BÀI 3: TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐINH HOẠT DỘ PEPSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Tách enzyme pepsin từ dạ dày heo Xác định hoạt độ enzyme thô NGUYÊN TẮC Enzyme pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật do sự tự phân trong môi trường acid loãng. Dung dịch sau khi tự phân chứa pepsin dạng hòa tan và các thành phần protein khác. Sự tinh sạch enzyme có thể được thực hiện sau khi đã thu nhận được chế phẩm enzyme thô nhờ vào các tác nhân gây tủa. Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.423.1) phân giải được Hemoglobin thành Tyrosine và Tryptophane hòa tan trong TCA. Xác định hàm lượng Tyrosine và Tryptophane nhờ vào thuốc thử Folin – Ciocalteu. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM Thu nhận enzyme từ dạ dày bò bằng muối Dạ dày heo mới giết mổ, xử lý thô sau đó được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thấp với sự có mặt chloroform 5%. Thời gian tối đa cho quá trình bảo quản là 48 giờ. Cân khối lượng niêm mạc m1 (g). Tự phân enzyme: Tách lớp niêm mạc thô từ dạ dày, xay nhỏ với máy xay sinh tố trong dung dịch HCl 0.5% (tỉ lệ 1:2 theo khối lượng). Sau đó cho vào chậu thuỷ tinh lớn, đậy kín, để yên ở nhiệt độ 40 – 42oC trong bể ổn nhiệt với thời gian 24 - 28 giờ. Tiến hành lọc dung dịch qua vải lọc (từ 2- 4 lần), loại bỏ tạp chất bằng cách lọc qua bông. Thu được dung dịch có enzyme thô được dùng tiến hành thử hoạt tính. + Thu chế phẩm pepsin thô: Tiến hành thu kết tủa pepsin bằng dung dịch muối NaCl 25% với tỷ lệ 1:4, cho từ từ dung dịch muối vào kết hợp với khuấy đảo liên tục để tránh sinh nhiệt trong hỗn hợp. Thời gian từ 5 – 10 phút, nhiệt độ khoảng 5oC. Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000v/phút trong 15 phút. Với tác nhân tủa là muối trung tính cần qua thẩm tích để giải phóng bớt lượng muối trong hỗn hợp. Sau đó tiến hành sấy khô bằng máy sấy không khí, nhiệt độ 30 – 40oC khoảng 1 –2 giờ. Cân khối lượng chế phẩm m2 (g).  Lập đường chuẩn Tyrosine Bảng 1: Lập đường chuẩn Tyrosine và kết quả đo OD Ống 0 1 2 3 4 5 Tyrosine chuẩn 1mM (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 HCl 0,2 N (ml) 5 4,8 4,6 4,4 4,2 4 NaOH 0,5 N (ml) 10 Folin pha loãng 3 lần (ml) 3 Lượng tyrosine (mol ) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc mạnh sau 5 – 10 phút OD660nm ? ? ? ? ? ? (1mol =103mmol = 106mol) Ống 0 là ống kiểm chứng (KC). Các ống khác là ống thí nghiệm (TN) Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm enzyme. Bảng 2: Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm enzyme và kết quả đo OD Chất dùng Ống 1 (mẫu thí nghiệm) Ống 2 (mẫu kiểm chứng) Hiện tượng Hb 2% ở 25oC (ml) 5 TCA 5% (ml) 0 10 Xuất hiện kết tủa nâu Enzyme pepsin (ml) 0,1 Nước (ml) 0,9 Thời gian Giữ 10 phút ở 35,5oC Không cần giữ 10 phút TCA 5% (ml) 10 0 Ống 1 xuất hiện kết tủa nâu với lượng lớn hơn ống 2 Sau 30 phút đem lọc lấy dung dịch Hút 5ml dung dịch lọc từ hai ống nghiệm chuyển sang ống nghiệm mới Thu được dịch trong hơi vàng Ống nghiệm 1 2 NaOH 0,5 N (ml) 10 Lắc mạnh Folin pha loãng 3 lần (ml) 3 Dung dịch bị đổi sang màu xanh. Màu của ống 1 đậm hơn màu của ống 2 Lắc đều, để yên sau 5-10phút OD ở = 660 nm ? ? Xác định hoạt độ đông tụ sữa Chuẩn bị 3 ống nghiệm: mẫu, PCN, PDD Hút mỗi ống 1 ml sữa Cho vào ống PCN và PDD tương ứng 0,1ml dịch chiết Enzyme Pepsin công nghiệp và Enzyme Pepsin dạ dày. Quan sát thời gian đông tụ GIẢI THÍCH THÍ NGHIỆM Tác dụng của các chất cho vào trong quá trình xác định hoạt tính pepsin: Khi cho TCA 5% vào ống nghiệm chứa Hb 2% ở 25oC thì TCA sẽ làm Hb kết tủa do