ð I H C QU C GIA HÀ N I
VI N VI SINH V T VÀ CÔNG NGH SINH H C
========000========
BÁO CÁO K T QU TH C HI N
ð TÀI KHCN ð C BI T C P ð I H C QU C GIA
Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t
và kháng dòng t bào ung thư t x khu n
Mã s :
QG. 09. 48
Ch trì ñ tài:
TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
Cơ quan:
Vi n Vi sinh v t & Công ngh Sinh h c
Hà N i, năm 2011
M CL C
PH N I. BÁO CÁO TÓM T T
3
B ng ti ng Vi t
3
B ng ti ng Anh
PH N II. BÁO CÁO T NG K T
8
12
Gi i thích ch vi t t t
Danh sách nh ng ngư i tham gia th c hi n ñ tài
13
13
Danh m c các b ng và hình
14
M
ð U
15
CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U
16
1.1 Kháng sinh
16
1.1.1. Khái ni m chung
16
1.1.2. L ch s phát tri n kháng sinh
16
1.1.3. Phân lo i kháng sinh
18
1.1.4. Kháng sinh kháng kh i u
1.1.5. Nhu c u phát tri n kháng sinh m i
21
21
1.2 X# khu$n
1.2.1. Các ñ c ñi m chung
22
22
1.2.2. X khu n và các ch t th sinh
23
1.3 Tình hình nghiên c%u x# khu$n & Vi t Nam
1.4 N'i dung và m c ñích c a nghiên c%u
23
24
CHƯƠNG II - NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C(U
2.1. Nguyên v)t li u
2.1.1. ð i tư ng nghiên c u
2.1.2. Hóa ch t
25
25
25
25
2.1.3. Thi t b , d ng c s d ng trong nghiên c u
25
2.2. Phương pháp nghiên c%u
2.2.1. Phương pháp phân l p x khu n
25
25
2.2.2. Các vi sinh v t ki m ñ nh
2.2.3. Sàng l c x khu n sinh kháng sinh
2.2.4. Chi t b ng ethyl-acetate
26
27
28
2.2.5. S c ký các ch t chi t thu ñư c
28
2.2.6. Sàng l c ch ng x khu n sinh anthracycline
2.2.7. Phép th ñ c t bào
29
30
1
2.2.8. Các phương pháp phân lo i x khu n
30
CHƯƠNG III. K T QU VÀ TH O LU N
32
3.1. ða d#ng sinh h*c các ch ng x# khu$n thu th)p ñư+c &
Vư n Qu c gia Cát Bà
3.2. Sàng l*c x# khu$n sinh kháng sinh
32
33
3.3. Hi u qu tách chi t d,ch nuôi c-y các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
35
3.4. Phân tích s c ký d,ch nuôi các ch ng x# khu$n chi t trong ethyl acetate
3.4.1. S c ký b!n m"ng (TLC)
36
36
3.4.2. S c ký l"ng hi u năng cao (HPLC)
3.5. ð.c ñi/m nh)n d#ng c a các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
3.5.1. ð c ñi m hình thái c a các ch ng thu c Streptomyces
38
42
42
3.5.2. Gi!i trình t# rDNA 16S ñ i v i các ch ng x khu n thu c chi Nonomuraea 44
3.6. Sàng l*c kh năng sinh anthracyline c a các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
3.7. Các nghiên c%u liên quan ñ n các ch ng có ho#t tính ñ'c t bào
45
46
3.7.1. Ho t tính gây ñ c t bào
46
3.7.2. Phân tích HPLC d ch nuôi chi t trong ethyl acetate
c a các ch ng có ho t tính ñ c t bào
47
K T LU N VÀ KI N NGH1
53
TÀI LI U THAM KH O
55
PH L C
62
2
PH N I. BÁO CÁO TÓM T T
1. Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c%u m't s ho#t ch-t có kh năng kháng vi sinh
v)t và kháng dòng t bào ung thư t2 x# khu$n
2. Mã s :QG.09.48
3. Th i gian th c hi n: 2 năm (2009 - 2011)
4. C-p qu n lý:
ð i h c Qu c gia Hà n i
5. Ch trì ñ tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c - ðHQGHN
ði n tho i: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn
6. Cán b' tham gia:
- TS. Nguy n Quỳnh Uy n
-
TS. ðinh Thúy H ng
-
CN. Lê Phương Chung
-
ThS. Phan Th Hà
-
CN. Lê H$ng Anh
7. M c tiêu và n'i dung nghiên c%u
Nghiên c u này nh m tìm hi u s# ña d ng sinh h c và sàng l c các ch ng x
khu n có ho t tính kháng vi sinh v t trong b sưu t p các ch ng x khu n thu th p t% ñ!o
Cát Bà, m t vư&n qu c gia có ña d ng sinh h c cao ' Vi t Nam. Các ch t kháng sinh do
các ch ng l#a ch n sinh ra ñư c ti p t c nghiên c u nh m tìm ki m b!n ch t c a chúng.
C th là:
- Phân l p x khu n t% m(u ñ t và lá m c ' ñ!o Cát Bà, H!i Phòng qua ñó ñánh
giá m c ñ ña d ng c a ñ i tư ng
- Sàng l c các ch ng có ho t tính kháng sinh cao
- Tách chi t sơ b thu các ch t có ho t tính kháng sinh t% các ch ng ch n l c ñư c
- Nghiên c u tính ch t c a các ch t kháng sinh thu ñư c b ng s c ký b!n m"ng
(TLC) và s c ký l"ng hi u năng cao (HPLC).
- Phân lo i, ñ nh danh các ch ng x khu n (b ng mô t! hình thái ho c b ng gi!i
trình t# gene 16S c a rDNA) có ho t tính kháng sinh cao.
3
- Th nghi m ho t tính kháng các dòng t bào ung thư ngư&i c a ch t chi t t% d ch
nuôi c a m t s ch ng có ti)m năng
- Phân tích HPLC ch t chi t t% d ch nuôi c a các ch ng có ho t tính kháng t bào
ung thư làm cơ s' cho nghiên c u b!n ch t c a các h p ch t ñó.
8. Các k t qu ñ#t ñư+c
8.1. K t qu v m.t khoa h*c
- 424 ch ng x khu n (g$m 353 ch ng t% m(u ñ t và 71 ch ng t% m(u lá cây m c) thu
th p t i vư&n Qu c gia ñã ñư c phân lo i (b ng quan sát hình thái k t h p v i ñ c
trình t# gene rDNA 16S) cho th y g n 70% thu c chi Streptomyces, còn l i thu c
nhóm x khu n hi m. Các chi x khu n hi m có t* l cao trong b sưu t p này là
Micromonospora (hơn 7% trong t+ng s 424 ch ng), Nonomuraea (4%) và Nocardia
(g n 3%).
- 424 ch ng x khu n này ñã ñư c sàng l c ho t tính kháng sinh v i 4 vi sinh v t ki m
ñ nh ñ i di n cho 3 nhóm vi sinh v t l n là vi khu n (Gram âm: Escherichia coli,
Gram dương: Micrococcus luteus), n m men (Candida albicans) và n m s i
(Fusarium oxysporium).
- 115 ch ng trong s 424 ch ng nói trên ñã bi u hi n ho t tính kháng ít nh t m t trong
b n vi sinh v t ki m ñ nh.
- V i 115 ch ng có ho t tính này có 2 ch ng (A1073, A1393) kháng c! 4 ch ng vi sinh
v t ki m ñ nh, 7 ch ng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng v i 3 ch ng ki m ñ nh, 8 ch ng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có ho t tính kháng 2 vi sinh v t ki m ñ nh. Xét v) ñ i tư ng b kháng thì 14
ch ng có ho t tính kìm hãm vi khu n Gram âm (E. coli), 14 ch ng kìm hãm vi khu n
Gram dương (M. luteus); 11 ch ng có ho t tính kháng c! hai nhóm vi khu n; 12 ch ng
có ho t tính kháng n m s i (F. oxysporium) và ch, 6 ch ng có ho t tính kháng n m
men (C. albicans). Như v y t+ng c ng có 17 ch ng có ho t tính kháng ít nh t 2 vi sinh
v t ki m ñ nh ñã ñư c l#a ch n cho các nghiên c u ti p theo. ði)u thú v là 17 ch ng
này ch, thu c 2 chi Streptomyces (10 ch ng) và Nonomuraea (7 ch ng).
- 17 ch ng ñã ñư c nuôi c y thu d ch nuôi và d ch nuôi ñã ñư c chi t b ng ethyl acetate
ñ thu các h p ch t có ho t tính sinh h c. Hi u qu! chi t ch t tan trong ethyl acetate
(t% 1 lít d ch nuôi c y) dao ñ ng t% 30mg (ch ng A154) ñ n 2152mg (ch ng A444).
4
So v i ch t khô thì ch t chi t ñư c chi m t% 0,51% (ch ng A154) ñ n 14,89% (ch ng
A396).
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 17 ch ng x khu n ñã ñư c phân tích
s c ký b!n m"ng (TLC) ñ so sánh v i ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và v i d ch nuôi c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline (A16). S băng
thu ñư c sau s c ký dao ñ ng t% 1 ñ n 4 băng. Có 8 ch ng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) ch, cho 1 băng, 3 ch ng (A396, A444, A1018) cho ph+
có 2 băng, 4 ch ng (A45, A1041, A1043, A1470) cho ph+ 3 băng và 2 ch ng (A390,
A1022) cho ph+ 4 băng. So v i các kháng sinh chu n thì th y ch t chi t t% d ch nuôi
c a ch ng A396 là có băng tương ng v i chloramphenicol; ch t chi t t% d ch nuôi
ch ng A45 và A410 có băng trùng v i băng c a erythromycin, không có m(u nào có
băng tương ñ$ng v i các băng c a kháng sinh kitasamycin. So v i d ch nuôi c a
ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline, các m(u A1018 và A1022 có ph+ s c ký r t g n
v i ñ i ch ng này.
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a 17 ch ng l#a ch n ñư c ñư c ti p t c phân tích
qua s c ký l"ng hi u năng cao (HPLC) v i các ñi)u ki n s c ký như v i các kháng
sinh chu n. K t qu! cho th y ngoài ch ng A396 có ñ,nh tương t# v i ñ,nh thu ñư c t%
chloramphenicol, t t c! các m(u còn l i không tìm th y m i tương quan nào so v i các
kháng sinh ñ i ch ng.
- M t trong nh-ng nghiên c u n-a ñư c th#c hi n v i 17 ch ng ch n l c ñư c là th#c
hi n th nghi m bi n ñ+i màu ph thu c pH. ðây là phép th ñ c hi u ñ i v i các
ch ng sinh kháng sinh thu c nhóm anthracycline. Qua ñó nh n th y có hai ch ng có
bi u hi n dương tính v i phép th này là A1018 và A1073.
- Như v y v i các bư c nghiên c u liên quan, t% 17 ch ng có ho t tính kháng sinh
tương ñ i cao, 3 ch ng ñư c l#a ch n th nghi m ho t tính gây ñ c t bào ung thư
ngư&i là A1018 (có ph+ TLC và ph!n ng ñ+i màu pH tương t# ch ng ñ i ch ng),
A1022 (có ph+ TLC tương t# ñ i ch ng) và A1073 (ph!n ng ñ+i màu pH).
- B ng th nghi m v i ba dòng t bào ung thư ngư&i là ung thư gan, ph+i và cơ vân tim,
các h p ch t chi t t% d ch nuôi c a c! ba ch ng ch n l c ñư c c a ñ) tài ñ)u có tác
d ng dương tính v i c! ba dòng t bào ung thư. So sánh v) ch, s IC50 (n$ng ñ gây
ch t 50% t bào ung thư, t c ch, s này càng nh" thì hi u qu! gây ñ c t bào càng l n)
thì th y trong ba m(u nghiên c u ch t chi t t% d ch chi t c a ch ng A1073 có ch, s
này th p nh t và th p g n b ng ñ i ch ng dương (m t trong nh-ng ch t có kh! năng
5
di t t bào) c a phép th ; th p b ng so v i ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline và th p
hơn ñáng k so v i hai ch ng còn l i. ðây là m t trong nh-ng k t qu! n+i b t nh t c a
ñ) tài, làm ti)n ñ) cho các hư ng nghiên c u ti p theo.
- Ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 3 ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư
nói trên ñã ñư c phân tích HPLC v i cùng m t ñi)u ki n s c ký v i các ñ i tư ng
tương t# hi n ñang ñư c th#c hi n t i Phòng thí nghi m Vi sinh v t h c phân t ,
Trung tâm công ngh sinh h c qu c t , ð i h c T+ng h p Osaka. Qua phân tích k t
qu! sau s c ký các ch t chi t ñư c t% d ch nuôi ch ng A1018 cho 8 ñ,nh khác nhau, t%
ch ng A1022 cho 5 ñ,nh khác nhau và ch ng A1073 cho 6 ñ,nh khác nhau. Các dli u liên quan hi n ñang ñư c so sánh phân tích v i cơ s' d- li u hi n có t i cơ s' nói
trên nh m tìm ki m b!n ch t c a các ch t ñó. ðây là m t k t qu! th hi n s# h p tác
qu c t c a ñ) tài.
8.2. K t qu ñào t#o
ð) tài ñã góp ph n ñào t o 01 Th c s. chuyên ngành công ngh sinh h c thu c
chương trình ñào t o liên k t qu c t v i ð i h c Liege, Vương qu c B, v i tên ñ) tài là:
“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam”. H c viên Nguy n Phương Chung ñã b!o v thành công lu n văn v i k t qu!
xu t s c trư c H i ñ$ng ngày 24 tháng 2 năm 2011.
8.3. Bài báo
K t qu! c a ñ) tài ñã ñư c ñúc k t thành 02 bài báo:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. T p chí Công ngh sinh h c (ñã nh n ñăng).
•
Bư c ñ u nghiên c u sàng l c kháng sinh ch ng ung thư t% x khu n thu th p '
vư&n Qu c gia Cát Bà, T p chí Khoa h c và Công ngh , ð i h c Qu c gia Hà N i
(ñã nh n ñăng).
9. Tình hình s3 d ng kinh phí
- T+ng kinh phí c a ñ) tài ñư c duy t:
- T+ng kinh phí c a ñ) tài ñã quy t toán:
100.000.000 VNð
100.011.400 VNð, bao g$m các m c:
+ Chi phí thuê mư n:
40.000.000
+ Chi phí nghi p v chuyên môn:
49.084.000
+ Photo tài li u, văn phòng ph m:
4.235.000
6
+ H i h p:
1.500.000
+ Thông tin liên l c:
442.000
+ Chi khác (l phí c a ñơn v DT):
4.750.000
Ch trì ñ tài
Xác nh)n c a cơ quan
Xác nh)n c a ð#i h*c Qu c gia
7
SUMMARY
Investigation and study some substances which have antibiotic
1. Project title:
activities against microorganisms and cancer cell lines from
actinomycetes
2. Code:
QG.09.48
3. Duration:
4. Organizer:
2009 – 2011
Institute of Microbiology and Biotechnology,
Vietnam National University, Hanoi (VNUH)
5. Project leader:
6. Key participants:
Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen
Dr. Nguy n Quỳnh Uy n
Dr. ðinh Thúy H ng
BSc. Lê Phương Chung
MSc. Phan Th Hà
BSc. Lê H$ng Anh
7. Objectives and study contents
Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from
actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam,
named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied
further in order to find out their nature.
Study contents:
• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai
Phong) and then evaluating their biodiversity
• Screening the strains possessing high antibiotic activities
• Primary extracting the antibiotics from these strains
• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography
(TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)
• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use
their morphology and the sequences of 16S rDNA gene
• Testing cytotoxic activity of some potential strains
• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer
agents to obtain data base in order to study their nature.
8. The obtained results
8
• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter
samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result
through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the
genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest.
Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea
appeared about 4% and Nocardia was 3% in total.
• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested
microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli;
Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi
(Fusarium oxysporium).
• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at
least one of the 4 testes microrganisms.
• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all
of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041,
A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410,
A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested
microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium
(E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M.
luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown
activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity
against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity
against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study.
Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains)
and Nonomuraea (7 strains).
• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were
extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of
extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was
variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with
their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)
to 14,89% (strains A396).
• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete
strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile
with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,
9
erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing
anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1
to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were
shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45,
A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In
comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the
cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol;
substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were
shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar
to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control
strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the
chromatography profile very close with this of the control.
• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by
high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that
of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar
to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection
with the control antibiotics.
• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the
enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group
anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this
test.
• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour
based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is
similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with
relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human
cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant
cytotoxic
activity
against
hepatocellular
carcinoma,
lung
cancer,
and
rhabdosarcoma human cell lines.
• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human
cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains
exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50
value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which
means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance
10
extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very
close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of
the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with
the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and
this provides the base to develop further research.
• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were
analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at
Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka
University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains
A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks
and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available
at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of
international collaboration of the project.
9.1.
Education results
The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology,
belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The
dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from
Catba island, Vietnam”. The master students Nguy n Phương Chung did defend
successfully on Feb 24th, 2011.
9.2.
Publication:
All of the results above resulted in 02 publications:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted).
• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà
National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam
National Unversity, Hanoi (accepted).
