của sản phẩm phụ thuộc vào nhíếu yếu tố: mùa thu hoạch, chế độ nuôi, điều kiện lên men. 248 Đưa thêm protease ngoại bào có nguồn gốc vi sinh vật từ ngoài vào sẽ làm lăng rõ rệl quá trình thuỷ phân, rút ngắn thời gian chế biến. Mức độ thuỷ phân phải được theo dõi chặt chẽ để tránh tạo thành peptit quá nhó, là nguyên nhân gây ra vị đắng. • Sản x u ất nước m ắm Sản xuất nước mắm theo phương pháp lèn men tự nhiên mất rất nhiều thòi gian, từ 6 tháng đến 1 năm. Nếu bổ sung một lượng rất nhỏ protease vào quá trình ủ chượp thì thời gian làm nước mắm sẽ rút lại còn rất ngắn chỉ từ 15 đến 30 ngày. Hiệu quả kinh tế nhất của việc bổ sung enzym là cấy một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt độ cao và chống chịu được các điều kiện bất lợi vào nguyên liệu trong quá trình ủ chượp (NaCl 4M). Các loài vi khuẩn có khả nâng sinh tổng hợp protease gồm có Baciiius subtiỉis, B. Megaieriitm, B. Cereus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Haỉobacterium... Nước mắm Thái lan từ hỗn hợp cá với muối theo tỷ lệ 3 : 2, sản phẩm cuối cùng nhận được sau 6 —12 tháng. Việc sử dụng 3 loại enzym thực vật (bromelin, papain, phyxin) cho sản phẩm nước mắm có hương vị nhẹ, có thể bổ sung vào nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền thống. Bromelin (nồng độ 0,8%, cofactơ xystein 0,025M, 33"C) cho kết quả tốt nhất và sản phẩm có chất lượng được chấp nhận thu được sau 21 ngày. Sử dụng bromelin cho phép nhận được sản phẩm thuỷ phân ít có vị đắng. Sử dụng hỗn hợp trypsin: chymotrypxin (50 : 50) ; nồng độ 0,3% ; 37°c cho phép giảm thời gian ủ chín 2 tháng mà vẫn giữ được hương vị theo yêu cầu của nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền thống. bí Bột cá Cá đừợc nghiền, sau đó trộn với nước 60”C theo tỷ lệ 1:1 (g/v). Trường hợp cá nhiều mỡ, bổ sung hỗn hợp etoxyquin và galatte etyl (1:1, 0,01% theo chất béo) như là chất chống oxy hoá. Papain được bổ sung vào theo tỷ lệ 0,05%. Hôn hợp đượe giữ với sự khuấy trộn trong thời gian 30 phút, sau đó phản ứng được dừng lại bằng cách đun nóng tới 10Ơ'C trong thời gian 10 phút để làm biến tính enzym. Sau khi lọc, sản phẩm thuỷ phân được sấy khô. Bột cá nhận đươc chứa 93% chất khô, trong đó 82% protein, 2% lỉpit và 6% tro. 249 d Các ứng dụng khúc của emym • Đ ánb Yẩy cá Đánh vẩy cá bằng enzym được sử dụng trong trường hợp xử lý cơ học không thể đáp ứng được. Kỹ thuật dựa trên cơ sở sử dụng một hỗn hợp protease của cá để phân huỷ tế bào cấu trúc liên kết với vẩy cá. Tế bào này chủ yếu chứa colagen, mà tính ổn định của nó đao động tuỳ theo kích thước và loại cá. Do đó, điều kiện thuỷ phân phải được xác định đối với từng trường hợp. Trong thực tế, dung dịch enzym được hoà tan trong axit axetic 0,5%, sau đó cá được giữ ở nhiệt độ đã định trong khoảng thời gian thích hợp. Phương pháp này thường không cho kết quả tốt đối với các loại cá nhiều chất béo, da của nó thường bị tuột ra khi rửa. Bảng 6.3. Các điều kiện thực hỉện đánh vẩy bằng enzym Nhiệt độ (°C) Thdi gian tác dụng 2 3 - 1 1 giờ 10 1 - 5 giò 1 5 -2 0 15 phút • Nhận xót phụ thuộc vào kích thước cá với máy đổng hoá đổi với cá nuớc nóng 25-30°C Làm mềm cấu trúc thịt Sử đụng enzym để làm mềm m ô thịt được sử đụng từ ỉâu ở các nước nhiệt đói. Sò, ốc được trộn với quả đu đủ bảm nhỏ để được làm mểm. Papain tự nhiên có mặt trong quả làm mềm thịt bởi sự thuỷ phân m ột phần protein. • Bảo quản cá bầng enzym Phun dung dịch glucose, gluco-oxydase và catalase lên bề mặt của cá cho phép tạo ra axit gluconic và H20 2 làm giảm pH và hạn chế phát triển của vi khuẩn. Kết quả nhận được bằng phương pháp này thấp hơn lysozym. Lysozym là enzym có khả năng xúc tác thuỷ phân peptiđoglucan của màng vi khuẩn. Lysozym được sử dụng ỏ Nhật Bản để bảo quản các sản phẩm biển lạnh đông như trai hay tôm. Lactoperoxydase được tách chiết từ sữa và xức tác oxy hoá thiocyanat (vSCN ). ion hypotiocyanat được tạo nên (OSCN ), hợp chất trung 'gian của sự oxy hoá, có hoạt tính kháng khuán. 250 6.1.5. Sử dụng các ch ế ph ẩm enzym trong công nghệ sữa 6.1.5.Ị. Enzym đông tụ của sữa Sản xuất phomat cần một giai đoạn đông tụ sữa, giai đoạn này cho phép đẩy ra một phần nước và các chất hoà tan, do đó ngưòi ta nhận được vẩy sữa hay gọi là phomat không tinh chế. Một số các enzym đông tụ của sữa được phân ra như sau : - Dịch v ị : tách chiết nhận được từ dạ dày cùa bò sữa và có tỷ lệ : khối luợng chymosin hoạt động/ khối lượng pepxin hoạt động = 1,38. - Pepsin bò : tách chiết lỏng nhận được từ dạ dày bò trưởng thành có tỷ lệ khối lượng chymosin hoạt động/ khối lượng pepxin bò hoạt động < 0,154. - Hỗn hợp của dịch vị và pepsin bò cho phép với tỷ lộ 2/ 2 hay 3/ 1 tuỳ theo độ giàu về chymosin. Hiộn nay gen của chymosin đã được tách dòng trong nhiều vi sinh vật để có thể sản xuất enzym này bằng phương pháp lẽn men. Enzym vi sinh vật thể hiện là một chất đông tụ thay thế tuyệt vời bởi tính chất của nó không khác xa với tác dụng của dịch VỊ bò sữa. - Protease axit có nguồn gốc nấm mốc : protease axit sử dụng trong cống nghiêp phomat nhận được từ nuôi cấy nấm mốc Endothia parasitica, M ucor pusillus hay M ucor miehei. - Chế phẩm có nguồn gốc thực vật : tách chiết từ hoa của Cynara cardunculus, hiện chúng đang được sử dụng rộng rãi đối với một số phomat truyển thống. aì Các tính chất chung của emym đống tụ Dịch vị (hỗn hợp của chymosin và pepsin) là các protease thu nhận được tù dịch dạ dày. Các enzym này được tiết ra dưối dạng không hoạt động (hay zymogen). Nó phải ưải qua một giai đoạn chuyển hoá thành enzym hoạt động ở điều kiện axit của địch đạ đày. Đây ỉà các enzym protease axit đặc hiệu mang 2 gốc aspartic trong tấm xúc tác của chúng. Các enzym đông tụ tạo nên một nhóm tương đối đổng nhất, bởi vì nó thích tấn công nhữiig 251 liên kết peptit được tạo nên từ các axit amin kồng kềnh và nói chung chúng kỵ nước như phenylalanin, leucin hay tyrosin. Tồn tại sự giống nhau tuơng đối rõ rệt giữa pepsin của bò, chymosin và protease của mucor. Các enzym đông tụ sữa có các tính chất chung sau: - Hoạt tính đông tụ sữa '.Trong số các protein của sữa, tất cả casein đều chứa 1 dưới dơn vị casein K đóng vai trò chất bảo vệ keo toàn bộ các chuỗi protein trong sữa bằng cách duy trì ở trạng thái phân tán và ổn định. Enzym đông tụ có khả năng xúc tác chuyển hoá các casein K qua 3 giai đoạn tạo ra hiện tượng đông tụ sữa. - Hoạt độ thuỷ phân protein chung. Protease của Endothia parasitica là enzym có hoạt độ thuỷ phân protein mạnh nhất đối với casein hoàn chỉnh cũng như casein c%(, casein /3 và casein K. Đường cong thuỷ phân protein của casein hoàn chỉnh và casein K bởi protease Mucor pussilus có tính chất tương tự tính chất của thuỷ phân protein bởi chymosin, do casein c%| và casein K ít bị thuỷ phân. Các casein ^( và casein jS được thu ỷ phân nhiều hơn bỏi protease của Mucor miehei so với Mucor pussilus. 0 • Các yếu tố ảnh hưỏng tới thuỷ phân casein K pH: pH tối ưu đối với chymosin và pepsin bò lên các peptitnhỏ chứa phemet là 4,7 và 5,3 - 5,5 lên đoạn H is-98-L ys-lH của casein K hay lên chính casein K. pH tối ưu đối với tác dụng của dịch vị giai đoạn đầu trong sữa là 6,0. Đối vối hầu hết các loại phomat sữa được dịch vị hoá ở pH = 6,5. Lực ion: tăng lực ion (0,01 - 0,11) giảm tỷ lệ thuỷ phân peptit His 98 Lys 112, ảnh hưởng trở nên đáng kể khi pH phản ứng tăng lên ở Im M CaCl2, NaCl và MgCl2 kích thích íhuỷ phân casein K Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho đông tụ sữa bởi dịch vị ở pH = 6,6 là 45"C. Xử lý nhiệt sữa: xử lý nỊìiệt sữa có ảnh hựởng nghịch tới đông tụ dịch vị ở T > 65"C và bị cản trở bởị xử lý nhiệt > 90°c trong 10 phút. Ảnh hưởng nghịch của nhiệt có thể đựợc đảo ngược lại nhờ việc axit hoá trước hay sau khi xử lý nhiệt hoặc bởi bổ sung CaCl2. 252 b! Vai trò của các túc nhân đông tụ trong quá trình ủ chín phomat - Lượng tác nhân đông tụ được giữ trong vẩy sữa: trong quá trình tách nước, một phần tác nhân đông tụ đi theo dịch sữa, phần khác nằm lại trong vẩy sữa. Tuỳ thuộc vào các điều kiện công nghệ lượng enzym này nầm trong khoảng 6 - 40%. Đối với dịch vị bò thì sự phân bô giữa vẩy sữa và dịch trong phụ thuộc nhiều vào pH, nếu pH càng thấp thì lượng dịch vị được giữ lại càng lớn. Trong khi đó các enzym của Mucor lại ít chịu ảnh hưởng hơn. Người ta thấy protease đông tụ từ nấm mốc Mucor được giữ lại trong vẩy sữa ít hơn chymoxin. - Phân huỷ protein trong quá trình ủ chín phomat: một phần (thậm chí là rất nhỏ) enzym đông tụ được giữ trong vẩy sữa thường là nhân tố thuỷ phân protein đầu tiên nằm trong cơ chế chung thuỷ phân casein trong quá trình ủ chín phomat. Sự thuỷ phân protein này cải thiện cấu trúc của vẩy sữa và chuẩn bị cho tác động của enzym vi sinh vật. Thường sử dụng các chế phẩm enzym dịch vị và một số protease vi sinh vật từ Mucor và Asp. Candidus. Dịch vị thương mại giải phóng chu yếu cấc peptit có trọng lượng phân tử lớn và thực tế khôĩig can thiệp vào giải phóng các peptit rất ngắn và các axit amin tự do. Việc giải phóng cág peptit bởi dịch vị thương mại chỉ đù để đạt các giá trị nitơ hoà tan ở pH = 4,6 giống như nhận được trong phương pháp truyền thống. Enzym đông tụ của mucor mang tính chất gần giống dịch vị bò, còn enzym của endothia parasitica thuỷ phân protein tốt hơn và được tính như một enzym ủ chín. - Vấn đề đấng: trong quá trình ủ chín phomat, các enzym đông tụ có thể tạo ra các peptit có vị đắng, đặc biệt là enzym của endothia parasitica. tất cả các yếu tố tạo điều kiện cho việc giữ mạnh hơn tác nhân đông tụ trong vẩy sữa đều kéo theo xu hướng tạo vị đắng nhiều. Nhưng thực tế vị đắng khộng phải hoàn toàn chỉ do enzym đông tụ, mà một phần do chủng vi khuẩn lactic có hoạt động mạnh của protease thành tế bào. 6.1.5.2. Enzym Glucooxydase (beta-D glucoza : 0 2 - oxydoreductase, EC 1.1.3.4) Glucooxydase là enzym xúe tác sự oxy hoá glucose thành axit gluconic iheo sơ đồ phản ứng: 253 Glucose GD > glucono-ô-lacton Lactonase hay phản ứng tức thời + FADH, o , gluco oxydase +o * FAD + H ,0 catalase Axit gluconic H , O t l / 2 O; Glucooxydase được sử dụng như một chất chống oxy hoá đối với các sản phẩm giấu chất béo như bơ, bột sữa. Sử đụng glucooxydase cho phép tạo ra H2Q2 để hoạt hoá hộ thống kháng khuẩn (Lạctọperoxydase- ThioxyanatHydroperoxyt, LTP). 6.1.5.3. Một số chếphạm enzym được sử dụng trong công nghệ chế biến sữa Ngoài nước chua lạm đông tụ sữa, nhiều hoạt động enzym cũng được đưa vào trong sữa và dịch sữa. Trong giai đoạn đầu tiên, enzym lactase được đưa vào để thuỷ phân ỉactơsè tạo thành gỉucose. Có 3 loại lactase hay dùng trong công nghệ sữa : Lactase từ Aspergillus nỉger được cố định dễ dàng và có pH(,rl ở vùng axit, thích hợp cho làm dịch sữa. Lactase từ Aspergillus oryzae kém ổn định hơn, thích hợp trong điều kiện axit yếu. Lactase từ Kluyveromycesỷragiỉis, có pHlipl gần 6,0, được sử dụng trong sản xuất sữa tươi để tăng vị ngọt và cải thiện được độ hấp thụ lactose. Tác động lần lượt của lactase và glucooxydase lên sữa tươi, tạo ra axit gluconic, kéo theo sự giảm pH, do đó gây nên sự kết tủa đẳng điện casein. Cuối cùng cho ta một sản phẩm ngọt đặc của sữa chua. Trong sản xuất dịch sữa, người ta có t h ể ‘kết hợp hoạt động của glucoizomerase với hoạt động của lactase để thu được sản phẩm ngọt hơn. Thường sử dụng 2 enzym này ở dạng cố định. 254 Sữa luơi r TSừađísis 1 tụ... DịcIi sừa — Lactase -----------Sữanaọỉ Esterase lipase ~ Dịch ưiuỷ phân' cớ vỊnsọt Phoroat có vị "Iialie" Glucooxydase Glucoizomerase Sữa chua có vị ngọc Dịch thuỳ phan nsọt chứa 50% galácỉoie + 26% glucose + 24% fructose Hỉnh 6.1. Sơ đồ chế biên các sản phẩm từ sữa tươi. bí Công nghiệp sản xuất phomat Bổ sung enzym từ ngoài vào cho phép ta có sự biến đổi đặc hiệu hom ở nhiệt độ cao thúc đẩy các phản ứng tạo hương vị trong quá trình ủ chín phomat. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy : Bổ sung hỗn hợp enzym (protease axit, protease trung tính, lipase, decacboxylase và lactasé) thúc đẩy được quá trình ủ chín phomat. Protease axit từ v s v thường gây ra vị đắng, nhưng protease trung tính và peptidase lại tăng hương vị của phomat sau 1 tháng ủ ở 2Ơ’C. Xử lý sữa dùng để sản xuất phomat bằng beta-galactosidase cho phép ta giảm thời gian sản xuất, quá trình ủ chín phomat được thúc đẩy tới 50%, cải thiện hương thơm và cấu trúc của phomat thu được. • Sử dụng proíease ngoạỉ bào Có 3 phượng pháp bổ sung enzym, mỗi phương pháp đểu có những ưu và nhược điểm riêng. 1: Bổ sung enzym trực tiếp vào sữa đ ể sản xuất phomat Phương pháp này đảm bảo được sự phân bố đồng đéu enzym trong quá trình tạo Yẩy, nhung đặt ra ít nhất 3 vấn đề • Protease thường hoà tan trong nước và phần lớn enzym bổ sung nằm lại trong sữa trong. 255 Sữa trong bị nhiễm enzym phái dược xử lý nhiệt sớm nhất có thể dược, nếu sữa trong dược sử clụng làm nguồn protein thực phám tạo cấu trúc, do đó việc lựa chọn enzym bị hạn chế vì nó phái bị vô hoạt bới nhiệt độ xử lý của sữa trong. Trong thực tế bổ sung protease vào sữa để sản xuất phomat tạo ra sự thuý phân protein sớm và đột ngột, đây là nguyên nhân tạo ra nitơ hoà lan với nồng dộ lớn trong dịch sữa trong và cũng tạo ra peptit đắng trong quá trình ú chín phomat, peptit và axit amin gây ra nhiều cảm vị. Tính kỵ nước có bản chất tạo vị đắng. 2. Bổ sung enzym trực tiếp vào phomat vẩy Phương pháp này gặp một khó khãn lớn trong quá trình phôi trộn dám bảo sự phân bố enzym đồng đều trong toàn khối phomat vẩy. 3. B ổ sung enzym dược bao bọc vào sữa đ ể sản xuất phomat Protease dược gói trong liposom, vì vậy casein của sữa được bảo vệ khỏi thuỷ phân protein sớm, quá trình thuỷ phân này sẽ được thúc đẩy dần dần theo sư giải phóng protease nhờ sư thuỷ phân các liposom trong vẩy sữa. Các bao enzym phải đủ lớn đế có thể đi vào vẩy sữa và phái được nhả ra hoàn toàn sau khi tạo thành vẩy sữa. Đường kính của bao thường vào khoáng 0,2 - 4.5 ụm, với kích thước này có tới 90% bao enzym dược giữ lại trong vẩy sữa (thành phần cúa bao enzym là phosphatidyicholin và colesterol). Các bao này bị phá vỡ cũng có thể do sốc thẩm thấu về nồng độ muối hay hoạt động của phospholipase. • Sử dụng lipase ngoại bào Lipase chủ yếu được sử dụng để sán xuất phomat có hương vị Italy. Nguồn lipase được lấy từ động vật (dạ dày bò, cừu, dê non), từ nấm mốc (A. nigér ; mucor miehẻi). Các axit béo tự do được giải phóng ra từ sự thuỷ phân có thành phần rất khác nhau tuỳ theo nguồn enzym dược sử dụng. Lipase nguồn gốc động vật giải phóng chù yếu axit béo bay hơi (C4 : 0 và C6 : O). Lipase nguồn gốc vi sinh vật (penicillinm camembert và penicillins roqueforti) là lipase kiềm tính pH,)pl = 9,0 ớ T = 30"C, nhưng nó vẫn hoạt 256 động tới pH = 4,5, độ bền hoạt lực được tăng lên nhờ Ca+2. Các axit béo dược giải phóng ra có phân tử lượng thấp, được chuyển hoá tạo thành chất thơm. bỉ Sừ dụng p-galactozidase P -galactosidase (/?-D-galactozit galactohydrolase, EC 3.2.1.23): Enzym thành glucose và galactose. Do đó, enzym có tác dụng giảm được mức độ kết tinh và làm tãng độ ngọt của sữa có nồng độ cao. Việc sử dụng /? -galactozidase trong công nghiệp sữa đã mớ ra nhiều triển vọng. Lĩnh vực áp dụng chủ yếu là : sản xuất sữa và sản phẩm sữa có nồng độ actose thấp cho người bệnh thiếu p -galactozidase. Sản xuất sữa chua và phomat. Biến đổi các sản phẩm sữa dùng để sản xuất kem và sữa chua. Xử lý sữa trước khi lạnh đông. Sản xuất sừo và những chất làm ngọt dùng cho thực phẩm. Sử dụng yổ -galactosidase mang lại nhiều ưu điểm như : thuỷ phân lactose trong sữa để làm sữa chua nhằm mục đích tăng độ ngọt mà năng lượng không tăng, hương vị của sữa chua thu được không thay đổi. Thời gian sản xuất phomat được giảm xuống, chất lượng được cải thiện. Chống kết tinh đường là ưu điểm chính trong sản xuất các sản phẩm bảo quản lạnh, sữa cỏ đặc và siro lactose (glucose - galactose). Độ ngọt của siro glucose galactose có thể được cải thiện bằng cách đồng phân hoá glucose bởi glucoizomcrase. 