- Khái niệm Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc phage λ ) bằng phương pháp hóa sinh. - Sau đó, đưa phân tử lai này vào tế bào chủ đã lựa chọn bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. - II-Nguyên liệu 1.1- DNA lạ cần tách dòng 1.2- Enzym 1.3- Vector chuyển gen 1.4- Hệ thống tế bào chủ 1- DNA cần tách dòng • Là đoạn DNA lạ, cần nghiên cứu 1- Enzym • 5 nhóm enzym: 1. - Các enzym nối khung phân tử DNA(E. - Các enzym tổng hợp mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử DNA (DNA polymerase, Reverse transcriptase) 5. - Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. - Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung B-Các loại enzym khác ENZYM VAI TRÒ DNA polymerase Nối các nu với nhau theo NTBS. - mạch DNA Enzym phiên mã ngược TH mạch DNA bổ sung với mach khuôn RNA theo chiều 5’-3’ Enzym nối ligase Nối các đoạn acid nucleic với nhau bằng lk phosphodieste Enzym methylase Thay đổi tính đặc hiệu của một số enzym giới hạn 2- Vector tách dòng • Vector là một phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và tự sao chép. - Lựa chọn vector tách dòng Loại vector tách dòng Kích thước đoạn gen đích có thể cài Plasmid 1-5 kb Phage 15-25 kb Phagemid 20-10kb Cosmid 30-50 kb BAC (thiết kế từ một phần DNA E.colivà các plasmid) 100-300 kb TAC (thiết kế từ một phần đoạn vir gen của Ti plasmid) 100-300 kb BiBac (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của 100-500 kb Agrobacterium) PAC (bộ gen của phage P1+plasmid) 100-300 kb YAC (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của nấm men Plasmid Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2- 5kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có ở vi khuẩn. - Ưu điểm Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh • Nhược điểm Đôi khi hiệu suất biến nạp vào TBVC thấp Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote Không tách dòng được các phân đoạn DNA có kích thước lớn (>10kb) Thực khuẩn thể (Phage. - Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. - Có thể tách dòng ở cả • Phage là thuật ngữ prokaryote và eukaryote. - chỉ các loại virut kí Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 sinh trên vi khuẩn. - Có khả năng mang Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở gen từ tế bào vi khuẩn nhiệt độ lạnh (vd. - cho sang tế bào chủ • Nhược điểm: nhận Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn. - Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid. - Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) của nấm men, trình tự tâm động, và đầu tận cùng (telomeres) giống như cấu trúc một NST của TB chân hạch • Có thể chuyển các đoạn ADN kích thước 150-1000kb 1.4- Hệ thống TB vật chủ • Mục đích: tạo DNA tái tổ hợp • Có thể sử dụng cả TB nhân sơ và nhân chuẩn làm TBVC • Yc: Dễ nuôi cấy để giữ và nhân giống, chấp nhận được nhiều loại vector. - VK E.coli Nấm men III- Quy trình 1.Tách lập các DNA cần tạo dòng • Chọn và cắt DNA của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE. - Khi sử dụng enzym cắt (RE), có thể tạo ra đầu dính hoặc đầu bằng. - Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA 2- Chọn vector • Chọn vector dựa vào kích thước và bản chất đoạn ADN • Yêu cầu của vector tách dòng. - Kích thước tương đối nhỏ so với NST của TB chủ Có thể nhân đôi độc lập trong TB chủ Có vùng nhận biết enzym giới hạn Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu Trình tự nu đã xác định Phải thích hợp với tế bào vật chủ Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai (polycloning site) 3.Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung. - Quy trình tạo vector tái tổ hợp • B1: chuẩn bị nguyên liệu, gen tách dòng tinh sạch được nhân lên bằng PCR • B2: Nối gen cần tách dòng với vector bằng Pư nối gen với các thành phần Pư thích hợp. - tiến hành điện di với thang DNA chuẩn kiểm tra KQ tạo vector TTH ->giữ ở nhiệt độ lạnh sâu -80 đến -85oC 4. - Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ Mục đích : sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành 1 số lượng lớn bản sao. - Có 2 phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào TB chủ. - Biến nạp - Tải nạp Các phương pháp chuyển DNA 1. - Biến nạp. - Là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận. - Không cần sự tiếp xúc giữa 2 tế bào hoặc các nhân tố trung gian ( phage hoặc virut. - Được thực hiện với vector chuyển gen là plasmit A- Biến nạp • Biến nạp là quá trình ở đó 1 cơ thể chủ có thể tiếp nhận 1 phân tử DNA ngoại lai từ môi trường bên ngoài • Có nhiều phương pháp biến nạp: sử dụng súng bắn gen, biến nạp TB trần, vi tiêm, xung điện (nấm men), sốc nhiệt (vi khuẩn. - Vi khuẩn có khả năng biến nạp tự nhiên gọi là các vi khuẩn khả biến di truyền (E.coli có thể khả biến khi được xử lý với ion Ca2. - Sau khi biến nạp , thường chỉ có 1 phần nhỏ tế bào chủ có vector tái tổ hợp. - B- Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận phải có nhân tố trung gian là virus. - Các dòng vi khuẩn mọc lên theo 3 khả năng tế bào vi khuẩn không nhận plasmit tái tổ hợp Tế bào nhận plasmit nhưng không có gen lạ tế bào vi khuẩn nhận được plasmit tái tổ hợp. - việc lựa chọn các chủng như ý muốn là không đơn giản Các phương pháp xác định dòng cần tìm Phương pháp lai axit nucleic Phương pháp sử dụng kháng thể Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn Phương pháp phát hiện do thay đổi kiếu hình Phương pháp lai axit nucleic Nguyên tắc • Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ. - Khi tăng nhiệt độ lên quá nhiệt độ sinh lý ( 80- 95oC), 2 sợi đơn DNA sẽ tách dời nhau do liên kết hidro bị đứt • Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại.Sự bắt cặp chỉ xảy ra khi 2 trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau Cách tiến hành • Chuẩn bị mẫu ( đầu ) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất • Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng 1 sợi bắng cách tăng nhiệt độ lên 80- 95oC • Hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. - Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và • Khái niệm đầu dò: các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu , có khả năng nhận biết 1 chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa • Đặc điểm: là 1 đoạn axit nucleic (DNA , RNA) sợi đơn. - Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ • Các loại đầu dò: cDNA, mRNA, oligonucleotide Phương pháp sử dụng kháng thể Nguyên tắc • dựa vào phản ứng đặc trưng của 1 số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu , phản ứng kết tủa Cách tiến hành • Chọn kháng thể đặc trưng cho protein • Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng • ủ protein với kháng thể đặc trưng • Tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn • Nguyên tắc Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình Nguyên tắc • Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng khuẩn lạc đó chứa gen lạ Cách tiến hành • Chuẩn bị 2 mẫu thử nghiệm mà plasmit tạo dòng có chứa gen lacZ , 1 mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ • Nuôi cấy cả 2 mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5- brom-4chloro-3indolyl D- galactopynoside) chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzim β-galactosidase tạo ra galactose và X ( dẫn xuất indol) dẫn xuất này cho màu xanh đậm • Qua quan sát t thấy , plasmit không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh, còn plasmit thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng. - chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng IV-Mục đích của sự tách dòng • Thiết lập ngân hàng bộ gen. - 1- Ngân hàng gen (genomic library) -Là tập hợp các trình tự DNA tái tổ hợp cả các chuỗi đã mã hóa lẫn chưa mã hóa , bao trùm các hệ gen của sinh vật đang nghiên cứu. - 2-Ngân hàng cDNA ( cDNA library) -Là tập hợp các bản sao cua cDNA từ mDNA -Mang tính tế bào cao -Mục đích