Ch trì ñ tài
Xác nh)n c a cơ quan
Xác nh)n c a ð#i h*c Qu c gia
11
PH N II. BÁO CÁO T NG K T
12
GI I THÍCH CH4 VI T T T
DMSO:
Dimethyl Sulfoxide
DNA:
Deoxyribonucleic acid
EDTA:
Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA:
Enzyme-linked immunosorbent assay
HPLC:
High-performance liquid chromatography
rDNA 16 S:
gene 16S c a DNA ribosome
TE:
ñ m có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0
TLC:
Thin layer Chromatography
DANH SÁCH NH4NG NGƯ5I THAM GIA TH C HI N ð TÀI
1. Ch trì: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
2. Nh ng ngư i th c hi n:
-
TS. Nguy n Quỳnh Uy n
-
TS. ðinh Thúy H ng
-
CN. Lê Phương Chung
-
ThS. Phan Th Hà
-
CN. Lê H$ng Anh
13
DANH M C CÁC B NG VÀ HÌNH
Danh m c b ng
B!ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c u trúc hóa h c
B!ng 2.1 ði)u ki n phân tích HPLC c a các ch t chu n
B!ng 3.1 Sơ b phân lo i các ch ng x khu n phân l p ñư c
B!ng 3.2. Ho t tính kháng vi sinh v t c a 17 ch ng x khu n ch n l c ñư c
B!ng 3.3. Hi u qu! tách chi t d ch nuôi các ch ng x khu n ch n l c ñư c
B!ng 3.4. T+ng k t k t qu! phân tích HPLC ch t chi t t% các ch ng x khu n ch n l c
ñư c
B!ng 3.5. Các ñ c ñi m nh n d ng c a 10 ch ng thu c chi Streptomyces
B!ng 3.6. K t qu! xác ñ nh ho t tính gây ñ c t bào
B!ng 3.7. T+ng k t k t qu! phân tích HPLC ch t chi t t% 3 ch ng có ho t tính gây ñ c
t bào ung thư
Danh m c hình
Hình 1.1 Kháng sinh ñư c phát hi n qua các năm
Hình 1.2 S# ti n hóa c a penicillin G
Hình 1.3. C u trúc hóa h c c a daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)
Hình 3.1. ðánh giá ho t tính kháng vi sinh v t c a các ch ng x khu n
Hình 3.2. Ph+ TLC ch t chi t t% d ch ngo i bào c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c
Hình 3.3. Ph+ HPLC c a chloramphenicol (A) và ch t chi t t% ch ng A396 (B)
Hình 3.4. Hình thái khu n l c m t s ch ng Streptomyces
Hình 3.5. H s i mang bào t c a m t s ch ng Streptomyces
Hình 3.6. Cây ch ng lo i phát sinh trình t# rDNA 16S cho th y v trí c a 7 ch ng x
khu n hi m trong chi Nonomuraea
Hình 3.7. S# thay ñ+i màu s c theo pH môi trư&ng c a các ch ng A1018 và A1073
Hình 3.8. S c ký ñ$ HPLC ch t chi t t% d ch nuôi ch ng A1018
Hình 3.9. S c ký ñ$ HPLC ch t chi t t% d ch nuôi ch ng A1022
Hình 3.10. S c ký ñ$ HPLC ch t chi t t% d ch nuôi ch ng A1073
14
M
ð U
S c kh"e luôn là m t trong nh-ng v n ñ) ñư c chú tr ng nh t trong m/i qu c gia.
M c dù các thành t#u có ñư c trong ngành hoá dư c ñã ñem l i s# phong phú v) ch ng
lo i dư c ph m, nhưng vi c tìm ki m và s d ng tr#c ti p các s!n ph m t# nhiên có ho t
tính sinh h c trong vi c ch-a tr các b nh nan y v(n luôn là hư ng ñư c quan tâm hi n
nay. Trong m t t+ng k t v) các lo i dư c ph m hi n ñang lưu hành trên th gi i, Newman
và c ng s# (2003) ñã cho bi t t% năm 1981 ñ n năm 2002 trong t+ng s 868 lo i thu c
ñư c phép ñưa vào s d ng thì có ñ n 58% là có ngu$n g c t# nhiên. ð c bi t con s này
là 62% ñ i v i thu c dùng trong ñi)u tr b nh ung thư.
V i ngu$n vi sinh v t vô cùng phong phú và ña d ng, Vi t nam có cơ s' ñ phát
tri n ngành công ngh sinh h c theo hư ng ng d ng y-dư c này. ðây cũng là m t bài
toán ñ t ra cho ngành dư c nư c nhà trư c tình hình thu c nh p ngo i chi m v trí áp ñ!o
trên th trư&ng và trong các b nh vi n l n. ð cung c p ngu$n nguyên li u h/ tr cho
ngành dư c, các nghiên c u v) ñ c tính sinh h c t% vi sinh v t có tác d ng ch-a tr b nh
c n ph!i ñư c chú tr ng, nh m t o ti)n ñ) cho vi c phát tri n dư c ph m m i v i tính
năng ñi)u tr cao và ít tác d ng ph không mong mu n. S# suy thoái môi trư&ng s ng '
Vi t nam hi n nay là nguyên nhân d(n ñ n ña d ng hoá các tác nhân gây b nh. Các b nh
viêm nhi m và b nh ung thư hi n ñang là ñ i tư ng c n thi t ñ các nhà nghiên c u ñ t
m c tiêu tìm ki m các ch t có công d ng c ch t% ngu$n vi sinh v t n i ñ a.
Thay ñ+i khí h u, ô nhi m môi trư&ng s ng là nh-ng y u t gây tác ñ ng tr#c ti p
ñ n s c kh"e c a con ngư&i. Theo d# báo toàn c u, t i m t s vùng trên th gi i, trong ñó
có Vi t nam, t* l ngư&i m c b nh viêm nhi m thông thư&ng hay các b nh nguy hi m
như ung thư, tim m ch... ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998).
Do v y, vi c nghiên c u ñ tìm ki m các ch t có ho t tính ch-a tr b nh t% các ngu$n g c
t# nhiên là m t trong nh-ng hư ng nghiên c u tr ng tâm c a ngành công ngh sinh h c
t i nhi)u qu c gia, ñ c bi t ' các nư c phát tri n. ð n m b t ñư c nh-ng k. thu t tiên
ti n trong lĩnh v#c này và t%ng bư c hoà nh p v i s# phát tri n chung, ñ$ng th&i ñ ñáp
ng nhu c u trong vi c b!o v s c kho2 c ng ñ$ng, Vi t nam c n chú tr ng khai thác
ngu$n ña d ng vi sinh v t c a mình làm nguyên li u ñ phát tri n dư c ph m. Vì l3 ñó
chúng tôi ñã ñ) xu t và ñã ñư c ð i h c qu c gia Hà N i phê duy t th#c hi n ñ) tài:
“ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t và kháng dòng
t bào ung thư t x khu n”
15
CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U
1. 1 Kháng sinh
1.1.1. Khái ni m chung
Theo ñ nh nghĩa truy)n th ng thì kháng sinh (còn ñư c g i là tr sinh) là nh-ng
ch t có kh! năng tiêu di t vi khu n hay kìm hãm s# phát tri n c a vi khu n m t cách ñ c
hi u. Nó có tác d ng lên vi khu n ' c p ñ phân t , thư&ng là m t v trí quan tr ng c a vi
khu n hay m t ph!n ng trong quá trình phát tri n c a vi khu n. Theo ñ nh nghĩa hi n
nay, kháng sinh ñư c hi u là các h p ch t hóa h c do vi sinh v t sinh ra và ' n$ng ñ
th p chúng có th kìm hãm s# sinh trư'ng ho c tiêu di t (các) vi sinh v t khác (Nduka,
2007).
Hi n nay các ch t có ho t tính sinh h c có kh! năng di t khu n g$m các ch t
kháng sinh truy)n th ng, các s!n ph m trao ñ+i ch t như các acid lactic do các vi khu n
lactic sinh ra, các ch t phân gi!i như lysozyme, các lo i ngo i ñ c t có b!n ch t protein,
các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh h c” này ñư c quan tâm ñ c bi t do tính ña d ng và
c! do chúng có nhi)u trong t# nhiên (Margaret & Milind, 2007).
Th#c, ñ ng v t b c cao cũng có kh! năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các h p ch t
này n m ngoài ñ nh nghĩa nói trên. Tương t# như v y, m c dù cũng do vi sinh v t sinh ra
nhưng bacteriocin cũng không ñư c coi là kháng sinh không ch, vì chúng có kh i lư ng
phân t không l n như các ch t kháng sinh thông thư&ng khác mà còn do chúng ch y u
!nh hư'ng ñ n các vi sinh v t g n v i vi sinh v t s!n sinh ra bacteriocin. So v i
bacteriocin, các ch t kháng sinh ña d ng v) b!n ch t hóa h c và t n công các vi sinh v t
không có quan h h hàng. ði m khác bi t quan tr ng n-a là trong khi thông tin di truy)n
c a các ch t kháng sinh thư&ng n m trên m t vài gen thì bacteriocin ch, c n gen ñơn.
(Nduka, 2007). ð n nay ñã có kho!ng 16.500 kháng sinh ñư c phát hi n t% vi sinh v t, và
hàng năm hàng ch c kháng sinh m i ñư c phát hi n (Hopwood, 2007).
1.1.2 L,ch s3 phát tri/n kháng sinh
Kháng sinh là thu c ñư c con ngư&i dùng ch y u ñ ch ng các b nh truy)n
nhi m. Các b nh truy)n nhi m chi m ph n r t l n trong các b nh c a con ngư&i và ñ ng
v t. Cho ñ n n a sau c a th k* 19 ngư&i ta ñã phát hi n ra r ng vi sinh v t chính là th
ph m gây ra hàng lo t các b nh truy)n nhi m. Do ñó li u pháp hóa h c nh m vào các vi
sinh v t gây b nh ñã ñư c phát tri n thành li u pháp ñi)u tr chính.
16
Vào năm 1928, Fleming phát hi n ra penicillin và kháng sinh này ñã ñư c dùng
trong ñi)u tr vào nh-ng năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã tr' thành m t kháng sinh
n+i ti)ng vì ñã c u s ng nhi)u chi n binh trong chi n tranh th gi i II (Saga &
Yamaguchi, 2008).
T% nh-ng năm 1940 ñ n cu i nh-ng năm 1960, nhi)u kháng sinh m i ñư c xác
ñ nh h u h t t% x khu n, và ñó tr' thành th&i kỳ vàng son c a hóa li u pháp kháng sinh
(Hình 1.1).
Hình 1.1 Kháng sinh ñư+c phát hi n qua các năm (Hopwood, 2007).
Năm 1944, streptomycin ñư c phát hi n t% vi khu n ñ t Streptomyces griseus. Sau
ñó ñ n chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thu c nhóm macrolide và
glycopeptide (t c vancomycin) ñư c phát hi n t% vi khu n ñ t. Các kháng sinh t+ng h p
như nalidixic acid, thu c ch ng vi sinh v t có b!n ch t quinolone ñã ñư c t o ra vào năm
1962. Vi c c!i ti n trong t%ng l p kháng sinh ti p t c thu ñư c ph+ kháng vi sinh v t r ng
hơn, ho t tính kháng vi sinh v t cao hơn ví d như các kháng sinh β-lactam. L p β-lactam
g$m penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñ u có tác d ng hi u
qu! lên vi khu n Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các
enzyme phân gi!i penicillin- penicillinase, nên ngư&i ta phát tri n methicillin. Bên c nh
ñó, ñ m' r ng ph+ tác d ng c a ampicillin (là kháng sinh ch ng vi khu n Gram âm
Enterobacteriaceae) ngư&i ta ñã phát tri n ñư c piperacillin có th kháng ñư c c!
Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2).
17
Hình 1.2 S ti n hóa c a penicillin G (Saga et al, 2008)
Vi c phát hi n, phát tri n và s d ng các kháng sinh trong ñi)u tr ' th k* 20 ñã
làm gi!m ñáng k t* l ch t do nhi m khu n. Tuy nhiên t% 1980 s kháng sinh m i ñư c
ñưa vào ñi)u tr gi!m h5n do chi phí cho vi c phát tri n và th nghi m thu c m i ngày
càng l n. Bên c nh ñó, m t hi n tr ng ñáng báo ñ ng là ngày càng tăng các vi sinh v t
gây b nh kháng v i các kháng sinh hi n có. Hi n nay, vi c kháng c a vi khu n ph!i ñư c
kh c ph c b ng vi c phát hi n ra các thu c m i. Tuy nhiên vi sinh v t càng ngày càng
nhanh kháng thu c và t c ñ ñó l i nhanh hơn t c ñ t o ñư c thu c m i c a con ngư&i.
Do v y, các nghiên c u c n ph!i t p trung vào làm th nào ñ vư t qua tính kháng thu c
kháng sinh cũng như phát hi n các kháng sinh m i có các cơ ch ho t ñ ng khác nhau
(Fred, 2006).
1.1.3 Phân lo#i kháng sinh
Có m t s phương pháp phân lo i kháng sinh. M t trong nh-ng phương pháp ñó là
d#a vào ki u ho t ñ ng t c là kháng sinh ñó tác ñ ng lên vách t bào, kìm hãm protein…
Tuy nhiên có khi m t kháng sinh l i có nhi)u cơ ch ñ$ng th&i cùng tác ñ ng nên cách
phân lo i này khó áp d ng. M t s trư&ng h p kháng sinh ñư c phân lo i d#a trên vi sinh
v t s!n sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trư&ng h p m t vi sinh v t có th sinh ra
m t s kháng sinh như Streptomyces sp. có th sinh penicillin N và cephalosporin. Ngư c
l i m t kháng sinh cũng có th do nhi)u vi sinh v t sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñư c
phân lo i d#a theo con ñư&ng sinh t+ng h p. Ph+ tác ñ ng cũng ñư c dung, ví d như tác
18
ñ ng lên vi khu n, n m, nguyên sinh ñ ng v t… Tuy nhiên m t lo i/nhóm kháng sinh
như aminoglycoside l i có th có ph+ tác d ng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,
2010).
Cách phân lo i nêu dư i ñây là d#a trên c u trúc hóa h c c a kháng sinh và theo
ñó kháng sinh ñư c phân thành 13 nhóm (B!ng 1.1) (Nduka, 2007).
B ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c-u trúc hóa h*c
Nhóm hóa h c
Ví d
Aminoglycoside
Streptomycin
Ansamacrolide
Rifamycin
Beta-lactam
Penicillin
Chloramphenicol và các ch t tương
t#
Chloramphenicol
Linocosaminide
Linocomycin
Macrolide
Erythromycin
Nucleoside
Puromycin
Puromycin
Curamycin
Peptide
Neomycin
Phenazine
Myxin
Polyene
Amphothericin B
Polyether
Nigericin
Tetracycline
Tetracycline
Như ñã ñ) c p ' trên có nhi)u cách phân lo i kháng sinh và không có cách nào
th"a mãn toàn b các yêu c u v) phân lo i. Do v y, cách phân lo i d#a trên c u trúc hóa
h c nêu ' ñây cũng ch, mang tính ch t tương ñ i và các ví d nêu ra là ñ d dàng nh n
bi t nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là m t s nhóm kháng sinh thông d ng:
a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñư&ng amino ñư c liên k t b ng
liên k t glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví d ñi n hình c a nhóm này.
Streptomycin v(n còn là thu c thay th trong ñi)u tr b nh lao, nhưng do s# phát tri n tính
kháng thu c nhanh chóng và các !nh hư'ng ñ c h i nghiêm tr ng ñã làm h n ch vi c s
d ng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm t+ng h p protein ' nhi)u vi khu n
Gram âm và m t s vi kh n Gram dương. ðôi khi chúng ñư c dùng k t h p v i penicillin.
19
Thành viên c a nhóm này thư&ng có xu hư ng ñ c hơn các nhóm kháng sinh khác
(Tortora et al, 2010).
b. Beta-lactam là các kháng sinh ñã ñư c s d ng r t nhi)u và r t quan tr ng trong ñi)u
tr như penicillin, cephalosphorin cũng như các lo i tương ñ i m i như cephamycin,
nocardicin, thienamycin và clavulanic acid (Nduka, 2007).
Penicillin là ch t di t khu n, kìm hãm s# t o thành vách t bào. Có 4 lo i penicillin:
penicillin-G ph+ h6p, ampicillin và các ch t tương t#, các penicillin kháng penicillinase
và các penicillin ph+ r ng có th kháng các vi khu n thu c nhóm Pseudomonas. Các
penicillin-G kháng hi u qu! các ch ng Gram dương như Streptococcus, Staphylococcus,
và m t s vi khu n Gram âm như Meningococcus. Penicillin-G ñư c dùng ñ ñi)u tr các
b nh như giang mai, l u, viêm màng não, lao và b nh gh2 cóc (yaws). Penicillin V có
ho t ñ ng tương t# nhưng hi u l#c th p hơn. Ampicillin và amoxicillin có tác d ng tương
t# penicillin-G nhưng có ph+ tác d ng r ng hơn bao g$m c! m t s vi khu n Gram âm
(Tortora et al, 2010).
c. Chloramphenicol kìm hãm s# sinh trư'ng c a nhi)u vi khu n Gram dương và âm,
ñây là kháng sinh ph+ r ng ñ u tiên ñư c s d ng trong ñi)u tr . Chloramphenicol ñư c
s!n xu t t% nuôi c y vi khu n ñ t Streptomyces venezuelae. Chloramphenicol kìm hãm
sinh t+ng h p protein c a vi khu n b ng cách gây nhi u ho t tính xúc tác c a peptidyltransferase c a ribosome trong pha kéo dài c a phiên mã. Do phân t lư ng th p, kháng
sinh này có th thâm nh p vào nhi)u vùng c a cơ th mà các lo i thu c khác không th
thâm nh p ñư c. Tuy nhiên, chloramphenicol có các !nh hư'ng b t l i, trong ñó quan
tr ng nh t là kìm hãm ho t ñ ng c a t y xương do ñó !nh hư'ng ñ n s# t o thành t bào
máu (Creighton, 1999; Nduka, 2007).
d. Macrolide là nhóm các kháng sinh ñư c ñ t tên do có m t vòng macrocyclic lactone
trong phân t . Macrolide ñư c dùng nhi)u nh t trong ñi)u tr là erythromycin. Ki u ho t
ñ ng c a nó là kìm hãm t+ng h p protein. Erythromycin có tác d ng hi u qu! lên các c u
khu n Gram dương và thư&ng ñư c dùng ñ thay th penicillin trong các b nh nhi m
Streptococcus và Pneumococcus. Macrolide còn ñư c dùng trong ñi)u tr b nh b ch h u
và nhi m trùng huy t (bacteremia). Tác d ng ph c a nhóm kháng sinh này có th g$m
nôn, m a và tiêu ch!y, ñôi khi gây suy gi!m thính giác (Nduka, 2007).
e. Tetracycline là nhóm kháng sinh ph+ tương ñ i g n nhau do Streptomyces spp sinh ra.
