Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối Nguyễn Quốc Tuấn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích.
- Phương Thiện Thương Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ nụ vối.
- Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học.
- Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
- Tìm ra được điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối.
- Xác định được flavonoid toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.
- Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC.
- Ứng dụng phương pháp xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.
- Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực.
- Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau.
- Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm đã có chuyên luận về lá và nụ vối.
- Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng.
- Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”.
- Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường.
- Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid.
- Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối.
- a) Cây vối b) Nụ vối tươi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.1.3 Thành phần hóa học Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen.
- Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol.
- Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học.
- 1.1.4 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong lá và nụ vối Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa.
- Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thƣ với các dòng TB ung thƣ khác nhau.
- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase.
- 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid 1.2.1 Phƣơng pháp định tính a) Phương pháp ống nghiệm Phản ứng với hơi amoniac Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3.
- Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H 2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1 gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm.
- Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.
- Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
- b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách .
- 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch chất ít tạp chất.
- b) Phƣơng pháp trắc quang Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng.
- Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định luật Lamber-Beer: A = K.C 3 Trong đó: A: Độ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phân tích Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng M và là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến.
- Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan… Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích.
- c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh.
- Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.
- Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.
- Đối tƣợng nghiên cứu Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc.
- Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối.
- Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.
- Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.
- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 2.3.2 Hóa chất, dung môi 4 - Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng.
- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck.
- Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck.
- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC.
- CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối 3.1.1.
- Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g).
- Dùng bình nón có thể tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml).
- Tất cả các bình hứng đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.
- Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g).
- a) Hình ảnh SKLM b) Hình ảnh chất CO-1 Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối 5 3.1.3.
- Xác định cấu trúc chất phân lập Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-1270C.
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml uL -002.dat Area 200 mAU Minutes Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1 Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'- dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu.
- Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC.
- Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối.
- 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối 3.2.2 Định tính bằng TLC 3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định tính.
- 6 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH (hàm lượng khoảng 1 mg/ml).
- b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v ) Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước v:v:v) Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm.
- Như vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối.
- 3.2.3 Định tính bằng HPLC * Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00ml.
- Lọc, đem đi xác định hàm lượng.
- Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00 ml.
- Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác 1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút.
- Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ của CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký.
- 7 9: 341 nm, 8 nm 9: 341 nm, 8 nm nm, 8 nm nuvoistd 80 nuvoihungyen lavoi nu voi_stdCO55(0.11mg-ml uL -002.dat nuvoihungyenm2(4mg.ml uL -001.dat lavoibacgiang(20mg.ml uL -003.dat Area Area Area m AU mAU 200 mAU Minutes Minutes Minutes Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) Sắc ký đồ của nụ vối (N) Sắc ký đồ của lá vối (L) Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu tR.
- 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang 3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên.
- Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang STT mmẫu(g Abs Số liệu thống kê SD = 0,83.10 .
- RSD = 4,45% Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 4,45.
- 3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là và 100 mg/l.
- Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.6).
- Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1 Nồng độ (mg/l A510 (Abs y = 0.0033x + 0.0026 R2 = 0.999 Độ hấp thụ quang Nồng độ CO-1 (mg/l) Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1 Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang.
- 2,571 phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y x Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là và 450 mg/l.
- Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
- Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin Nồng độ (mg/l Độ hấp thụ quang A510(Abs y = 0.0024x + 0.0022 Độ hấp thụ quang 1 R Nồng độ Catechin (mg/l) Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang.
- a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ: 9 Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa sẵn khoảng 4 ml nước cất + 0,3 ml NaNO2 5.
- 2 ml NaOH 1M sau đó định mức bằng nước cất hai lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bước sóng 510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng 3.7.
- Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng STT A Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình: AO = 0,0026 Giá trị độ lệch chuẩn: SD Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu: SY LOD = 3.
- 2,55 mg/l b 0, 0033 Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn: SY LOD = 3.
- 3,51 mg/l b 0, 0024 b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa.
- Đối với chất đối chiếu CO-1: Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1 Nồng độ CO-1 (mg/l A Giới hạn LOL 0.5 Độ hấp thụ quang Nồng độ CO-1 (m g/l) Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1 Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính.
- Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ mg/l.
- Đối với chất chuẩn catechin: Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin Nồng độ catechin (mg/l A Giới hạn LOL Độ hấp thụ quang Nồng độ catechin (m g/l) Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính.
- Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là khoảng từ mg/l.
- 3.3.1.5 Độ đúng của phƣơng pháp Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác 12 mg/l.
- Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở bảng 3.7 Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp STT A Hàm lƣợng Số liệu thống kê m = 12,78.
- Như vậy : tc > ttn : Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống.
- 3.3.1.6 Độ ổn định của phƣơng pháp Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất CO-1 có nồng độ 12 mg/l và của catechin có nồng độ 100 mg/l.
- Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9 Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1 STT A510 CO Catechin Ta có : Đối với chất CO-1: A .
- 5,0503 > Ftn = 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng.
- Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối Hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối được tính theo khối lượng chất chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g).
- Giá trị kết quả của hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại 3 lần và kết quả ở bảng 3.12 được biểu diễn : m ± SD Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần Hàm lƣợng Hàm lƣợng STT Tên mẫu mmẫu (g) flavonoid toàn phần flavonoid toàn phần (nơi thu hái) tính theo Catechin tính theo (mg/g) CO-1 (mg/g) Các mẫu lá 12 1 Bắc Giang Bắc Ninh Hà Đông (HN Hòa Bình Phú Thọ Quảng Ninh Thái Bình Các mẫu nụ 8 Chợ Đồng Xuân(HN Hưng Yên Nam Định Hải Dương Hà Đông (HN Hà Nam Thái Nguyên Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối trong khoảng mg/g.
- Trong nụ vối khoảng từ mg/g.
- Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá vối trong khoảng mg/g.
- Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ vối cao hơn so với hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá vối.
- 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid chính bằng HPLC 3.3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu đối chiếu có nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn.
- Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống được ghi ở bảng 3.11.
- Bảng 3.11.
- Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Lần Thời gian lƣu Diện tích pic Các thông số thống kê tiêm SD RSD = 0,95.
- Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng CO-1.
- 3.3.2.2 Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký như điều kiện đã mô tả.
- Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình 3.12.
- Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn và tính toán 5000000 DiÖn tÝch PÝc Ph-¬ng tr×nh: Y = A + B * X 4000000 Th«ng sè Gi¸ trÞ Sai sè 3000000