6.1.6. Enzym tro n g công nghiệp chê biến tinh bột 6.1.6.1. Một số c h ế phẩm enzym thương mại al Termumyl 120L Được sử dụng trong quá trình dịch hoá tinh bột để đạt mức độ thuỷ phân cần thiết cho quá trình tiếp theo. Quá trình dịch hoá tinh bột được tiến hành trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ 105 - 110 C, do đó lợi dụng được tính ổn định nhiệt độ cao của enzym. Enzym thường được sử dụng để đạt mức độ thuỷ phân DE = 8 - 12, hoặc các mức độ DE cao hơn cần thiết cho sản xuất maltodextrin. Độ thuỷ phân tối đa đạt được khi sử dụng Termamyl là DE = 40. 257 Trong một số trường hợp enzym phải được khử hoạt tính một cách tuyệt đối sau khi hoàn thành dịch hoá, để hoạt tính không còn lại trong sản phẩm cuối cùng, maltodextrin. Điều kiện khử hoạt lính dung dịch DE = 20 tại 30% chất khô pH = 3,5 T = 95°c T = 0,5 phút pH = 4,0 T = 95°c T = 5 phút b! Fungamyl 800L Enzym a - amylase từ nấm mốc xúc tác chuyển hoá tinh bột và các dextrin thành chủ yếu là đưòng maltose. Được sử dụng để sản xuất sừô maltose nồng đô cao 40 - 60% maltose (2 - 7% glucose) hay sừô cổ độ chuyển hoá cao DE = 60 - 7 0 ; 35 - 43% glucose ; 30 - 37% maltose. Chế phẩm enzym cc-amylase này có nhiột độ tối ưu Top, = 60 - 65°c. Sản phẩm nhận được sau thuỷ phân chứa nhiểu maltose. Enzym có thể chịu được pH xuống tới 4,5 và không bị ảnh hưởng gì nếu thêm ion Ca+2. c/ Promozyme 200L Promozyme 200L là m ột chế phẩm chứa chủ yếu enzym phân nhánh pullulanase (EC.3.2.1.41, pullulan 6-glucano-hydrolase). Đ ây là enzym chịu nhiệt nhận được từ một chủng nấm mốc của loài Bacillus acỉdopuỉlulytỉcus. Promozyme xúc tác thuỷ phân lièn kết ctr 1,6 glucozit của các amilopectin đã được thuỷ phân m ột phần bởi enzym a - amylase và của các pullulan cố ít nhất 2 đơn vị glucose trong chuỗi m ạch bên. Do đố Promozyme thích hợp cho việc phân giải các m ạch nhánh của tinh bột sau khi dịch hoá, do đó giảm đước hàm lượng các oligosacarit trong dịch đường glucose. Trong sản xuất dường dextrin, promozyme được sử dụng trong giai đoạn đường hoá cùng với gìucoamylase. Sử dụng promozyme tăng tỷ lộ dextrin bằng cách giảm hàm lượng oligosacarit và cho phép giảm được hàm lượng glucoamylase sử dụng. 258 Trong sản xuất đường maltose, promozyme được sử dụng đồng thời với fungamyl. Nhờ đó tăng được tỷ lộ maltose và giảm được lượng oligosacarit nhánh trong sản phẩm. Lượng enzym sử dụng phụ thuộc chủ yếu vào thời gian phản ứng, độ chuyển hoá mong muốn cũng như điều kiện nhiệt độ và pH. Thường Liểu lượng sử dụng thích hợp là 0,25 - 3 kg/ tấh tinh bột khô. Độ ổn định hoạt độ : pH và nhiệt độ là 2 yếu tố có ảnh hưởng đồng thời tói hoạt độ của promozyme. T = 62,5°c pH^pt = 5,0 T = 60°c pHop, = 4,5 T = 57,5°c pHopl = 4,5 - 5,5 So sánh độ ổn định của promozyme, của glucoamylase AM G và của pamylase cho thấy đưòng cong hoạt độ của chúng rất gần nhau. Như vậy fromozyme có thể sử đụng đồng thời cùng với các enzym đường hoá. Khi dịch đưòng hoá được xử lý qua trao đổi ion hay than hoạt tính sẽ loại bỏ được hoạt động của promozyme. Hoạt độ của nó cũng cố thể được loại bỏ khi đun nóng dịch tói 85°c Ưong thcd gian 5 phút hay 80°c trong 40 phút. • A M G 300L Enzym glucoamylase xúc tác thuỷ phân dextrin thành đường glucose. • D extrozym e 75 Đây là hỗn hợp cân bằng của AMG và promozyme dùng để sản xuất đường glucose có hàm lượng cao, nhờ tiến hành song song 2 quá trình phân giải nhánh và tạo glucose. • B A N 240L Chế phẩm chứa chủ yếu enzym a-am ylase được tách chiết từ vi khuẩn. Enzym thường đuợc sử dụng để dịch hoá tinh bột thành các dextrin phân tử lượng thấp ở nhiệt độ 90°c. 259 • Sweetzyme 350T Chế phẩm chứa chủ yếu enzym glucoizomerase xúc tác chuyển hoá glucose thành fructose. Do đó enzym thường được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đường fructose. 6.1.6.2. Công nghiệp sản xuất các loại đường và các loại m ật tinh bột • Sản xuất đường glucoza và các loại m ật tinh bộ t Khi thuỷ phân tinh bột bằng enzym của vi sinh vật không xảy ra sự phân huỷ đường bởi axit và bởi nhiệt và không xảy ra sự phân huỷ các tạp chất có lẫn trong tinh bột (protein, cellulose...) làm cho chất lượng của dịch thuỷ phân tốt hơn. Dễ dàng tinh chế hơn. Trong những năm gần đây ở nhiều nước trên thế giới người ta đã sử dụng amylase của vi sinh vật với qui mô lớn để sản xuất glucose tinh thể, glucose khan, glucose nưóe và các loại mật tinh bột khác. Khi đó hiệu suất thu hồi glucose tăng lên nhiều có thể lên tới 106 - 109% so với trọng lượng tinh bột. Hiệu suất chuyển hóa cao (>95%), độ phân cắt chính xác, nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm và giảm giá thành sản phẩm một cách đáng kể. Mặt khác dùng phương pháp enzym tiện lợi trong việc sử đụng các trang thiết bị cho sản xuất, giảm tiền đầu tư thiết bị, do đó cũng giảm được giá thành sản phẩm. Sử dụng enzym còn cho phép tăng gấp đôi, gấp ba nồng độ tinh bột đem thuỷ phân (tới nồng độ 30 -40%) và đơn giản hoá quy trình xử lý dịch thuỷ phân. Ngoài ra cho phép không cần tách tinh bột sơ bộ trước mà có thể chuyển hoá trực tiếp nguyên liệu chứa tinh bột thành glucose. Thường sử dụng các enzym amylase và glucoamylase để sản xuất mật tinh bột và glucose. Transglucosilase làm giảm hiệu suất thu hồi glucose nên muốn có hiểu suât glucose cao phẩm glucoamylase. Trong các chế phẩm amylase cũng không được lẫn protease vì enzym này sẽ làm bẩn dịch thuỷ phân tinh bột bởi các sản phẩm thuỷ phân của protein. 260 ứng dụng các sản phẩm thuỷ phản Sản phẩm thuỷ phân Lĩnh vực áp dụng chính Dịch glucose và malto-dextrin Mứt quả, thức ăn trẻ em, thức ăn kiêng, công nghệ lên men Dịch thủy phân có DE 97 Công nghệ đường glucose, công nghệ ên men, sorbitol, isogiucose Glucose kết tinh nghiệp Mứt quả, siro và rượu mùi, công nghệ ên men, sorbitol-mannitol, fructose Siro fructose Đổ uống, thức ăn nhanh, bánh mì và dồ h( >p Isoglucose Nước giải khát, nước quả, mứt quả, fructos e Siro maltose Công nghệ bia, siro, mứt quả • Sản x uất đường fructose Fructose là đường có độ ngọt cao nhất, ngọt gấp 2,5 ỉần glucose. Để mớ rộng khả nãng sử dụng các dần suất có vị ngọt từ tinh bột, người ta tìm cách chuyển hoá đường glucose thành fructose. Có thể thực hiện quá trình này bàng phương pháp hoá học, tuy nhiên do thiếu tính đặc hiệu cũng như do thiếu các điều kiện tiến hành phản ứng khắc nghiệt về pH và nhiệt độ, nên một phần sản phẩm tạo thành bị phân huỷ làm cho hiệu suất thu hồi thấp. Đổng phân hoá bằng phương pháp enzym thường cho ta kết quả khả quan hơn. Khi dịch glucose đưa sang công đoạn đồng phân hoá cần phải tuân thủ một sô' nguyên tắc sau : Dịch đường glucose phải được làm sạch để giữ được hoạt lực của enzym (lọc, tẩy bằng than hoạt tính, trao đổi ion). - Dịch sau khi làm sạch phải có [Ca+2] < 10'6M, vì cation này sẽ làm mất hoạt lực của glucoisomerase. - Bổ sung Mg+2 vào dịch glucose: [Mg+2] * 5.10'4M, vì cation này có tác d ụ n p ằ rh tăng độ bền của isomerase. - pH được chỉnh tới pH = 7,5 - 8,2. - Nhiệt độ thích hợp là 6Ơ’C. - Tách fructose có thể sử dụng phương pháp trao đổi ion Ca+2. 261 6.1.6.3. M ột sô' công nghệ sản xuất các loại đường từ tình bột có sử dụng chếphẩm enzym SO ĐỔ DỊCH HOÁ CAO ÁP KẾT HỢP s ử DỤNG TERMAMYL Hồ hóa dịch hóa Sữa tinh bột hóa —► Đường hóa 1 Teimamyl Maltodextrin Điểu kiện <— Tinh chế, cô đãc Hổ hóa □Ịch hóa pH loại 120L (loại LS) Nhiệt độ (°C) 6,0-6,5 5,7- 6,2 105 95 Thời gian giữ 5 phút Hàm lượng tinh bột (%CK) 30-40% hay 17-22 Bome 1-2 giờ Hàm lượng Canxl 30-60ppm Termamyl 120L (kg/tCK) 0,5-0,7 Termamyl LS (kg/t CK) 0,35-0,5 DE cuốỉ cùng đạt đuợc 8-16 S ơ ĐỒ ĐUỒNG HOÁ • Đường hoá sản xuất maltođextrỉn; sirô glucose Dịch bột sau dịch hoá — Ị— * Đường hoá ------ * Tinh chế, cô đãc BAN T AMG Ị r 1 DE 30 DE 42 Loại khác Điều kiện Độ DE của tinh bôt dich hóa Nồng đô chất khô (%CK) pH Nhiệt độ (°C) Thời gian đưòng hóa (giờ) BAN 120L (kg/tấn CK) AMG 300L (ml/tấn CK) 262 12 35 6,0 75 6 1,5 20 35 4,5 58-60 6 150 Độ thủy phân (DE) Glucose (%) Maltose (%) cuốicùng nhận được 30 42 5 15 18 14 Đường hoá sản xuất sỉrôdextrose nồng độ cao Dịch bột sau địch hoá — Đường hoá ------ ' Tinh chế, cô đặc — f—► r — —1 Dextrozyme Đường tinh bội _ Sấy ___ sirỏ dexưose r nồng độ cao Kết tinh Tinh thể dextrin Đồng * phàn hói Điều kiện Độ DE của tinh bột dịch hóa 8-16 Nồng độ chất khô (%CK) 30-35 pH 4,3-4,5 Nhiệt độ (°Q 58-60 Thòd gian đường hóa (giờ) 40-70 Dextrozyme 225/75 (1/tấn CK) 0,7-1,1 Độ thủy phân cuối cùng nhân được (DE) 97-98 Dextroza cuối cùng nhận được (%) 95-97 Đường hoá sản xuất sin 5 glucose nồng độ cao Dịch bột sau dịch hoá — f—►Đường hoá ------►Tinh chế, cỏ dặc Fungamyl 1 AMG ..... r 1 30/30 các thành 30/^5 phần khác Điều kiện Đô DE của tính bổt dich hóa Nồng đô chất khô (%CK) pH Nhiệt độ C’C) Thời gian đường hóa (giờ) A M G 300L (mì/tấn CK) Fungamyl 800L (gAấn CK) 12 35 5,0 55 21 150 300 52 45 5,5 55 21 200 263 Độ thủy phân cuối cùng nhận được (DE) 62 60 Glucose (%) 30 30 Maltose (%) 45 30 ' Đường hoá sản xuất sirô maltose Dịch bột sau dịch hoá Tinh chè, cò đặc ---- T— * Đường hoá Fungamyl Maltoeenase promozyme Í T “10% Imaltose T 55% maltose Điều kiện Độ DE của tinh bột dịch hóa Nồng độ chất khô (% CK) 12-20 35 5,5 55 42 300 2 pH Nhiệt độ (°C) Thời gian đường hóa (giờ) Fungamyl 800L (g/ tấn CK) Maltogenase 4000L (kg/tấn CK) Promozyme 200L (kg/tấn CK) Glucose (%) Maltose (%) Maltotriose (%) 4 55 20 .H I 1 các thàrih phán khác 12-20 30 5,5 55 42 2 8 70 3 Đồng p h ân hoá sản x uất đường fructose (theo phương pháp liên tục và cố định enzym) Sứỏcó )Ecao Xử lý ' ban đẩu Cột cố định * enzym Sweetzyme' 55% fructose 90% fructose 264 «- Tinh chế, cỏ đặc 42% fructose Hệ thốns phân tách Điều kiện Nồng độ chất khô (%CK) 35-45 Hàm lượng dextrose (%) 94-97 pH (tại 25"C) 7,3-7,5 Nồng độ Mg trong siro (ppm) 40-50 Sweetzyme (kg/tấn CK) 0,09-0,14 Thành phần sản phẩm điên hình Fructose (%CK) 42 Dextrose (%CK) 53 Oligosacarit (%CK) 5 6.1.6.4. M ột sớ'các sản phẩm khác Các enzym thuộc nhóm này xúc tác quá trình chuyển một phần phân tử gọi là chất cho lên một phân tử gọi là chất nhận (transferase). Sự ạo thành cyclodexưin là ví dụ điển hình nhất trong trường hợp của tinh bột. Các enzym cyclodextrin glucantransferase (CGTase) và cylodextrin glucosyl-transferase là các enzym có khả năng chuyển hoá các mach thẳng của tinh bột thành phân tử mạch vòng quen biết dưới tên cyclodextrin. Tác động của enzym này rất phức tạp, bởi vì dường như nó xúc tác ít a 3 phản ứng với quá trình tạo vòng, nối mạch và thuỷ phân. Tao vòng từ các phân tử mạch dài G„n ^^ = ± G„(n - X) + C ycloG x • • Nối mạch hay liên kết các oligosacarit C ycloG n + A ^ Tạo sự không cân xứng Gn ; Gm ^ = ± G n +A ^(m +x Nhíẹt độ tối ưu cho hoạt động của các enzym CGTase nãm trong khoảng 50 - 70°c, pH tối ưu nằm giữa 5,0 - 7,0. Trọng lượng phân tử của enzym dao động từ 67000 đến 88000. pH tối ưu sản xuất ra các cyclodextrin nằm trong khoảng rộng 4,5 - 9,0. 265 B. Macerans sản xuất chủ yếu p-cyclodextrin. Lúc đầu tạo ra P' cyclodextrìn, tiếp sau là a-cyclodexưin và y-cyclodetrin. Tỷ lộ cuối cùng đạt được 42, 44 và 14 đối với a , p và y-cyclodextrin. B. magaterium sản xuất chủ yếu p-cyclodextrin Thuỷ phân tinh bột bằng enzym CGTase thường cho ta hỗn hợp a -, pvà Ỵ-cyclodextrin, cùng với cả maltose và các oligosacarit khác. Nói chung а , p-cyclodextrin được tạo thành nhiều nhất. Sử dụng cyclodextrin cho phép ổn định được sản phẩm, chuyển hoá từ dạng lỏng sang dạng rắn, giảm được bao bì. - Trong công nghiộp dược dùng cyclodextrin để sản xuất steroit, thuốc làm dịu đau, thuốc chống nhiễm trùng. - Trong nông nghiệp : các cyclodextrin làm tăng năng suất của ngũ cốc khi mầm đuợc xử lý bằng P-cyclodextrin. Trcmg công nghiệp thực phẩm : sử dụng cyclodextrin để sản xuất đầu ẫn, mỡ, chất thơm, chất màu.... Ị}-cyclodextrin được đùng để loại chất béo của sữa. б.1.7. C ông nghiệp sản x u ấ t bánh m ì và bán h kẹo 6.1.7.1.Công nghiệp sản xuất bánh mì và bánh bisqui A/ ứ n g dụng m ột số ch ế phẩm amylase Trong sản xuất bánh m ì đường khổng chỉ có ý nghĩa đối với quá trình lên men, mà còn có vai trò quan tĩọng trong tạo thành chất mùi và vị của bánh mì. M ột đối tượng khác đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chuẩn bị bột nhào đổ sản xuất bánh m ì là các chất protein trong bột. Các protein và sự biên đổi do enzym của chúng có tác dụng quyết định đến tính chất vật lý của bột nhào, đặc biệt là đến khả năng giữ khí. Do vậy ảnh hưởng tới độ nở, độ xốp và cấu trúc của ruột bánh. Độ xốp của bánh phụ thuộc vào sự tạo khí C 0 2 trong quá trình lên men bột nhào và khả năng giữ khí này của bột. Cụ thể hơn, độ xốp phụ thuộc vào hàm lượng đường, hoạt động amilaza, hàm lượng và tính chất của gluten ừong bột. 266 Trong bột mì thông thường hàm lượng đường thấp không đủ để nấm men tạo ra độ xốp cho bánh. Vì vậy đã từ lâu người ta quan tâm tới việc cho thêm amilase vào bột nhào. Các chế phẩm amilase dùng trong công nghiệp bánh m ì được sản xuất từ canh trường nấm mốc A.oryzae, A. awamori hoặc từ vi khuẩn. Trong đó amylase của nấm mốc là tốt hơn cả, do a-am ylase của nấm mốc nhạy cảm với nhiột hơn amylase của vi khuẩn và malt nên đễ bị vô hoạt khi nâng nhiệt độ lên tới 65 - 80"C. M ặt khác a-am ylase nấm mốc chịu được m ôi trường axit tốt hơn, phù hợp với điều kiộn hoạt động của nấm men trong bột nhào, sau đó vô hoạt ngay trong thời gian nướng bánh, nên có cho dư cũng không sợ tinh bột bị thuỷ phân quá mức cần thiết. Mặc dù vậy ở nhiều nước amylase của vi khuẩn vẫn được nghiên cứu để giữ cho bánh mì được "tươi" lâu nhờ độ thuỷ phân sâu sắc của nó. Các chế phẩm enzym thường được sử dụng l à : - AM G : enzym làm tãng hàm lượng glucose, tức là tăng khả năng lên men của bột nhào, tảng độ ngọt cho bánh mì và cải thiện m àu sắc của vỏ bánh. - F u n g a m y l: làm nỏ bánh, cải thiện cấu trúc của ruột bánh. - N o v a m y l: chống lão hoá tinh bột, giúp lưu trữ bánh lâu han với hình dạng như mới. - P entosan : enzym Pentosanase/ Xylanase giúp tăng cường độ nở, độ ổn dịnh của bột ủ. B/ ứng dụng một số chế phẩm protease Về nguyên tắc chung, hoạt độ của protease nội bào của túa mì rất thấp nếu không có sự nảy mầm. Do vậy, hoạt động của nó khổng được chú ý tới trong còng nghệ chế biến bột. Ngược lại người ta rất quan tâm tới protease ngoại bàò có nguổn gốc vi khuẩn và thực vật. Sử dụng protease trung tính (neutrase) phân giải protein trong bột mì cho phép thay đổi tính chất đàn hổi của gluten, đo nó làm mềm dẻo mạng lưói gluten, nhựng thuỷ phân kéo dài có thể phá huỷ nó; N hờ những biến đổi của pH trong thời gian sản xuất bánh protease trung tính hay kiềm sẽ hoạt động mạnh hơn vào thctì điểm nhào bột và các protease axit vào thời điểm lên men. 267 Bổ sung đồng thời amylase và protease tạo thuận lợi cho protease hoạt động, bởi vì các tâm hoạt động của enzym trớ nên dễ tiếp xúc với tinh bột sau khi thuỷ phân sơ bộ. Nói chung với mức độ thuỷ phân thấp (<10%) người ta nhận thấy sự tăng độ xốp (thể tích lỗ xốp tạo nên). Tuy nhiên nó kéo theo sự giảm lớn của sự ổn định lỗ xốp. Do vậy, cần lựa chọn loại enzym protease và mức độ thuỷ phân cho thích hợp. Chất lượng của bánh mì quyết định chủ yếu do hương và vị của bánh. Tạo thành màu của vỏ và chất thơm của bánh mì là do các phản ứng amin. Kết quả là tạo thành các sản phẩm trung gian - furfurol và oxymetilfurfurol. còn từ axit amin - aldehyt tương ứng trong đó ít hơn 1 nguyên tử cacbon so với axit amin ban đầu. Qua nghiên cứu người ta thấy khi sử dụng chế phẩm enzym , thì lượng dường khử và các dạng nitơ hoà tan tăng lên khá nhiều. Đây là nguồn tạo hành chất màu và chất thơm của bánh mì. Khi sản xuất bánh mì, thường cho vào bột đầu 0,002% (so với khối lượng bột) chế phẩm sạch cô đặc từ A Oryzae. Cho thêm chế phẩm enzym đã làm tăng hàm lượng axetal dehyt trong ruột bánh và trong vỏ bánh 6.1.7.2. Công nghiệp sản xuất kẹo Enzym đóng vai trò chuyển hoá chính là invertase hay c òn gọi là saccarase, enzym này xúc tác thuỷ phân saccarose thành glucose và fructose. Ngoài ra nó còn có khả năng phân giải một số trisacarit và tetrasacarit khác, chúng tách các phân tử glucose và fructose ở đầu và cuối mạch ra. Nước Saccarose Glucose + Fructose Inverla.se Sự thuỷ phân saccarose với sự có mặt của invertase hình thành glucose mạch vòng và fructose mạch vòng. Invertase bền trong khoảng pH = 3,5 J 5;5 hoạt động tốt ở-pH = 4,5. Nhiệt độ tối thích của enzym này khó xác định vì chế phẩm chưa tinh khiết có tính ổn định cao hơn. Nồng độ đường trong dung dịch ảnh hưởng lớn tới tính ổn định của nó, ở nồng độ đường loãng nhiệt độ thích hợp cho invertase 268 khoảng 55"C, còn khi nhiệt độ lên tới 65 - 70"C thì nồng độ đường phải cao hơn. Nhiệt độ tới hạn của enzym là 59”C, ở nhiệt độ này enzym sẽ bị phá huỷ nhanh chóng khi nồng độ đường loãng. Thuỷ phân saccarose đạt tốc độ tối đa khi nồng độ dịch đường 2 - 8%, khi nồng độ dịch đường đạt 70 - 80% thì tốc độ chỉ còn 1/4 tốc độ cực đại ở pH = 4,5. mmI mmgurnH H M H j Invertase của nấm men rất nhạy cảm với ion kim loại như Cu2\ Cd2\ Hg2+..