Tetracycline !nh hư'ng t i s# g n tRNA mang amino acid vào ribosome ' ti u ñơn v
30S c a ribosome 70S do ñó ngăn c!n s# b+ sung amino acid vào chu/i polypeptide ñang
t+ng h p. Tetracycline là các kháng sinh ph+ r ng kháng các Streptococcus, Bacillus
20
Gram âm, rickettsia (gây s t thương hàn) và Spirochetes (gây b nh giang mai). Các kháng
sinh này cũng ñư c dùng ñ ñi)u tr nhi m trùng ñư&ng ti t ni u và viêm cu ng ph+i.
Nh& ph+ tác d ng r ng, tetracycline ñôi khi làm thay ñ+i cân b ng h vi khu n n i sinh
thông thư&ng ñư c duy trì/ki m soát b'i h mi n d ch c a cơ th , d(n ñ n vi c nhi m
khu n th c p ví d như ' h tiêu hóa hay âm ñ o. Vi c s d ng tetracycline hi n nay còn
b h n ch do s# tăng tính kháng c a các ch ng vi khu n (Nduka, 2007).
1.1.4 Kháng sinh kháng ung thư (Anti-tumor antibiotics)
7 sinh v t b c cao m/i t bào có ch c năng nh t ñ nh ñư c th#c hi n trong m i
tương tác/liên h v i các t bào khác. ðôi khi, t bào m t liên h v i các t bào xung
quanh và phân chia m t cách không ng%ng ñ t o thành c u trúc g i là kh i u hay ung thư.
Ung thư ñư c ñi)u tr b ng m t trong ba li u pháp ho c k t h p các li u pháp g$m ph(u
thu t ñ lo i b" kh i u, chi u x ñ phá h y ch n l c các t bào ung thư ho c hóa tr .
Nhi)u ch t hóa h c dùng trong hóa tr li u ung thư là các s!n ph m th c p do vi sinh v t
sinh ra do ñó ñư c g i là kháng sinh ch ng/kháng kh i u (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009). M t s nhóm kháng sinh ñã ñư c dùng trong ñi)u tr ung thư có th k ñ n là
anthracycline, actinomycin và bleomycin.
Anthracycline ñư c s d ng r ng rãi trong ñi)u tr ung thư như ung thư máu, ung
thư b ch huy t, ung thư ti)n li t tuy n, ung thư
vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999). M t s
ch ng ñư c cho là sinh anthracycline là
Streptomyces
coeruleorubidus
ho c
Streptomyces peucetius. Nhóm kháng sinh này
cho ñ n nay ñư c ghi nh n g$m daunorubicin
(DNR), doxorubicin, epirubicin và idarumycin
(IDA) (Hình. 1.3). Daunorubicin và adriamycin
g n vào các c p base do ñó kìm hãm t+ng h p
RNA và DNA. Mithramycin và chromomycin
A3 (là các actinomycin), kìm hãm t+ng h p
RNA ph thu c DNA. Bleomycin tương tác và
làm ñ t gãy DNA (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009).
1.1.5. Nhu c6u phát tri/n kháng sinh m7i
M t trong các thành t#u c a y h c hi n
ñ i là phát tri n các ch t kháng sinh và các ch t
Hình 1.3. C u trúc hóa h c c a
daunorumycin (DNR) và
idarumycin (IDA)
21
kháng vi sinh v t khác. Tuy nhiên, rõ ràng là các vi sinh v t ñã và ñang phát tri n tính
kháng v i các kháng sinh hi n có b ng các ñ t bi n m i ho c thay ñ+i thông tin di truy)n
(Arnold et al, 2009). C n ph!i có các kháng sinh m i có tác d ng hi u qu! lên các vi
khu n kháng thu c, ñ c bi t là các h p ch t ch ng kh i u và v t ký sinh (anti-parasitic).
Tuy nhiên vi c tìm ki m các kháng sinh ch ng ung thư khó hơn nhi)u so v i các ch t
kháng khu n hay kháng n m v) m t phương pháp và bi u hi n (interpretation) (Nduka,
2007). Hơn n-a còn c n các kháng sinh m i cho nông nghi p ñ làm thu c ch-a b nh cho
cây tr$ng và v t nuôi vì các b nh ñó s3 !nh hư'ng ñ n con ngư&i thông qua chu/i th c ăn.
1.2 X# khu$n
1.2.1 Các ñ.c ñi/m chung
X khu n là m t nhóm vi sinh v t r t ña d ng trong ñó ña s sinh trư'ng hi u khí
và t o khu n ty phân nhánh tương t# như n m. Tên x khu n –actinomycete- b t ngu$n t%
ti ng Hy L p “actys” (tia) và “mykes” (n m) và ban ñ u x khu n ñư c coi là n m nh" vì
chúng sinh trư'ng gi ng v i n m. M ng lư i phân nhánh c a th s i thư&ng phát tri n '
c! b) m t cơ ch t r n (t o thành h s i khí sinh) l(n bên trong t o thành h s i cơ ch t
(Ashutosh, 2008). ða s x khu n sinh bào t , bào t r t khác nhau v) hình d ng và kích
thư c. ðây là m t trong nh-ng ñ c ñi m ñ phân lo i.
X khu n là vi khu n Gram dương có t* l G+C cao (>55%) trong DNA. ða s x
khu n s ng t# do, ho i sinh và phân b r ng rãi trong ñ t, nư c và xác th#c v t. X khu n
ñóng vai trò v) m t sinh thái quan tr ng trong vòng tu n hoàn t# nhiên. Chúng phân h y
và s d ng các ch t h-u cơ khó phân h y như humic acid trong ñ t. Nhi)u ch ng x
khu n có kh! năng hòa tan lignin và phân h y các h p ch t liên quan ñ n lignin b ng
cách sinh các enzyme th y phân cellulose và hemicellulose và các peroxidase ngo i bào
(Pasti et al., 1990; Mason et al., 2001). Các ch ng x khu n cũng xu t hi n trong môi
trư&ng giàu h-u cơ như các compost, ' c! hai pha ôn hòa (mesophilic) và ch u nhi t
(thermophilic) (Steger, 2006), và ' c ng rãnh nư c th!i nơi mà các x khu n ch a
mycolic acid k t h p v i vi c t o thành các b t khí và váng b t +n ñ nh, ñ c trưng (Seong
et al., 1999, Goodfellow et al., 1996).
Nhìn chung, nhi t ñ ôn hòa 25-30°C và pH trung tính là các ñi)u ki n t i ưu cho
x khu n phát tri n. M c d u v y, nhi)u loài ñã ñư c phân l p ' các môi trư&ng kh c
nghi t ví d như Arthrobacter ardleyensis ưa l nh ñư c phân l p t% tr m tích h$ ' Nam
c#c có th s ng ' nhi t ñ 0°C (Chen et al., 2005) và Nocardiopsis alkaliphila ñư c phân
l p t% ñ t sa m c ' Ai C p có th s ng ' pH 9.5-10 (Hozzein et al., 2004).
22
V) m t phân lo i, l p x khu n có 5 phân l p, 6 b trong ñó b ñư c nh c ñ n
nhi)u nh t (có giá tr trong y h c và kinh t ) là b Actinomycetales. B Actinomycetales
có 13 dư i b , 42 h và kho!ng 200 chi (http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria).
X khu n thư&ng ñư c chia thành hai lo i: Streptomyces và không ph!i
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi x khu n ñư c bi t nhi)u nh t là Streptomyces, v i
kho!ng 500 loài, t t c! ñ)u có GC cao (69–73 %) trong DNA. Streptomyces ñ c bi t
nhi)u trong ñ t nơi chúng phân h y ho i sinh r t nhi)u ph c các ch t h-u cơ b ng các
enzyme ngo i bào. Th#c t , mùi m c ñ c trưng c a nhi)u lo i ñ t liên quan ñ n s# s!n
sinh
h p
ch t
h-u
cơ
d
bay
hơi
g i
là
geosmin
(http://science.howstuffworks.com/question479.htm). M t ph n r t l n các ch t kháng
sinh ñư c s# d ng hi u qu! trong ñi)u tr có ngu$n g c t% các loài Streptomyces trong ñó
ñư c bi t ñ n nhi)u nh t là streptomycin, erythromycin và tetracycline (Stuart, 2005).
1.2.2 X# khu$n và các ch-t th% sinh
X khu n ñư c ñ c bi t quan tâm là do kh! năng sinh ra các h p ch t th sinh có
giá tr ng d ng cao. Trong các h p ch t t# nhiên do vi sinh v t sinh ra ñã ñư c công b
s d ng trên toàn th gi i thì 45% ñư c sinh ra t% x khu n, 38% t% n m và 17% t% vi
khu n ñơn bào (Arnold et al, 2009). Hai ph n ba kháng sinh ñã bi t ñư c sinh ra b'i x
khu n ch y u t% các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997). Các h p ch t kháng sinh khác
nhau c a x khu n ñã ñư c nghiên c u ñ c ñi m g$m aminoglycoside, anthracyclin,
glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide,
actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988). Các h p ch t này ñã ñư c s d ng
thành công làm thu c gi t c", thu c ch ng ung thư, thu c, các ch t ñi)u hòa mi n d ch và
các ch t ch ng ký sinh trùng (Thomson et al, 1995).
1.3. Tình hình nghiên c%u x# khu$n & Vi t Nam
7 Vi t Nam x khu n ñã ñư c quan tâm nghiên c u khá nhi)u trong ñó các nghiên
c u t p trung vào ñ c ñi m sinh h c (Bi)n Văn Minh, 2000-2004), t i ưu hóa môi trư&ng
nuôi c y (Bùi Vi t Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), kh! năng sinh kháng sinh kháng các vi
sinh v t gây b nh th#c v t (như vi khu n héo lá, n m th#c v t, n m ñ o ôn, n m th i c+
r …) (Ki)u H-u 8nh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh v t
gây nhi m trùng b nh vi n (Nguy n Phú Hùng và cs, 2009). Ngoài ra còn có công trình
nghiên c u s d ng k. thu t dung h p t bào tr n nh m nâng cao hi u qu! sinh kháng
sinh c a x khu n (Vi Th ðoan Chính, 2000), hay s!n xu t kháng sinh b-lactam (Lê Gia
Hy và Ph m Th Bích H p, 2004), tìm hi u kh! năng s d ng d u m" c a m t s x
23
khu n (L i Thúy Hi)n và cs., 1998), nâng cao hi u su t sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs,
2005).
Cho ñ n nay chưa th y công trình nào ñ) c p ñ n kháng sinh kháng ung thư có
ngu$n g c t% x khu n ' Vi t Nam.
1.4. N'i dung và m c ñích c a nghiên c%u
Nghiên c u này nh m tìm hi u s# ña d ng sinh h c và sàng l c các ch ng x
khu n có ho t tính kháng vi sinh v t trong b sưu t p các ch ng x khu n thu th p t% ñ!o
Cát Bà, m t vư&n qu c gia có ña d ng sinh h c cao ' Vi t Nam. Các ch t kháng sinh do
các ch ng l#a ch n sinh ra ñư c ti p t c nghiên c u nh m tìm ki m b!n ch t c a chúng.
C th là:
- Phân l p x khu n t% m(u ñ t và lá m c ' ñ!o Cát Bà, H!i Phòng qua ñó ñánh
giá m c ñ ña d ng c a ñ i tư ng
- Sàng l c các ch ng có ho t tính kháng sinh cao
- Tách chi t sơ b thu các ch t có ho t tính kháng sinh t% các ch ng ch n l c ñư c
- Nghiên c u tính ch t c a các ch t kháng sinh thu ñư c b ng s c ký b!n m"ng
(TLC) và s c ký l"ng hi u năng cao (HPLC).
- Phân lo i, ñ nh danh các ch ng x khu n (b ng mô t! hình thái ho c b ng gi!i
trình t# gene 16S c a rDNA) có ho t tính kháng sinh cao.
- Th nghi m ho t tính kháng các dòng t bào ung thư ngư&i c a d ch chi t t% d ch
nuôi c a m t s ch ng có ti)m năng
- Phân tích HPLC ch t chi t t% các ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư làm cơ
s' cho nghiên c u b!n ch t c a các h p ch t ñó.
24
CHƯƠNG II - NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C(U
2.1.
Nguyên v)t li u
2.1.1. ð i tư+ng nghiên c%u
Các ch ng x khu n phân l p t% các m(u ñ t và rác thu th p t% Cát Bà năm 2008 là
ñ i tư ng nghiên c u c a ñ) tài này.
Ch ng x khu n Nonomuraea roseoviolacea có ký hi u A16 do National Institute
of Technology and Evaluation (NITE, Nh t B!n) cung c p ñư c dùng làm ñ i ch ng như
x khu n sinh anthracycline trong các phân tích s c ký và ñ c t t bào.
2.1.2. Hóa ch-t
Các hóa ch t ñư c s d ng trong nghiên c u vi sinh v t ñ)u là nh-ng hóa ch t có
tiêu chu n ch t lư ng cao c a các hãng cung c p l n như Merck (ð c), Sigma (M.). Hoá
ch t và m t s kit dùng cho phân tích sinh h c phân t do các hãng Bioneer (Hàn Qu c),
Fermentas (ð c), Qiagen (M.), ABI (M.), BioRad (M.) cung c p. Các hóa ch t dùng
cho HPLC ñ t tiêu chu n cho phân tích này.
2.1.3. Thi t b,, d ng c s3 d ng trong nghiên c%u
Nghiên c u ñư c th#c hi n ch y u t i Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c –
ð i h c Qu c gia Hà N i, s d ng các thi t b chuyên môn dùng trong vi sinh v t h c,
sinh h c phân t và hoá phân tích ñ t tiêu chu n qu c t .
2.2.
Phương pháp nghiên c%u
2.2.1. Phương pháp phân l)p x# khu$n
Hai phương pháp phân l p ñã ñư c s d ng trong ñ) tài là phương pháp s y khô
(Nonomura et al, 1969) và phương pháp ly tâm-hoàn m (rehydration–centrifugation)
(Hayakawa et al, 2000).
Trong phương pháp s y khô, các m(u ñ t và rác ñư c làm khô ' nhi t ñ phòng
trong 5-7 ngày r$i x lý ' nhi t ñ 90 – 110 0C trong 10 – 30 phút ñ lo i b" các vi khu n
không sinh bào t (h u h t các bào t x khu n không ch t ' ñi)u ki n này). Ti p theo,
các m(u ñư c tr!i lên môi trư&ng HV (môi trư&ng th ch có humic acid và vitamin: humid
acid 1 g, CaCO3 0,02 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; KCl 1,71 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; Na2HPO4
0,5 g, cycloheximine 50 mg, nalidixic acid 20 mg, kabicidine 14 mg, th ch 18 g, H2O 1 L,
pH 7,2) và nuôi ' 28 – 300C trong 7 ñ n 14 ngày. Các khu n l c x khu n v i hình thái
khác nhau ñư c nh t và chuy n sang môi trư&ng YS (môi trư&ng th ch ch a d ch chi t
25
n m men và tinh b t: glucose 10 g, cao n m men 2 g, th ch 17 g, H2O 1 L, pH 7,0) ñ t o
sinh kh i t bào nhi)u hơn.
Phương pháp ly tâm-hoàn m (RC) là m t phương pháp phân l p ñ c hi u v i x
khu n ñ ng. Các bư c ti n hành như sau:
−
L y 0.5 g m(u ñ t và rác ñã ñư c phơi khô cho vào bình tam giác 100 ml, nh6
nhàng thêm 50 ml ñ m phosphate 10 mM (pH = 7) ch a 10% d ch chi t ñ t (tr n
500 g ñ t v i 500 ml nư c c t trong bình tam giác, kh trùng ' 121°C trong 30
phút, l c hai l n, kh trùng và b!o qu!n ' 4°C).
−
ð y bình b ng gi y nhôm và nuôi ' 30°C trong 90 phút ñ gi!i phóng các ñ ng bào
t (motile zoospores).
−
Chuy n 8 ml d ch n+i vào ng falcon 15 ml, ly tâm ' nhi t ñ phòng trong 20 phút
' 1,500 g ñ lo i b" các x khu n không ñ ng. ð các ng +n ñ nh trong 30 phút.
−
L y 1 ml d ch n+i r$i pha loãng b c 2 b ng nư c s ch ñã kh trùng, l y 0,2 ml c a
các b c pha loãng 10-2, 10-3 và 10-4 cho lên ñĩa môi trư&ng th ch HV và nuôi ' 28 –
30°C trong 2 – 3 tu n ñ t o khu n l c.
