- 2005 CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn Bộ môn Hoá sinh - Trường Đại học Y Hà Nội Đã có một số nghiên cứu trên thế giới đánh giá về tác dụng quý có thể áp dụng trong sinh y học của lá dâu. - Cây dâu được trồng phổ biến ở nước ta để lấy lá nuôi tằm, nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào về chiết xuất, xác định lượng polyphenol, tác dụng chống oxy hoá của lá dâu. - Mục tiêu: (1) Chiết xuất và xác định hàm lượng polyphenol lá dâu. - (2) Đánh giá khả năng chống oxy hoá của các mẫu bột chiết lá dâu. - Đối tượng và phương pháp: Dùng 5 loại dung môi methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100% để chiết xuất tạo bột lá dâu. - Hàm lượng polyphenol trong các mẫu bột chiết được xác định bằng phương pháp đo quang đơn giản dùng ferrous sulphate. - Sử dụng acid linoleic đánh giá khả năng chống oxy hoá in vitro của các mẫu chiết xuất. - Kết quả: (1) Methanol 75% cho hiệu xuất chiết xuất bột lá dâu cao nhất (3,9. - trong đó lượng polyphenol chiếm 2,62%. - Xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu chiết xuất bằng phương pháp Ferrous sulphat cho kết quả chính xác hơn phương pháp dùng thuốc thử folin. - (2) Ở ngày thứ 7 và 12, acid linoleic với sự có mặt của các mẫu bột chiết lá dâu chỉ bị peroxy hoá từ 15% tới 42,2%, trong khi ở mẫu đối chứng bị peroxy hoá là 100%. - Kết luận: (1) Lá dâu có chứa polyphenol và Ferrous sulphat là phương pháp đơn giản, tin cậy để xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu chiết xuất. - (2) Bột chiết lá dâu từ 5 loại dung môi trên đều có khả năng chống oxy hoá và tốt nhất là bột chiết bằng methanol 75%. - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Cây dâu được trồng khá phổ biến ở nước ta để NGHIÊN CỨU lấy lá nuôi tằm, lấy tơ dệt vải. - Lá dâu và các bộ 1. - Chất liệu một số bệnh, làm mỹ phẩm bảo vệ và làm đẹp da Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâu (Morus alba [5,6]. - Lá dâu là loại thảo dược dễ tháng 11 năm 2004 tại xã Tam Giang, huyện Yên tìm, giá thành rẻ, không độc, rất phù hợp với đời Phong, tỉnh Bắc Ninh. - Hóa chất Gần đây các công trình nghiên cứu của một số - Ethylgallate, ferrous sulfate, postasium tác giả Nhật Bản, Trung Quốc cũng chứng minh lá sodium tartrate tetratrydrat, phosphate buffer dâu có nhiều tác dụng quí có thể áp dụng trong sodium, acid linoleic, polyphenol chè xanh, folin sinh y học như: làm hạ Glucose máu, chống oxy ciocalteau phenol. - Acid linoleic (Nhật bản). - Chiết xuất và xác định hàm lượng - Sunphenon 100S của công ty Taiyokagaku polyphenol từ lá dâu sử dụng một số dung (Nhật Bản) chứa 68,5% polyphenol môi khác nhau. - Đánh giá khả năng chống oxy hoá của các mẫu dịch chiết lá dâu. - Đánh giá khả năng chống oxy hóa - Quang kế photometer 4010 (Đức) của các mẫu chiết lá dâu - Quang phổ kế Optizen 2120 UV (Hàn Quốc) Khả năng chống oxy hoá của các mẫu chiết lá dâu được xác định qua việc bảo vệ acid linoleic 2. - Phương pháp nghiên cứu. - khỏi bị tác động oxy hoá [4] qua thực nghiệm sau. - Chiết xuất tạo dịch chiết cô đặc - Tạo các nhóm hỗn hợp ủ: quá trình peroxy Lá dâu sau khi thu hái được xử lý sơ bộ và hóa acid linoleic được thực hiện trong 7 ống được chiết xuất các thành phần có hoạt tính bằng nghiệm (kể cả ống chứng). - Mỗi ống chứa 0,8 ml 5 loại dung môi. - acid linoleic 2,5. - Mẫu 1: 50g bột lá dâu + 200ml n - Hexan 100%. - 0,8 ml nước cất và 1,8 ml mỗi mẫu dịch chiết Mẫu 2: 50g bột lá dâu + 200ml Ethyl axetat 100%. - Các ống nghiệm được nút kín, tránh Mẫu 3: 50g bột lá dâu + 200ml Aceton 100%. - Mẫu 4: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 100. - Thực hiện phản ứng xác định mức độ peroxy Mẫu 