„ đặc biệt là ion Ag+. Nó hoàn toàn mất hoạt lực khi có 7 - 8 AgVmol invertase, có thể do ion Ag+ liên kết với histidin bên trong phân tử enzym, nhưng không liên kết với nhóm -SH. Invectase rất nhạy cảm với ánh sáng. Khi có sự tham gia của oxy nó dễ dàng bị phá huỷ, ngay cả trong bóng tối dưới tác dụng của tia tử ngoại invectase bị phá huỷ nhanh chóng. Ngoài ra invectase còn bị giảm hoạt lực dưới tác dung của dòng điện xoay chiều và sóng siêu âm. 6.1.8. ứ n g d ụ n g enzym trong chê biến q u ả và rau 6.1.8.1. M ột sô' c h ế phẩm enzym được sử dụng trong chế biến rau và quả Sử dụng các chế phẩm enzym có thể coi là một trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Khi đó cần phải lựa chọn các chế phẩm enzym có chứa một lượng nhất định các phức hợp enzym. Trong nhiều trường hợp cần có các chế phẩm của các enzym riêng rẽ. Ngoài ra, chế phẩm enzym cần phải thoả mãn các yêu cầu công nghệ sản xuất từng loại sản phẩm cụ thể, không những chỉ về dạng phản ứng xúc tác, mà cả điều kiện tác dụng tức là pH, nhiệt độ, độ ổn định và một số yếu tố khác, quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm trong môi trường đã cho. Với một chế phẩm enzym không nên dùng để chế biến nhiều loại quả khác nhau hoặc dùng chể biến các sản phẩm khác nhau từ các loại quá ấy. Chế phẩm enzyme này được sản xuất từ A. niger, ở dạng dung dịch, có màu thẫm, mùi thơm nhẹ đặc trưng của sản phẩm lên men,chứa chủ yếu pectinase và có hoạt tính nhất định của hemicellulase. Nó có khả nâng phân 269 huỷ màng tế bào thực vật. Người ta thường sử dụng chế phẩm enzym này để xử lý quả nghiển và ngâm mô tế bào thực vật. Pectin hoà tan và không hoà tan cũng như các polysaccarit làm đục nước quả đều bị phân huỷ. • Pectinex 3XL và Pectinex AR Chế phẩm enzym được sản xuất từ một chủng chọn lọc của Aspergillus niger. Chế phẩm enzym ở dạng dung dịch màu thẫm, có mùi thơm nhẹ đặc trưng của sản phẩm lên men chứa chủ yếu pectinase. N ó có khả năng phân huỷ hoàn toàn araban thành arabinose, đồng thời thuỷ phân nhanh và hoàn toàn polyssacarit. Người ta thường sử đụng chế phẩm enzym này để xử lý làm trong nước quả, vì trong nứớc ép quả cô đặc thường chứa nhiều araban làm vẩn đục. • V iscozym el20L Chế phẩm enzym được sản xuất từ một chủng chọn lọc của Aspergillus niger. Chế phẩm enzym ở dạng dung dịch màu nâu, có tỷ trọng d = 1,2 g/ml chứa chủ yếu pectinase và một lượng lán cacbohydrolase bao gổm arabanase, glucanase, beta-glucanase và hemỉcelluỉase. Người ta thường sử dụng chế phẩm enzym này để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu ỉương. 6.1.8.2. ứng dạng các chếphẩm enzym • Ép cbiết dịch quả Đ ể nhận được dịch quả phải tiến hành nhiểu công đoạn : nghiền, ép, ly tâm hay lọc, sau đó tuỳ theo dạng sản phẩm mong muốn mà tiến hành làm trong, cô đặc và thanh trừng. Nghiền kéo theo hoà tan một phần pectin và thịt quả, môi trường phức tạp mà trong đó pha lỏng rất nhớt. Ria rắn tạo nên một khối nủa dẻo có khả năng giữ nước lớn ngăn cản thoát dịch quả khi ép. Bổ sung enzym pectinolytic vào khối thịt quả nghiền làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả. Thêm vào đó, Sự phân huỷ một phần tế bào quả bởi enzym tạo thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần vào cải thiện chất lượng cảm quan của dịch quả; Dịch quả từ dâu, dâu tây, nho rất giàu pectin, do đó dịch quả rất nhớt và không thể lọc hay ly. tâm -được vói năng suất lớn. 270 Hiện nay sử dụng enzym hỗ trợ cho quá trình ép ngày càng được mở rộng ra các lĩnh vực sản xuất khác, đặc biệt là chế biến táo. Thực vậy nhu cầu ngày càng tăng về các sản phẩm sản xuất từ táo (nước táo lên men, nước quả táo...) đòi hỏi phải kéo dài thời gian thu hoạch. Mặc dù đã sử dụng các biện pháp bảo quản lạnh nhưng vẫn chưa đáp ứng đaợc yêu cầu đặt ra. Viộc chế biến táo có độ chín cao cần thiết phải được hỗ trợ bằng tác đụng của enzym để tảng hiệu suất thu hồi khi ép. Ngược lại địch quả thu được sau khi ép chứa nhiều pectin hơn nên đục hơn và đòi hỏi phải có tác dụng hỗ trợ của enzym khác làm tăng độ trong cho sản phẩm thu được. A : pectinase hỗ ượ ép; Nghiên lén B : pectinase hỗ trợ chiết rút; c : pectinase + cellulase giảm độ nhớt; D : pectinase làm trong. Dịch quà nong Hỉnh 6.1. sử dụng enzym phân huỷ các polysacarit trong chế biến quả và rau. Bảng 6.4. Tóc dụng xử lý thịt quả bằng enzym tới hiệu suất thu hồi dịch quả Táo tươi Táo được bảo quản lạnh Không xử lý enzym 80-82% 70 - 74% Xử lỹ enzym khi nghiển 83-85% 81 - 83% Xử lỹ enzym dịch hoá 93-96% 93 - 95% Xử lý th|t quả Hoạt động ehứih của enzym giúp quá trình ép là thuỷ phân các khung xương chính của pectin, tức là endo-polygalacturonase, pectinmetylesterase 271 v à p e c tin ly a s e . M ứ c đ ộ tá c d ụ n g c ủ a m ỗ i lo ại e n z y m p h ả i đ ư ợ c k iể m soát k ỹ , vì e n d o -p o ly g a la c tu ro n a s e , p e c tin m e ty le s te ra s e tá c d ụ n g đ ồ n g th ờ i, trong k h i đ ó d ư th ừ a p e c tin m e ty le s te ra s e k ìm h ã m h o ạ t đ ộ n g c ủ a p e c tin ly a se . T h à n h p h ầ n c ủ a c á c p o ly s a c c a rit th ự c v ậ t c ủ a t ế b à o c ầ n th u ỷ p h â n ánh h ư ở n g trự c tiế p tới h iệ u su ấ t x ử lý e n z y m . K h ả n ă n g p h â n h u ỷ c ủ a m à n g tế b à o k h ô n g n h ữ n g p h ụ th u ộ c v ào lo ại thự c vật m à c ò n p h ụ th u ộ c v ào cá c loại tế b à o c ủ a c ù n g m ộ t lo ại th ự c vật. C á c đ iề u k iệ n b ả o q u ả n c ũ n g là m th a y dổi ít n h iề u tới k h ả n ă n g p h â n h u ỷ c ủ a t ế b ào d o n ó th a y đ ổ i m ộ t p h ầ n thành p h ầ n tế b ào. T u y n h iê n , c á c c h ế p h ẩ m e n iz m p e c tin b á n trê n th ị trư ờ n g th ư ờ n g dược sả n x u ấ t từ Aspergillus v à n ó c ó n h ũ n g h o ạ t đ ộ n g c ủ a a ra b in a s e và g a la c ta n a s e . D o đ ó , c h ú n g c ũ n g th a m g ia v à o v iệc tâ n g h iệ u su ấ t thu hồi d ịc h q u ả . Đ iề u n à y c h o th ấ y lợi ích lớ n c ủ a v iệc tái tổ h ợ p g e n sin h tổ n g hựp enzym /?-(l-4 ) galactanase của gen ớ A s p e r g illu s a c u le a tu s , tách dòng và biểu hiện Aspergillus oryzae. V i sin h v ậ t tái tổ h ợ p sẽ c ó th ể c h o ta c h ế phẩm e nzym giàu hoạt đ ộ g alactan ase, đ iều n ày cải thiện đ á n g k ể q u á trìn h ép. L iề u lư ợ n g e n z y m đ ư ợ c sử d ụ n g đ ư ợ c tạ o lậ p tu ỳ th e o lo ại q u ả và điểu k iệ n c ô n g n g h ệ (n h iệ t đ ộ , th ờ i g ia n tá c d ụ n g , lo ại h ìn h é p ). T h ư ờ n s ch ú n g đ ư ợ c d ù n g với liề u lư ợ n g 100 - 150 g / tấ n th ịt q u ả . T h ư ờ n g d ịc h q u á thu đ ư ợ c c ó h à m lư ợ n g c á c c h ấ t k h ô v à tro c a o h ơ n , m à u đ ậ m h ơ n v à pH thấp h ơ n m ẫ u đ ố i c h ứ n g (c à rố t, m ư ớ p , k h o a i tâ y , h à n h , m ơ , d ứ a , m ậ n ). Bảng 6.5. Enzym cần bổ sung khi xử lý táo phù hợp với phương pháp công njjhệ Đổ pecti n ho á/ làm trong Pectin lyí ise Pectin es erase Polygala< ,turonase Arabinas' ỉ xử lý enzym khi ép Pectin lyase Pectin esterase Polygalacturonase Arabinase Rhamnogalacturonase Galactanase xử lý enzym dịch hoá Pectin lyase Pectin esterase Polygalacturonase Arabinase Rhamnogalacturon ase Galactanase Xyloglucanase Endoglucanase Celllobiohydrolase Glucozidase 272 E n z y m h o á trư ớ c k h i n g h iề n c ũ n g làm g iá m đ ộ n h ớ t c ủ a d ịc h q u ả tạo đ iề u k iệ n th u ậ n lợi c h o q u á trìn h lọc, d iề u n à y c h o p h é p g iả m đ ư ợ c thờ i g ia n lọc c ũ n g n h ư th ờ i g ia n là m tro n g d ịc h q uá, c h ín h vì v ậy g iả m đ ư ợ c thờ i g ian cò đ ặ c d ịc h q u ả . • Ngâm dầm và ổn định necíar N e c ta r là c á c lo ại n ư ớ c u ố n g , m à nước q u ả n h ớ t c h ứ a m ộ t lư ợ ng lớn c á c c h ấ t ở d ạ n g h u y ề n p h ù . Đ ộ đ ụ c n à y ch ù y ếu là d o c á c t ế b à o đư ợc c h iế t ra v à cá c tậ p h ợ p t ế b à o . Sự p h â n tá n t ế b ào n à y n h ậ n đ ư ợ c d o sự p h ân h u ỷ p e c tin có độ m e to x y hoá th ấ p của các lá t m ỏng tru n g b ìn h bới e n d o g a la c tu ro n a s e . T u ỳ th e o q u ả x ử lý và đ ặ c b iệ t đ ố i với c a m q u ý t, n e c ta r tạo ra đ ộ đ ụ c n h iề u k h i rấ t k h ô n g ổ n đ ịn h . T ín h k h ô n g ổ n d ịn h n à y liên q u a n trự c tiế p tới h à m lư ợ n g p e c tim e ty le s te ra s e c ủ a q u ả : p e c tim e ty le s te ra s e c ủ a q u ả d ễ e s te h o á c á c p e c tin h o à ta n , n ó sẽ p h ả n ứng với c a n x i c ủ a m ỏ i trư ờ ng đ ể tạ o n ê n g e i p e c ta tc a n x i k h ô n g h o à tan , làm k ế t tủ a c á c p h ầ n tử g ây d ụ c. C h ín h vì v ậ y c á c c h ế p h ẩ m e n z y m tạ o đ ụ c p h ải k h ô n g đ ư ợ c c h ứ a h o ạ t đ ộ c ủ a en zy m p ectim ety lesterase. N gược lai, hoạt đ ộ củ a enzym en d opolygalacturonase p h ải đ ủ lớ n đ ể th u ỷ p h â n cá c p e c tin h o à tan đ ư ợ c ở d ạ n g o lig o m e r c ó k ích th ư ớ c p h â n tử q u á n h ỏ đ ể tạ o n ê n c á c gel. Đ ể trá n h tạo th à n h g e l p e c ta t, p ec tin h o à tan p h ả i c ó đ ộ m e to x y h o á ca o . V ấ n đ ề đ ặ t ra là k h ô n g c ó m ộ t c h ế p h ẩm e n z y m th ư ơ n g m ại n ào , k h ô n g c ó m ộ t lo ại q u ả n à o k h ô n g c h ứ a p e c tim e ty le s te ra s e . • Dịch hoá N g ư ợ c v ớ i n g â m d ầ m , d ịc h h o á đ ò i hỏ i c ó sự p h â n h u ỷ h o à n to àn c ủ a m à n g t ế b ào . Sự p h á h u ỷ h o à n to à n m à n g t ế b ào đ ò i h ỏ i tá c d ụ n g đ ồ n g thờ i c ủ a c á c e n z y m p e c tin a s e và c e llu la s e . T u y n h iê n , tỷ lệ h o ạ t đ ộ c ủ a c h ú n g c ó ả n h h ư ở n g tới h iệ u s u ấ t d ịc h h o á và th à n h p h ần p o ly sa c a rit c ủ a d ịc h q u ả . T h ự c v ậy , d ịc h h o á e n z y m c à rốt tạo ra n h iề u p e c tin h ơ n v à n h ớ t hơn khi d ù n g c h ế p h ẩ m e n z y m c h ứ a n h iề u e n d o g lu c a n a s e . E n z y m n à y là đ iể m m ấ u c h ố t cải th iệ n h iệ u su ấ t d ịc h h o á. C ác e n z y m p e c tin e s te ra s e , h e m ic e llu la s e v à c e llu la s e lạ i là n h ữ n g e n z y m q u y ế t đ ịn h h iệ u q u ả tá c d ụ n g c ủ a c h ế p h ẩ m , vì c h ú n g làm c h o đ ộ đ ồ n g th ế c ủ a n ư ớc q u ả c ó th ịt tố t hơn. T ro n g trư ờ n g hợ p n à y c h ế p h ẩm không được phép có enzym p o ly g a la c tu ro n a s e , đặc b iệt là endo- 273 polygalacturonase, vì chúng iàm giảm độ nhớt của dịch quả, gày kết tủa pectin. Hiệu suất tách chiết tốt nhất làm thay đổi đặc tính cảm quan của sản phẩm. Chính vì vậy, dịch táo nhận được bằng xử lý enzym nhiều khi có hương vị không thích hợp với người tiêu thụ và thường the thé hay axit và biểu hiện thiếu hụt về mùi vị. Vị the thé liên quan trực tiếp với sự giảm pH của dịch quả do thuỷ phân pectin. Những năm gần đây với sự phát triển của công nghệ enzym đã có nhiều chế phẩm enzym hoạt lực cao nên đã giảm được thời gian tác đụng và hoạt động ở khoảng nhiệt độ xác định tạo điều kiện cho các phản ứng mong muốn và kìm hãm các phản ứng có hại khác. • Làm trong Quá trình ép có được sử dụng hay không chế phẩm enzym, thì dịch quả thu được đầu là dịch quả thô, mà độ nhót và độ đục của nó rất cao. Làm trong là loại bỏ các phần tử gây đục. Loại bỏ các chất pectin có thể được thực hiện bằng cách kết tủa hay thuỷ phân. Trường hợp kết tủa, enzym thuần khiết pectimetylesterase được sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion canxi kéo theo sự tạo thành các gel pectat canxỉ, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trơng dịch quả, hay ngược lại chúng nổi lên bể mật khi lên men do tác dụng của C 0 2 : đây ià trường hợp sản xuất nước quả lên men độ rượu thấp, Làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzym pectimetylesterase và polygalacturonase. Các phần tử đục được tạo nên từ protein liên kết với các pectin thường có mạch bên giàu arabinan và gaỉactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dương và bao quanh nó là các lớp pectin tích điện âm. Phân huỷ pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dương và pectin tích điện âm. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng bởi tưang tác iĩnh điện với nhau và dịch quả đuợc làm trong. Hoạt độ của enzym pectimetylesterase thể hiện nhược điểm lớn là giải phóng ra metanol trong dịch quả. Sử dụng enzym pectinlyase để đề polyme hoá khống có đề metyl hoá đã được thử nghiệm. Kết quả nhân được đáp ứng yêu cầu trong trường hợp của cam, táo, nhưng chưa làm trong được hoàn toàn trong truờng hợp của nho. Sự khác nhau này lặ do múc độ metyl hoá 274 thấp của pectin nho. Thực vậy, ái lực của pectinlyase giảm xuống theo mức độ metyl hoá cúa cơ chất. Trẽn kbía cạnh công nghệ, làm trong có thể tiến hành gián đoạn hoặc liên tục. Phương pháp liên tục có ưu điểm dung hoà phản ứng enzym liên tục và phân tách đồng thời sán phẩm và enzym mà chúng có thể được tái sừ dụng. Mặc dù cải thiện tính chất lọc của dịch quả bằng sử dụng enzym vào các giai đoạn khác nhau của qúa trình chế biến thực vật, nhưng phương pháp siêu lọc để phân tách làm cho phương pháp này không có khả năng áp đụng đối với dịch quả nhớt nhất như đào. Hình 6.3. Sơ đồ của một thiết bị phản ứng liên tục dể iàm trong (Alkorta et al, 1995). • ứ n g dụng của một sô en/ym khác Các enzym phân huỷ polysacarit thực vật đượe sử dụng trong công nghệ sản xuất quả và rau. Sử dụng quả không đạt độ chín để sản xuất các sản phẩm cô đặc dễ bị đục bởi tinh bột. Chúng có thể được loại ra bằng việc sử dụng amylase. Các protease đôi khi cũng được bổ sung vào enzym pectiolytic, hoặc để cải thiện hiệu suất ép, hoặc để tránh tạo thành đục protein khi đun nóng, hoặc để tham gia vào cải thiện việc tách chiết chất màu trong sản xuất rượu vang đỏ. 275 VỊ đắng của một số dịch quả, cam và bưởi liên quan tối sự có mặt của naringin (trihydroxyflavanon 7-rhamnogIucozit). Chất này có thể bị thuỷ phân bởi naringinase giải phóng ra phần ozidic của phân tử và naringenin làm giảm vị đắng. Cập gluco-oxydase/ catalase có thể được sử dụng để loại bỏ oxygen và bảo vệ dịch quả khỏi sự oxy hoá. 6.1.8.3. ứng đụng enzym để tăng giá trị của các sản phẩm phụ thực vật • Thức ãn gia súc Thức ãn gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cqc. Glucan, thành phần của ngũ cốc không tiêu hoá được làm tảng độ nhớt của dịch dạ dày, do đó hạn chế sự hấp thụ lại các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hoá của động vật. Bổ sung beta-glucanase vào thức ăn cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hoá thức ăn của động vật. Sử dụng lúa mì làm thức ăn cho gà cũng bị hạn chế bởi sự có mặt của các polysacarit thực vật : arabinoxylan. Những chất này làm tăng độ nhớt của dịch đạ đày, do đó làm giảm khả năng tiêu hoá tinh bột và protein. Bổ sung xylanase vào thức ăn cho phép tăng năng lượng chuyển hoá. • Sản xuất etanol sinh học Sản xuất etanol sinh học sử dụng hệ enzym ligno-cellulase ( cellulase, hemicellulase, laccase,lignin-peroxydase,Mn-peroxydase để thủy phân sinh khối lignocellululọse (sản phẩm phụ nông sản, rác thải sinh hoạt) tạo glucose cho phản ứng lên men tiếp theo. Các vật liệu này rất bền với tác động thuỷ phân, do đó cần phải có xử lý hoá học hay vật lý trước giúp enzym tấn công cơ chất đễ đàng hon. Nhiều phương pháp sản xuất được đặt ra: - Phương pháp thuỷ phân và lên men riêng biệt, thực hiện trong 2 giai đoạn khác nhau : dịch hoá enzym, sau đó lên men bởi nấm men. - Chuyển hoá sinh học trực tiếp : thực hiện toàn bộ chuyển hoá chỉ trong một giai đoạn, mà ở đó vi sinh vật sử dụng có khả năng vừa thuỷ phân toàn bộ cellulose và lên men các đường tạo thành. - Đường hoá và lên men đồng thời là con đường hay được sử dụng nhất. Nó cũng diễn ra chỉ trong một giai đoạn với sự có mặt đồng thời của enzym và nấm men chịu trách nhiệm lên men. Cellulase bị kìm hãm bởi 276 glucose mà nó giải phóng ra, nên sự chuyển hoá nó ngay lập tức sẽ tạo điểu kiện nâng cao hiệu suất chuyển hoá. Cần phải thấy rằng trong thục tế thuỷ phân cellulose thành mortome rất khó khãn, trong khi đó lại có rất nhiều vi sinh vật có khả năng chuyển hoá monome này thành etanol. Nhưng các sản phẩm phụ giàu heteroxylan (gỗ, cỏ) rất dễ dàng phân huỷ thành các monome, nhung lại ít v s v có khả năng lên men rượu từ các pentoza. 