−
Nh t các khu n l c ñư c t o thành và chuy n vào ñĩa môi trư&ng th ch HV m i ñ
thu n khi t l n th hai r$i chuy n sang môi trư&ng th ch YS ñ t o sinh kh i.
T t c! các ch ng x khu n phân l p b ng hai phương pháp nói trên ñ)u ñư c lưu gi-
' -80°C trong dung d ch glycerol 20% t i B!o tàng gi ng chu n vi sinh v t (Vietnam
Type Culture Collection-VTCC), Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c, ð i h c Qu c
gia Hà N i.
2.2.2. Các vi sinh v)t ki/m ñ,nh
B n ch ng vi sinh v t do VTCC cung c p, g$m Micrococcus luteus (có ký hi u
VTCC-B-644), Escherichia coli (VTCC-B-428), Candida albicans (VTCC-Y-674) và
Fusarium oxysporium (VTCC-F-239) ñư c s d ng làm ñích ñ sàng l c ho t tính kháng
vi sinh v t. Các ch ng này ñư c nuôi trong các môi trư&ng dinh dư9ng thích h p, c th
là môi trư&ng Mueller-Hinton (MHA: cao th t 0,3%; casein th y phân 1,75%; tinh b t
0,15%; pH 7,4) ñ i v i E. coli và M. luteus, môi trư&ng cao n m men/malt (YM; glucose
1%, peptone 0,5%; cao n m men 0,3%; cao malt 0,3%) ñ i v i C. albicans và F.
oxysporum. Vi c nuôi c y ñư c ti n hành trong ñi)u ki n l c ' 37 °C ñ i v i E. coli và
M. luteus ho c 30°C ñ i v i C. albicans và F. oxysporum.
26
2.2.3 Sàng l*c x# khu$n sinh kháng sinh
Trư c tiên, t t c! các ch ng x khu n ñư c ho t hóa trong ñĩa môi trư&ng YS '
30°C trong 3–4 ngày. Sau ñó các ch ng ñư c nuôi trong môi trư&ng ñ u tương l"ng (tinh
b t 25 g, b t ñ u tương 15 g, cao n m men 1 g, CaCO3 4 g, nư c c t 1 L, pH 6,2) ' 30°C
trong 3 ngày có l c v i t c ñ 100 vòng/phút. Sau th&i gian nuôi c y, d ch nuôi ñư c ly
tâm ' 8.000 vòng/phút trong 15 phút. D ch n+i thu ñư c ñư c dùng ñ ñánh giá ho t tính
kháng vi sinh v t. Có hai bư c ñánh giá ho t tính:
a. Phương pháp th"i th ch
Các m!nh th ch có ñư&ng kính 5 mm ñư c c t t% ñĩa môi trư&ng YS có ch ng x
khu n m c r t t t ñư c ñ t lên b) m t các ñĩa th ch trư c ñó ñã ñư c c y vi sinh v t ki m
ñ nh và nuôi trong ñi)u ki n thích h p trong 2 ngày. Hi u qu! kìm hãm ñư c ñánh giá
thông qua s# t o thành các vùng kìm hãm quanh m!nh th ch có x khu n và ho t tính
ñư c ño b ng ñư&ng kính c a các vùng này (Ichikawa T. và c ng s#, 1971).
b. Phương pháp khu ch tán d ch nuôi
Các gi ng nh" ñư c ñ c trên các ñĩa th ch r n trư c ñó v%a ñư c c y vi sinh v t
ki m ñ nh. Nh" kho!ng 25 µl d ch nuôi ñã ly tâm vào các gi ng và nuôi trong 2 ngày dư i
các ñi)u ki n thích h p v i vi sinh v t ki m ñ nh. Ho t tính kháng sinh ñư c ñánh giá
thông qua các vòng kìm hãm ñư c t o thành quanh gi ng. Các thí nghi m ñư c l p l i hai
l n và d ch môi trư&ng ban ñ u ñã kh trùng ñư c dùng làm ñ i ch ng âm (Alex Y. l. T.,
Hai M.T. 2006).
2.2.4 Chi t b ng ethyl acetate
D ch nuôi c y c a các ch ng x khu n trong môi trư&ng ñ u tương l"ng sau ly tâm
(' 8000 vòng/phút trong 15 phút ' nhi t ñ phòng) lo i b" t bào ñư c tách chi t theo mô
t! c a Guoliang Yin và c ng s# v i m t s thay ñ+i cho phù h p (Guoliang Yin và cs,
2010). B n th tích ethyl acetate ñư c thêm vào r$i ñư c l c k. trong 1 gi&. Ph n hòa tan
ñư c thu l i b ng bình chi t sau ñó ñư c b+ sung sulfate natri sao cho có n$ng ñ là 5
g.L-1. Dung môi ñư c lo i b" b ng máy lo i dung môi. Ph n c n thu ñư c s3 ñư c x lý
tùy theo m c ñích thí nghi m ti p theo.
ð ti n hành s c ký, ph n c n s3 ñư c hòa tan trong chloroform (Westley J.W., và
cs., 1979). Tuy nhiên trư c khi ti n hành s c ký, d ch chi t thô trong chloroform s3 ñư c
ki m tra l i ho t tính kháng vi sinh v t b ng phương pháp ñã mô t! 2.2.3.b v i chloroform
là ch ng âm.
27
ð i v i phép th ñ c t t bào c n ñư c thu l i ' d ng r n. Vi c ti n hành x lý ti p
theo ñư c tuân th theo quy trình mô t! ' 2.2.7.
2.2.5 S c ký các ch-t chi t thu ñư+c
2.2.5.1. S c ký b!n m"ng (Thin Layer Chromatography - TLC)
Phân tích TLC ñư c ti n hành trên b!n Silica Gel G (20 x 10 cm) v i h dung môi
chloroform : methanol (90:10). Chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin d ch chi t
thô c a anthracyclines (do ch ng A16 sinh ra) ñư c dùng làm chu n so sánh. Các băng
ñư c hi n th b ng tia UV (bư c sóng 254 và 366 nm) ho c b ng phun sulfuric acid
(H2SO4) 10% và c ñ nh ' 120 °C trong 5-10 phút (Irena C., 2010, Matook S. M., Fumio
H., 2005).
2.2.5.2. S c ký l"ng hi u năng cao (High-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
a. S c ký so sánh v i các kháng sinh chu n
Phân tích này ñư c ti n hành trên h th ng Agilent 1100 series HPLC (M.) v i c t
C18 Synchropak RP-4 (250 mm × 4.6 mm, ID 11704457 Agilent, M.) và UV detector.
Dung d ch các kháng sinh chu n (chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin) ñ c ñư c
pha trong methanol ' n$ng ñ 1 mg.ml−1 và b!o qu!n ' 4 °C trong t i. N$ng ñ và ñi)u
ki n s c ký áp d ng cho các ch t chu n thay ñ+i tùy theo b!n ch t hóa h c c a chúng và
ñư c nêu c th ' b!ng 2.1.
B ng 2.1 ði u ki n phân tích HPLC c a các ch-t chu$n
Kháng sinh
Chloramphenicol
B n ch-t hóa h*c
Công th c:
C11H12Cl2N2O5
MW: 323.132
ði u ki n phân tích
Pha mang: 25% acetonitril
(pH 6)
−1
V n t c: 1 ml min
Nhi t ñ c t: 30 °C
Tài li u
tham
kh o
Jeffrey
R.K.
(1978)
Bư c sóng: 270 nm
Erythromycin
Công th c:
C37H67NO13
MW: 733.93
Có m t vòng
lactone l n g n
v i hai ñư&ng
không có oxy
Pha mang: acetonitril (25%) :
phosphate buffer (0.05M, pH
6.3) = 3 : 7 (vol:vol)
Stubbs
C., et. al.
(1985)
−1
V n t c: 1 ml min
Nhi t ñ c t: 35 °C
Bư c sóng: 200 nm
28
Công th c:
C35H59NO13
Pha mang: acetonitril (25%) :
phosphate buffer (0.05M, pH
2.5) = 58 : 42 (vol:vol)
MW: 701.84
V n t c: 0.5 ml min
Nhi t ñ c t: 40 °C
Kitasamycin
−1
Horie M.,
et.al.
(1996);
Leo M. L.
N. (2000)
Bư c sóng: 232 nm
Pha mang: Dung môi A (0.1%
formic acid trong nư c) :
Dung môi B(0.1% formic acid
trong acetonitril) = 70 : 30
(vol:vol)
Anthracyclines
−1
R1=CH3, R2=H:
Daunorubicin
R1=CH3, R2=OH:
Adriamycin
V n t c: 1 ml min
Nhi t ñ c t: 30 °C
Kristof
M.
(2009),
Young
S.R., et.
al., 2001
Bư c sóng: 480 nm
Các m(u ñư c phân tích v i m/i chu n trong cùng ñi)u ki n. Trư c khi cho m(u
c t ñư c r a b ng ñ m cho ñ n khi cân b ng. Th tích m(u là 10 :l.
b. S c ký phân tích trên các bư c sóng khác nhau
Phân tích ñư c ti n hành trên h th ng t# ñ ng Agilent 1200 series HPLC (M.) v i
DAD detector v i các ñi)u ki n: c t: Varian, Microsorb MV 100C18, 100mm x 4.6 mm,
kích thư c h t 3 µm; pha ñ ng : 0,15 % KH2PO4 (pH 3,5) và acetonitril (CH3CN) có
gradient (0 - 3 phút: 15 %, 3 - 6 phút: 40 %, 6 - 12 phút: 40 %, 12 - 19 phút: 45 %, 19 22 phút: 85 %, 22 - 29 phút: 85 %, 29 - 32 phút: 15 %); v n t c: 1,2 ml/phút; nhi t ñ lò
c t: 30 'C; bư c sóng: UV/VIS 190 - 600 nm (kho!ng cách 2 nm). Các m(u ch t chi t
ñư c hòa tan trong DMSO. Ph n nghiên c u này ñư c th#c hi n t i Phòng thí nghi m Vi
sinh v t phân t , Trung tâm Công ngh sinh h c qu c t (International Centre of
Biotechnology-ICBiotech), ð i h c T+ng h p Osaka, Nh t B!n.
2.2.6 Sàng l*c ch ng x# khu$n sinh anthracycline
Kh! năng sinh anthracycline c a các ch ng x khu n ñư c sàng l c b ng phép th
màu. B!n ch t c a phép th như sau: Do có m t c a vòng anthraquinone trong c u t o
hóa h c, các anthracycline thay ñ+i màu s c tùy theo pH c a môi trư&ng, c th là có màu
da cam ' pH acid và màu tím khi ' pH base. ð c tính này ñư c dùng ñ sơ b sàng l c
29
các ch ng sinh anthracycline trong s các ch ng x khu n phân l p ñư c (Trease G. E.,
Evans W. C., 1996).
Cách ti n hành như sau: ñ c 2 gi ng nh" trên ñĩa th ch trư c ñó ñã ñư c nuôi x
khu n (kho!ng 4 – 5 ngày tu+i). Nh" vào m/i gi ng 25 µl HCl (1N) ho c NaOH (2N).
Quan sát màu quanh gi ng sau 10 – 20 phút.
2.2.7. Phép th3 ñ'c t bào
Kh! năng gây ñ c t bào c a các ch t chi t ñư c t% d ch nuôi x khu n ñư c xác
ñ nh theo phương pháp c a Skehan và c ng s# (1990) và Likhiwitayawuid và c ng s#
(1993) hi n ñang ñư c áp d ng t i Vi n Nghiên c u ung thư qu c gia (Hoa Kỳ) và trư&ng
Dư c, ð i h c Illinois, Chicago (Hoa Kỳ). Phép th ñư c th#c hi n t i Phòng Sinh h c
th#c nghi m, Vi n Hóa h c các h p ch t thiên nhiên, Vi n Khoa h c và Công ngh Vi t
Nam. C th là:
Ba dòng t bào ung thư c a ngư&i g$m ung thư gan (hepatocellular carcinoma, HepG2), ung thư ph+i (lung cancer, Lu) và ung thư cơ vân tim (rhabdosarcoma, RD) ñư c
dùng ñ sàng l c ho t tính gây ñ c t bào b ng phép th Sulforhodamine B (SRB assay).
Các dòng t bào này ñư c cho vào ñĩa 96 gi ng (m/i gi ng ch a 2x103 t bào) r$i
cho ch t c n th (' ñây là ch t chi t t% d ch nuôi x khu n như ñã mô t! ' 2.2.4. v i các
n$ng ñ pha theo thang 10) hòa tan trong DMSO. Sau ñó các ñĩa ñư c nuôi trong t CO2
' 37 ºC trong 7 ngày. Vào ngày th 3 môi trư&ng nuôi ñư c thay m i. T* l ph n trăm
s ng sót c a t bào ñư c hi n th màu b ng SRB (sulforhodamine B) và ñư c ñ c b ng
máy ñ c ELISA (ELISA reader) ' bư c sóng 495 nm.
Ho t tính gây ñ c t bào ñư c tính b ng ph n trăm c ch khi so sánh m t ñ quang
h c c a gi ng ñư c x lý v i m(u nghiên c u và ch ng âm (DMSO). N$ng ñ
c ch
50% (IC50) ñư c suy ra t% ñư&ng cong phát tri n t bào và n$ng ñ ch t th (ph n trăm
s ng sót so v i n$ng ñ ch t th ).
2.2.8. Các phương pháp phân lo#i x# khu$n
a. Qua ñ c ñi m hình thái
Các ñ c ñi m hình thái c a x khu n ñư c quan sát sau hai tu n nuôi ' các ñi)u
ki n như ñã mô t!. Các ñ c ñi m hi n vi như h s i cơ ch t, hình thái s i khí sinh, c u
trúc chu/i bào t ñư c quan sát dư i kính hi n vi ph!n pha (Carl-Zeiss) có n i máy !nh
và ph n m)m ch p !nh. Atlas hình thái x khu n (Gernot, 1997) và S+ tay nh n d ng x
khu n (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñư c dùng ñ
30
tham kh!o v) ñ c ñi m phân lo i.
b. B ng sinh h c phân t
Tách chi t DNA
DNA genome c a các ch ng x khu n ñư c tách chi t theo phương pháp ñã ñư c
Marmur (1961) và Saito (1963) mô t! v i m t s c!i ti n. C th là, nuôi x khu n trong
môi trư&ng YS l"ng trong 3 ngày ' 30°C và thu t bào b ng ly tâm ' 3000 vòng/phút
trong 5 phút. T bào sau khi ñã ñ$ng nh t (b ng que nh#a vô trùng, r a b ng 2 ml ñ m
1 TE 2 – 3 l n và hòa tan l i trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) b phá v9 b ng x lý v i
lysozyme (50 µl có n$ng ñ 40 mg.ml−1) ' 37°C qua ñêm, r$i ñư c x lý v i SDS (50 µl
có n$ng ñ 20%) và proteinase K (50 µl có n$ng ñ 4 mg.ml−1) ' 55°C trong 1 gi&. DNA
ñư c chi t b ng b+ sung m t th tích tương ñương h/n h p phenol:chloroform:isoamine
alcohol = 25:24:1 (PCI), tr n và ly tâm ' 15000 vòng/phút trong 15 phút ' 4°C. Bư c
chi t này ñư c l p l i 3 l n. DNA nhi m s c th ñư c k t t a b ng 2 th tích 2-propanol
l nh, r$i làm khô b ng ethanol 70% ' nhi t ñ phòng và hòa tan trong 100 µl nư c c t.
Ph!n ng PCR, gi!i trình t# và phân tích cây ch ng lo i phát sinh
Gene rDNA 16S ñư c khu ch ñ i b ng c p primer:
27F
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)
1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)
H/n h p ph!n ng (50 µl) g$m 5 µl ñ m (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20
mM MgCl2), 20 nM m/i lo i deoxynucleotide, 50 pM m/i lo i primer, 2.5 U Taq DNA
polymerase, và 1 µl DNA khuôn (n$ng ñ kho!ng 10-20 ng). Chu trình PCR g$m 5 phút
s c nhi t ' 95°C, ti p ñ n là 30 chu kỳ g$m 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và
72°C trong 1 phút, cu i cùng là 72°C trong 7 phút. S!n ph m PCR ñư c ñi n di trên gel
agarose, c t và tinh s ch băng DNA b ng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñ c
trình t# b ng máy t# ñ ng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer.
Trình t# gen sau ñó ñư c phân tích so sánh v i trình t# 16S rDNA c a các loài có
liên quan hi n ñã công b trên Database DDBJ/EMBL/GenBank s
d ng ph n m)m
BLAST Search. So sánh tương ñ$ng v i các trình t# liên quan ñư c th#c hi n b ng ph n
m)m CLUSTAL_X, phiên b!n 1.8 (Thompson et. al., 1997). Cây phân lo i ñư c d#ng
theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñ nh d ng cây ñư c
ti n hành d#a trên 1000 phép so sánh ña chi)u (Felsenstein, 1985).
31
CHƯƠNG III. K T QU VÀ TH O LU N
3.1. ða d#ng sinh h*c các ch ng x# khu$n thu th)p ñư+c & Vư n Qu c gia Cát Bà
Vi t Nam v i hơn 1.700 km b& bi n tr!i t% b c xu ng nam v i r t nhi)u ñ!o có
m c ña d ng sinh h c cao. M t s ñ!o c a Vi t Nam ñã ñư c công nh n là vư&n qu c gia
ñ b!o t$n và phát tri n b)n v-ng ngu$n gene sinh h c. Trong khi h th#c v t và ñ ng v t
' các vư&n qu c gia c a Vi t Nam ñã ñư c quan tâm nghiên c u v) m c ñ ña d ng r t
nhi)u thì vi sinh v t chưa ñư c quan tâm ñúng m c cho dù vi sinh v t ñóng vai trò ch
ñ o trong s# phát tri n c a công ngh sinh h c. Hi n v(n còn ít các nghiên c u liên quan
ñ n s# ña d ng cũng như kh! năng ng d ng c a h vi sinh v t ' các vư&n qu c gia này.