5: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 75%. - hoá của các mẫu ở các thời điểm: Trước khi tạo Chiết xuất 2 lần và dịch chiết của các mẫu hỗn hợp phản ứng, ngày thứ 7, ngày thứ 12 sau được cô đặc ở áp suất và nhiệt độ thấp. - Mức độ peroxy hoá 2.2. - Định lượng polyphenol dịch chiết acid linoleic được xác định bằng phản ứng màu với Polyphenol dịch chiết lá dâu được xác định hỗn hợp sau: dịch các ống nghiệm ở trên (0,05ml), bằng 2 phương pháp Ferrous sulphate và phương Ethanol 750 (4,85ml), NH4SCN 30% (0,05ml), FeCl2 pháp dùng thuốc thử Follin. - Nồng độ polyphenol sau đo mật độ quang học các mẫu thí nghiệm so trong các mẫu chiết xuất được tính toán theo nồng với ống trắng (Ethanol 750) ở bước sóng 500nm. - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. - Kết quả chiết xuất tạo dịch chiết cô đặc Từ 50g lá dâu khô chiết xuất bằng 5 loại dung môi khác nhau, kết quả như sau: Chiết bằng n - Hexan 100% Lượng bột thu được: 0,09g Chiết bằng Ethylacetate 100% 1,56g Chiết bằng Aceton 100% 0,72g Chiết bằng Methanol 100% 1,75g Chiết bằng Methanol 75% 1,94g Như vậy lượng bột chiết thô thu được khi chiết bằng Methanol 75% là lớn nhất. - Hàm lượng polyphenol trong lá dâu Qua mẫu polyphenol chuẩn, chúng tôi thấy phương pháp xác định hàm lượng polyphenol trong dịch chiết bằng thuốc thử ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn hẳn phương pháp folin ( kết quả định lượng bằng phương pháp folin không trình bày ở đây). - Vì vậy kết quả về hàm lượng polyphenol ở các mẫu dịch chiết ở bảng 1 là dựa theo phương pháp ferrous sulphate. - Hàm lượng polyphenol ở các mẫu chiết cô đặc thu được sau chiết xuất Lượng polyphenol Mẫu chiết xuất Hàm lượng (mg) Tỷ lệ % trong bột chiết Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Nhận xét: Trong 50g bột lá dâu khô lượng polyphenol chiết xuất được bằng dung môi methanol 75% (mẫu 5) là cao nhất và chiết xuất bằng n - hexan là thấp nhất (mẫu 1). - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết lá dâu bằng cách sử dụng acid linoleic Hoạt tính chống oxy hoá của 5 loại bột chiết lá dâu dựa theo ống chứng có so sánh với mẫu chè xanh có cùng hàm lượng polyphenol được trình bày ở bảng 2 và minh hoạ ở biểu đồ 1. - MĐQH và mức độ peroxy hoá acid linoleic (POL) của các mẫu thí nghiệm ở các thời gian Thời điểm Polyphenol Trước khi ủ Ngày 7 sau ủ Ngày 12 sau ủ (0,01%) MĐQH POL. - Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Chè xanh Chứng Nhận xét: Tất cả các mẫu bột chiết lá dâu có tác dụng hạn chế quá trình peroxy hóa lipid in vitro và tác dụng mạnh nhất là ở mẫu bột lá dâu 5 tương đương với mãu chè xanh. - Chúng tôi coi toàn bộ lượng acid linoleic có trong ống nghiệm ở thời điểm 12 ngày sau ủ đã bị oxy hoá hết và có MĐQH là 1,276. - Mức độ peroxy hoá acid linoleic của các mẫu thí nghiệm với sự có mặt của các loại bột chiết lá dâu 3 TCNCYH 38 (5. - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết bằng cách sử dụng acid 1. - Kết quả xác định hàm lượng linoleic polyphenol Trong thí nghiệm này chung tôi đánh giá tác Hàm lượng polyphenol trong các mẫu chiết dụng chống oxy hoá của các polyphenol trong các xuất được xác định bằng phương pháp Ferrous mẫu chiết (ở nồng độ 0,01%) thông qua lượng acid sulphate chính xác hơn dùng thuốc thử Follin. - Cả 2 linoleic bị peroxy hoá (POL) theo thời gian ủ ở 400C. - phương pháp đều dùng acid gallic là chất chuẩn để Lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 7 dựng biểu đồ chuẩn. - ngày sau ủ nhỏ hơn lượng acid linoleic bị peroxy Kết quả định lượng polyphenol bằng phương hóa ở thời điểm 12 ngày sau ủ. - Mức độ chênh lệch pháp Ferrous sulphate trên cơ sở phản ứng màu này ở các thí