6.1.9. Enzym trong công nghệ rượu cồn và bia 6.1.9.1. Enzym trong công nghệ rượu cồn aì Mội sô' c h ế phẩm enzym thường được sử dụng - Termamyl 120L - Neutrase 0,5L : Chế phẩm enzym chứa chủ yếu protease được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtiỉỉỉs. Đây là protease kiềm tính, protease kim loại (Zn) được ổn định bằng Ca2+ và bị ức chế bởi EDTA. Ngoài ra chế phẩm còn chứa một lượng nhỏ p-glucanase. Điều kiện hoạt động tối ưu cho protease là T = 45 - 55"C và pH = 5,5 7,5. Neutrase có thể bị mất hoạt tính bằng xử lý nhiệt T = 55°c trong thời gian X = 2 phút. - Sansuper 240L: Chế phẩm enzym được sản xuất từ nấm mốc Asperỉỉỉus niger, chứa glucoamylase, ngoài ra còn có a-amylase, protease. Chế phẩm enzym ờ dạng chất lỏng màu nâu, d = 1,25g/ml, hoạt tính 240 AGU/ml. b ỉứng dụng một s ố ch ế phẩm enzym Dùng chế phẩm các enzym amylase vi sinh vật cho phép tãng cao nồng độ enzym trong môi trường lên men, do đó cho phép thuỷ phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong một thời gian ngắn (chỉ cần 30 - 40 phút). Trong chế phẩm amylase dùng trong công nghệ rượu, ngoài enzym amylase ra còn có các enzym đồng hành khác nữa như protease và các enzym phân huỷ thành tế bào. Như vậy khi dùng chế phẩm enzym amylase không chỉ có tinh bột bị thuỷ phân mà cả thành tế bào nguyên liệu thực vật, màng, vỏ cũng bị thuỷ phân giúp cho tinh bột tiếp xúc với amylase tốt hơn. 277 Hiệu suất thu hổi rượu tăng lên trung bình là 1,5% nhờ các đường lên men được tạo thêm từ các polysacarit khác (hemicellulose, cellulose). Trong quá trình đường hoá, dịch hoá tinh bột trong công nghiệp rượu cồn, Sansuper thường được sử dụng với quá trinh nấu không áp suất. Liều lượng là 1 lít/] tấn tinh bột. Mặt khác enzym protease có trong các chế phẩm sẽ thuỷ phân protein, polypeptit của nguyên liệu tạo ra các axit amin làm nguồn đạm dinh dưỡng cho nấm men. Nguvẻn liều chứa tính bồt Hình 6.4. Nhũng công đoạn chính trong sản xuất rượu cồn có sử dụng enzym. Chế phẩm amylase không những chỉ được đùng trong giai đoạn đường hoá mà còn ờ cả giai đoạn hồ hoá nữa. Chế phẩm a-amylase của vi khuẩn dùng cho giai đoạn này rất thích hợp vì khả năng chịu nhiệt độ cao của enzym. Nhờ sử dụng chế phẩm enzym ở giai đoạn này mà hoạt động của thiết bị đễ dàng hơn (do độ nhớt của dịch bột giảm xuống) chi phí hcfi giảm, 278 hiệu suất rượu tăng, đặc biệt được sử dụng để dịch hoá tinh bột trong phương pháp nấu liên tục. Việc dùng a-amylse vi khuẩn để dịch hoá dịch bột khi nấu đến 85 - 90°c cho phép có thể hoàn toàn chỉ dùng hơi Ihứ cấp cho đun nóng sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi phí hơi trong gia nhiệt và làm giảm tổn thất tinh bột. Trong quá trình đường hoá, dùng chế phẩm glucoamytase hoạt động mạnh, giảm thời gian lên men từ 73 giờ xuống 48 giờ, {hậm chí 36 giờ, tăng nàng suất phân xưởng lên men từ 1,5 đến 2 lần. Tóm ĩại, áp dụng enzym trong sản xuất rượu cổn từ ngũ cốc có nhiều ưu điểm n h ư : nâng cao hiệu suất thu hổi cổn. Nấu nguyên liệu ngũ cốc bột tại nhiệt độ thấp. Không sử dụng axit (không làm hư thùng nấu), khổng gây nguy hiểm cho người phụ trách công đoạn nấu. Thiết bị nấu đơn giản. 6.1.9.2. Enzym trong công nghệ bia Trong sản xuất bia có thể dùng chế phẩm enzym amylase vi sinh vật ở các công đoạn khác nhau nhằm thay thế một phần hay thậm chí hoàn toàn malt bằng các nguyên liệu không nảy mầm khi dùng các chế phẩm enzym của nấm mốc và vi khuẩn. Nguyên liệu không nảy mầm thường dùng là ngổ, gạo, lúa mì, tiểu mạch. Bảng 6.6. Các enzvm sử dụng trong sản xuất bỉa (Slaughter, 1994) Chức năng Ấp dụng a-amylase Thuỷ phàn tinh bột tới glucose và olygosacarit Sử dụng khi malt chất lượng kém, hoặc sử dụng nguyên liệu thay thế khóng nảy mầm P-glucanase Thuỷ phân một phần các phân tử trọng luạng cao pgiucan Làm lỏng bổ sung Lọc dịch đưởng Protease Thuỷ phân các liên kết peptit Tăng khả nãng lên men Tãng khả nâng bọt của bia Amy loglucosìđase Thuỷ phân hoàn toàn tinh bột và dextrin tới glucose Sản xuất bia nhẹ độ a-axetolactat decacboxylase Để cacboxyl hoá axetolactat tới exetoin Quá trình ủ bía Enzym a- 279 Sử dụng chế phẩm enzym để nâng cao hiệu suất thu hồi sán phẩm, sủ dụng nguyên liệu thay thế, tăng khả năng lọc dịch đường, tăng độ hoà tan của các hợp chất nitơ, tâng khả năng giữ bọt và độ bền vững của bia. Bảng 6.7* Các chế phẩm a-amylase vi sinh vật dùng trong sản xuất bia N guổn chê' p h ẩm Fungamyl asp. oryzae Ceremix 2X L B. amyloliquefaciens Termamyl loại L B. Licheniformis Nhiệt S ản phẩm p h ả n ứng C a~ (ppm ) đô <°C) pH là 55-60 4,5-6 50 Nâng cao khả nâng lên men dextrin hoà tan, olygosacarit 60-80 5-7 250-500 Tăng khả nâng lọc địch đưởng dextrin hoà tan, olygosacarit 85100 6-7 50-150 Làm loãng dịch hổ hoá chủ yếu maltose Áp dụng Bảng 6.8. Các chế phẩm enzym (3-gIucanase sử dụng trong sản xuất bia N guồn c h ế phẩm Cereflo 200L s ẳ n phẩm p h ả n ứng Nhiêt đô <°C) pH Tâm hoạt đúng Olygosacarit không lẽn men được 50-60 6-7,5 Ơ-Amylase B. amyloliquefacjens Finizym 200L A. nigổr Glucose, cellữbiose, <60 4-4,5 Cellulase - olygosaccarit Các chế phẩm enzym amylase, glucanase và protease đã được sử dụng trong công nghệ sản xuất bia từ rất lâu, nhưng từ 5 năm trở lại đây một chế phẩm enzym mới được đưa vào sử đụng ngày càng nhiều, đó là chế phẩm Maturex. Maturex chứa chủ yếu là enzym a - axetolactat decacboxylase xúc tác quá trinh đề cacboxyl hoá a-axetolactat tới axetoin. Chế phẩm enzym được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtiỉis và Enterobacter aerogenese. Nó được sử dụng trong quá trình lên men để ngăn chặn sự tạo thành diaxetyl, do đó giảm lượng diaxetyl được tạo thành, rút ngắn được thời gian cần thiết để ủ bia. 280 Decacboxyl hóa ọ NH, Ọ CH--C - ỉ - C - ơ ỐH ơ.-axetolactat oxy hoá ------ — -------- ► c h 3- o o £ - 6 - ch3 (phản ứng ckậra) ÒH axetoin Hình 6.5. Chuyển hoá diacetyl. 6.2. ỨNG DỤNG ENZYM TRONG M ỘT s ố NGÀNH CÔNG NGHIỆP KHÁC 6.2.1. Công nghiệp dệt, nhuộm Trong công nghiệp dệt, việc sử dụng enzym đã được áp dụng từ những năm 50 của thế kỷ này. Trong kỹ thuật dệt vải, để làm tăng độ bền đối vói các tác động kéo và mài mòn, các sợi vải thường được hồ hoá trước vói các chất cao phân tử có khả năng kết dính với cellulose. Các chất kết dính thường dược dùng là tinh bột, gelatin, cacboxylmetyl cellulose hoặc rượu polyvinyl. Trong đó tinh bột dưới dạng tự nhiên hoặc biến tính là chất kết dính được dùng nhiểu và phổ biến hơn cả. Tuy nhiên trước khi tẩy trắng và nhuộm, vải mộc phải được loại bỏ các chất kết dính nhung yêu eầu không xâm hại đến các sợi vải. VỚỊ các sợi vải được hồ hoá bằng tinh bột, trưốe kia nguổn enzym từ nước chiết malt đại mạch hoặc pancrease được sử dụng để rũ hồ, tuy nhiên hai loại enzym này thường kém bén với nhiệt. Năm 1917, Boìdin và Effront sử dụng amylase của Bacilìus subtiỉis để rũ hồ ở nhiệt độ 80-90°C trong thời gian từ 5 đến 15 phút, rút ngắn được thời gian rũ hổ vải so với phương pháp truyển thống. Từ 281 đó đến nay, a-am y lase từ vi khuẩn đóng m ột vai trò quan trọng trong còng nghiệp dệt. Enzym chịu nhiệt từ B a c illu s lic h e n if o r m is được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực này có tên thương mại là termamyl, chế phẩm ở dạng lỏng, chịu được nhiệt độ cao, là một endo-amylase có tác dụng thuỷ phàn liên kết a 1-4 glucozit của tinh bột tạo ra các sản phẩm dextrin và oligosacarit tan trong nước. Trên thị trường hiện nay cũng xuất hiện một sô' chế phẩm aamylase dạng lỏng từ Bacillus subtiỉis với tên là Tinozym L40 hoặc Tinozym ADC có phổ pH hoạt động rộng từ 5-9,5 và chịu được nhiệt độ cao tói 95l,c đến 120l’C tương ứng với lượng dùng trung bình từ 2-4 ml/kg, xử lý trong thời gian từ 1-2 giờ tuỳ tùng quá trình. Vói những loại sợi được hồ hoá bằng gelatin (thường là những loại sợi nhân tạo như acetat, rayonne, visco...) người ta thường sử dụng các protease trung tính từ Baciỉỉus subtilis hoặc từ protease kiểm tính từ Bacillus licheniformis. Protease trung tính từ Bacillus siibtilis cũng được ứng dụng trong sản xuất tơ tằm làm tăng hiệu suất kéo kén đổng thời làm cho sợi tơ mểm mại và bóng mượt hơn. Sợi tơ tàm gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin. Lượng cerixin chiếm khoảng 30% sợi tơ và được tách ra bằng cách nấu với dung dịch xà phòng trong khoảng từ 1,5 đến 2 giờ. Chỉ sau khi có sự gia công này tơ mới được kéo chỉ. Một lượng nhỏ cerixin nằm lại trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và gây khó cho khâu trang trí lụa sau này. Lượng cerixin còn lại sau khâu nấu thường được tách ra bởi các chế phẩm protease. Đ ể nhuộm được vải,, sợi bông và sợi pha (polyeste/bông, polyeste/visco) cần tiến hành xử lý trước, trơng dó nấu là một công đoạn quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần khòng phẫi cellulose ra ngoài như pectin, protein, các chất sáp, dầu m áý... Sợi và vải sau khi nấu có độ ngấm thấu cao, có khả năng hút nước nhanh đảm bảo nhuộm đạt chất lượng tốt. Với cồng nghệ truyển thống thường sử dụng các chất như xút (NaOH), cacbonatnatri (Na2CO,), thêm một số chất trợ khác như chất ngấm thấu, khuếch tán, nhũ hoá, càng hoá dé nấu trong điều kiện nhiệt độ cao (100 °C) sẽ loại bỏ được hoàn toàn các tạp chất không mong muốn. Tuy nhiên với cách xử lý này sẽ sản sinh ra oxycellulose làm giảm cường lực của sợi vải hơn nữa nước thải sau khi nấu có các chỉ số COD, BOD khá cao. 282 Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy việc xử lý trước sợi và vải bằng enzym có lính kỹ thuật khả thi hơn hẳn. Các enzym có thể được sử dụng như glucanase, pectinase, esterase, protease, trong đó pectinase là enzym quan trọng nhất trong quá trình nấu. Pectin nằm ở bẽn ngoài cùa xơ bông, nó là một chất keo chứa các axit poligalacturonic và thường được chuyển sang các dạng muôi canxi, magie, sắt và cả nhôm ĩrong quá trình phát triển của xơ bông. Các muối pectin không tan trong nước này kết dính với sáp và protein tạo ra “tấm chắn” bảo vệ xơ trong quá trình trưởng thành. Thuỷ phân pectin bằng các pectinase, biến các muối không tan thành các sản phẩm hoà tan trong nước, như vậy phá vỡ có hiệu quả “tấm chắn”, đạt được mức độ hút nước cao mà không có hiệu ứng phụ bất lợi phân giải' cellulose. Hiện nay trên thị trường đã có bán loại enzym kiềm tính với tên thương mại ]à BioPrep 3000L (Novozymes AS, Đan mạch) và Baysolex VP-SP 20022 (Bayer, Đức). Bảng 6.9 cho kết quả so sánh xử lý vải dột kim bông trước nhuộm giữa công nghệ nấu truyền thống bằng xút với công nghệ nấu bằng pectinase kiềm BioPrep 3000L. Kết quả cho thấy xử lý bằng enzym có nhiều ưu điểm hơn so với xút, vừa đảm bảo chất lượng vải, vừa tiết kiệm được năng lượng và nước. Bảng 6.9. So sánh xử tý vải dệt kim bỏng trước nhuộm bầng enzym và bằng xút Các chỉ tiêu Xử fý bằng pectinaza xử lý bằng xút 8-9 13-14 Nhiệt độ ẹcrc 95-100 °c Tổn thất trọng luợng <3% 5-10% Độ ngám thấu (phép thử nhỏ giọt) < 1 giây < 1 giây Độ bền đột phá (% so với ban đầu) 95-100 90-97 Mềm Cứng Tiêu thụ nước giạt 40-50% 100% BOD 33-45% 100% COD 36-45% 100% PH Độ cứng sờ tay Nguồn: (Đặng Trấn Phòng-2002) 283 Ngoài pectinase, hiện nay một số enzym cũng được sử dụng trong một số khâu khác của quá trinh nhuộm như catalase (Tinozym 7678- CL heonc) để loại các gốc peroxit sau quá trình tẩy trắng sợi vải nhằm táng hiệu suất bắt màu. 6.2.2. Công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong những năm gần đây số lượng những ứng dụng enzym trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy đã tăng lên đáng kể. Các quá trình chính trong ngành công nghiệp này là nghiển bột, tẩy trắng và xeo giấy. Với quá trình sản xuất giấy tái sinh thì việc phàn loại, làm sạch và khử mực cho giấy tái chế cũng chiếm một phần quan trọng trong quá trình sản xuất (hình 6.6). Bảng 6.Ỉ0. Vai trò tác động của enzym lên một số thành phẩn của gỗ Thảnh phẩn Enzym Thay đổi hoá lý Lợi ích kỷ thuật Cellulose Cellobiohydrolase (CBH) Endoglucanase (EG) Hổn hợp CBH và EG Làm nhỏ sợi Khử tính trùng hợp Khử tính trùng hđp Tiết kiệm năng luợng trong quá trình lọc bột giấy. Đa dạng sản phẩm. Loại mựfc Xylan Endo xylanase Khử tính trùng hợp Tách chiết lignin Glucomanan Endomannanase Axetyi glucomannan esterase Khử tính trùng hợp. Độ bền kết tụ giảm. Khả nâng hoà tan giảm Tách chiết lignin Tăng hiệu xuất nghiền bột và các thuộc tính bển Pectin polygalacturonase Khử tính trùng hợp Tiết kiệm năng lượng trông công đoạn tước vo Giảm iưạng cation yêu cẩu trong sàn xuất. Lignin Laccase Mn-peroxydase Khử tính trùng hợp Trùng hợp hoá Tăng độ sáng màu Trùng hợp lignín Các chất khác lipase Tang tính háo nước Cải thiện thuộc tính bền. Tăng độ kéo của giấy. 284 Trong quá trình nghiền bột các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau bằng quá trình cơ học hoặc hoá học để chuyển thành bột giấy chứa các sợi và các bột mịn. Khi nghiền hoá học thì phần lớn lignin trong sợi và một phần hemicellulose được hoà tan và loại bỏ. Quá trình tẩy trắng nhằm mục đích khử hoặc làm sáng màu các cấu tử mang màu có nguồn gổc chính từ lignin còn tồn đọng trong bột giấy sau khi nấu. Trong quá trình xeo giấy, bột giấy được chuyển thành giấy với sự thêm vào của một số chất hoá học, các chất phụ gia. Vì quá trình sản xuất giấy là một phức hợp các phản ứng hoá học nên ngày nay một số lớn enzym có thể được sử dụng để cải tiến các quá trình truyền thống nhằm nhiều mục đích khác nhau. Bảng 6.10 tóm tắt một số enzym được sử dụng trong quá trình sản xuất giấy. Hình 6.6 Các cõng doạn chỉnh trong quá trình sản xuất giấy. 285 Enzym cellobiohydrolase được bổ sung vào cống đoạn nghiền bột giày sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình củá sợi cellulose tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền bột giấy cơ học. Trong quá trình nghiền bội hoá học, nếu gỗ được xử lý trước với một số enzym như hemicellulase, pectinase và cellulase làm cho lớp vỏ ngoài của gỗ bị phá vỡ tăng khả năng khuếch tán các hoá chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin. Trong quá trình tẩy trắng, enzym có Ihể được sử dụng để nâng cao hiệu suất của quá trình. Trong phương pháp gián tiếp quá trình tẩy trắng bột giấy được cải thiện thông qua hoạt động của xylanase hoặc mannanase nhàm loại bỏ lignin còn trong phương pháp trực tiếp sử dụng hệ thống “laccase-chất trung gian” để phân huỷ lignin (bảng 6.11). Bảng 6.11. Các enzym dùng trong quá trình tẩy tráng bột giấy hoá học Enzym Cd chê' Lợi ích và hạn chế Xylanase. Phân huỷ xylan vả phúc tíợp lignin-hỹdratcacbon Tiết kiệm 10-20% hoá chất Tảng độ sáng Mannartase Phân huỷ glucomannan Lợi ích phụ thuộc vào loại bột giấy Laccase (kết hợp với các chất trung gian) Phân huỷ lignin Thay thế hoàn toàn các hoá chất clo Có tính đắc hiệu Khả năng quay vỏng còn hạn chế và giá của các chất trung gian còn cao Mn- peroxydase (với các chất phu trợ) Phân huỷ lignin Hiệu quả cao Giá cùa enzym và các chất phụ trợ cao Lignirt- peroxydase (với chất phụ trợ) Phân huỷ tỉgnin Hiệu quả cao Giá cè còn cao Xylanase thuỷ phân một phần xylan hoặc loại bỏ xylan khỏi phức hợp lignin-hydratcacbon, cả hai cớ chế này đều làm tăng khả năng tách lignin khỏi lớp thành ngoài của sợi gổ. Các kết quả thử nghiệm cho thấy xylanase có khả năng tác động lên mọi loại sợi và chúng không phụ thuộc vào nguồn gốc của enzym từ nấm mốc hay vi khuẩn. Gần đây khoảng 20 nhà máy giấy và bột giấy ở miền nam nước Mỹ đã sử dụng enzym này trong cồng đoạn tẩy ưắng bột giấy và so với công nghệ truyền thống đã làm giảm được lượng hoá 286 chất sử dụng (khoảng 25% lượng clo và 15% iượng axit hexenuronic), cái thiện được độ trắng, duy tri tính bền của sợi và giá thành sản phẩm giảm. Chế phẩm xylanase bền nhiệt dùng cho tẩy trắng bột giấy dã xuất hiện trên thị trường từ năm 1995 và khoảng vài năm trở lại đây một số chế phẩm mới có khả năng chịu được cả nhiệt độ và pH cao (90 "C và pH 10) đã được đưa ra thị trường. Giá trung bình tính cho xylanase là nhỏ hơn 2 USD cho 1 tấn bột giấy (1999). Laccase thuộc nhóm enzym phenoloxydase cũng mới được nghiẻn cứu ứng dụng cho quá trình tẩy trắng bột giấy. Laccase cùng với một số chất khác tạo thành một chuỗi oxyhoá khử để ọxy hoá hoàn tọàn một số cơ chất như polyphenol, amin thơm, lignin... đến Oj và nước. Quá trình này đuợc sơ đổhoá như sau: Nguồn thu laccase chủ yếu từ nấm mốc, một số thực vậí và côn trùpg cũng có chứa enzym này, ở vi khuẩn mới chỉ phát hiện được ò một vài loài. Các chất trung gian tham gia vào chuỗi vận chuyển điên tử trên là 2,2’azinobis(3 ethylbcnzx)thiazoione-6-sulfonic axit) di amonium (ABỊTS), 1-hydroxy benzotriazole (HBT), hoặc một số chất chứa nhỏm chức N-ỎH cổ khả năng khử nhanh lignin nhưng không gây biến động tới cấu trúc của cellulose mới được còng bố như axit violuric (VIO), N-hydroxy-N-phenylacetamide (NHA). So với công nghệ tẩy trắng bằng oxy và ozon truyền thống, bột gỗ được xử lý bằng hệ thống laccase có cùng độ trắng nhưng độ nhót và hiệu suất đạt cao hơn (bảng 6.12). 