Trong s các ñ!o c a Vi t Nam, Cát Bà là ñ!o l n nh t c a V nh H Long, di s!n
thiên nhiên th gi i. ð!o hi n có 620 loài th#c v t b c cao, 32 loài ñ ng v t có vú, 69 loài
chim và 20 loài bò sát. Cũng tương t# như h u h t các khu b!o t$n ' Vi t Nam, Vư&n
qu c gia Cát Bà chưa ñư c nghiên c u v) m c ñ ña d ng và ti)m năng s d ng c a vi
sinh v t.
Nh m góp ph n nghiên c u v) nhóm x khu n có ' ñ!o Cát Bà, ñ) tài ñã ti n hành
phân l p x khu n theo hai phương pháp khác nhau như ñã mô ' chương II. Qua ñó ñã
phân l p ñư c 424 ch ng x khu n t% các m(u ñ t và lá cây m c thu t i Cát Bà. Trong s
424 ch ng ñó, 353 ch ng (83.25%) phân l p ñư c t% ñ t và 71 ch ng (16.75%) t% m(u lá
cây m c.
Ti p theo, các ch ng x khu n phân l p ñư c ñã ñư c phân lo i theo hình thái ñ
phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (x khu n hi m) (B!ng 3.1). ð
ñ nh lo i chính xác hơn nhóm x khu n hi m phương pháp ñ c trình t# m t ph n rDNA
16S (kho!ng 900 bp) ñã ñư c th#c hi n và so sánh v i các trình t# ñã có trên cơ s' d#
li u b ng công c Blast Search.
Qua b!ng 3.1 chúng tôi nh n th y 296 ch ng phân l p ñư c là Streptomyces (chi m
kho!ng 69,81%) và 128 ch ng thu c nhóm x khu n hi m (non-Streptomyces) (chi m
kho!ng 30,19%). Các nghiên c u trư c ñây cho th y Streptomyces là m t trong nh-ng
nhóm vi khu n chi m ưu th trong ñ t và phân b+ r ng rãi trên th gi i (Hopwood A. D.,
2007). Do v y t* l cao c a Streptomyces trong b sưu t p x khu n ' Cát Bà kh5ng ñ nh
k t lu n này.
Nhìn chung, h u h t các ch ng Streptomyces phân l p ñư c m c nhanh và kh"e,
xu t hi n trư c tiên trong các ñĩa phân l p và d phân l p. Ngư c l i, các ch ng x khu n
hi m (non-Streptomyces) m c ch m, khu n l c nh", khó phân l p và nuôi c y. S lư ng
32
x khu n hi m thu ñư c t% phương pháp ly tâm-hoàn m nhi)u hơn b ng phương pháp
s y khô truy)n th ng.
B ng 3.1 Sơ b' phân lo#i các ch ng x# khu$n phân l)p ñư+c
Các nhóm x# khu$n
S lư+ng ch ng
%
296
69.81
Micromonospora
27
6.36
Nonomuraea
17
4.00
Nocardia
12
2.83
Kineosporia
8
1.90
Microbispora
7
1.65
Actinomadura
7
1.65
Pseudonocardia
6
1.42
Nocardiopsis
6
1.42
Micrococcus
5
1.18
Streptosporangium
5
1.18
Khác (m/i lo i ít hơn 1%)
28
6.60
424
100.00
Streptomyces
X# khu$n hi m (non-Streptomyces)
T8ng c'ng
Xét v) m c ñ ña d ng, chúng tôi nh n th y các chi Micromonospora, Nonomureae
và Nocardia là các chi chi m ưu th trong các chi x khu n hi m (non-Streptomyces) thu
th p t i Cát Bà (B!ng 3.1). Các loài thu c ba chi này cũng thư&ng ñư c phân l p ' các
ñ a ñi m khác ' Vi t Nam (Duong V.H., Ando K., 2010).
Các ch ng phân l p ñư c hi n ñư c lưu gi- t i B!o tàng gi ng chu n vi sinh v t
(Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c trong
glycerol 20% ' −80 °C.
3.2 Sàng l*c x# khu$n sinh kháng sinh
ð sàng l c các ch ng sinh kháng sinh, 4 ch ng vi sinh v t ñ i di n cho vi khu n
Gram âm và dương; n m và n m men ñã ñư c l#a ch n làm vi sinh v t ki m ñ nh.
Bư c sàng l c ñ u tiên ñư c th#c hi n b ng phương pháp m!nh th ch như ñã mô t!
' chương II. Qua ñó cho th y trong 424 ch ng x khu n nghiên c u ch, có 115 ch ng
33
(chi m kho!ng 27,12%) cho ho t tính ñáng k kháng ít nh t m t trong b n vi sinh v t
ki m ñ nh.
Ti p theo 115 ch ng này ñư c dùng làm ñích cho bư c sàng l c th hai s d ng
phương pháp khu ch tán d ch nuôi c y. M t s hình !nh ñ i di n cho bư c phân tích này
ñư c trình bày ' hình 3.1. T% bư c sàng l c này 17 ch ng th hi n ho t tính tương ñ i
cao v i ít nh t hai trong b n vi sinh v t ki m ñ nh ñã ñư c l#a ch n. Ho t tính tương ñ i
c a các ch ng này ñư c trình bày ' b!ng 3.2.
F. oxysporium
E. coli
M.luteus
C. albicans
Hình 3.1. ðánh giá ho#t tính kháng vi sinh v)t c a các ch ng x# khu$n
M t s hình !nh tiêu bi u minh h a cho phương pháp khu ch tán d ch nuôi c y.
Trong s 17 ch ng ch n l c ñư c, 14 ch ng có ho t tính kìm hãm vi khu n Gram
âm (E. coli), 14 ch ng kìm hãm vi khu n Gram dương (M. luteus) và 11 ch ng có ho t
tính kháng c! hai nhóm vi khu n. V i các t bào nhân th t, g$m n m (F. oxysporium) và
n m men (C. albicans), 12 ch ng có ho t tính kháng n m và ch, 6 ch ng có ho t tính
kháng n m men (B!ng 3.2).
B ng 3.2. Ho#t tính kháng vi sinh v)t c a 17 ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
Hi u qu %c ch vi sinh v)t ki/m ñ,nh
(ñư&ng kính vòng kìm hãm, mm)
Ch ng
E. coli
M. luteus
F. oxysporium
C. albicans
A45
10
0
6
0
A149
8
6
0
0
A154
8
8
0
0
A160
0
6
0
10
A232
6
7
0
12
A390
10
10
18
0
A396
8
12
0
0
A410
24
0
10
0
A427
16
0
12
0
34
A444
0
7
8
0
A1018
0
40
10
16
A1022
16
30
10
0
A1041
22
28
6
0
A1043
8
32
6
0
A1073
21
30
10
10
A1393
14
18
14
6
A1470
15
26
12
0
K t qu! còn cho th y 9 trong s 17 ch ng ch n l c ñư c có ho t tính m nh v i c! vi
khu n và n m (ñư&ng kính vòng kìm hãm > 10 mm). ð c bi t là hai ch ng A1073 và
A1393 kìm hãm c! b n ch ng vi sinh v t ki m ñ nh (b!ng 3.2, các dòng ñư c bôi ñ m).
3.3. Hi u qu tách chi t d,ch nuôi c-y các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
17 ch ng ch n l c ñư c ñã ñư c ti n hành nuôi c y l"ng và sơ b tách chi t d ch
ngo i bào ñ ti n hành các phân tích ti p theo. Hi n nay có nhi)u công b liên quan ñ n
vi c tách chi t các ch t có ho t tính sinh h c ngu$n g c t% vi sinh v t. Qua tham kh!o tài
li u chúng tôi nh n th y ethyl acetate thư&ng ñư c s d ng trong bư c ñ u tiên khi tách
chi t h p ch t có ho t tính kháng sinh t% vi sinh v t. Ethyl acetate ñư c coi là m t trong
nh-ng dung môi h-u cơ tương ñ i ít ñ c h i, d lo i b" do có ñ bay hơi cao và là dung
môi ñư c dùng ph+ bi n trong tách chi t nhi)u ch t hóa h c. Ethyl acetate hi n ñư c s
d ng trong nhi)u ngành công nghi p trong ñó có c! công nghi p th#c ph m (làm bánh
k6o). Vì v y s d ng dung môi này s3 an toàn cho ngư&i th#c hi n (Dutia, Pankaj, 2004).
Do ñó chúng tôi ñã l#a ch n ethyl acetate làm dung môi ñ chi t các ch t tan trong d ch
nuôi thu ñư c t% các ch ng ch n l c ñư c. Quy trình tách chi t ñã ñư c mô t! chi ti t '
chương II. Hi u qu! tách chi t các ch t tan trong ethyl acetate ñư c trình bày ' b!ng 3.3.
Qua ñó cho th y t% 01 lít d ch nuôi c y (sau khi ñã lo i b" t bào) thu ñư c t% vài ch c
miligram ñ n vài gram ch t tan trong ethyl acetate. So v i ch t khô thì lư ng ch t tan này
chi m t% 0,5% ñ n g n 15% tùy theo t%ng ch ng x khu n. Trong ñó d ch nuôi c a ch ng
A396 có t* l ch t tan này cao nh t (14,89%), còn th p nh t là ch ng A154 (ch, chi m
0,51%).
B ng 3.3. Hi u qu tách chi t d,ch nuôi các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
(t2 1 lít d,ch nuôi ñã lo#i t bào)
TT
Ch ng
Ch-t khô (gam)
Ch-t tan trong
ethyl acetate (mg)
Ph6n trăm so v7i
ch-t khô (%)
35
1
A45
5,040
504,76
10,02
2
A149
33,445
103,20
3,09
3
A154
5,883
30,15
0,51
4
A160
14,114
72,96
0,52
5
A232
16,556
158,76
0,96
6
A390
13,076
361,40
2,76
7
A396
6,209
924,64
14,89
8
A410
9,699
113,60
1,17
9
A427
18,238
101,92
0,56
10
A444
18,413
2152,36
11,69
11
A1018
28,650
544,96
1,90
12
A1022
30,076
257,04
0,85
13
A1041
25,825
268,64
1,04
14
A1043
23,413
310,40
1,33
15
A1073
30,333
388,72
1,28
16
A1393
28,911
309,04
1,07
17
A1470
20,348
726,80
3,57
3.4. Phân tích s c ký d,ch nuôi các ch ng x# khu$n chi t trong ethyl acetate
3.4.1. S c ký b n m9ng (TLC)
Ch t chi t ñư c t% d ch ngo i bào c a 17 ch ng x khu n sau khi hòa tan l i trong
chloroform ñã ñư c cho ch y TLC cùng v i các ñ i ch ng là chloramphenicol,
kitasamycin, erythromycin và ch t chi t d ch ngo i bào ch ng A16 ñư c coi là ñ i ch ng
cho anthracycline. K t qu! ñư c trình bày trên hình 3.2.
K t qu! thu ñư c cho th y ph+ các băng TLC c a 17 ch ng r t khác nhau. S băng
thu ñư c dao ñ ng t% 1 ñ n 4 băng. Có 8 ch ng (A149, A154, A160, A232, A410, A427,
A1073, A1393) ch, cho 1 băng, 3 ch ng (A396, A444, A1018) cho ph+ có 2 băng, 4
ch ng (A45, A1041, A1043, A1470) cho ph+ 3 băng và 2 ch ng (A390, A1022) cho ph+
4 băng.
36
D
Hình 3.2. Ph8 TLC ch-t chi t t2 d,ch ngo#i bào c a các ch ng x# khu$n ch*n l*c
ñư+c. A, B và C – ph+ TLC dư i ánh sáng UV. D – ph+ minh h a các băng ñư c hi n th .
Vi t t t: CAP-Chloramphenicol; Kita-Kitasamycin; Ery-Erythromycin; các s bi u di n
s c a tên ch ng. Mũi tên ch, hư ng pha ñ ng.
So sánh v i t%ng ñ i ch ng chúng tôi nh n th y:
- Chloramphenicol cho ph+ TLC ch, g$m 01 băng. Trong 17 m(u nghiên c u ch, có
m(u A396 (có hai băng) là có băng có cùng ñ di ñ ng tương ñ i v i kháng sinh
này.
- Kitasamycin cho m t ph+ hai băng. Không có m(u nào trong 17 m(u nghiên c u có
ph+ TLC cũng như băng s c ký trùng v i ph+ hay băng c a kháng sinh này.
- Erythromycin cũng có ph+ g$m hai băng nhưng có ñ di ñ ng tương ñ i nh" hơn
so v i hai băng c a kitasamycin. Có hai m(u có băng tương t# v i băng nh n ñư c
t% erythromycin. ðó là băng có ñ di ñ ng tương ñ i th p nh t (t c băng ch m
37
nh t) c a A45 (cùng ñ di ñ ng v i băng ch m c a kháng sinh này) và băng duy
nh t c a A410 trùng v i băng nhanh c a kháng sinh này.
- Ch t chi t t% ch ng A16 cho ph+ TLC g$m 5 băng. Trong s 5 băng này có 2 băng
(băng th hai và băng th năm tính t% phía xu t phát) là không tìm th y ' b t kỳ
ph+ TLC nào c a 17 m(u nghiên c u. Ba băng còn l i có th quan sát th y ' m(u
A1043 (băng th nh t); A232, A390, A1018 và A1022 (băng th ba); A45, A427,
A1018, A1022 và A1470 (băng th tư). Như v y trong 17 m(u nghiên c u có hai
m(u (A1018 và A1022) có 2 băng TLC trùng v i 2 băng c a m(u ñ i ch ng này.
Như v y qua phân tích TLC dư&ng như các h p ch t chi t ñư c không hoàn toàn tương
ñ$ng v i m t trong các kháng sinh ñư c dùng làm chu n trong nghiên c u này. Tuy nhiên
ñ tr! l&i chính xác li u các h p ch t ñó có ph!i là các ch t ñã bi t hay là các h p ch t
m i c n ph!i có các phân tích sâu hơn.
3.4.2. S c ký l9ng hi u năng cao (HPLC)
Ti p theo nh m tìm hi u sâu hơn các h p ch t tách chi t ñư c t% x khu n, chúng
tôi ñã ti n hành ch y HPLC c a các m(u v i cùng ñi)u ki n s c ký c a các ch t chu n (là
các kháng sinh như ñã ñ) c p ' ph n phân tích TLC).
V i các ñi)u ki n ch y HPLC như ñã mô t! ' ph n phương pháp, k t qu! phân tích
ñư c t+ng k t ' b!ng 3.4, s c ký ñ$ ñư c ñính kèm ' ph n ph l c c a báo cáo.
B ng 3.4. T8ng k t k t qu phân tích HPLC ch-t chi t t2 các ch ng x# khu$n ch*n
l*c ñư+c
TT
I
1
2
Ch-t
chu$n/ch ng
Kitasamycin
A232
A390
S
lư+ng
ñ:nh
thu
ñư+c
7
3
2
Th i
ñi/m
thôi c a
các ñ:nh
chính
(phút)
T; l so
v7i t8ng
s thu
ñư+c
3.714
17,77 %
4.427
62,82 %
7.062
10,65 %
7.291
54,83 %
7.662
34,03 %
7.276
7.276 %
7.672
7.672 %
Ghi chú
các ñ,nh không tách rõ r t
các ñ,nh không tách rõ r t
38
3
4
5
6
7
A1018
A1041
A1073
A1393
A1470
5
6
5
5
4
5.723
64,09 %
6.174
28,67 %
6.456
5,28 %
6.648
6,92 %
7.266
50,77 %
7.622
36,10 %
7.266
55,60 %
7.619
40,53 %
8.180
3,2 %
7.293
60,43 %
7.641
38,50 %
3.396
5,61 %
3.898
22,47 %
5.877
71,46 %
8
Các ch ng còn l i (10 ch ng và ch ng ñ i ch ng
A16)
II
Erythromycin
1
A149
6
11
các ñ,nh ko tách rõ r t
không tách t t
không tách rõ r t
3.117
53%
3.357
24,7%
8.661
50%
9.166
40%
nhưng không tách bi t
hoàn toàn
2
A154
5
9.107
96%
nhưng không tách t t
3
A160
8
8.789
94%
nhưng không tách t t
4
A232
9
3.925
21.19%
4.054
71.16%
4.024
88,53%
5
A390
11
6
A396
8
7
A427
12
8
A444
8
phân ño n t% 6 – 12 phút
không tách
3.363
8,98%
4.775
6,70%
8.607
70%
3.044
1,2 %
nhưng không tách
39
9
10
A1018
A1022
10
13
3.339
1,1 %
9.107
93%
3,999
26,34 %
4.063
56,95 %
5.892
6,68 %
3.977
62,58 %
4.567
11,49 %
5.755
14,49 %
11
A1041
10
3.985
81,25%
12
A1043
8
3.333
2%
8.585
86%
nhưng không tách
nhưng không tách t t
13
A1073
11
4.011
84,89 %
14
A1393
12
4.007
81,85%
15
A1470
8
3.038
1%
3.343
2,38%
9.467
93,62%
nhưng không tách t t
9.539
95%
nhưng không tách t t
16
A16: ch ng ñ i
ch ng dương
17
Các ch ng còn l i: 2 ch ng
III
Chloramphenicol
1
5.498
100%
1
A232
10
1.186
5,16 %
4.192
62,27 %
5.153
15,60 %
1.195
29,61 %
4.190
66,82 %
3.609
6,15 %
3.876
18,64 %
4.464
17,96 %
5.407
4,33 %
6.185
11,04 %
10.852
40,22 %
1.184
8,65 %
2
3
4
A390
A396
A1018
8
7
8
8
không tách t t
40
5
A1022
6
A1041
7
A1073
8
A1393
12
9
7
7
4.210
60,80 %
5.905
16,31 %
8.212
11,08 %
1.195
4,55 %
4.189
36,76 %
5.876
28,13 %
8.174
25,72 %
1.182
10,23 %
4.111
71,33 %
1.201
16,14 %
4.193
66,39 %
1.201
17,59 %
4.193
80,14 %
Các ch ng còn l i: 9 ch ng và ch ng ñ i ch ng
dương A16
9
không tách t t
Qua phân tích k t qu! thu ñư c t% HPLC, chúng tôi nh n th y các h p ch t thu ñư c
t% các ch ng x khu n nghiên c u chưa th kh5ng ñ nh thu c vào nhóm nào trong s các
ch t chu n ñã s d ng, tr% m(u A396 có m t ñ,nh (thôi ' 5.476 phút) tương ng v i
chloramphenicol (Hình 3.3). K t qu! này cũng ñư c kh5ng ñ nh t% phân tích TLC (Hình
3.2).