nghiệm là khác nhau: Mẫu chứng của polyphenol với ion Fe2+. - Mặc dù phương pháp (100. - Mẫu bột lá dâu 1 (11,6. - Mẫu bột lá dâu 2 (17. - Mẫu bột có) trong mẫu chiết xuất có thể phản ứng với ion lá dâu 3 (13,7. - Mẫu bột lá dâu 4 (11,5% Fe2+ và làm tăng MĐQH, ảnh hưởng đến kết quả - 18,3. - Mẫu bột lá dâu 5 (14,1. - Tuy nhiên đây là phương pháp đơn chè xanh (15,3. - giản cũng cho phép xác định sơ bộ hàm lượng Kết quả thực nghiệm cho thấy ở các nhóm thí polyphenol trong dịch chiết trên cơ sở mẫu chuẩn, nghiệm ủ với polyphenol thì lượng acid linoleic bị cho kết quả phân tích khá chính xác. - Lượng acid tham khảo mà chúng tôi có, trong lá dâu hầu như linoleic bị peroxy hóa tỷ lệ nghịch với tác dụng không chứa monophenol [1][4]. - chống oxy hóa của các polyphenol. - Polyphenol các Do vậy lượng polyphenol định lượng được mẫu chiết đều có tác dụng hạn chế quá trình trong dịch chiết bằng phương pháp sử dụng thuốc peroxy hóa acid linoleic nhưng ở mức độ khác thử Ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn, kết nhau: quả định lượng được như sau: Hàm lượng - Ngày 7 sau ủ: Polyphenol Mẫu 4 có tác dụng polyphenol dịch chiết lá dâu (từ 50g bột lá dâu chống peroxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol khô) cao nhất ở mẫu chiết bằng Methanol 75% Mẫu 3, tiếp theo là polyphenol Mẫu 5, polyphenol (50,8mg), tiếp đến là mẫu chiết bằng Methanol Mẫu 1, polyphenol Mẫu chè xanh và thấp nhất là 100% (17,5mg), sau đó là mẫu chiết bằng polyphenol Mẫu 2. - chống oxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol Mẫu chè xanh, tiếp theo là polyphenol Mẫu 4, Sự khác nhau về lượng dịch chiết thô thu được polyphenol Mẫu 1, polyphenol Mẫu 3 và thấp nhất cũng như hàm lượng polyphenol dịch chiết ở đây polyphenol Mẫu 3. - phụ thuộc hoàn toàn vào dung môi dùng để chiết xuất. - Vì các mẫu chiết xuất trên cùng một lượng Sự khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của 50g bột lá dâu khô (lá dâu cùng loại), qui trình và các polyphenol ở các mẫu chiết có thể do thành điều kiện chiết xuất giống nhau. - Tỷ lệ polyphenol phần và lượng polyphenol. - Hay nói cách khác, trong dịch chiết ở các mẫu đánh giá chất lượng dùng các dung môi chiết xuất khác nhau có thể dịch chiết thu được ở mỗi mẫu chiết bằng các thu được các polyphenol có phẩm chất khác nhau. - dung môi khác nhau. - Tỷ lệ này cao nhất ở mẫu Ta thấy polyphenol Mẫu 1 (chiết bằng Methanol chiết bằng Methanol 75% (2,62. - tiếp theo là 75%) có khả năng chống peroxy hóa tốt và tác mẫu chiết bằng Methanol 100% (1,01. - là mẫu chiết bằng Aceton 100% (0,44. - KẾT LUẬN chiết bằng Ethylacetate 100% (0,34. - thấp nhất ở mẫu chiết bằng n - Hexan 100% (0,04. - Lá dâu chiết bằng dung môi methanol 75% thu được lượng bột lớn nhất (3,9. - trong đó hàm lượng polyphenol cũng nhiều nhất (2,62. - Các mẫu chiết xuất lá dâu đều có khả năng mulberry (Morus alba L. - Agre Food Chen: chống oxy hóa, mẫu chiết bằng methanol 75% có . - khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp đến là mẫu 4. - aceton 100% và thấp nhất là mẫu chiết bằng dung 5. - Methods: Mulberry leaf extract powder were extracted from mulberry leaves by five solvens: methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100%. - Polyphenol concentration of the extracts are determined by ferrous sulphate and follin reagent assay. - Results: Among five solvens, the extract by methanol 75% from 50g dryed leaves is best. - Polyphenol concentraion of the extract powders are determined by two methods: ferrous sulphate and follin reagent. - Among them extraction of polyphenol by methanol 75% is best. - The extract powder by methanol 75% showed highest antioxidant capacitiy