287 Báng 6.12. So sánh hiệu quả của hai công đoạn tẩy trán g bột gỏ thòng K raft (kappa = 24,7) bàng hệ laccase và bàng oxy hoặc azon Đồ trắng (%) Chỉ sô kappa Độ nhốt (mg/g) Hiêu suất '(%) O Q PZ/Q P 84,1 720 42,0 LQPZ/QP 83,2 2,5 2,4 730 42,6 OOQZP 85,6 O O LQ P 87,6 2,3 3,0 670 790 42,1 42,9 Quá trình xử lý* * O: oxy; Q: chất càng hoá; P: peroxyt; Z: ozon; L: hệ thống laccase. T ro n g c ô n g n g h iệ p g iấ y , a - a m y la s e từ vi k h u ẩ n c ũ n g đ ư ợ c s ử d ụ n g phổ b iế n v ớ i m ụ c đ íc h d ịc h h o á h ồ tin h b ộ t ở n ồ n g đ ộ c a o đ ể th u đ ư ợ c k e o h ồ có đ ộ n h ớ t c ầ n th iế t d ù n g tro n g sả n x u ấ t c á c loại g iấ y tố t. T ro n g n h iề u n ă m q u a v iệ c sử d ụ n g cá c sợ i tái c h ế từ c á c lo ại g iấ y thải lo ại đ ể s ả n x u ấ t b ộ t g iấ y và x e o g iấ y đ ã tă n g lê n đ á n g k ể. C á c lo ại g iấ y báo cũ trư ớ c k h i d ù n g đ ể s ả n x u ấ t g iấ y in , g iấ y v iế t c ầ n p h ả i đ ư ợ c tẩ y m ực. T ro n g c ô n g n g h ệ tẩ y m ự c tru y ề n th ố n g p h ải b ổ su n g c á c tá c n h â n k iể m và h o á c h ấ t tẩ y ở c ô n g đ o ạ n n g h iề n b ộ t. G ầ n đ â y p h ứ c h ợ p e n z y m c e llu la s e và h e m ic e llu la s e đ ã đ ư ợ c đ ư a ra ứ ng d ụ n g và là m ộ t tro n g n h ữ n g ứ n g d ụ n g c ô n g n g h ệ s in h h ọ c h ứ a h ẹ n n h ấ t tro n g n g à n h c ô n g n g h iệ p g iấ y và b ộ t giấy. C ơ c h ế k h ử m ự c b ằ n g e n z y m d ự a trê n h a i h ư ớ n g c h ín h : th ứ n h ấ t là m ự c được tá c h k h ỏ i bề m ặ t sợ i bới c á c e n z y m th u ỷ p h ân h y d ra tc a c b o n n h ư c e llu la s e , h e m ic e llu la s e h o ặ c p e c tin a s e , th ứ hai là e n z y m th u ỷ p h â n c á c c h ấ t m a n g m ự c h o ặ c lớ p p h ủ b ề m ặ t g iấ y n h ư d ầ u đ ậ u tư ơ n g , lig n in , tin h b ộ t (h ìn h 6 .7 ). T rm W r rr r r fn n Enzym Lớp phù Hình 6.7. Cơ chê khử mực bỏi enzym. 288 6.2.3. C ông nghiệp thuộc da T ro n g c ô n g n g h iệ p th u ộ c d a c ó h ai q u á trìn h sử d ụ n g e n z y m là tách lô n g v à làm m ề m d a . T h ò n g th ư ờ n g d a tươi n h ậ p về đ ư ợ c rử a s ạ c h sau đ ó đ ư ợ c b ảo q u ả n b ằ n g m u ố i N a C l với tỷ lệ 3 0 0 k g m u ố i/tấ n d a s ố n g . T rư ớ c kh i th u ộ c , d ạ đ u ơ c íứ a , h ồ i tư ơi k h o ả n g 12 g iờ tu ỵ th e o n h iệ t đ ộ m ệ ý í ư ờ n g đ ể d a lấy lại lư ợ n g n ư ớ c đ ã m ất d o b ả o q u ản . Sau c ô n g đ o ạ n n à y d a d ư ợ c tẩy lỏ n g , n g â m v ò i c h ứ a s u lfu a n a tri (N a 2S) đ ể làm lỏ n g c h â n lô n g h o ặc h o à tan \ ' .1 > I I I — N *. a / ••»Im I/•rt•1 c h ú n g th à n h d ạ n g n h ã o v à m ở c ấ u trú c sợi c ủ a d a. H ìn h 6 .8 m in h h o ạ sơ đ ồ lát c ắ t n « a n g c ủ a d a v à sợ i lô n g . ^L ứ p sừìiEv "I uy Vỏ Ị Lôm ; A o n u tù il L ớ p M.li'J / f p đ á y Ccí ctựnẹ lóng A o liè n kẽ Tuyết) bã A o Irony rề lũ. T u y ến ruổ hói Ao njỊi>à11C ít’’ N hú IỎI1U C ltíú n ẻ II . Hình 6.8. Sơ đố lát cắt ngang của da và sợi lông. T h à n h p h ầ n c h ín h c ủ a d a là c o la g e n và đ ư ợ c x ế p v ào n h ó m c á c p ro te in c ứ n g d ạ n g sợ i, h o à n to à n k h ô n g ta n tro n g nư ớ c, tro n g d u n g m ô i, tro n g d u n g d ịc h m u ố i tru n g tín h , tro n g c á c p H k h á c n h a u k iề m c ũ n g n h ư a x it và tương đ ố i trơ t á c :d ụ n g c&Ể^cắc- erizyrrr -iihtí ẽ ổ ĩa g e n a s e , try p s in , c h y m o try p s in và c a c b o x y p e p tid a s e c á c c h ấ t n h ờ n bị tá c h ra v à m ộ t s ố liê n k ế t tro n g sợ i c o la g e n bị p h á h u ỷ . K ết q u ả lô n g đ ư ợ c tá c h k h ỏ i d a và d a th u đ ư ợ c c ó đ ô m ề m n h ấ t đ ịn h . 289 Khả năng dùng protease để khử lông của da thú đã được biết đến từ đầu thế kỷ với việc lợi dụng hoạt động của các vi khuẩn gây thối rữa trộn trong nước bột mì phết trên da chúng sẽ làm rã các protein của lớp bao phủ da. Tiếp đến là các chế phẩm enzym thu được từ đường tiêu hoá của động vật (tripsin tuyến tuỵ hoạt động thích hợp ở pH 7-9) đuợc sử dụng để làm mềm và khử các vết sứt trẻn da sau khi xử lý bằng vôi. Hiện nay các chế phẩm protease từ vi khuẩn, nấm mốc đã được sử dụng để thay thế cho enzym tuyến tuỵ. Các chế phẩm enzym này thường được sử đụng dưới dạng chế phẩm thô (nước chiết canh trường nuôi cấy) chứ không cần đòi hỏi phải tinh chế cẩn thận. Da thú thường được xử lý ở 30-35"C bằng protease từ BMcheniformis với sự bổ sung sulfit ỏ các giá tri pH kiềm trung bình rồi sau đó mới xử lý bàng kiềm. Hiộn nay với sự phát hiện các loại protease kiềm cao trong Bacillus đã cho phép đẩy nhanh quá trình này. Quá trình bao gồm việc xử lý da thú bằng dung địch chứa 8 % vôi và 1% enzym khử lông, trong thời gian 18-24 giờ ở 20-30 °c và pH 12-12,5. Với quy trình xử lý này các sắc tố của da bị phá huỷ, diện tích bề mặt của da tăng lên, da trở nên mềm hơn, thời gian ngâm vổi thuộc da rút ngắn hoặc được loại bỏ, hàm lượng Na2S sử dụng cũng giảm. Hiện tại hãng Novo thường xuyên cung cấp hai chế phẩm NƯ.EO 6MPX và Aquaderm dùng cho công nghiệp da. Mục đích của công đoạn thuộc da là làm cho da mềm và đàn hồi, cố khả nâng ngấm thấu sâu các chất thuộc vào da để da không bị phân huỷ hay thối rữa trong điều kiện mổi tnròng bình thường hay nóng ẩm. Trước đây da thường được làm mềm bằng vỏ cây hay bằng chất “pomet” chứa các enzym và vi khuẩn lấy từ ống thục quản của chim hay chó. Ngày nay để làm mềm da người ta thường sử dụng các pròtease thu được từ một sổ chủng nấm mốc và vi khuẩn như A. oryzae, A. flavus, A. parasitucus, Bacillus subtỉỉus, B.iicheniformis Atinomyces fradiae, Streptomyces rìmosus. Hình 6.9 minh hoạ một mẫu da trâu trước và sau khi xử lý bằng chế phẩm protease kiềm từ B.brevìs B l. 290 M ẩu da tràu trước khi xử lý Hình 6.9. Mẩu da trâu được xử lý bằng protease kiềm từ B.brevls 81 (Nguyễn Liêu Ba-2001). 6.2.4. Công nghiệp sản xuất bột giật và các chất tẩy rửa Theo các số liộu thống kê, ngành công nghiệp này sử dụng một lượng enzym lớn nhất so với các ngành công nghiệp khác (45%), chiếm khoảng 30% lợi nhuận thu được từ các enzym bán trên thị trường. Với các chất tẩy rửa thông thường không thể tẩy sạch một số các vết bẩn có nguồn gốc protein đôi khi còn làm chúng bám chật thêm vào quẩn áo. Nhưng khi protease kiềm tính được thêm vào các chất tẩy rửa thì chúng có khả năng làm sạch một cách có hiệu quả các vết bẩn trên vì protease thuỷ phân protein thành các dạng hoà tan. Hiện nay khoảng 80-85% các ỉoại bột giật trên thị trường có chứa enzym trong đó chủ yếu là các protease và một số enzym khác như lipase, ceỉlulase, amylase, oxydoreductase đổ tăng tốc độ và hiệu quả cho quá trình tẩy rửa. Năm 1971, doanh số của thị trưòng thế giới về protease đã giảm từ ỉ 50 triộu USD xuống chỉ còn 1/3 do nhiều người bị dị ứng khi sử dụng bột giặt chứa protease. Đến khi kỹ thuật bao gói vi thể ra đời thị trường enzym trong nghành công nghiệp bột giặt mới phát triển trở lại. Mặc dù tỷ lệ protease bổ 291 s u n g v à o b ộ t g iặ t k h ô n g c a o ( l g c h ế p h ẩ m /k g ) n h ư n g h à n g n ă m lư ợ n g e n z y m sử d ụ n g c h o n g à n h c ô n g n g h iệ p n ày c ũ n g lê n tới 5 0 -6 0 n g à n tấ n . C á c c h ế p h ẩ m e n z y m c ó th ể th u n h ậ n từ n h iề u n g u ồ n , n h iề u c h ủ n g và n h iề u c á c h k h á c n h a u n h ư n g đ ế c ó th ể ứ ng d ụ n g m ộ t c á c h c ó h iệ u q u ả tro n g q u á trìn h tẩ y rử a, c h ú n g đ ề u p h ả i m a n g m ộ t s ố th u ộ c tín h c h u n g sau : - B ền v ữ n g tro n g q u á trìn h b ả o q u ả n b ộ t g iặ t v à th ế h iệ n h o ạ t tính x ú c tá c tro n g c á c đ u n g d ịc h tẩ y rử a th ư ờ n g c ó đ ộ pH k h á c a o (9 -1 0 ) và sự có m ặ t c ủ a m ộ t s ố c h ấ t tạ o p h ứ c , c h ấ t h o ạ t đ ộ n g b ề m ặt, c á c tá c n h â n n ộ i liên kết n h ư p h o tp h a t, E D T A ... 6 tín h bền n h iệt c a o phù hợ p với các c h ế đ ộ n h iệt c ủ a q u á trìn h giặt. - C ó tín h đ ặ c h iệ u rộ n g đ ả m b ả o th u ỷ p h â n đ ư ợ c n h iề u lo ại p ro te in . - T ồ n tại tro n g b ộ t g iặ t d ư ớ i d ạ n g k h ô n g b ố c b ụ i, g iả m k h ả n ă n g dị ứng cho người sử dụng. Y ê il c ầ u đ ố i vối đ ộ b ề n n h iệ t c h o c á c c h ế p h ẩm p ro te a s e ở c á c nước c h â u  u v à ở M ỹ là k h á c n h a u . Ở c h â u  u , tro n g q u á trìn h g iặ t tố c đ ộ tăng n h iệ t đ ộ từ n h iệ t đ ộ p h ò n g lê n đ ế n 100“C là g ầ n 2 " C /p h ú t d o v ậ y đ ò i hỏi e n z y m pliải làm v iệc c ó h iệ u q u ả tro n g v ò n g 1 5 -2 0 p h ú t đ ầ u trư ớ c k h i n h iệt đ ộ đ ạ t tới 60"C , trê n k h o ả n g n h iệ t đ ộ n à y e n z y m bị m ất h o ạ t tín h n h an h c h ó n g . C ò n ở M ỹ tiêu c h u ẩ n n h iệ t đ ộ c h o cá c p ro te a s e h o ạ t đ ộ n g c h i nằm tro n g k h o ả n g 4 5 -5 5 (’C tro n g th ờ i g ia n từ 10-15 p h ú t đ ầ u c ủ a q u á trìn h giặt. T u y n h iê n , c á c n h à sả n x u ấ t đ ề u k h u y ế n c á o n ê n n g â m q u ầ n á o trư ớ c khi g iặ t sẽ n â n g c a o đ á n g k ể k h ả n ă n g tẩ y b ỏ c á c c h ấ t b ẩ n (N o v o e n z y m ). Để có thể hoạt động trong môi trường pH cao, protease kiềm tín h là thích hợp hơn cả so với các loại protease khác, chúng thường được t IU từ các vi k h u ẩ n , liế p đ ế n là n ấ m v à m ộ t ít từ p a n c re a tin (try p s in ). H iệ n n a y h ầu hết N h iề u p h ư ơ n g p h á p là m g iả m b ụ i c h o c á c b ộ t e n z y m v à c á c c h ấ t tẩy rử a đ ã đ ư ợ c n g h iê n cứ u. V í d ụ c á c c h ế p h ẩ m e n z y m đ ư ợ c g ó i tro n g c á c ch ấ t h o ạ t đ ộ n g b ề m ặ t k h ô n g io n h o á (p o ly e th y le n g ly c o l) tạ o th à n h c á c h ạ t n h ỏ 292 h o ặ c d u n g d ịc h e n z y m đ ư ợ c trộ n với c á c c h ấ t táy rứa k h ô n g io n h o á đ ã d ư ợ c n g h iề n n h ỏ rồ i p h u n th à n h bụi m ù tro n g k h í q u v ể n lạ n h , kh i đ ó c á c g iọ t n h ỏ li ti sẽ c ứ n g lạ i, h ìn h th à n h c á c h ạ t, c á c h ạ t đ ó sẽ k h ô n g bị th a y đ ổ i khi trộ n c h ú n g với n h ữ n g c h ấ t tẩ y rử a k h á c tro n g b ộ t g iặt. N g o à i v iệc d ư ợ c sử d ụ n g đ ể b ổ su n g v ào c á c c h ấ t tẩ y rử a, x à p h ò n g g iặ t, n g à y n a y m ộ t s ố e n z y m c ò n đ ư ợ c d ù n g đ ể b ổ s u n g v à o c á c lo ại x à phòng tắm , k e m bòi m ặt d ư ỡ n g d a , th u ố c đ á n h ră n g như D rom elin, c o la g e n a s e , l i p a s e ...c á c e n z y m n à y c ó tác d ụ n g tẩy h ô i, tẩ y cá c vếl b ẩn b ám trc n d a k h á tố t, h ơ n n ữ a n ó c ò n làm m ịn và tă n g đ ộ đ à n hổi c h o d a. 6.2.5. Công nghiệp dược và y tê V aí trò c ủ a e n z y m tro n g đ iề u trị c ũ n g n h ư c h u ẩ n đ o á n m ộ t sộ b ệ n h đ ã đ ư ợ c b iết đ ế n từ k h á lâu tro n g lĩn h vực y -d ư ợ c và n g à y c à n g đ ư ợ c p h á t triể n . M ặ c d ù lư ợ n g e n z y m s ử d ụ n g c h o lĩn h vực n à y c h ỉ c h iế m 1% so với c á c n g à n h c ô n g n g h iệ p k h á c n h ư n g n ó đ ã đ e m lại k h o ả n g 8 % lợi n h u ậ n từ cá c en /.v m b án trê n thị trư ờ n g . N g à y n a y cá c n h à k h o a h ọ c đ ô i k h i c ũ n g lợi d ụ n g “ tín h iệ u e n z y m ’ làm ch i tiêu đ á n h g iá tìn h trạ n g c ơ th ể bị b ệ n h . V í d ụ h o ạt đ ộ a ld o la s e tă n g tro n g h u y ế t th a n h là tín h iệ u c ủ a v iê m g a n , lư ợ n g c re a tin k in a s e h u y ế t tă n g v ọ t vài g iờ đ ầ u sau k h i bị n h ồ i m á u c ơ tim . C ác n g h iê n cứ u g ầ n đ â y c h o th ấ y khi h o ạt đ ộ m e th e m o g lo b in re d u c ta s e ở h ồ n g c ầ u tă n g c a o là triệ u c h ứ n g c ủ a b ệ n h th iế u m á u d o s u y tu ỷ (th ư ờ n g c a o h ơ n g ầ n g ấ p đ ô i so với n g ư ờ i k h ỏ e m ạ n h b in h thường). Đ ặ c đ iể m chung c ủ a th iế u m á u tro n g s u y tu ỷ x ư ơ n g là th iế u m á u n ặ n g , th iế u h e m o g lo b in (H b ) m ộ t p ro te in c ủ a h ồ n g c ầ u ám n h ậ n c h ứ c n ã n g v ậ n c h u y ể n v à c u n g c ấ p o x y c h o to à n c ơ th ể . L ư ợ n g h e m o g lo b in c ó k h i c h ỉ c ò n d ư ớ i 2 0 g /l n h ư n g b ệ n h n h â n v ản th íc h n g h i đ ư ợ c với c u ộ c s ố n g th iế u o x y c ủ a t ế b à o . Sự th íc h n g h i trê n là n h ờ s ự tã n g h o a t đ ộ c ủ a m e th e m ọ g lo b in re d u c ta s e h ồ n g c ầ u , e n z y m n à y x ú c tác c h o p h ả n ứng k h ử M e tH b (d ạ n g H b đ ã g ắ n o x y ) th à n h H b. W e m ^ m fr y psin và c h im o try p s in . D o đ ặ c đ iể m c h ỉ p h à n g iải cá c p ro te in bị h o ại, cá c e n z y m n ày th ư ờ n g đ ư ợ c sử d ụ n g đ ể làm th u ố c tiê u v iê m , làm làn h vết th ư ơ n g , vết b ỏ n g , làm g iã n v à tiê u b iến n iê m m ạc bị h o ạ i tro n g m ộ t sô' b ện h v iêm p h ổ i, v iêm 293 khí quản. Trypsin dùng trong chữa bệnh viêm tĩnh mạch huyết khối (trypsin, chimotrypsin, peptitdase, lipase và amylase), viêm phổi (xông khí dung bao gồm trypsin và dezoxyribonuclease). Chimotrypsin dùng để chữa bệnh loét dạ dày, loét kết tràng. Một số enzym tiêu hoá cũng đã được nghiên cứu và sử dụng góp phần khắc phục tình trạng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và người bệnh. Ví dụ pepsin (từ dạ dày lợn) được sử dụng để nâng cao hiệu quả chuyển hoá protein của cơ thể, nhất là đối với trẻ em vì ở lứa tuổi này hệ enzym tiêu hoá của chúng chưa hoàn chỉnh. Sự tiẻu hoá protein bát đầu xảy ra ở dạ dày, giai đoạn tiêu hoấ protein ở đây giữ vai trò đặc biệt quan trọng, ở đó các phân tử protein được phân cắt chủ yếu thành các peptit chứa từ 5-8 axit amin nhờ tác dụng của pepsin, các peptit này sẽ tiếp tục được phân cắt ở ruột non nhờ tác dụng của hệ protease của địch rùột và dịch tuỵ. Nếu ở dạ dày protein không được tiêu hoá tốt sẽ ảnh hưởng xấu đến sự tiêu hoá protein chung, làm giảm hiệu quả sử dụng protein chung của cơ thể, gây nên hiện tượng rối loạn tiêu hoá, để lại những hậu quả nguy hại. Ngày nay một số thuốc được tổng hợp bằng con đường hoá học đã dần được thay thế bằng các quá trình enzym nhờ những ưu điểm vốn có của nó. Một ví dụ điển hình là sản xuất các penicillin bán tổng hợp, bằng việc sử dụng penicillin acylase để sản xuất ra hai dẫn xuất ban đầu là 6 APA và 7ADCA và từ đó tổng hợp nên hàng loạt kháng sinh thế hệ thứ II, III, IV, V đóng góp không nhỏ vào thu nhập của ngành công nghệ kháng sinh. Tất cả các penicillin đểu chứa gốc 6 amìnopenicillìn axit (6-APA) gắn với các cạnh bên R khác nhau. Do vậy cấu trúc của các cạnh bên sẽ quyết định các thuộc tính quan trọng cho mỗi loại penicillin như phổ kháng sinh, đặc tính gắn kết thành tế bào, liều lượng trong máu, tính bền axit.... Trong thực tế chỉ có hai ioại kháng sinh penicillin -V và penicillin - G là được tổng hợp với hiệu suất cao bằng phương pháp lên men (hình 6.10). Tuy nhiện, trong tự nhiên vốri tồn tại và ngày