B
Abs270
A
Th&i gian (phút)
Hình 3.3. Ph8 HPLC c a chloramphenicol (A) và ch-t chi t t2 d,ch nuôi ch ng A396
(B)
41
3.5. ð.c ñi/m nh)n d#ng c a các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
ð i v i nghiên c u v) vi sinh v t, vi c ñ nh lo i là h t s c quan tr ng. Như ñã trình
bày ' ph n 3.1 (ða d ng sinh h c c a các ch ng x khu n phân l p ' Cát bà), trong 424
ch ng phân l p ñư c có kho!ng 70% thu c Streptomyces còn l i là x khu n hi m (nonStreptomyces). Sau ñây là các thông tin c th hơn v) 17 ch ng ch n l c ñư c trong b
sưu t p nói trên. 17 ch ng ch n l c ñư c ch, thu c 2 chi là Streptomyces (10 ch ng) và
chi Nonomuraea (7 ch ng).
3.5.1 ð.c ñi/m hình thái c a các ch ng thu'c Streptomyces
Như ñã trình bày, các ch ng x khu n ph+ bi n (Streptomyces) có ñ c ñi m hình
thái ñi n hình có th dùng ñ nh n d ng [11], [29]. T% các ñ c ñi m ñó 10 ch ng (g$m
A390, A410, A427, A1018, A1022, A1041, A1043, A1073, A1393 và A1470) trong s
17 ch ng ch n l c ñư c thu c v) chi Streptomyces.
Các khu n l c c a các ch ng này r t khác bi t v) m t kích thư c (trong ho c b u
A1073 c u trúc h t), và ñ dày (ph$ng hay d6t).
d c), b) m t khu n l c (m)m, c ng, nhăn nheo,
Các khu n l c t o thành h s i cơ ch t và s i khí sinh v i các lo i màu khác nhau như
tr ng, vàng, ñ" ho c nâu. Các khu n l c này ñư c ph kín b'i m t l p s i khí sinh ho c
ñư&ng ñ$ng tâm. Kích thư c khu n l c ph thu c vào các ch ng và ñ tu+i nhưng dao
ñ ng t% vài mm ñ n 1 cm (hình 3.4).
A1018
A390
A1073
A1043
Hình 3.4. Hình thái khu$n l#c m't s ch ng Streptomyces
Liên quan ñ n vi c t o thành h s i khí sinh và chu/i b!o t , 10 ch ng Streptomyces
này t o thành h s i khí sinh v i các chu/i bào t dài trên môi trư&ng th ch YS. ð c ñi m
bào t và chu/i bào t ñư c quan sát dư i kính hi n vi ph!n pha (hình 3.5).
(A)
A1018
(B)
A390
42
Hình 3.5. H s+i mang bào t3 c a m't s ch ng Streptomyces
A, B – D ng th5ng; C, D – D ng hình xo n c a s i mang bào t
D#a trên quan sát dư i kính hi n vi, chu/i bào t c a các ch ng Streptomyces có th
chia thành hai lo i:
- D ng th ng (Hình 3.5.A và B) có chu/i bào t th5ng ho c ngo n ngoèo, h s i khí
sinh phân nhánh màu tr ng. Các ch ng thu c nhóm này g$m A390, A427, A1018, A1022,
A1393 và A1470.
- D ng xo n (hình 3.6. D và D) có h s i khí sinh t o thành s i mang bào t phân
nhánh có hình móc, vòng m', các xo n dài, r ng hay vu t dài (hình 3.5.C) ho c các xo n
v i 3 -5 vòng (hình 3.5.D). Các ch ng thu c lo i này g$m A410, A1041, A1043 và
A1073.
Các bào t có hình b u d c ho c hình xo n, s p x p thành chu/i dài. Không quan
sát th y các c u trúc ñ c bi t khác như túi bào t hay các cơ quan d# tr-.
Thông tin chi ti t v) ñ c ñi m nh n d ng c a các ch ng thu c chi Streptomyces
ñư c t+ng h p ' B!ng 3.5.
43
B ng 3.5. Các ñ.c ñi/m nh)n d#ng c a 10 ch ng thu'c chi Streptomyces
TT
Ch ng
ð.c ñi/m khu$n l#c
ð.c ñi/m
bào t3
1
A390
D ng th5ng
2
A410
3
A427
4
A1018
5
A1022
6
A1041
7
A1043
8
A1073
9
A1393
10
A1470
ñư&ng kính 0,5cm, màu tím nh t, có s i khí
sinh, b) m t khu n cao
ñư&ng kính 0,2 cm, b) m t ph5ng, s i khí sinh
tâm màu xám, vòng ngoài màu tr ng, các khu n
l c già t o nh-ng gi t d ch th màu nâu ' tâm
khu n l c
ñư&ng kính 0,2 cm - 0,3 cm, b) m t l$i, xung
quanh có màu tr ng, s i cơ ch t màu tr ng
ñư&ng kính 0,1 cm, khí sinh màu tr ng xám, cơ
ch t màu be
ñư&ng kính 0,2 cm, s i khí sinh màu tr ng sau
chuy n sang vàng, tâm khu n l c già t o gi t
nư c, cơ ch t màu vàng nâu
ñư&ng kính 0,3 cm - 0,5cm, s i khí sinh màu
xám, b) m t hơi d6t
ñư&ng kính 0,1 cm - 0,2cm, s i khí sinh màu
nâu, b) m t hơi d6t
ñư&ng kính 0,2cm - 0,3cm, s i khí sinh màu
xám ng! vàng, ngoài màu tr ng xám, b) m t hơi
d6t
ñư&ng kính 0,2cm - 0,3cm, khu n lac nh", l$
cao, s i khí sinh màu tr ng
ñư&ng kính 0,3cm, b) m t l$i, s i khí sinh xung
quanh màu xám, tâm màu tr ng
chu<i
D ng xo n
D ng th5ng
D ng th5ng
D ng th5ng
D ng xo n
D ng xo n
D ng xo n
D ng th5ng
D ng th5ng
3.5.2 Gi i trình t 16S rDNA ñ i v7i các ch ng x# khu$n thu'c chi Nonomuraea
Như ñã trình bày ' ph n 3.1. phương pháp sinh h c phân t (gi!i trình t# và so sánh
16S rDNA ñã ñư c dùng ñ phân bi t các ch ng thu c nhóm x khu n hi m. ði)u thú v
là c! 7 ch ng thu c nhóm x khu n hi m ch n l c ñư c l i cùng thu c chi Nonomuraea.
Quan h di truy)n gi-a các ch ng này ñư c trình bày ' hình 3.6. và qua ñó cho th y 7
ch ng này có th chia thành 5 nhóm.
Tóm l i, m c dù b sưu t p x khu n t% Cát Bà có m c ñ ña d ng v) phân lo i
nhưng các ch ng có ho t tính kháng vi sinh v t cao ch, thu c v) hai chi Streptomyces và
Nonomuraea.
44
Hình 3.6. Cây ch ng lo#i phát sinh trình t rDNA 16S cho th-y v, trí c a 7 ch ng x#
khu$n hi m trong chi Nonomuraea
Giá tr t i các ñi m phân nhánh l n hơn 500 ñư c bi u di n trên cây. Thư c ño là 5%
khác bi t trong trình t# DNA. Microbispora parva ñư c ch n làm g c phân nhánh
3.6. Sàng l*c kh năng sinh anthracycline c a các ch ng x# khu$n ch*n l*c ñư+c
M t trong nh-ng nhóm kháng sinh có ngu$n g c t% x khu n hi n ñang ñư c s
d ng ñ ñi)u tr nhi)u lo i ung thư là anthracycline. ð bư c ñ u tìm hi u xem li u 17
ch ng ch n l c ñư c có ch ng nào sinh anthracycline không chúng tôi ñã ti n hành phép
th ñ c hi u v i nhóm h p ch t này – th nghi m bi n ñ+i màu ph thu c vào pH.
Nguyên t c c a phép th này là ' ch/ do có m t c a vòng anthraquinone trong c u t o
hóa h c, các anthracycline thay ñ+i màu s c theo pH c a môi trư&ng, c th là có màu da
cam ' pH acid và màu tím khi ' pH base.
Trên cùng ñĩa nuôi, hai pH khác nhau ñư c t o thành b ng cách nh" dung d ch acid
và base vào hai gi ng ñư c ñ c ' ch/ khu n l c m c t t. Sau kho!ng 20 phút quan sát
màu s c quanh các gi ng ñ có k t lu n bư c ñ u v) kháng sinh mà ch ng x khu n ñó
sinh ra. K t qu! cho th y, trong 17 ch ng nghiên c u ch, có 2 ch ng (A1018 và A1073) là
th hi n ph!n ng này t c chuy n màu da cam khi có pH acid và màu tím khi có pH base
45
(hình 3.7). Như v y, r t có th h p ch t do hai ch ng x khu n này sinh ra thu c nhóm
kháng sinh anthracycline.
Hình 3.7. S thay ñ8i màu s c theo pH môi trư ng c a các ch ng A1018 và A1073.
A: gi ng có pH acid; B: gi ng có pH base. A16 – ch ng ñ i ch ng sinh anthracyclin.
3.7. Các nghiên c%u liên quan ñ n các ch ng có ho#t tính gây ñ'c t bào
3.7.1. Ho#t tính gây ñ'c t bào
Như v y, qua các nghiên c u ' trên có ba ch ng x khu n ñư c th y là có ti)m
năng sinh ch t kháng sinh kháng ung thư là A1018, A1022 và A1073. Trong ñó A1022 có
ph+ TLC g n v i ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline A16 (xem m c 3.4.1); A1018 v%a
có ph+ TLC tương t# ñ i ch ng l i v%a ñư c ch n t% phép th thay ñ+i màu do thay ñ+i
pH (xem các m c 3.4.1 và 3.6); còn A1073 thì ñư c l#a ch n t% phép th pH (xem m c
3.6).
Các ch t chi t t% d ch nuôi c a ba ch ng này và c a ch ng ñ i ch ng sinh
anthracycline (A16) ñư c g i th nghi m ho t tính gây ñ c t bào t i Phòng Sinh h c
th#c nghi m, Vi n Hóa các h p ch t thiên nhiên, Vi n Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
Quy trình th nghi m, các dòng t bào dùng trong th nghi m ñã ñư c trình bày '
phân phương pháp c a báo cáo này. K t qu! nh n ñư c cho th y c! 4 ch t chi t t% d ch
nuôi các ch ng ñ)u có k t qu! dương tính v i c! 3 dòng t bào ung thư gan (Hep-G2),
ung thư ph+i (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) c a ngư&i (b!ng 3.6).
Ho t tính gây ñ c t bào ung thư ñư c th hi n thông qua ph n trăm t bào s ng
sót và IC50 (trong trư&ng h p này ñư c hi u là n$ng ñ ch t làm ch t 50% t bào). Trong
ñó ch ng A1073 cho ho t tính cao nh t và cao m t cách có nghĩa so v i hai ch ng còn l i
mà chúng tôi l#a ch n th nghi m. Ho t tính c a A1073 tương ñương v i ch ng ñ i
46
ch ng A16. C! ba ch ng ñ)u có hi u qu! gây ñ c cao v i dòng RD – ung thư cơ vân tim.
ði)u thú v là khi sàng l c ho t tính kháng vi sinh v t ki m ñ nh ba ch ng này cũng là các
ch ng th hi n ho t kháng vi sinh v t nhân th t (t c F. oxysporium và C. albicans) khá
cao. V y ph!i chăng có m i liên h gi-a ho t tính kháng vi sinh v t và ho t tính kháng t
bào ung thư? Cho ñ n nay chưa có tài li u nào ñ) c p ñ n m i liên h này.
B ng 3.6. K t qu xác ñ,nh ho#t tính gây ñ'c t bào
TT
M=u
Hep-G2
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
K t lu)n
Dòng t bào
Ph n trăm s ng sót (%)
Ch ng âm (DMSO) 100,0 ± 0,0
Ch ng dương
1,8 ± 0,5
Ch t chi t t% d ch
12,3 ± 0,6
nuôi ch ng A1018
Ch t chi t t% d ch
50,1 ± 0,2
nuôi ch ng A1022
Ch t chi t t% d ch
0,0 ± 0,0
nuôi ch ng A1073
Ch t chi t t% d ch
0,6 ± 0,4
nuôi ch ng A16
Giá tr IC50 (µg/ml)
Ch ng dương
0,310
Ch t chi t t% d ch
4,170
nuôi ch ng A1018
Ch t chi t t% d ch
20,000
nuôi ch ng A1022
Ch t chi t t% d ch
0,510
nuôi ch ng A1073
Ch t chi t t% d ch
0.585
nuôi ch ng A16
Lu
RD
100,0 ± 0,0
1,2 ± 0,1
7,6 ± 0,1
100,0 ± 0,0
0,5 ± 0,0
0,0 ± 0,0
25,1 ± 0,7
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
3,9 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,420
1,440
5,250
0,450
0.545
Âm tính
Dương tính
Dương tính v
3 dòng
Dương tính v
3 dòng
Dương tính v
3 dòng
Dương tính v
3 dòng
0,220 Dương tính
2,700 Dương tính v
3 dòng
0,446 Dương tính v
3 dòng
0,550 Dương tính v
3 dòng
Dương tính v
0.469
3 dòng
i c!
i c!
i c!
i c!
i c!
i c!
i c!
i c!
Ch ng dương: là m t trong nh-ng ch t có kh! năng di t t bào (ellipithine, vinblastine ho c
taxol) pha trong DMSO. Hep-G2: dòng t bào ung thư gan, Lu: dòng t bào ung thư ph+i, RD:
dòng t bào ung thư cơ vân tim. IC50: n$ng ñ ch t làm ch t 50% t bào ung thư.
3.7.2. Phân tích HPLC các h+p ch-t chi t t2 d,ch nuôi c a các ch ng có ho#t tính
kháng t bào ung thư
Sau khi ñã nh n ñư c k t qu! kh! quan kh5ng ñ nh kh! năng gây ñ c t bào ung thư,
các ch ng A1018, A1022 và A1073 ñư c ti p t c nuôi v i th tích l n nh m thu ñư c
nhi)u hơn ch t tan trong ethyl acetate. Các ch t tan này sau ñó ñư c ti n hành s c ký trên
47
HPLC ñ so sánh v i cơ s' d- li u hi n có t i ð i h c T+ng h p Osaka nh m tìm hi u
b!n ch t c a các ch t này. Các ñi)u ki n s c ký ñã ñư c trình bày chi ti t ' ph n phương
pháp (2.2.5.2.b). K t qu! s c ký ñư c t+ng k t trong b!ng 3.7, s c ký ñ$ ñư c trình bày
trong hình 3.8; 3.9 và 3.10.