đó trong ống 2 xuất hiện kết tủa nâu, ống 1 không có TCA nên không bị kết tủa. TCA kết tủa Hb trong ống 2 để khi cho enzyme vào thì enzyme sẽ không còn cơ chất để phân giải, khi đó trong ống 1 không có TCA thì khi cho enzyme vào thì enzyme sẽ phân giải Hb tạo ra những chất tan trong TCA. Sau khi cho Enzyme pepsin và nước vào hai ống như nhau để một lúc sau tiếp tục cho TCA vào ống 1 thì kết tủa nâu xuất hiện. TCA cho vào lúc sau có tác dụng tủa các Hb và enzyme còn dư. Dịch lọc từ hai ống được bổ sung NaOH và Folin để đo OD. Ta bổ sung môi trường NaOH 0.5N vì Folin chỉ xảy ra phản ứng màu với Tyrosine trong môi trường kiềm. KẾT QUẢ Thu nhận enzyme từ dạ dày bò bằng muối Hiệu suất chiết tách được tính bằng công thức Sau khi ly tâm không thu được tủa enzyme dạ dày Nguyên nhân: có thể do enzyme tách chiết đã để quá lâu nên bị phân hủy, sau khi ly tâm ta không thu được tủa của enzyme Ta chỉ có khối lượng của m1 nên không thể tính được hiệu suất thu nhận enzyme bằng muối. Lập đường chuẩn Tyrosine Hình 1: Mẫu Tyrosin đo OD Kết quả đo OD Ống 0 1 2 3 4 5 Tyrosine chuẩn 1mM (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 OD660nm 0 0,051 0,113 0,156 0,229 0,310  Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm enzyme. Hình 2: Sau khi bổ sung các dung dịch Hình 3: Bổ sung TCA 5% Hb 2%, TCA 5%, Pepsin, Nước vào ống 1 sau 10 phút Hình 4: Dịch lọc từ 2 ống nghiệm Hình 5: Dịch lọc sau khi đã thêm sau 30 phút NaOH 0,5N và Folin để đo OD Kết quả đo OD Chất dùng Ống 1 ODTN (mẫu thí nghiệm) Ống 2 ODKC (mẫu kiểm chứng) OD ở = 660 nm 0,045 0 Dựa vào phương trình đường chuẩn của tyrosin y = 0,3039x – 0,0088 Và kết quả ODTN (mẫu thí nghiệm) = 0,045 Ta có lượng tyrosin x = (0,045+0,0088)/0.3039 = 0,177 (µmol) a: Tỉ lệ thể tích mẫu thí nghiệm (16/5=3,2) v: Thể tích dung dịch đem xác định (0,1ml) t : Thời gian thuỷ phân 10 phút 1,82: hằng số giá trị cường độ màu ở 25OC. Xác định hoạt độ đông tụ sữa Ống mẫu Ống PCN Ống PDD Hình 6: sữa đông tụ sau khi cho enzyme pepsin vào Kết quả: sữa bị đông tụ sau thời gian t = 275 giây Xác định hoạt độ đông tụ sữa của pepsin dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ dung dịch sữa đã loại béo có nồng độ xác định. Công thức tính: F: hoạt độ đông tụ sữa E: lượng enzyme tham gia (mg) t: thời gian (phút hoặc giây). Thời gian động tụ sữa của enzyme công nghiệp: t=6s Hoạt độ đông tụ sữa: Thời gian đông tụ sữa của enzyme dạ dày :t = 9 phút 57s = 597s Hoạt độ đông tụ sữa: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Trả lời câu hỏi Giải thích tại sao phải chiết pepsin trong môi trường acid ? Pepsin hoạt động ổn định nhất trong môi trường axit giữa 37 - 42°C pH 1.5 – 2.0 Pepsin hoạt động tối đa ở pH 2.0 và không hoạt động ở pH 6.5 trở lên do đó để giữ nguyên hoạt tính của enzyme sau khi tách chiết thì phải thực hiện ở môi trường acid. Ngoài ra pepsin có trong dạ dày với pH acid nên cần giữ chúng trong môi trường acid để enzyme không bị biến tính. Pepsin được dạ dày tiết ra ở dạng tiền pepsin là pepsinogen trong môi trường acid pepsinogen mới được chuyển thành pepsin và mới có hoạt tính phân giải protein. Mô tả chế phẩm thu được. Chế phẩm tự nhiên có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, vô định hình và có mùi nước thịt, vị hơi chua. Người ta có thể thêm vào chế phẩm chất nền như tinh bột hay dextrin để bảo quản. Điều kiện giữ chế phẩm cần khô, kín (trong lọ màu) và ở nhiệt độ 5oC. Nhận xét: Không thu được khối lượng enzyme khi tử bằng muối nên không tính được hiệu suất thu hồi. Hoạt độ đông tụ sữa của pepsin dạ dày thấp hơn nhiều so với enzyme công nghiệp 7