càng xuất hiện thêm nhiều biến chủng vi sinh vật kháng lại được hai loại kháng sinh này. Đ ể tăng cường hiệu quả kháng sinh của penicillin đối vói những chủng bền này, các chuỗi bên của penicillin V và G được loại bỏ khỏi gốc 6-APA và thay bằng các chuỗi bên khác, tạo ra các loại penicillin khác. Một vài loại penicillin 294 t 1 Ị bán tổng hợp theo kiểu này đã tỏ ra khá hiêu quả, đãc biẻt là ampicillin và amoxycillin. ỉ Penicillin Cephalosporin H H s /C H ' R— NH— HC-ự' Nc C C -N ------CH CHl Ổ 1 COOH R -N H —cH -Cl-rs v C H 2 i 1 1 , c N ^ ^ c -C H 3 o ' COOH Cạnh bênR Ố-APA H- G-peniãllin v-penicillin Ampidllin Amoxyciliin 7-ADCA Q H j- 'CH2 - CO 0 - CH2 - CO Q H S- CH (NH3) - CO - (V-ADCA) Cephalexin (OH) Q H , - CH (NH2) - CO - Hình 6.10. Cấu tạo cạnh bèn R của một vài loại penicillin. Các cạnh bên V và G của penicillin có thể đuợc loại bỏ bằng con đường hoá học và bằng enzym (hình 6.11). Tlieo con đưòng hoá học, bước đầu tiên phải bảo vệ nhóm cacboxyl, tiếp đến tạo ra iminoether như Là bước trung gian trong dung mồi butanol ở - 40 "C. Hiệu suất của quá trình đạt cao tuy nhiên giá thành của sản phẩm cũng rất cao do giá thành của dung môi sử đụng cao và phản úng phải duy trì ở nhiệt độ thấp. Từ năm 1960, quá trình chuyển hoá trên được thực hiện nhờ các enzym penicillin acylase (EC.3.5.1.11) thu từ một số chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Khoảng năm 1966, Penicillin-G-Acylase cố định ra đời, góp phần cái thiện quá trình một cách đáng kể. Ngày nay con đường chuyển hoá bằng enzym đã được sử dụng một cách rộng rãi trong công nghiộp, với sản lượng hàng năm khoảng trên 3000 tấn 6-APA. Quá trinh diễn ra trong môi trường nựớc, ở nhiệt độ 35"C. Nàng xuất của chế phẩm "Novo Semacylase" đạt khoảng 250-500 kg 6-APA cho 1 kg enzym cố định. 295 SiMe. Cl, Quá trìiih hoá học K-PenV PCụ/K ièm ---------------*■ (Pen-V-COO) 2 SiMe, n-BuOH/- 4 0 °c Imid clorit . thuỷ phán -----------------*■ Inúnoether ---------------- *• 6-APA Pen-V -acylase/35°C. pH 8 Quá ưình enzym PenV 6-APA + axit phenoxyaceiic Pen-V-acỵlase V-ADCA -► 7-ADCA + PAA Hình 6.11. Chuyển hoá Penicillin - V thành 6-APA. C ù n g v ớ i s ự p h á t triể n c ủ a k ỹ th u ậ t g en và la i t ế b à o với sự h ỗ trợ đắc lực c ủ a c á c e n z y m n gư ờ i ta c ó th ể s ả n x u ấ t trê n q u i m ô c ô n g n g h ệ p n h ữ n g c h ấ t m à c ơ th ể s ố n g c h ỉ c ó th ể tổ n g h ợ p với lư ợ n g cự c n h ỏ n h ư in te rfe ro n , h o c m o n sinh trưởng người, một số kháng thể, vacxin... Insulin n g ư ờ i, một h o c m o n đ ầ u tiê n đ ư ợ c tổ n g h ợ p th e o k ỹ th u ậ t g e n v ào n ă m 19 7 8 , n a y đã đ ư ợ c hãiỊig E li L illy v à G e n e te c h In c c ủ a M ỹ sả n x u ấ t và b á n rộ n g rãi trê n thị trư ờ n g . n te rfe ro n tổ n g h ợ p th e o c o n đ ư ờ n g s in h h ọ c ra đ ờ i ờ A ille n n ăm 1985 (hă n g S c h e rin g -P lo u g h ). B ằng k ỹ th u ậ t lai so m a g iữ a m ộ t tế b à o B với m ộ t t ế b 'ào ung thư, năm 1975 Kohler và Milster đã tìm ra phương p h á p sail x u ấ t cá c k h á n g th ể đ ơ n d ò n g . D o c ó tín h đ ặ c h iệ u c a o n ê n n g à y n a y các k h á n g t hêỉ đ ơ n d ò n g đ ã đ ư ợ c s ử d ụ n g rộ n g rãi tro n g đ iề u trị c ũ n g nlh ư đ ể tạo ra n h ữ n í b ộ k it th ử d ù n g đ ể c h u ẩ n đ o á n m ộ t sô' b ệ n h n h iễ m k h i n n , n h iễ m v iru s, c h u ẩ n đ o á n th a i n g h é n (p h ư ơ n g p h á p m iễ n d ịc h g ắ n e n z y m E L IS A ). 6.2.6. Chê biến thức ãn cho gia súc V a i trò c ủ a e n z y m tro n g lĩn h vự c n à y c ũ n g đ ã đ ư ợ c b iế t đ ế n và k hai th á c từ t r ậ t tiế p m ộ t s ố e n z y m v à o k h ẩ u p h ầ n ă n c ủ a g ia s ú c , g ia c ầ m n h ằ m tã n g n h a n h q u á trìn h tra o đ ổ i c h ấ t tro n g c ơ th ể .ch ú n g , đ ồ n g th ờ i làm tă n g trọ n g rấ t n h a n h . H a i là, s ử d ụ n g c á c c h ế p h ẩ m e n z y m đ ể x ử lý c á c m ó n ă n " c ồ n g k ề n h " k h ó tiê u , có 296 g iá trị d in h d ư ỡ n g th ấ p n h ư c h ấ t b ộ t, c h ấ t xơ, c h ấ t béo ... th à n h c á c m ó n ă n d ễ tiê u , c ó g iá trị d in h d ư ỡ n g c a o h ơ n n h ư cá c a x it a m in , p ro te in , c á c lo ại đ ư ờ n g ta n , v i ta m in , h o c m o n ... làm tă n g h iệ u s u ấ t tiêu h o á v à c u ố i c ù n g là tă n g n ă n g s u ấ t v ật n u ô i. V í d ụ , p ro te a s e đ ư ợ c sử d ụ n g đ ể th u ỷ p h ân p h ế liệu bộ t c á , th ịt c á , trộ n v ào th ứ c ã n g ia sú c, sản x u ấ t d ịc h th u ỷ p h â n g ià u đ ạ m bổ su n g th ứ c ăn c h o lợn và g ia c ầ m . Amylase kết h ợ p v ớ i m ộ t s ố enzym k h á c c ủ a n ấ m m en th ư ờ n g d ư ợ c d ù n g đ ể x ử lý s ơ b ộ th ứ c ă n tươi n h ư n g ô , k h o a i, s ắ n c h u v è n m ộ t p h ầ n tin h b ộ t th à n h đ ư ờ n g , rư ợ u, a x it hữ u cơ ... k íc h th ích n g o n m iệ n gÕ và tă n g k h á n ă n g h ấ p th u c h o v ật n u ô i. V iệc ứ ng d ụ n g ph ứ c h ệ cellule se tro n g p h à n g iả i c á c n g u ồ n p h ế liệ u g ià u c e llu lo s e n h ư rơ m , rạ, b ã k h o a i , b ã sắ n . b ã m ía ... đ ã v à đ a n g đ ư ợ c triển k h a i ở n h iề u nư ớc với tốc đ ộ n h a n h c h ó n g tro n g m ọ i lĩn h v ự c, n h ấ t là tro n g x ử lý ô n h iễ m m ô i trư ờ n g , sin h tổ n g h ợ p p ro te in đ ơ n b à o , s ả n x u ấ t d ư ợ c p h ẩ m , s ả n x u ấ t c ồ n c ô n g n g h iệ p , ax it hữu cơ ... T ro n g lĩn h vự c sả n x u ấ t protein đ ơ n b à o (S in g le C ell Protein -S C P ) làm thứ c ăn c h o g ia sú c, n ấ m sợ i th ư ờ n g đ ư ợ c sử d ụ n g đ ể lê n m e n rắ n trực tiế p trê n c á c n g u ồ n p h ế liệu g ià u c e llu lo s e , d o c h ú n g c ó k h ả n ă n g p h á t triể n d ề d à n g trê n c á c c ơ c h ấ t rắ n , n g h è o d in h d ư ỡ n g , c ó k h ả n ă n g đ â m x u y ê n lớn tạo ra sin h k h ố i c ó c h ứ a h à m lư ợ n g p ro te in c a o v ớ i tỉ lệ a x it a m in c â n đ ố i, ít ax it n u c le ic , k h ô n g c h ứ a đ ộ c tố n g o à i ra c h ú n g c ò n c h ứ a cả c á c v ita m in , cá c c h ấ t k íc h th íc h s in h trư ở n g v à cá c h ư ơ n g th ơ m c ó lợi c h o tiêu h o á c ủ a v ậ t n u ô i. V í d ụ , cú c n h à k h o a h ọ c P h ilip in e đ ã sử d ụ n g c h ủ n g Aspergillus nigcr 3 1 0 4 đ ể lên m e n b ã s ắ n v à sau 7 2 g iờ lê n m e n đ ã n â n g đ ư ợ c h â m lư ợ n g p ro te in tro n g bã từ 2,5% lên tới 40%. ở Cuba c h ủ n g Cellulomơnas đ ư ợ c sử d ụ n g đ ể c h u y ể n h o á h à n g triệ u tấn b ã m ía th ải ra từ c ô n g n g h iệ p sả n x u ấ t đ ư ờ n g làm n g u ồ n th ứ c ăn c h o g ia sú c c ó h iệ u q u ả , c ó h à m lư ợ n g p ro te in c a o tới 304 0 % (trư ớ c k h i lê n m e n , b ã m ía đ ư ợ c x ử lý b ằ n g k iề m ở 140 "C). 6 .2 .7 . Sán xuất các đường chức năng (prebiotic) Sư lá t triể n m ạ n h m ẽ c ủ a k h o a h ọ c c ơ b ả n , k h o a h ọ c ứ ng đ ụ n g , c ủ a c ô n g n g h ệ th ự c p h ẩ m , d in h d ư ỡ n g h ọ c , c ủ a y h ọ c đ iề u trị và c h ă m só c sứ c sức khỏe con người luôn gắn kết chặt chẽ với việc duy trí sự phát triển cân dối và cân bằng hệ sinh thái các vi sình vật có ích sinh sông trong mỗi cơ thê đó. L u ậ n k h ỏ e c ộ n g đ ồ n g tro n g n h ữ n g n ă m c u ố i th ế k ỷ X X đ ã k h ẳ n g đ ịn h 297 cứ khoa học này đã trở thành nền tảng ra đời cho một hướng nghiên cứu vé: “ Sản phẩm chửa vì sinh vật lành hữii ích cho cơ thể và các thành tố cần thiết đ ể duy trì sự phát triển cân bằng của chúng”- (Probiotic and prebiotic), mới xuất hiện và thu hút ngay được sự quan tâm và nỗ lực tập trung nghiên cứu ở nhiều quốc gia trẻn thế giới, đặc biệt là ở các nước công nghiệp phát triển trong khoảng hai chục nãm gần đây. Probiotic là các dạng thực phẩm (hoặc các dạng chế phẩm dùng để ăn uống) có chứa vi sinh vật sống, có khả năng góp phần làm cải thiện chất lượng và duy trì trạng thái cân bằng hệ sinh thái khỏe mạnh. Đại biểu điển hình cho nhóm vi sinh vật có lợi này là các giống Lactobacciỉỉits, Bificiobacterium...Khi con người sử dụng, các vi sinh vật này có khả năng sống sót qua quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột non, rồi chúng khu trú và phát triển ở đại tràng, kết quả sẽ làm thay đổi hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho sức khỏe. Prebiotic là nhóm oligosaccarit chức năng, sử dụng trong sản phẩm thực phẩm (hay sản phẩm ăn uống) với mục đích chính đổ cung cấp thức ăn cho hộ vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa, đặc biột là hệ vi sinh vật có lợi khu trú trong đại tràng. Điểm mấu chốt quan trọng của các cấu tử prebiotic chức năng này là chứng không bị phân giải ò dạ dày và không bị hấp thu ở ruột non, mà tồn tại ờ cuối đường tiêu hóa (ruột kết) và trở thành nguổn dinh dưỡng cho hệ vi sinh vật đường ruột phát triển cân bằng. Việc duy trì cân bằng sinh thái ổn định này đã ngăn chặn hữu hiệu sự phát triển của các loài vi sinh vật có hại khác; qua đó, góp phần tăng sức đề kháng cho cơ thể chủ, tránh bị táo bón, hạn chế béo phì, kiểm soát tốt hơn quá trình lão hóa và giảm nguy cơ xơ vữa động mạch... Ngày nay, khoa học đã xác định được các cấu tử chức năng có hiệu quả lác dụng prebiotic điển hlnh là các loại đường chức năng (oligosàccarit) như: galactooỉigosaccasrit (GOS), mannooligosaccarit (MOS), fructooligosaccarit (FOS), rafinoseoligosaccarit (ROS), xyloseoligosaccarít (XOS).~ Nhiều công ưình nghiên cứu khoa học liên quan đến việc tổng hợp cũng như vai trò chức nãng của các loại đường trên đã được công bố. Người ta đã phát hiện được vai ưò của phản ứng transgalactosyl hóa tíong việc hình thành các galactooligosaccarit từ vai trò của phản ứng thủy phân mannan để 298 I tạo m a n n o o lig o s a c c a rít hay h iệ u ữ u c to o lig o s a c c a rit đ ố i với vi k h u ẩ n quả cảm ứ ng LactobaciUus phát triể n tố t của tro n g đ ạ i trà n g ...C ơ c h ế c h o v iệ c tạ o ra g a la c to o lig o s a c c a r it G O S đ ư ợ c m in h h ọ a th e o s ơ đ ổ dư ớ i đ ây : Glu E + lac -ị' * lac —í —► E- Gal Gal V Gal-Nu Enzym (E) tham gia phản ứng thường là jS-galactosidase hoặc /?glucosidasae sẽ kết hợp vói lactose (Lac), giải phóng ra glucose (Glu) và phức enym-galactose (E-Gal). Mối liên kết giữa E-Gạl dẽ dàng bị chuyển hóa bởi các chất ái nhân (Nu) như là lactose, glucose hoặc galactose để tạo oligosaccarit hơn là nước để tạo galactose tự do. Hiệu suất tổng hợp oligosaccarit của phản ứng transgalactosyl phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản úmg như pH, nhiệt độ và có lẽ quan trọng hơn là phụ thuộc vào nồng độ cơ chất ban đầu, hoạt độ enym và thời gian phản ứng. Bằng cách sử dụng các chế phẩm enzym bền nhiệt sẽ là giảm đáng kể các chủng nhiễm tạp vào sản phẩm và tăng hiệu suất tổng hợp lên nhiều. Trên đây chỉ là một số lĩnh vực minh họa vể ứng dụng enym, cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thụật enzym đã, đang và sẽ thâm nhập nhiều hơn vào mọi lĩnh vực của cuộc sống con người. Riêng trong lĩnh vực nông nghiệp, enym đang là một trong những công cụ đắc lực cho việc lai tạo các giống cây, con mới sạch bệnh và có những đặc tính di truyền quí giá. Hay trong lĩnh vực bảo vệ môi trường, các phương pháp xử lý sinh học thân thiện với môi trường đang dần chiếm ưu thế. Thực chất của các phương pháp này đều là quá trình biến đổi sinh hóa được điều khiển bởi sự hoạt động của các vi sinh vật chứa các phức hệ enzym khác nhau phụ thuộc vào từng nguồn thải. Trong lĩnh vục khoa học vật liệu, với sự trợ giúp của enzym, các nhà khoa học cũng đã chế tác ra được nhiều loại polỵme sinh học mang những thuộc tính tưởng hợp sinh học cao... được ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực kinh tế quốc dân lihư hàng không, xây dựng, khai thác... 299 6 .3 . T R I Ể N V Ọ N G C Ủ A C Ô N G N G H Ệ E N Z Y M 6.3.1. Phản ứng của enzym trong hệ hai pha lỏng 6.3.1.1. Phản ứng emzym trong hệ hai pha lỏng không trộn lẫn: pha hữu cơ - nước T ro n g q u á trìn h s ứ d ụ n g e n z y m . n g ư ờ i ta n h ậ n th ấ y rà n g d u n g m ôi lý tư ở n g c h o n h iề u p h à n ứ n g c ủ a c á c c h ấ t h ữ u c ơ k h ô n g p h á i là n ư ớ c . N h iều c ơ c h ấ t n h ư o x y , steroit, c h ấ t b é o ... cũng n h ư s ả n p h ẩ m p h á n ứ n g h ò a tan tố t tro n g d u n g m ô i h ữ u c ơ h ơ n là tro n g d u n g m ô i n ư ớ c . C á c p h ả n ứ n g n h ư v ậy n ế u đ ư ợ c th ự c h iệ n tro n g d u n g m ô i h ữ u c ơ c ó th ể d iễ n ra h o à n to à n với h o ạ t tín h e n z y m c a o hom n h iề u so v ớ i p h ả n ứ n g d iễ n ra tr o n g m ò i trư ờ n g n ư ớ c . N g o à i ra , n ế u p h à n ứ n g đ ư ợ c th ự c h iệ n tro n g m ô i trư ờ n g h ữ u cơ . sự nh iễm vi sin h v ậ t c ò n c ó th ể đ ư ợ c h ạn ch ế, đ iề u n à y đ ặ c b iệ t c ó ý n g h ĩa đối với các p h ả n ứ n g n h ạ y cả m v ớ i tá c đ ộ n g c ù a protease c ủ a vi sin h v ậ t n h iễm tạp. S ử d ụ n g e n z y m tro n g h ệ d u n g m ô i h ữ u c ơ d ẫ n tớ i p h ả n ứrm en z y m tro n g h è h a i p h a d o c á c p h â n tử e n z y m c ó ái lự c c a o v ớ i c á c phân tư n ư ớ c và đ ư ợ c b a o b ọ c b ở i m ộ t lớ p c á c p h â n tử n ư ớ c n g a y c ả k h i e n z y m ở trạ n g thái k h ô . K h i đ ó , e n z y m tồ n tại ở ư ạ n g th á i h u y ề n p h ù tro n g d u n g m ô i h ữ u cơ d ư ợ c b ao b ọ c bởi lớ p p h â n c h ia p h a h o ặ c bời cấ u trú c m ic e ll tạo bời ( ác ch ất có h o ạt tín h b ề m ặt kh i có h o ặc k h ô n g có các ch ấ t h ỗ tr ợ b ể m ặ t (h ìn h 6. 2). Dung môi hữu cơ Enzym A ■ Chất hoạt đông bé mảt r r W i • Chái hỗ trợ bé mặ! Bé mật phân chia pha a) b) Hình 6.12. Trạng thái tốn tại của enzym trong dung môi hữu cơ: a) enzym với vỏ nưốc / hoặc vặt liệu cố định bao quanh; b) enzym với vỏ micell tạo bời các chất bể măl /chất hỗ trơ bể mât 300 - Độ ôn định của enzym trong hệ hai pha hữu cơ - nước V ấ n đ ề c ơ b ả n khi s ử d ụ n g e n z y m tro n g h ệ hai p h a là ổ n đ ịn h trạ n g th ái e n z y m tro n g m ô i trư ờ n g d u n g m ôi h ữ u cơ . T ín h ổ n đ ịn h n à y c ủ a cá c e n z y m ư a n ư ớ c rấ t k h á c vớ i cá c e n z y m k ỵ n ư ớ c . T ín h ổ n đ ịn h v à k h ả n ă n g g ắn k ế t ờ trạ n g th ái h o ạ t đ ộ n g c ủ a e n z y m ư a n ư ớ c p h ụ th u ộ c v à o sự có m ặ t c ù a lớ p m ỏ n g c á c p h â n tử nirớ c (k h o ả n g 5 0 - 5 0 0 p h ả n tử n ư ớ e / p h ân tử e n z y m ) tro n g v i m ô i trư ờ n g p h à n ứ n g . K hi ấy , e n z y m c ó th ể h o ạ t đ ộ n g ớ trạ n u thái n g ậ m n ư ớ c . C á c e n z y m k ỵ n ư ớ c (n h ư lip a se ) chi c ầ n rấ t ít các p h â n từ n u ớ c đ ể ồ n đ ịn h cấu h ìn h c ủ a tru n g tâ m h o ạ t đ ộ n g c ủ a e n z y m . E n zy m c ó th ể bị v ô h o ạ t n ế u d u n g m ô i h ữ u c ơ s ử d ụ n g là d u n g m ô i h ò a tan n ư ớ c, khi ấ y lớ p n ư ớ c b a o q u a n h p h â n tử e n z y m sẽ bị h ò a tan , d ần tới sự k h ô n g ồ n đ ịn h c ù a tru n g tâm h o ạ t đ ộ n g v à c u ố i c ù n g là e n z y m bị v ô hoạt. M ộ t v ấ n đ ề k h á c g ặ p p h ả i là tro n g m ô i trư ờ n g d u n g m ô i h ữ u c ơ có rất ít p h â n tử n ư ớ c , v à d o v ậ y rấ t ít io n H +. K hi ấy rấ t k h ó v à k h ô n g th ế k iể m tra và k iềm s o á t g iá trị p H c ủ a m ô i trư ờ n g p h á n ứ n g . D ư ờ n g n h ư e n z y m c ò n “ lưu lạ i" g iá trị p H c ủ a d u n g d ịc h n ư ớ c c ủ a n ó trư ớ c đ ó v à th ể h iệ n p h ả n ứ n g tại g iá trị p H đ ó . M ô i trư ờ n g d u n g m ô i h ữ u c ơ c ó h o ạ t đ ộ n ư ớ c th ấ p , vì th ế đ ộ ồ n n h iệt c ủ a e n z y m tr o n g m ô i trư ờ n g d u n g m ô i h ữ u c ơ đ ư ợ c tă n g c ư ờ n g . H iệ u q u ả ổ n đ ịn h n h iệ t n à y c ó tác d ụ n g đ ố i v ớ i m ọ i e n z y m . C ó th ể lấy ví d ụ lip a se đ ể x e m x ét. T ro n g m ô i trư ờ n g trib u ty l c h ứ a 0 ,0 2 % n ư ớ c , c h u k ỳ b á n hủy c ủ a lip a se ớ 1 0 0 ° c là 12h, kh i m ô i trư ờ n g c h ứ a 0 ,8 % n ư ớ c , c h u k ỳ b án h ú y c ủ a lip a se gi ana x u ố n g c ò n 12 p h ú t v à e n z y m bị v ô h o ạ t n g a y tứ c k h ắ c ở m ôi trư ờ n g 10 0 % n ư ớ c . N g o à i ra , tro n g d u n g m ô i h ữ u c ơ , đ iể m đ ó n g b ă n g c ủ a n ư ớ c g iảm x u ố n g c h o p h é p s ử d ụ n g c á c e n z y m n h ạ y c ả m n h iệ t ở n h iệ t đ ộ th ấp , H o ạ t độ n ư ớ c th ấ p c ó x u h ư ớ n g làm cá c p h â n tử e n z y m rắ n lại. Đ iề u đ ó có thể ả n h i th ay .............v hưcrnu tó i K m v à Vmax c ủ a p h ả n ứ n g e n z y m v à th ậ m ch í có th ề d ẫ n tớ đổ i tín h c h ấ t x ú c tá c c ù a e n z y m . L ip a s e tụ y tạ n g c ù a lợ n là m ộ t trư ờ n g h ợ p đ iể n h ì n h ^ í ử s ự t h t y đ ồ í i đ i ả rrârìg x ííc tá c ờ m ô i trư ờ n g có h o ạ t d ộ n ư ớ c th ấp . K h i p h ả n ứ n g tro n g h ệ p h ả n ứ n g hai p h a c ó a w th ấp , e n z y m n à y k h ô rìg th ể h iệ n h o ạ t tín h x ú c tác p h ả n ứ n g c h u y ể n e s te h ó a d ẫn tớ i s ự b ù n g n ô các rư ợ u b ậc cao . 