B ng 3.7. T8ng k t k t qu phân tích HPLC ch-t chi t t2 d,ch nuôi c a 3 ch ng có
ho#t tính gây ñ'c t bào ung thư
M=u
Ch-t chi t t2
d,ch nuôi
ch ng A1018
Ch-t chi t t2
d,ch nuôi
ch ng A1022
Ch-t chi t t2
d,ch nuôi
ch ng A1073
Bư7c sóng
phân tích
(nm)
S lư+ng
ñ:nh
254,4
27
290,16
14
210,8
30
230,16
32
254,4
40
290,16
35
210,8
230,16
40
49
254,4
48
290,16
210,8
47
50
230,16
49
Th i gian
%
thôi m=u c a
ñ:nh chính
(phút)
6.305
9.8890
16.632
46.4839
18.076
11.1244
0.862
15.4892
6.306
29.6140
0.922
19.0729
1.079
67.4264
0.936
36.1242
1.090
51.1499
7.190
16.5334
8.107
30.9796
7.190
16.3111
8.107
24.5976
1.160
34.3541
0.909
13.1443
1.081
21.3425
7.182
18.6807
7.336
11.7642
8.099
25.0185
Không có ñ,nh n+i tr i
1.080
32.9418
7.182
5.4240
8.099
7.2609
23.073
5.9238
1.023
31.0006
7.182
10.1459
8.098
8.1295
23.072
6.0938
[ñ,nh chính ñư c hi u là ñ,nh chi m % cao so v i t+ng di n tích s c ký ñ$ ho c ñ,nh có ñ cao
(mAU-mili ñơn v h p th ) khác bi t ñáng k so v i các ñ,nh thu ñư c sau s c ký]
48
Hình 3.8. S c ký ñ> HPLC ch-t chi t t2 d,ch nuôi ch ng A1018
49
Hình 3.9. S c ký ñ> HPLC ch-t chi t t2 d,ch nuôi ch ng A1022
50
Hình 3.10. S c ký ñ> HPLC ch-t chi t t2 d,ch nuôi ch ng A1073
51
Qua phân tích k t qu! bư c ñ u có th nh n th y như sau:
-
V i m(u A1018: có th g$m 8 ch t khác nhau v i th&i gian (phút) thôi ra là 0.862,
0.922, 0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076
-
V i m(u A1022: có th g$m 5 ch t khác nhau v i th&i gian (phút) thôi ra là 0.909,
1.081, 1.160, 7.190 và 8.107
-
V i m(u A1073: có th g$m 6 ch t khác nhau v i th&i gian (phút) thôi ra là 1.023;
1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073
Hi n nay vi c so sánh v i cơ s' d# li u các ch t có ho t tính sinh h c ñang ñư c ti n
hành t i Phòng thí nghi m Vi sinh v t phân t , Trung tâm Công ngh sinh h c qu c t
(International Centre of Biotechnology-ICBiotech), ð i h c T+ng h p Osaka, Nh t B!n.
52
K T LU N
T% k t qu! thu ñư c, chúng tôi rút ra m t s k t lu n sau:
1. 424 ch ng x khu n ñã ñư c phân l p t i Vư&n Qu c gia Cát Bà v i 353 ch ng
(83.25%) t% ñ t và 71 ch ng (16.75%) t% m(u lá cây m c.
2. G n 70% s ch ng phân l p ñư c thu c chi Streptomyces, ph n còn l i thu c v) 10 chi
x khu n hi m trong ñó hơn 6% thu c chi Micromonospora và 4% thu c chi
Nonomuraea.
3. B ng sơ b sàng l c, 115 ch ng (chi m hơn 27% s ch ng phân l p ñư c) có ho t tính
kháng ít nh t m t trong b n ch ng vi sinh v t ki m ñ nh.
4. Trong 115 ch ng có ho t tính kháng sinh, 17 ch ng có ho t tính cao và kháng ít nh t
hai trong b n vi sinh v t ki m ñ nh. Các ch ng này thu c hai chi Streptomyces (10
ch ng) và Nonomuraea (7 ch ng). B ng phân tích quan h di truy)n, 7 ch ng thu c
chi Nonomuraea có th x p vào 5 nhóm.
5. Hi u qu! chi t ch t tan trong ethyl acetate (t% 1 lít d ch nuôi c y) dao ñ ng t% 30mg
(ch ng A154) ñ n 2152mg (ch ng A444). So v i ch t khô thì ch t chi t ñư c chi m
t% 0,51% (ch ng A154) ñ n 14,89% (ch ng A396).
6. Qua phân tích TLC, ch ng A396 có hai băng có cùng ñ di ñ ng tương ñ i v i
chloramphenicol; các ch ng A45 và A410 (m/i ch ng m t băng) có băng có cùng ñ
di ñ ng tương ñ i v i các băng c a erythromycin. Không có m(u nào có băng tương
ñ$ng v i kitasamycin. Hai ch ng A1018 và A1022 có ph+ TLC tương ñ i g n v i
ph+ TLC c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline.
7. Qua phân tích HPLC ch t chi t t% 17 ch ng nghiên c u, v i cùng m t ñi)u ki n s c ký
ch ng A396 cho m t ñ,nh có th&i gian thôi tương
chloramphenicol.
ng v i kháng sinh
8. Hai ch ng A1018 và A1073 có ph!n ng tương t# khi có pH thay ñ+i ñ c trưng cho vi
sinh v t sinh kháng sinh thu c nhóm anthracycline.
9. Ch t chi t t% d ch nuôi c a ba ch ng A1022, A1018 và A1073 có tác d ng gây ñ c
cho ba dòng t bào ung thư (gan, ph+i và cơ vân tim) trong ñó A1073 có ho t tính cao
nh t.
10. Qua HPLC, v i cùng m t ñi)u ki n phân tích, ch t tan trong ethyl acetate c a d ch
nuôi t% ch ng A1018 tách thành 8 ñ,nh v i th&i gian (phút) thôi ra là 0.862, 0.922,
53
0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076; t% ch ng A1022 tách thành 5 ñ,nh v i
th&i gian (phút) thôi ra là 0.909, 1.081, 1.160, 7.190 và 8.107; t% ch ng A1073 tách
thành 6 ñ,nh có th&i gian (phút) thôi là 1.023; 1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073.
KI N NGH1
ð ti p t c hư ng nghiên c u này m t s ñ nh hư ng c n ti p t c:
- Xác ñ nh ñ,nh có ho t tính sau s c ký
- Nghiên c u tinh s ch ch t có ho t tính
- Nghiên c u c u trúc hóa h c c a ch t có ho t tính sau khi ñã tinh s ch
54
TÀI LI U THAM KH O
Ti ng Vi t
1. Ki u H u
nh, Ph#m Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Th, Vi t Hà, Nguy?n Thanh
Huy n, 2003. Tách chi t ch t kháng sinh t% ch ng x
khu n Streptomyces
hygroscopicus TC-54 có ho t tính cao ch ng n m gây b nh, T p chí Sinh h c, t p
25-s 2A, trang 85-91
2. Vi Th, ðoan Chính (2000), Nghiên c u kh! năng nâng cao ho t tính kháng sinh c a
ch ng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 b ng k. thu t
dung h p t bào tr n, Lu n án TS sinh h c, Vi n công ngh sinh h c, Hà N i.
3. Bùi Th, Vi t Hà, Lê Gia Hy, Ki u H u
nh, 1998. T i ưu hóa môi trư&ng nuôi c y
x khu n Streptomyces sp. TC54 sinh ch t kháng sinh, T p chí Khoa h c và Công
ngh , XXXVI, 6B, tr.155-159
4. Bùi Th, Vi t Hà, ðào Duy ð#t, Ki u H u
nh, 2004. Phân l p và tuy n ch n x
khu n sinh ch t kháng sinh ch ng n m gây b nh th#c v t, T p chí Khoa h c, T. XX,
No2AP., tr103-107
5. Bùi Th, Vi t Hà, Nguy?n Thanh Huy n, ðinh Xuân Tu-n, Ki u H u nh, 2004.
Nghiên c u kh! năng sinh ch t kháng sinh ch ng n m gây b nh th#c v t ' 2 ch ng x
khu n T41, D42, T p chí Di truy)n và ;ng d ng, tr 50-55, T-4
6. Bùi Vi t Hà, 2005. Study on Streptomyces hygroscopicus for control of
phytopathogenic fungi. VNU, J. Scien Nat Tech, T.XXI, N04AP.
7. L#i Thúy Hi n, Nguy?n Th, L+i, Lê Gia Hy, Ki u H u
nh, 1998. ð c ñi m phân
lo i và kh! năng s d ng d u m" c a m t s ch ng x khu n phân l p t% nhiên li u
JET-A1 ' Vi t Nam, T p chí Khoa h c và Công ngh , XXXVI, 6B, tr.64-69
8. Nguy?n Phú Hùng, Li?u Th, Phương, Nguy?n Th, Yên, Tr,nh Ng*c Hoàng, Vi
Th, ðoan Chính, 2009. Tuy n ch n và ñ nh lo i m t s ch ng x khu n có kh! năng
ñ i kháng vi sinh v t gây nhi m trùng b nh vi n. T p chí Y h c Th#c hành, s 2, 82009, tr.81-85.
9. Lê Gia Hy, Ph#m Kim Dung, Nguy?n H>ng Hà, Vũ Th, Nhung, Ph#m Th, Bích
H+p, Ph#m Minh Hương, Ngô ðình Bính, 1992. Tính ñ i kháng c a x khu n phân
l p t% ñ t Vi t Nam ñ i v i b nh ñ o ôn. T p chí Sinh h c, t p 14, s 4, tr.11 - 12.
55
10. Lê Gia Hy, Ph#m Th, Bích H+p, Ngô ðình Bính, 1992. Nghiên c u kh! năng sinh
ch t kháng sinh ch ng n m gây b nh ñ o ôn c a m t s ch ng x khu n
(Streptomyces) phân l p ' Vi t Nam. T p chí Sinh h c, t p 14, s 4, tr. 59-63.
11. Lê Gia Hy, Ph#m Kim Dung, Ph#m Th, Bích H+p, Ngô ðình Bính, 1994. 8nh
hư'ng c a môi trư&ng lên men lên kh! năng sinh t+ng h p kháng sinh ch ng n m gây
b nh th#c v t c a ch ng x khu n 5820. T p chí Sinh h c, t p 16, s 2, tr. 44 - 48.
12. Lê Gia Hy, Ph#m Th, Bích H+p, 2004. ;ng d ng công ngh sinh h c trong nghiên
c u s!n xu t kháng sinh nhóm b-lactam. Báo cáo khoa h c H i ngh khoa h c toàn
qu c: Nh-ng v n ñ) nghiên c u cơ b!n trong khoa h c s# s ng ñ nh hư ng y dư c
h c. Nxb KH&KT, Hà N i, tr. 246-251.
13. Lê Gia Hy, Nguy?n Phương Nhu , Phan Th, H>ng Th o, Ph#m Th, Bích H+p,
2005. Nghiên c u nâng cao hi u su t sinh t+ng h p kháng sinh c a ch ng
Streptomyces orientalis 4912. Báo cáo khoa h c H i ngh toàn qu c 2005: Nh-ng v n
ñ) nghiên c u cơ b!n trong khoa h c s# s ng, Nxb Khoa h c và K. thu t Hà N i, tr.
574-577.
14. Bi n Văn Minh và c'ng s , 2000. Tìm hi u kh! năng sinh kháng sinh và ñ c ñi m
phân lo i c a m t s ch ng Micromonospora phân l p t% ñ t Bình Tr Thiên. T p
chí Khoa h c, ð i h c Hu s 2, 2000, tr: 24 28.
15. Bi n Văn Minh và c'ng s , 2000. Kh!o sát x khu n sinh kháng sinh thu c chi
Micromonospora t% ñ t bùn Th%a Thiên Hu . T p chí Khoa h c và Công ngh s
1(38), 2000, tr: 18 - 21.
16. Bi n Văn Minh và c'ng s , 2003. M t s tính ch t lý hoá c a ch t kháng sinh M101
ch ng vi n m chi t xu t t% Streptomyces craterifer S1. T p chí khoa h c, Trư&ng
ðHSP Hà N i s 4, 2003, tr: 91- 93.
17. Bi n Văn Minh và c'ng s , 2003. Kh!o sát x khu n sinh kháng sinh thu c chi
Micromonospora t% ñ t bùn ' Bình Tr Thiên. Báo cáo khoa h c H i ngh toàn qu c
l n th 2, NCCB trong Sinh h c, Nông nghi p, Y dư c, Hu , 25- 26/07/2003, tr: 177
- 179.
18. Bi n Văn Minh và c'ng s , 2004. Phân l p ch ng x khu n sinh kháng sinh t% m t
s m(u ñ t bùn ' Th%a Thiên Hu . Báo cáo khoa h c H i ngh toàn qu c 2004,
NCCB trong khoa h c s# s ng. ð nh hư ng Nông Lâm nghi p mi)n núi, Thái
Nguyên 23/09/2004, tr: 822 - 824.
56
Ti ng Anh
1. Alex Y.l.T., Hai M.T. (2006), Microbial Biotechnology (2nd edition) Principles and
Applications, World scientific, pp. 3 – 23.
2. Arnold L.D., Sergio S. (2009), “Microbial drug discovery: 80 years of progress”, J.
Antibiotics, 62, pp. 5–16.
3. Ashutosh K. (2008), Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd,
pp. 89 – 101.
4. Burdick M.D., Harris A., Reid C.J., Iwamura T., Hollingsworth M.A. (1997).
Oligosaccharides expressed on MUC1 by pancreatic and colon tumour cell lines,
J.Biol. Chem. 272, 24198-24202.
5. Carlo O., Carmen M., Jose A.S. (2009), “Antitumor compounds from marine
actinomycetes”, Marine Drugs, 97, pp. 210 – 248.
6. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F. (2005), “Arthrobacter ardleyensis sp.
nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment”, Arch Microbiol,
183, pp. 301-305.
7. Creighton T.E. (1999), The encyclopedia of molecular biology, Vol 1-4, John Wiley
& Sons, Inc, pp. 771 – 779.
8. Cruciani R.A., Barker J.L., Zasloff M, Chen H.C., Colamonici O. (1991)
Antibiotic magainins exert cutolitic activity against transformed cell lines through
channel formation. Proc. Natl. Acad. Sci., 3792-3796
9. Dobrzanska J., Szachowicz-Petelska, Sulkowski S., Figaszewski. (2005). Changes
in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells.
Mol. Cell. Biochem. 276, 113-119
10. Duong V.H., Ando K. (2010), Taxonomic and ecological studies of microorganisms
in Vietnam and the utilization, Joint research project between IMBT-VNU and NITEDOB, Japan, final report, March 2010, pp. 315 – 358.
11. Dutia, Pankaj (2004). "Ethyl Acetate: A Techno-Commercial Profile" (PDF).
Chemical
Weekly:
http://www.chemicalweekly.com/Profiles/Ethyl_Acetate.pdf#page=6.
184.
Retrieved
2009-03-21
57
12. Eyassu H.G. (2002), “Antimicrobial resistance: A global public health threat”, J. Erit.
Med. Assoc. Jema, pp. 36 – 40.
13. Felsenstein J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the
bootstrap”, Evolution, 39, pp. 783–791.
14. Fred C. Tenover (2006), “Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria”, Amer.
J. Med, 119, pp. 3–10.
15. Gernot V. (1997), Morphology of actinomycetes, In Miyadoh S., Hamada M., Hotta
K., Kudo T., Seino T. et al (eds), Atlas of Actinomycetes, Asakura, Tokyo, pp. 180191.
16. Gewirtz D.A. (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for
the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”,
Biochem Pharmacol, 57, pp. 727 – 741.
17. Goodfellow M., Williams S.T., Mordarski M. (1988), Actinomycetes in
biotechnology, Academic Press, London, pp. 1 – 32.
18. Goodfellow M., Davenport R., Stainsby F.M., Curtis T.P. (1996), “Actinomycete
diversity associated with foaming in activated sludge plants”, J. Ind. Microbiol.
Biotechnol, 17, pp. 268-280.
19. Guoliang Yin, Weimin Wang, Sha Sha, Lei Liu and Xiaoping Yu (2010),
“Inhibition and control effects of the ethyl acetate extract of Trichoderma harzianum
fermented broth against Botrytis cinerea”. African Journal of Microbiology Research
Vol. 4(15), pp. 1647-1653.
20. Hayakawa M., Otoguro M., Takeuchi T., Yamazaki T., Iimura Y. (2000),
“Application of method incorporating differential centrifugation for selective
isolation of motile actinomycetes in soil and plant litter”, Antonie Van Leeuwenhoek,
78, pp. 171 – 185.
21. Horie M., Saito K., Nakazama H. (1996), “Determination of kitasamycin and
josamycin in meat by HPLC”, Japan Analyst, 45, pp. 1089 – 1094.
22. Hopwood A. D. (2007), Streptomyces in nature and medicine, the antibiotics maker,
Oxford University Press, pp. 28 – 50.
23. Hoskin DW, Ramamoorthy A. (2008). Studies on anticancer activities of
antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 1778(2), 357-75.
58
24. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang
C.L. (2004), “Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete
isolated from desert soil in Egypt”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252.
25. Ichikawa T., Date M., Ishikura T., Ozaki A. (1971), “Improvement of kasugamycinproducing strain by the agar piece method and the prototroph method”, Folia
Microbiol, 16, pp. 218 – 224.
26. Irena C. (2010), Encyclopedia of chromatography 3rd Edition, CRC Press, pp. 89 –
95.
27. Jeffrey R.K. (1978), “High-Performance Liquid Chromatographyic assay of
chloramphenicol in serum”, Antimicrob Agent Chemother, 14, pp. 439 – 443.
28. Kristof M. (2009), PhD thesis: Quantitative liquid chromatographic analysis of
anthracyclines in biological fluids, Ghent University, Belgium.
29. Leo M.L.N. (2000), Food analysis by HPLC 2nd Ed, Marcel Dekker, New York, pp.
649 – 653.
30. Likhiwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G. and
Ruangrungsi, N., 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the bulbs of
Crinum amabile. Journal of Natural Products 56 8, pp. 1331–1338.
31. Mason M.G., Ball A.S., Reeder B.J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M.T. (2001),
“Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity”, Appl
Environ Microbiol, 67, pp. 4512-4519.
32. Marmur J. (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from
micro-organisms”, J Mol Biol, 3, pp. 208-218.
33. Margaret A. R., Milind A. C. (2007), Bacteriocins: ecology and evolution, Springer,
Berlin Heidelberg New York, pp. 1-5.
34. Matook S. M., Fumio H. (2005), “Antibacterial and antioxidant activities of banana
(Musa, AAA cv. Cavendish) fruits peel”, Amer J Biochem Biotech, 1, pp. 125-131.
35. Miyadoh S., Hamada M., Hotta K., Kudo T., Seino T. (1997), Atlas of
Actinomycete, The Society for Actinomycetes Japan, Asakura Co, pp. 2 – 10.