301 Yếu tố quan trọng nhất kiểm soát sự cân bằng giữa độ ổn định và khả năng vô hoạt enzym trong môi trưcmg hữu cơ là độ phân cực của dung môi. Dung môi có độ phân cực thấp (tính kỵ nước cao) ít có khả nâng phá vờ cấu trúc của các phân tứ nước gắn chặt xung quanh enzym. Độ phân cực có thể biểu thị bàng logP (P là hệ số phân bố) cùa dung dịch hữu cơ trong noctanol và nước: 1°8p = 1°sís <*■'> Trong đó n octanoi là nồng độ chất tan phân bố trong octanol, n H2 0 là nồng độ chất tan phân bố trong nước. Giá ừị logP càng lớn, độ phân cực của dung môi càng nhỏ, LogP tăng 0,52 lần khi có thêm một nhóm -CH 2 - gắn thêm vào mạch cacbon của dung môi. Ví dụ, logP của butanol là 0,8. LogP của hexanol (thêm hai nhóm -CH2 -) cỏ thể tính được là 0,8 + 2 X 0,52 (1,84). Hoạt tính của enzym trong hệ hai pha phụ thuộc vào logP (hình 6.13). Có thể thấy ràng enzym thường bị vô hoạt khi logP < 2. Khi logP > 4 (dung môi ít phân cực hơn), enzym ít bị ảnh hựởng hơn. Các dung môi thông dụng thường có logP nằm trong khoảng từ 2 - 4 (bảng 6.13). LogP Hình 6.13. Sự phụ thuộc hoạt tính của enzyme trong hộ hai pha vào giá trj logP cùa pha hữu co: - enzyme tự do, — enzym cổ định ưèn chất mang kỵ nước. 302 Bảng 6.13. Giá trị ỉogP của một số dung môi hữu cơ thông dụng Dung môi logP Dung môi logp Butan 0,3 1,1,1 - Tricloetan 2,8 Etylacetat 0,7 Cacbon tetraclorua 2,8 Butanol 0,8 Dibutyl ete 2,9 Dietyl ete 0,8 Cyclohexan 3,1 Metylen clorua 1.4 Hexan 3,5 Butylacetat 1.7 Petroleum ete (60-80) 3,5 Diizopropyi e te . 2,0 Petroleum ete (80-100) 33 Benzen 2,0 Dipentyl ete 3.9 Cloroform 2,2 Heptan 4,0 Tetracloroetylen 2,3 Petroleum ete (100-120) 4,3 Toluen 2,7 Hexan decari 8,7 Tính tan cùa một sổ cơ chất hoặc sản phẩm phản ứng có thể làm thay đổi logP. Nhiều phân từ không phân cực có chứa các vùng cấu trúc phân cực làm cho phần tử loại này kém hòa tan trong đung môi không phân cực. Việc lựa chọn dung môi hữu cơ còn phụ thuộc vào các yếu tổ khác như giá cả, khả năng thu hồi, đặc tính dễ cháy, bay hơi hoặc các đặc tính ức chế khác. Việc cố định enzym ừên các chất mang phân cực mạnh có thể làm đường cong phụ thuộc logP và hoạt tính enzym lệch về trái, c ỏ thể đạt được điều đó bằng cách cố đinh enzym trên các chất mang cao phân tà như agarose, sephadex, sau đó ngâm ngập khối enzym cố định ừong pha hữu cơ. Nếu đường cong lệch trái, khả năng lựa chọn dung môi hữu cơ thích hợp được mở rộng. Ngoài ra, khối enzym cổ định này còn có các ưu điểm như: 1) bảo vệ enzym trong chất mang chống lại sự biến đổi của bề mặt phân chia pha lỏng - lỏng trong đòng khuấy mạnh; 2) đễ thu hồi enzym; 3) có thể sử dụng cùng với các coenzym trọng lượng phân từ thấp ưa nước như NAD(P)+ khí cỏ hệ thống tái sinh coenzym; 4) cho phép sử dụng liên tục và 303 h iệ u q u ả th iế t bị p h ả n ứ n g h ai p h a d ạ n g cố đ ịn h , p h a đ ộ n g là d u n g m ô i h iìu c ư c ó th ể b ào h ò a n ư ớ c . N g a y c à tro n g trư ờ n g h ợ p d u n g m ô i h ữ u c ơ c ó logP th ấ p v à tan tro n g n ư ớ c , v iệ c m ấ t h o ạ t đ ộ e n z y m c ó th ể đ irợ c b ù đ ắ p b ằ n g s ự th a y đ ổ i h à n g số c â n b à n g . V í d ụ g lu c o is o m e ra s e đ ư ợ c s ử d ụ n g tro n g d u n g m ô i e ta n o l đ ể s á n x u ấ t m ậ t tin h b ộ t c ó h à m lư ợ n g fru c to s e c a o d o p h â n đ o ạ n su ất k in h tế th u đ ư ợ c trong trư ờ rm h ợ p s ử d ụ n g d u n g m ô i hĩru c ơ c a o hơn m ặc d ù h o ạ t tín h e n z y m giảm c ò n 10% s o vớ i trư ờ n u h ọ p s ử dụng d u n g m ôi n ư ớ c. - Trạng thủi cân bằng trong hệ hai pha hừii cơ — nước T ro n g p h à n ứ n g e n z y m th ô n g th ư ờ n g , đ ổ i v ớ i p h à n ứ n g đ ơ n p là n , luôn lu ô n tồ n tại trạ n g th ái c â n b a n g g iữ a c ơ c h ấ t A v à sà n p h ẩ m B n ô n g q u a h à n g số o ân bẳng Kntrong pha nước: Knụ (6 .2 ) B T ro n g h ệ h ai p h a , A v à B sẽ p h â n b ố v à o c ả h a i p h a v ớ i h ệ số p h â n bố PA v à PB v à trạ n g th ái c â n b à n g đ ư ợ c th iế t lậ p n h ờ h ằ n g s ố cân b à n g K he tro n g p h a h ữ u cơ : Pha nước Kn A ^— 4 , B 1k» (6.3) Pha hữ u cơ với =[Bn]/[A„], (6.4) = [B h c ] / [A h c ], (6.5) =[Ahc] / [ A n] (6.6) và tro n g đ ó , ch ỉ có b a th ô n g số là đ ộ c lập vớ i n h a u , c ò n m ộ t th ô n g số c ò n lại p h ả i p h ụ th u ộ c v à o b a th ô n g số k ia. H a n g sổ c â n b ằ n g tro n g h ệ h a i p h a đ ư ợ c tín h th eo : 304 K h a i pha [B tố n g ] / [A tồ n g ] ( 6 .8 ) v ớ i [Biáng] v à [Atồng] là n ồ n g đ ộ h ò a tan tổ n g sổ c ủ a A v à B. T ư ơ n g tự b iến đ ổ i c á c b iế u th ứ c s a u c h o p h é p tín h đ ư ợ c Khai pha: và [ A tô n g ] . V tố n g = [A n ]. V n + [A h c ]. V hc [Biôno]. Btồng = [Bp ]. v n + [Bhc]. Vhc ( 6 .9 ) (6 .1 0 ) V tông — V n + V h c K [ B n ] - V n + [ B hJ ha,pha [ a J - U a J u h,. . vZ (611) K ế t h ợ p (6 .6 ) v à (6 .7 ): K =K„ í l l ĩ ỉ s l (6.12) a + a Pf, I v ớ i tỷ lệ th ể tíc h hai p h a h ữ u c ơ v à n ư ớ c: a = v hc/ v n (6 .1 3 ) a c ó trị số n h ỏ , th ể tíc h p h a n ư ớ c rất lớ n h ơ n p h a h ữ u cơ , Khai pha tiế n g ầ n tớ i K n, n ế u a đ ù lớ n, th ể tíc h p h a h ữ u c ơ lớ n , Khaipha tiế n đ ến KheN ếu C ó th ể th ấ y rõ đ iề u n à y k h i b iế n đ ổ i K haipha n h ư sau: kh i a đ ủ lớ n, c ô n g th ứ c (6 .1 2 ) trở th à n h : K h a i pha = K n P B/P A K h ai pha = (6-14) [B h c ] /[ A h c ] = K h c ( 6-1 5 ) Đ ố i v ớ i c á c p h ả n ứ n g nhị p h â n , h ệ hai p h a ả n h h ư ở n g đ ế n p h ả n ứ ng p h ứ c tạ p h ơ n đ ố i v ớ i c á c p h à n ứ n g đ ơ n p h ân . T ro n g trư ờ n g h ợ p n ày , q u á trìn h đ ư ợ c đ ơ n g iả n h ó a th e o m ô h ìn h sau: Pha nước K„ A + B —•"*“ r, Pha hữu Cơ A + B c + 11,0 '4 K c + H: 0 (6.16) / \ = [ C hJ / [ C J (6.17) PD = [Dh ]/[Dn] (6.18) B ằng cách tương tự, Kị^, phi, dược tính bàng: k ** hai phu fl + a.Pc H\ + a PD ) _ K n (6 19) n +QLPA )(ị + aPfí ) 305 Khi thể tích pha hữu cơ đủ lớn, Khai pha tiến tới Khe như trong trường hợp phản ứng đơn phân. Tuy nhiên, do Khai pha phụ thuộc bậc 4 vào a, do vậy, tại các giá trị trung gian của ạ, K h a i pha sẽ nhận các giá ưị cực đại hoặc cực tiểu khác với Kn vả Khc. Như vậy, K hai pha có thể có giá trị lớn hom các phản ứng tương tự xảy ra trong hệ một pha hữu cơ hoặc nước. Trong trường hợp này, vận tốc phản ứng trong hệ hai pha có thể lớn hem nhiều so với phản ứng trong hệ một pha. Một trường hợp đặc biệt của phản ứng nhị phân trong hệ hai pha là một trong các cấu tử của phản ứng là nuớc. Khi ấy, quá ưình (6.16) sẽ trờ thành: Kn Pha nước Pha hữu Cơ A + B _ iĩ f .F ' A + B „ — c í + HjO _ //C I6 -2™ c + H:0 (6 21) r. p n = IHjO h,J / í H ,0 „] Thông thường trong hệ dung môi nước, phản ứng thủy phân sẽ xảy ra, nghĩa là theo chiều từ phải sang ừái. Tuy nhiên trong hệ hai pha, hàng sổ cân bằng của phản ứng thay đổi như đã mô tả ở trên, cho phép enzym thủy phân hoạt động theo chiều từ ứái qua phải. Điều này rất có ý nghĩa bởi vì phản ứng tổng hợp rất khó xảy ra trong các phản ứng hỏa học hữu cơ thông thường đo đòi hỏi các vùng đặc hiệu và lựa chọn các nhóm phản ứng. Có hai yếu tổ ảnh hưởng tới năng suất thu nhận sản phẩm c , đó là: 1) sự thay đồi của Khai pha, và 2) nồng (Jộ ([H20]t). Nồng độ nước tổng cộng được tính theo phương trình cân bằng vật liệu: [H20 ]t (Vn + Ỵhc) = [H20]n.vn + [H20 ]hc.vhc (6.22) [H2 Ơ]n là nồng độ phần mol của nước tinh khiết, [H2 Ơ]n = 1000/18 = 55,5M r u m _ 55,5(1 +aPn) [H 20 ] , = 1+ a Với 306 K"haipha = i M Ề i I (6.23) Và (6.19), thay Pn cho P [), được: r c i = K q + « P j.( l + q ).[A l3.[BJ (6.24) " 55f5.(l + a P A).(l + aP B) Nếu c ít phân cực han A và B, hiệu suất phản ứng sẽ tăng lên cùng nồng độ pha hừu cơ. Ví dụ hình 6.14 về sự tổng hợp este từ axit và rượu trong hệ hai pha cho thấy khi nồng độ pha hữu cơ tâng lên, hiệu suất phản ứng có thể tăng từ 0% lên 100%. Để đạt được hiệu suất chuyển hóa cao, cần loại bỏ lượng nước tạo thành trong hệ hai pha để tránh giảm DL Tuy nhiên loại bỏ nước trong hệ hai pha là không đễ đạt được. Có thể bổ sung đều đặn enzym hoặc một thể tích nhất định pha hữu cơ để giữ cho hằng số cân bẳng pha của hệ không thay đổi. Hình 6.13. Tổng họp etyỉ este -benzoyl-L-phenyialanin từ N-benzoyl-Lphenyỉaỉanitì vứ rượu etylic trong hệ hai pha cloroform ■nước - Động học enzym trong hệ hai pha hữu cơ - nước Trong hệ hai phai luôn có một lượng nhất định các chất phản ứng tan trong lớp nước bao quanh enzym. Thường thi iớp nước này không bị khuấy trộn cho dù pha hữu cơ được khuấy đều đặn trong suốt quả trình phản ứng, Nếu chịều dảy lớp nước này ỉà lớn, vận tốc phản ứng enzym bị kiểm soát bởi vận tốc khuếch tán của cơ chất qua lớp nước do độ hòa tan thấp cùa cơ chất trong pha nước. Trong trường hợp enzym hòa tan tốt trong nước, lớp nưóc này thường rất mỏng, và vận tốc phản ứng phụ thuộc vào vận tốc 307 khuếch tán cơ chất ờ nồng độ cao trong pha hữu cơ qua lớp phân chia bề mặt tới vi môi trường bao quanh enzym có nồng độ cơ chất rất thấp. Trong trường hợp enzym cố định, vận tốc dòng cơ chất tới bề mặt xúc tác và hiệu suất của phản ứng phụ thuộc vào bề mặt riêng của hạt enzym. Trong trường hợp hệ một pha, bề mặt riêng này là bề mặt của hạt enzym tiếp xúc với môi trường phản ứng. Trong hệ hai pha, bể mặt riêng là bề mặt phân chia hai pha. Trong các trường hợp thông thường, bề mặt phân chia pha phụ thuộc vảo thể tích của giọt nước bao quanh hạt enzym. Nếu thể tích pha hữu cơ tăng lên, thể tích giọt nước này giảm đi, làm giảm năng suất thể tích phản ứng. Khi phản ứng tạo thành nước, cần tách nước ra do hàm lượng nước tích tụ không những làm chuyển dịch cân bàng của hệ thống mà còn làm giàm vận tốc phàn ứng. Các nguyên tắc cho phép tối ưu hỏa phản ứng enzym trong hệ hai pha chủ yếu phụ thuộc vào logP: - Giảm tối đa sự khác biệt giữa logP của cơ chất và bề mặt phân chia pha. LogP của dung môi hữu cơ cần lớn hơn logP của cơ chất rất nhiều để đảm bảo nồng độ cơ chất cao trong khu vực phân chia pha và nhờ đó có thể đạt được vận tốc khuếch tán cao cùa cơ chất từ pha hừu cơ vào pha nước. - Sự khác biệt của logP của sản phẩm và pha hữu cơ cần phải rất nhỏ, đồng thời logP của sản phẩm phải lớn hơn logP của bề mặt phân chia pha. Nhờ đó có thể đạt được vận tốc chuyển dịch lớn của sản phẩm sau phản ứng từ pha nước qua bề mặt phân chia vào pha hữu cơ. - Có thể thay đổi logP của bề mặt phân chia pha độc lập với pha hữu cơ nhờ bổ sung các chất hoạt động bề mặt hoặc các chất hiệp trợ thích hợp. Tuy nhiên trong thục tế, việc sử dụng và lựa chọn các chất hoạt động bề mặt phức tạp hơn nhiều. Đặc biệt khi phản ứng tạo ra nước, các chất hoạt động bề mặt sẽ tạo ra các lớp màng kép của chất hoạt động bề mặt bao quanh giọt nước. Có thể hạn ehế nồng độ nước xung quanh hạt enzym bàng cách sử dụng các màng lọc phân từ (K-A]-silicagel) để hẩp thụ nirớc ứong pha hữu cơ. Nếu dung môi hừu cơ có nhiệt độ sôi cao, có thể tách nước bàng chưng cât chân không (ví dụ, trong phản ứng este hóa các axit béo và các rượu kỵ nước nhờ lypase trong công nghệ sản xuất các loại sáp). 308 6.3.1.2. Phản ứng enzyrn trong hệ hai pha lỏng tan lẫn: pha ntrớc - nước Hệ hai pha nước cho phép chuyển dịch cân bằng phản ứọg về phía tạo ra sản phẩm băng cách đảm bào cơ chất và enzym phân bổ chủ yếu vào một pha, sản phẩm phân bố chủ yếu trong pha còn lại. Lý thuyết của hệ hai pha hữu cơ - nước hoàn toàn có thể áp dụng trong trường hợp hai pha nước. Có thể minh họa hệ thống này thông qua ví dụ thủy phân tinh bột nhờ ctamylase và gluco-amylase trong hệ haí pha nước tạo bởi nước (pha trên) vá nước - propyenglycol (PFG 20000) (pha dưới). Tinh bột và phàn lớn enzym phân bố trong pha dưới, glucose phân bố chủ yếu trong pha trên. Một lượng nhỏ glucoamylase phân bố trong pha trên giúp chuyển hóa ologosaccarit trong pha này thành glucose nâng nồng độ sản phẩm tới 140 g/1.trong pha trên. Hệ thống này cho phép enzym và cơ chất tồn tại trong cùng một pha, do vậy ưánh được hạn chế cùa hiện tượng chụyển khối qua bề mặt phân chia pha như trong trường hợp hệ hai pha không tan lẫn. Ngoài ra, không cần tách sản phẩm khỏi cơ chất chưa đư ợ c chuyển hóa và giảm được m ấ t mát enzym. - Phàn ứng tỏng hợp do enzym xúc tác Các phản ứng tổng hợp nhờ enzym đang là mối quan tâm của các nhà công nghệ sinh học do việc tổng hợp các chất nhờ con đường hóa học là rất khó khăn, tạo ra nhiều sàn phẩm phụ và giá thành sản phẩm cao. Việc sử dụng enzym với tính đặc hiệu nhỏm, đặc hiệu mạch bên hoặc đặc hiệu quang học cao trong điều kiện cân bằng phản ứng chuyển dịch theo chiều từ phải sang trái (tổĩig hợp) có thả thu được các sản phẩm sạch với giá thảnh thấp hơn nhiều sơ với phương phảp hóa học. Chúng ta xem xét các ví dụ sử dụng protease trong phản ứng plastein, glycozidase tròng phản, ứng tổng hợp cảc oligosaccarit và lipase trong phản ứng chuyển vị estq. Phản ứng pỉastéiri Sử dụng protease trong dung dịch protein, axit amin và pepỉit có nồng độ cao có thể tổng hợp ngẫu nhiên các polyme. Phản ửng này thường được sử dụng để cải biến các chất dinh dưỡng, cảm quan không hấp đẫn của các protein, ví dụ như tạo rá các protein có mùi, vị hoặc'màu sắc hấp dẫn hơn so với protein nguyên thủy. Phàn ứng này cũng có thể sứ dụng để gắn thêm 309 vào các protein một thành phần axit amin nào đó nhảm nâng cao giá trị dinh dưỡng hoặc biến đổi cấu trúc bậc 1 của protein nhàm cải biến tính chất chức năng của protein. Hầu như các protease phân cắt protein ớ các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzym này theo chiều phàn ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptit định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm cacboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khà năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. Các yếu tố này đạt được bằng cách kiểm soát cân bàng phản ứng. Một cách khác để tổng hợp các peptit là dựa vào quá trình được kiểm soát động thái khi quá trình tổng hợp có vận tốc tạo sản phẩm (kp) cao hơn quá trình thùy phân (A h). Quá trình này được mô tả như sau (X cỏ thề là este, amit hoặc cacboxyl): Ọ H II t R - c —X + enzym ọ H Ọ r II I t _ _ — Ị^R—c —X : enzymj— ► R - c —X -enzym + HX Vận tổc tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào tỷ số kp / kh, và km cũng như nồng độ của nước và hợp chất amin. Hiệu suất quá trình này được nâng cao nếu giảm hoạt độ nước của môi trường phản ứng. Có thể kéo dài một peptit bàng cách thêm vào peptit đó từng axit amin hoặc bằng cách ngưng tụ các peptit. Phản ứng ngưng tụ các peptit được thực hiện bằng quá trình kiểm soát động thái, phản ứng kéo dài peptit được thực hiện tốt nhẩt trong hệ hai pha rắn - lỏng (thông qua việc kết tủa) hoặc quá trinh kiểm soát động thái trong hệ hai pha lỏng - ỉỏng. Để kiểm soát động thái của phàn ứng, cần có enzym hoạt độ cao, và do vậy giá thành sản phẩm cao. Để giảm chi phí, có thể sử dụng enzym cố định. Tổng hợp chất ngọt thay thế aspartam là một ví dụ đơn giản của phản ứng plastein. Aspartam là một dipeptit ữ-L-asparty-L-phenylalanyl-Ometyl-este tạo bời L-aspartic và metyl este của phenylamin. Trong phương pháp tông hợp asparỉam băng con đường hóa họe, cần bảo vệ cà hai nhóm j8- 310 cacboxyl và ữ-amin của L-aspartic. Nếu nhóm /3-cacboxyl không được bảo vệ, phản ímg sẽ tạo ra cả dạng /3-izome mà để loại bỏ nó, giá thành sản phâm sẽ tăng lên 30%. Hiệu suất tổng hợp theo con đường này rất thấp, giá thành sản phẩm cao. Nếu sử dụng protease thermolysin, chỉ cần bảo vệ nhóm a -am in cùa L-aspartic nhờ phản ứng với benzyl chloroformat để tạo thành đẫn xuất của benzyloxy-cacbonyl-BOC (BOC-L-aspartic), ưánh tạo thành poly L-aspartic. Có thể sừ dụng hỗn hợp racemic của L-aspartic để tổng hợp aspartam do tính đậc hiệu quang học của enzym. Việc tổng hợp isulin nguời từ isulin của lợn đòi hỏi thay thế alanin ở đầu cacbon của mạch peptit lợn bằng threonin. Có thể thực hiện được phản ứng này nhờ phản ứng chuyển peptit do trypsin xúc tác vói sự tham gia của threonin có nhóm cacboxyl được bảo vệ. Phản ứng xảy ra trong pha nước với dung môi hữu cơ tan trong nước. Sản phẩm tạo thành được thủy phân nhẹ để tách nhóm cacboxyl của threonin để tạo ra insulin người. - Phản ứng tổng hợp sử dụng glycozidase Bên cạnh việc sử đụng protease ừong các phàn ứng plastein, glycozidase cũng được sử dụng khá rộng rãi hiện nay để tổng hợp các oligosaccarit khử hoặc không khử từ các đường khử quen thuộc như glucose, fructose... trong việc phát triển các thực phẩm chức năng. /3galactosidase có thể sử dụng ừong phản ứng tổng hợp N-acetyllactosamin từ lactose và N-acetylglucosamin để loại bỏ lactose trong sữa trong sản xuất các chế phẩm sữa chọ người tiểu đường hoặc bệnh nhân mẫn cảm vói lactose. Phản ứng chuyển vị este Vị trí và bản chất các gốc cacboxyl trong cấu tạơ các lipít tạo nên các lipit có tính chất vật lý hoặc cảm quan hoàn toàn khác nhau. Một số lipit có giả trị thường mại lớn, vỉ dụ như bơ cacao. Bơ cacao có giá trị rất caơ do nhiệt độ nóng chảy đặc biệt của nớ (nằm giữa nhiệt độ môi trường và nhiệt độ cơ thể người). Trong thành phần cấu tạo của bơ cacáo, 80% triglycerit có thành phần axit palmitic và stearic ở vị trí 1 và 3, axit oleic ở vị trí 2. Cố thể sản xuất các lipìt có giá trị cáo từ các lipit thông thường hoặc rẻ nhờ các phàn ứng chuyển vị este hoặc thay thế các gốc cacboxyl hoặc gốc rượu trong lipit dưới tác dụng của lipase. 311 Để sản xuất bơ cacao từ dầu cọ, các gốc axit trong dầu cọ cần được thay thế bằng gốc strearic. Phản ứng được thực hiện trong hexan chứa một lượng vừa đủ nước cho hoạt hóa lipạse. Cũng có thể nâng cao chat lượng của dầu oliu bàng cách thay các gốc oleic ớ vị trí 1,3 bàng các gốc palmitic, chất lượng dầu cọ hoặc dầu hướng dương bằng cách tâng tỳ lệ gốc oleic trong đàu. Ngoài ra, lipase còn được sử đụng ưong các phản ứng tong hợp các chất thơm tự nhiên trong hệ hai pha (ví dụ tổng hợp isoamyl acetat và rượu isoamyỉic). Các phản ứng tổng hợp này cỏ thể thực hiện được chì khí sử dụng lipase có tính đặc hiệu phù hợp và điều kiện phản ứng thích ứng sao cho quá trình hợp ưu thế hơn quá trình thủy phân. Đối với các lipase công nghiệp, thông thường hoạt tính thủy phân cao hơn hoạt tính tổng hợp 1 0 - 1 5 lần. Có thể hạn chế phản ứng thủy phân bằng cách làm giàm hàm lượng nước của hệ thống phản ứng hoặc sử dụng phản ứng ừong hệ hai pha hữu cơ -n ư ớ c. 6.3.2. Triển vọng tương lai của công nghệ enzym Hiện tai, mới có một số ít enzym được sản xuất ờ quy mô lớn và thích ứng với sản xuất công nghiệp. Ngành công nghiệp enzym hiện nay phát triển dựa trên những hưởng sau: kiểm tìm nguồn enzym mới; thiết lập và sử dụng đa năng hóa enzym công nghiệp; sử đụng công cụ kỹ thuật di truyền để thiết kế và sản xuất các chất xúc tác hữu cơ tương tự enzym và sử dụng các hệ enzym phức tạp. Để đáp ứng yêu cầu của phát triển công nghiệp enzym, cẩn có sự phối hợp cùa các nhà enzym học, các nhà di truyền và các nhà hóa học. 63.2.1. Cơ c h ứ phi tự nhiên Rất nhiều enzym không thể hiện tính đặc hiệu với cơ chất tự nhiên hoặc đôi khi trong điều kiện phản ứng thay đổi các enzym thể hiện hoạt tính hoàn toàn khác với các hoạt tính biết tnrớc của chúng. Nhở các phản ửng này, có thể thực hiện được các phản ứng enzym với vận tốc cao hơn nhiều lần so với sử dụng cơ chất thông thường của chúng hoặc có thể tạo ra cách thức mới để sản suất một sản phẩm nào đó. Có thể minh họa các khả năng này của enzym trong các trường hợp sau: Enzym glucooxydase đặc hiệu trong phản ứng oxy hóa đưcmg khừ với cơ chất đặc hiệu D-glucose nhưng không đặc hiệu với chất nhận electron cùa phản ứng oxy hỏa. Thông thưcmg, oxy đóng vai trò chất nhận electron của phản ứng oxy hóa D-glucose bằng enzym glucooxydase. Benzoquinon cũng có thể đóng vai trò chất nhận điện tử thay thế cho oxy, khi ấy phản ứng diễn ra như sau: o D -G lu co se B enzoquinon D-Glucono-1,5-lacion Ồ Hydroquinon Hydroquinon là hợp chất hữu cơ quý sử dụng nhiều trong kỹ thuật nhiếp ảnh. Phản úng này xảy ra với hiệu suất gần 100%, enzym không bị vô hoạt bởi peroxyt như ưong phản ứng với oxy. Vận tốc phản ứng giữa glucooxydase với benzoquinon cao hơn vận tốc phản ứng của enzym với oxy do tỉnh tan của benzoquinon trong pha nước cao hơn oxy. Acetylcholinesterase là enzym xúc tác sự thủy phán acetylcholin, một chất dẫn truyền thần kinh của động vật có xương sống, tạo thành cholin và acetic. Enzym này cũng có thể xúc tác đặc hiệu việc thủy phân acetyl-Dcamitin và không có hoạt tính đối với acetyl-L-camitin. L-camitin có hoạt tính vitamin và được sử dụng rất hữu ích trong điều trị, trong khi đó, dạng D-camitin lại không có giá trị này. Vì thế, enzym acetylcholinesterase có thể sử đụng để phân tách hỗn hợp racemic của hai hợp chất này. Người ta tổng hợp hỗn hợp racemic L,D-camitin bằng con đường hóa học, sau đó acetylat hỏa hỗn hợp bàng acetyl clorua để tạo ra acetyl-L,D-camitin. Cho hỗn hợp này qua cột phản ứng với acetylcholinesteraza, thu được acetyl-L-camitin và D-camitin. Tách hỗn hợp bàng sắc ký trao đổi ion, thu được acetyl-Lcamitin, chất này có tác dụng tương tự L-camitin. 6.3.2.2. Biến đổi cấu trúc enzym Một xu hướng rất phát triển trong những năm vừa qua trong lĩnh vực enzym là áp dụng kỹ thuật di truyền làm biến đổi có định hướng cấu trúc 313 enzym, làm thay đổi hoạt tính, hiệu suẩt phản ứng hoặc động học enzym, hoặc làm cho quá trình thu hồi enzym trờ nên hiện thực hơn. Một khía cạnh nữa trong sản xuất enzym cũng được tính đến là gắn các gen chịu trách nhiệm tổng hợp enzym có nguồn gốc từ các nguồn không an toàn vào các cơ thể chủ an toàn và tổng hợp chúng với năng suất cao nhờ việc chứa nhiều bản sao của gen đó. Trong tương lai, enzym có thể được thao tác sao cho dễ dàng phù hợp với các điều kiện trong sản xuất như điều kiện nhiệt độ, các ion, kiềm hoặc pH ... Một xu hướng cũng rất hứa hẹn trong công nghệ enzym là sừ dụng công nghệ protein trong cài biến trung tâm hoạt động của enzym, nhờ đó có thể thu được enzym có hoạt tính rất cao hoặc có hoạt tính mới. Một trong các kỹ thuật được xem là triển vọng là đột biến điểm cho protein enzym. Điểm mấu chốt của kỹ thuật này là chỉ thay đổi một hoặc vài axit amin trong cấu tạo protein của enzym, có thể dẫn tới thay đổi rất lớn về cấu hình của protein, và do vậy hoạt tính hoặc tính chất của enzym sẽ thay đổi theo. Để kỹ thuật này có thể phát triển được, cần cớ một hệ dữ liệu đủ chi tiết và các phần mềm hỗ trợ, cộng thêm các kỹ thuật đột biến điểm bẳng các phương pháp truyền thống, hóa học cũng như phân tử cả về lý thuyết cũng như thực nghiệm. 6.3.23. Tổng hợp enzym nhân tạo Các chất có hoạt tính tương tự enzym (synzym) có thể được tổng hợp bằrig con đuờng nhân tạo. Để tổng hợp các synzym, cần thiết kế và tổng hợp trung tâm gán cơ chất và trung tâm xúc tác. Thực tế cho thấy việc thiết kế trung tâm gẳn cơ chất khá đơn giản còn thiết kể trung tâm xúc tác, gập rất nhiều khỏ khăn. Nhìn chng các synzym cũng tuân thủ mô hỉnh MichaelisMenten, cơ chế phản ứng tương tự như phản ứng đo enzym xúc tác, Cho tới nay, các enzym nhân tạo chưa thể được thiết kể từ các protein do chưa có đầy đủ thông tin và nguyên tác về cấu hỉnh không gian từ cấu trúc bậc một của protein. Hơn thế nữa, enzym được tạo nên tự prọtein cũng sẽ gặp phải các nhược điểm của enzym tự nhiên là dễ biến tính, d i bị oxy hóa và thủy phân. 314 I Một vài enzym nhân tạo đà được sử dụng thành công, ví dụ như trường hợp axit polyglutamic với tính chất tương tự esteraza, hoạt động ở pH rất hẹp, tối ưu ở pH = 5,3; Km= 2mM và V m ax = 10"4 thủy phân cơ chất 4-nitrophenyl acetat. 10'5 s"1đối với phản ứng 6.23,4, Hệ thống tái tạo coenzym Đối với các enzym sử dụng coenzym, việc tái tạo coenzym là vô cùng quan trọng do giá thành cao của các coenzym và khó khăn trong tái tạo coenzym. c ỏ thể giải quyết van đề này nếu cố định coenzym cùng các enzym trên chat mang thích hợp. Một trong các biện pháp như vậy là hệ thống cố định tế bào. Tuy nhiên hệ thống này làm việc với hiệu suất thấp và tính ổn nhiệt không cao. Có thể thực hiện phản ứng enzym trong thiết bị phản ứng màng với kích thước lỗ màng lọc phải nhỏ hơn kích thước coenzym. Hoặc các coenzym được cố định ừên các chất mang. Thông thường cần dẫn xuất hóa coenzym để dễ dàng cố định chúng trên chất mang nhưng không ảnh hường tới chức năng hỗ trợ xúc tác của chúng. Các chất phân tử lượng cao hòa tan ừong nước thường được sử dụng làm chất mang coenzym đo ít ảnh hưởng tói sự khuếch tán của coenzym so với các chất mang không tan trong nước. Các chất hay sử dụng là dextran, propylenglycol, polyetylenimin. Thường coenzym chỉ nên gắn ở mức độ thấp tránh làm giảm khả năng chuyển động và khuếch tán cũng như ảnh hưởng ức chế của chúng tới phản ứng enzym. Động thái của các phản ứng enzyw nảy thay đổi theo từng hệ thống, tuy nhiên chúng đều tuân theo mô hình Michaelis-Menten với Kmcao hom và v m thấp hom trong trường hợp không cô định coenzym. Hiện nay, đã có một số hệ thong tái tạo coenzym dựa trên nguyên tẳc hồa học, điện hỏa và nguyên tắc enzym. Tái tạo coenzym theo nguyên tắc enzym là ưu điểm hơn cả do tính đặc hiệu cao của nó, nhưng phương phầp điện hóa lại cỏ tính cạnh tranh hơn. Dưới đây là hai ví dự về tái tạo coenzym theọ nguyên tạc enzym. Đê có thể thực hiện được nguyên tác này, cơ chất enzym phải rẻ và các enzym hỗ trợ quá tìn h phải (dễ kiếm, sản phẩm cần tách ra dễ dàng, cơ chạt cũng như sản phẩm của phản ứng tái tạo coenzym không ảnh hưởng tới hệ thống. 315 C ơchấi (A = 0 ) ----------- oxydoreduciase ------sán phẩm (A H O H ) polyeivlen glycol-N A D * Polyeíhylen glycol-NADH + H* CO: (khí) HCOOH form al dehydrogenase kinase Cơ chất (A O H ) dextran-A D P D e x tra n -A T P Axit acetic sàn phẩm (A O PO r ) acítat kinase acetyl phosphai 6.3.2.S. S ử dụng enzym trong phân tích, chẩn đoán và điều trị Một lĩnh vục phát triển quan trọng của công nghệ enzyra là sử dụng enzym trong phân tích - chẩn đoán và điều ưị. Trong những năm gần đây, kỹ thuật enzym đã tiếp cận các phân tích trong chăn nuôi, trồng trọt, trong nghiên cứu sinh thái học và công nghiệp thực phẩm và đặc biệt việc sử dụng các công cụ enzym ừong chẩn đoán y tế và vệ sinh môi trường. Việc sử dụng enzym ưong y học hiện mới chỉ đạt được các thành công khá hạn chế, chù yếu là các phân tích và chẩn đoán. Việc sử đụng enzym như là một tín hiệu cảnh bảo hoặc điều trị hiện đang gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là: Các enzym .là các polyme lớn, khỏ có thể đưa vào trong các tể bào của cơ thể. Đây là lý do cơ bàn hạn chế khả năng khai thác việc sử dụng enzym trong chẩn trị các bệnh đi truyền. Nhiều phương pháp đã được phát triển và áp dụng để giải quyết vấn đề này bàng cách sử dụng enzym hướng đích. Vi dụ như enzym với liên kết cộng hóa trị gắn vào gổc galactose có tác dụng hưổmg đích tế bào gan, enzym với liên kết cộng hóa trị gắn kháng thể đon dòng đặc hiệu được sử dụng để tránh các hiệu ứng phụ do tính không đặc hiệu gây nên. 316 - Do có bản chất protein, các enzym khi vào cơ thể có thể đóng vai trò một kháng nguyên và cảm ứng phản ứng miễn địch của cơ thể. Điều này có thể gây nên các phản úmg dị ứng đặc biệt khi sừ dụng trong thời gian đài. Trong một vài trường hợp có thể giải quyết vấn đề này bằng cách biến đồi enzym thành chất không còn bản chất protein nhờ các liên kết cộng hóa trị. Khí ấy, enzym nảy thể hiện hoạt tính chống khối u và không gây nên bất cứ một đáp úng miễn địch nào. Tuy nhiên việc sử dụng enzym cần đảm bảo không kèm theo độc tố. Chính vì thế mà các enzym động vật được sử dụng phổ biến hơn enzym vi sinh vật cho dù giá thành của chúng cao hơn enzymvi sinh vật. - Các enzym có thể được kéo dài thời gian bán hủy nhờ các phương pháp khác nhau: tạo ra các liên kết cộng hóa trị, bao enzym bởi một lớp vỏ nhân tạo. Tuy thời gian hoạt động của các enzym được cải thiện song cũng có thể gây nên các phản ứng miễn dịch hoặc tạo ra các cục máu đông. Các enzym sử dụng trong chẩn đoán, điều trị cần có độ tinh sạch và đặc hiệu cao. Các giá trị Km phải thấp và Vmax cao để đạt được hiệu quà sử đụng ngay cả ở nồng độ enzym và cơ chất thấp. Gia thành của các chế phẩm enzym này tuy cao nhưng vẫn có thể cạnh tr-anh được với các hóa trị đắt tiền. 63.2.6. Bảo vệ môi trường Việc sử dụng enzym quan trọng nhất trong công tác bào vệ môi trường là sử dụng enzym trong “công nghệ cuổi đuờng ổng”- trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành các sản phẩm có ích, hoặc ừong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải thành các sàn phẩm có ích. Trong trường hợp này, các enzym được sử dụng dưới dạng các chế phẩm kỹ thuật. Ngoài ra, do trong môi trường còn chứa rất nhiều các thành phần khác nên đòi hòi các enzym phải có độ đặc hiệu cao. Chính yêu cầu này đặt ra thách thức lớn cho việc sử dụng enzym ưong công tác bảo vệ môi trường. Một trong các xu hướng bào vệ môi trường lả sừ dụng enzym vì mục đích phát triển công nghiệp bền vững. Người ta hy vọng enzym sẽ giúp phát triển chiến lược sản xuất sử dụng nguyên liệu tái chể, thay thế các kỹ thuật sử dụng hóa chất bằng các vật liệu và quá trình sinh học. 317 Công nghệ enzym hiện đang ở giai đoạn chín mùì để phát triền. Lý thuyết về enzym đã và đang được tích lũy. Việc sù dụng enzym đã và đang được nhân rộng trong nghiên cứu, trong công nghiệp và ngày càng tìm thấy các ứng dụng đặc biệt không thể thay thế được. Tuy vậy, vẫn còn rất nhiều khoảng trống trong kiến thức về enzym cả về phương diện lý thuyết cũng như thực nghiêm. Việc phát hiện các enzym tự nhiên mới ừong hệ sinh thái cùng như thiết kế các enzym còn đều đang ở phía trước. 318 X à i Liệu Tham Khảo 1. Aehle Wolgang, 2004 Enzyme in industry, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.kgaA. 2. Andres Illanes, 2008, Enzyme Biocatalysis, Applications, Springer Science Publishing 3. Anthony p. Turner F, 1996, Biosensors; Past* Present and Future, Institute of Bioscience and Technology 4. Asjhok Mulchandani, 2008, Principles o f Enzyme Biosensors, vol 6 : Enzyme and Microbial Biosensors. 5. Byong H. Lee, 1996, Fundamentaks o f Food Biotechnology, VCH Publisher 6. Bommarius, A. s, Riebel. B. R, 2004, Biocatalysis and Applications Wiley -V C H Verlag GmbH and Co.kgaA. 7. Campbell, c . N, Gal. D, Cristies. N, Barditrat. c , 2002, Enzyme amplified amperometric Sandwich test for RNA and DNA - Anal chem, pp158-162. 8. Erika Kressroger, 1997, Handbook of Biosensors and Electronic Noces Medicine, Foof and the Environment. CRC Press. 9. FOX. P.F, 1991, Food Enzymology-Vol2-Elivier Science Publishers LTD. 10. Georgres Hennen, 1998, Biochimie r r Cycle, Dunod, Paris u. Gerard Coutouly, 1991, Genie Enzymaticque. CO-Edition Masson- Principles and Doin. 12. Graham Romsay, 1998, Commercial Biosensors-Application to Chilical Bioprocess and Environment Samples, Chem, Anal. Vol 148. 13. Hideaki Nakamura, Isao Karube, 2003, Current Reseach Activity in Biosensors Anal Bianal Chem 377. 14. Josh Haacker, 1997, Immobilized Enzyme. Weiley, Chichester. 319 15. Jacquer-Henry Well, 1997, Biochimie General, Masson Paris. 16. Kiyoshi Toko, 2000, University Press. Biometric Sensor Technology. Cambridge 17. Lehniger, A. L, 2004, Principles of Biochemistry, 4<h Edition, Ư. H. Freeman. 18. Martin Chaplin, Christopher Bucker, Cambridge Unviversity Press. 1990, Enzym Technology, 19. Nicholas, Price, Lewis Stevens, 1984, Fundamentals of Enzymology. Oxford University Press. 20. Publications of “ 2001 Annual Meeting and Food Expo” -6-2002. Anaheim, California, Session 76A-Biotechnology. 21. R.Monsan.G, Durand, 1985, Biochimie Appỉiquee. 22. 320 Wang D.I.C, Cooney C.L, Demain A.L, 1979, Fermentation and Enzyme Technology, Wiley, New York.