36. Miyadoh S., Hotta K., Kudo T., Seino A., Suzuki K., Yokota A. (2001),
Identification Manual of Actinomycetes, The Society for Actinomycetes Japan,
Business Center for Acedamic Societies Japan, pp. 2 – 28.
59
37. Nduka O. (2007), Modern Industrial Microbiology and Biotechnology, Science,
Enfield, USA, pp. 429 – 453.
38. Newman D. J., Cragg G. M., and Snader K. M. (2003), Natural Products as
Sources of New Drugs over the Period 1981-2002, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037.
39. Nonomura H., Ohara Y. (1969), “Distribution of actinomycetes in soil. VI. A culture
method effective for broth preferential isolation and enumeration of Mircobispora
and Streptosporangium strains in soil (Part 1)”, J Ferment Technol, 47, pp. 463 – 469.
40. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L. (1990), “Lignin-solubilizing
ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt”, Appl Environ
Microbiol, pp. 2213-2218.
41. Saga T., Yamaguchi K. (2008), “History of antimicrobial agents and resistant
bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 – 517.
42. Saito H., Miura K. (1963), “Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by
phenol treatment”, Biochim. Biophys. Acta, 72, pp. 619–629.
43. Saitou N., Nei M. (1987), “The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4, pp. 406 – 425.
44. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M.
(1999), “Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge
foam”, J Microbiol, 37, pp. 66-72.
45. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren
J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R. (1990), “New colorimetric cytotoxicity
assay for anticancer-drug screening”, J. Nat Cancer Inst, 82, pp. 1107-1112.
46. Steger K. (2006), PhD. Thesis: Composition of microbial communities in composts. A
tool to assess process development and quality of the final product. Swedish
University of Agricultural Sciences, Uppsala.
47. Stuart H. (2005), Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp. 191
– 369.
48. Stubbs C., Haigh J. M., Kanfer I. (1985), “Determination of erythromycin in serum
and urine by HPLC with ultraviolet”, J Pharm Sci, 74, pp. 1126-1128.
60
49. Thomson C.J., Bialphos S.H. (1995), Genetics and Biochemistry of antibiotic
production. L.C. Vining, C. Stuttard (eds), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 197
– 222.
50. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. (1997),
“The CLUSTAL X Windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools”, Nucleic Acids Res, 25, pp. 4876–4882.
51. Tomoo S., Keizo Y. (2009), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J
Japan Med Assoc, 52, pp. 103 – 108.
52. Tortora J. G., Funke R. B., Case L. C. (2010), Microbiology – An Introduction, 10th
ed, Pearson Education, Inc, pp. 553 – 583.
53. Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy. 14th ed. Bailliere
Tindall Ltd, London, pp. 832.
54. Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F. (1979),
“Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid
ionophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J. Antibiot, 32, pp.
100-107.
55. Young S.R., Wan J.K., Dong J.Y., Heun S.K., Soon R.C. (2001), “Synthesis and
antitumor activity of new anthracycline analogues”, Bull. Korean Chem. Soc, Vol. 22,
9, pp. 963 – 968.
56. http://science.howstuffworks.com/question479.htm
61
PH L C
Ph l c 1. Thành ph6n các môi trư ng nuôi c-y
1. Môi trư ng Mueller – Hinton (MHA)
- Cao th t
3g
- Casein th y phân 17,5 g
- Tinh b t
- Th ch
1,5 g
17 g
- Nư c c t
- pH
1 lít
7,4
2. Môi trư ng tinh b't-cao n-m men
- Glucose
10 g
- Cao n m men
2g
- Th ch
17 g
- Nư c c t
- pH
1 lít
7,0
3. Môi trư ng dinh dưAng ñ)u tương
- Tinh b t
25 g
- ð u tương
15 g
- Cao n m men
1g
- CaCO3
4g
- Nư c c t
- pH
1 lít
6,2
4. Môi trư ng cao malt- n-m men
- Cao malt
3g
- Cao n m men
3g
- Glucose
10 g
- Pepton
- Th ch
- Nư c c t
5g
17 g
1 lít
5. Môi trư ng th#ch vitamin-acid humic
- Acid humic
1g
- CaCO3
0,02 g
- FeSO4.7H2O 0,01 g
- KCl
1,71 g
62
- MgSO4.7H2O
- Na2HPO4
0,05 g
0,5 g
- Cycloheximide
- Nalidixic acid
50 mg
20 mg
- Kabicidine
14 mg
- Th ch
14 g
- pH
7,2
63
Ph l c 2. Trình t các gene rDNA 16S c a 7 ch ng thu'c chi Nonomuraea
>A0045 Contig1, 1495 bases
TTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTC
GGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCG
GGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCCCCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTT
GGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCC
GGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
GGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGG
TTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTG
CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGG
TGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTA
GAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACC
GGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA
TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTG
CCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTG
ACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGT
TTGACATCACCCGGAAACGCTCAGAGATGGGCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTG
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCA
GCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGAT
GACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTG
CGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACC
CCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT
ACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGG
GAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCG
GCT
>A0149 Contig1, 1436 bases
TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACA
CGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCC
CCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGT
GGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACT
GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGAC
GCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGAC
GTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGC
GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAG
CTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTG
TAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGA
CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTG
GGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGG
AGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGC
TTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGCCTGGAGACAGGCG
CCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT
CCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGG
GACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGC
TGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGC
CGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATC
AGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAA
CACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACG
AAGTCGTAAC
>A0154 Contig1, 1476 bases
CATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCA
ACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACGTTCTGTCGCAT
GACATGAACGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGT
GGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGAC
GCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCT
64
GCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCG
GAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTG
CGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG
AAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGG
AGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAG
GTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGC
CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGA
CGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCTCTTCGG
ACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC
GAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCTACGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCG
GGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACA
TGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAGCCGTGAGGCGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCA
GTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGC
TGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAA
GCCCGTGGGCCAACCCCCAAGGGGGGGAGAGGGCGAAAGTGGGGCTGGCGATTGTGACAAAATCGTA
ACAAGGTAGCCGTACCGCAAAGTGCGGCTGGATCACCTCCTTATAAAGGAGC
>A0160 Contig1, 1440 bases,
TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACA
CGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCC
TCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTG
GGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACG
CAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACG
TGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGT
TGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCT
TAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTA
GCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACG
CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGG
GCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGA
GTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCT
TAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGGTCCAGAGATAGGCCT
TCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGG
GGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGG
CTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAG
CCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATC
AGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAA
CACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGA
CGAAGTCGTAACAA
>A0232 Contig1, 1441 bases
GCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTA
ACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACA
CACCCCGGCATCGGGTGTGTGTGGAAAGTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTG
GTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTG
ACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTG
ACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAA
GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGC
AGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGCAGGGGCAAGTGGAATTCCTGG
TGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCT
GACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACG
TTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTG
GGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGT
TGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGGCCAGAGATGG
TCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA
AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATG
65
GGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTG
GGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTAA
AAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCA
GATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCG
GCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATT
GGGACGAAGTCGTAACAA
>A0396 Contig1, 1432 bases
TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACA
CGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCC
TCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTG
GGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACG
CAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACG
TGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGT
TGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCT
TAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTA
GCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACG
CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGG
GCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGA
GTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCT
TAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGCCTCAGAGATGGGGCT
TCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGG
GGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGG
CTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAG
CCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATC
AGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAA
CACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGA
CGAAGT
>A0444 Contig1, 1496 bases
GTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCT
TCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCC
CGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGT
TGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGC
CGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG
TGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGG
GTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGT
GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAG
GTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCT
AGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACAC
CGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGT
GCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATT
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAG
GTTTGACATCACCCGGACCGGTCTAGAGATAGGCCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGG
CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTG
CCAGCAACACTTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGG
ATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGT
TGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGA
CCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT
GTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGG
GGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGT
GCG
66
Ph l c 3. K t qu phân tích HPLC ch-t chi t t2 d,ch nuôi các ch ng ch*n l*c ñư+c
v7i các ñi u ki n tương %ng v7i các kháng sinh chu$n
67
Ph l c 4. B n sao k t qu th3 nghi m gây ñ'c t bào
68
Ph l c 5. K t qu phân tích HPLC ch-t chi t thu ñư+c t2 d,ch nuôi c a ba ch ng
có ho#t tính kháng t bào ung thư ngư i
69
S N PHBM CCA ð TÀI
Bài báo
•
Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam.
T p chí Công ngh sinh h c (ñã nh n ñăng).
•
Bư c ñ u nghiên c u sàng l c kháng sinh ch ng ung thư t% x khu n thu th p ' vư&n
Qu c gia Cát Bà, T p chí Khoa h c và Công ngh , ð i h c Qu c gia Hà N i (ñã nh n
ñăng).
ðào t#o
ð) tài ñã góp ph n ñào t o 01 Th c s. chuyên ngành công ngh sinh h c thu c chương trình ñào
t o liên k t qu c t v i ð i h c Liege, Vương qu c B, v i tên ñ) tài là: “Biodiversity and
antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam”. H c viên Nguy n
Phương Chung ñã b!o v thành công lu n văn v i k t qu! xu t s c trư c H i ñ$ng ngày 24 tháng
2 năm 2011.
70
PHI U ðĂNG KÝ
K T QU NGHIÊN C(U ð TÀI KHCN
Tên ñ tài:
Mã s :
ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi
sinh v t và kháng dòng t bào ung thư t x khu n
QG.09.48
Cơ quan qu n lý ñ tài: ð i h c Qu c gia Hà N i
ð a ch,:
ði n tho i:
144 ñư&ng Xuân Th y, C u Gi y – Hà N i
37 54 86 64
Cơ quan ch trì ñ tài: Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c, ðHQGHN
ð a ch,:
Nhà E2, 144 Xuân Th y, C u Gi y – Hà N i
ði n tho i:
37547407
100.000.000 ñ
T8ng chi phí th c chi:
Trong ñó:
− T% ngân sách NN: 100%
− Ngu$n khác:
không có
Th i gian nghiên c%u: 2 năm
− Th&i gian b t ñ u: 3/2009
− Th&i gian k t thúc: 3/2011
Tên các cán b' ph i h+p nghiên c%u:
− Ch trì ñ) tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên
− Cán b tham gia: TS. Nguy n Quỳnh Uy n
S ñăng ký ñ) tài
-
TS. ðinh Thúy H ng
-
CN. Lê Phương Chung
-
ThS. Phan Th Hà
-
CN. Lê H$ng Anh
S ch ng nh n ñăng ký KQNC
B!o m t
A. Ph+ bi n r ng rãi
Ngày
Ngày
Tóm t t ý nghĩa, k t qu nghiên c%u:
- 424 ch ng x khu n (g$m 353 ch ng t% m(u ñ t và 71 ch ng t% m(u lá cây m c) thu
th p t i vư&n Qu c gia ñã ñư c phân lo i.
71
- 424 ch ng x khu n ñã ñư c sàng l c ho t tính kháng sinh v i 4 vi sinh v t ki m ñ nh
cho th y trong ñó có 115 ch ng bi u hi n ho t tính kháng ít nh t m t trong b n vi sinh
v t ki m ñ nh.
- V i 115 ch ng có ho t tính này có 2 ch ng (A1073, A1393) kháng c! 4 ch ng vi sinh
v t ki m ñ nh, 7 ch ng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng v i 3 ch ng ki m ñ nh, 8 ch ng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có ho t tính kháng 2 vi sinh v t ki m ñ nh. Xét v) ñ i tư ng b kháng thì 14
ch ng có ho t tính kìm hãm vi khu n Gram âm (E. coli), 14 ch ng kìm hãm vi khu n
Gram dương (M. luteus); 11 ch ng có ho t tính kháng c! hai nhóm vi khu n; 12 ch ng
có ho t tính kháng n m s i (F. oxysporium) và ch, 6 ch ng có ho t tính kháng n m
men (C. albicans). Như v y t+ng c ng có 17 ch ng có ho t tính kháng ít nh t 2 vi sinh
v t ki m ñ nh ñã ñư c l#a ch n cho các nghiên c u ti p theo.
- 17 ch ng ñã ñư c nuôi c y thu d ch nuôi và d ch nuôi ñã ñư c chi t b ng ethyl acetate
ñ thu các h p ch t có ho t tính sinh h c. Hi u qu! chi t ch t tan trong ethyl acetate
(t% 1 lít d ch nuôi c y) dao ñ ng t% 30mg (ch ng A154) ñ n 2152mg (ch ng A444).
So v i ch t khô thì ch t chi t ñư c chi m t% 0,51% (ch ng A154) ñ n 14,89% (ch ng
A396).
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 17 ch ng x khu n ñã ñư c phân tích
s c ký b!n m"ng (TCL) ñ so sánh v i ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và v i d ch nuôi c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline (A16). S băng
thu ñư c sau s c ký dao ñ ng t% 1 ñ n 4 băng. Có 8 ch ng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) ch, cho 1 băng, 3 ch ng (A396, A444, A1018) cho ph+
có 2 băng, 4 ch ng (A45, A1041, A1043, A1470) cho ph+ 3 băng và 2 ch ng (A390,
A1022) cho ph+ 4 băng. So v i các kháng sinh chu n thì th y ch t chi t t% d ch nuôi
c a ch ng A396 là có băng tương ng v i chloramphenicol; ch t chi t t% d ch nuôi
ch ng A45 và A410 có băng trùng v i băng c a erythromycin, không có m(u nào có
băng tương ñ$ng v i các băng c a kháng sinh kitasamycin. So v i d ch nuôi c a
ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline, các m(u A1018 và A1022 có ph+ s c ký r t g n
v i ñ i ch ng này.
- Các ch t tan trong ethyl acetate c a 17 ch ng l#a ch n ñư c phân tích qua s c ký l"ng
hi u năng cao (HPLC) v i các ñi)u ki n s c ký như v i các kháng sinh chu n cho th y
ngoài ch ng A396 có ñ,nh tương t# v i ñ,nh thu ñư c t% chloramphenicol, t t c! các
m(u còn l i không tìm th y m i tương quan nào so v i các kháng sinh ñ i ch ng.
72
- B ng phép th ñ c hi u (ñ+i màu theo pH) v i các ch ng sinh kháng sinh thu c nhóm
anthracycline nh n th y có hai ch ng có bi u hi n dương tính v i phép th này là
A1018 và A1073.
- 3 ch ng ñư c l#a ch n th nghi m ho t tính gây ñ c t bào ung thư ngư&i là A1018
(có ph+ TLC và ph!n ng ñ+i màu pH tương t# ch ng ñ i ch ng), A1022 (có ph+
TLC tương t# ñ i ch ng) và A1073 (ph!n ng ñ+i màu pH). B ng th nghi m v i ba
dòng t bào ung thư ngư&i là ung thư gan, ph+i và cơ vân tim, các h p ch t chi t t%
d ch nuôi c a c! ba ch ng ch n l c ñư c c a ñ) tài ñ)u có tác d ng dương tính v i c!
ba dòng t bào ung thư. So sánh v) ch, s IC50 (n$ng ñ gây ch t 50% t bào ung thư,
t c ch, s này càng nh" thì hi u qu! gây ñ c t bào càng l n) thì th y trong ba m(u
nghiên c u ch t chi t t% d ch chi t c a ch ng A1073 có ch, s này th p nh t và th p
g n b ng ñ i ch ng dương (m t trong nh-ng ch t có kh! năng di t t bào) c a phép
th ; th p b ng so v i ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline và th p hơn ñáng k so v i
hai ch ng còn l i.
- Ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 3 ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư
nói trên ñã ñư c phân tích HPLC v i cùng m t ñi)u ki n s c ký v i các ñ i tư ng
tương t# hi n ñang ñư c th#c hi n t i Phòng thí nghi m Vi sinh v t h c phân t ,
Trung tâm công ngh sinh h c qu c t , ð i h c T+ng h p Osaka. Qua phân tích k t
qu! sau s c ký các ch t chi t ñư c t% d ch nuôi ch ng A1018 cho 8 ñ,nh khác nhau, t%
ch ng A1022 cho 5 ñ,nh khác nhau và ch ng A1073 cho 6 ñ,nh khác nhau. Các dli u liên quan hi n ñang ñư c so sánh phân tích v i cơ s' d- li u hi n có t i cơ s' nói
trên nh m tìm ki m b!n ch t c a các ch t ñó.
- ðã ñào t o ñư c 01 th c s. Công ngh sinh h c thu c chương trình ñào t o liên k t
qu c t .
- 02 bài báo ñã ñư c t p chí Công ngh sinh h c và t p chí Khoa h c ð i h c Qu c gia
Hà N i nh n ñăng.
Ki n ngh, v qui mô và ñ i tư+ng áp d ng k t qu nghiên c%u:
- Nghiên c u b!n ch t/c u trúc hóa h c c a các ch t quy t ñ nh ho t tính sinh h c
- Sàng l c các ñ i tư ng thu th p t i các ñ a danh khác c a Vi t Nam nh m tìm ki m
thêm các ngu$n gene quý giá
-
Xây d#ng cơ s' d- li u s d ng trong phân tích các ch t kháng sinh b ng phương
pháp HPLC
73
Ch c v
Ch nhi m ñ)
Th trư'ng cơ
quan ch trì ñ)
Ch t ch h i ñ$ng
ñánh giá chính
Th trư'ng cơ
quan qu!n lý ñ)
tài
tài
th c
tài
H và tên
Nguy n Huỳnh Dương Văn H p
Minh Quyên
Ph m Th
Châu
H cv
TS
GS. TSKH.
TS
Trân
Ký tên
ðóng d u
74
winny phạm