Professional Documents
Culture Documents
Số tiết: 3
Nội dung
I. Đột biến gene
Đột biến gene là những biến đổi xảy ra bên trong cấu trúc gene. Mỗi đột biến gene
dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotide tạo ra các allele khác nhau. Đột biến gene có thể
xảy ra do biến đổi của trình tự nucleotide trong gene. Đột biến gene không phát hiện
được khi quan sát tế bào học.
Trong tự nhiên, tất cả các gene đều có đột biến được gọi là đột biến tự nhiên hay
ngẫu phát (spontaneous mutation). Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít.
Mức độ ảnh hưởng của đột biến nhầm nghĩa và vô nghĩa lên chuỗi polypeptide khác
nhau tùy trường hợp.
Nếu đột biến nhầm nghĩa thay thế một acid amin này bằng một acid amin khác tương
tự về mặt hóa học, được xem là đột biến thay thế bảo thủ (conservative substitution). Sự
thay đổi này hầu như ít ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng protein. Ngược lại, nếu thay
thế bằng một acid amin khác về phương diện hóa học gọi là nonconservative substitution,
hầu hết đều gây ra sự thay đổi lớn ở cấu trúc và chức năng protein.
Đột biến vô nghĩa sẽ dẫn đến sự kết thúc dịch mã sớm. Vì vậy chúng gây ra hậu quả
tương ứng trên chức năng protein. Nếu đột biến vô nghĩa xảy ra càng ở gần đầu 3' của
khung đọc mã, kết quả ít ảnh hưởng đến protein. Tuy nhiên nhiều đột biến vô nghĩa ở
vùng này vẫn tạo ra các sản phẩm hoàn toàn bị mất hoạt tính.
Hình 12.1 Hậu quả của đột biến điểm trong gene. Codon 1-4
nằm trong vùng mã hóa của gene
Giống với đột biến vô nghĩa, đột biến thêm bớt base gây hậu quả trên trình tự
polypetide kể từ điểm bị đột biến (Hình 12.1). Trình tự trên mRNA được đọc theo từng
khung gồm ba base (codon) một lúc. Mất hoặc thêm base sẽ làm thay đổi khung đọc
trong quá trình dịch mã từ điểm bị đột biến cho đến kết thúc theo khung mới. Vì vậy loại
đột biến này được gọi là đột biến dịch khung (frameshift mutations). Đột biến này tạo ra
trình tự acid amin kể từ điểm bị đột biến cho đến kết thúc khác với trình tự acid amin
gốc. Đột biến dịch khung gây ra sự mất hoàn toán cấu trúc và chức năng của protein bình
thường.
Trường hợp đột biến xảy ra ở trình tự điều hòa và các trình tự không mã hóa khác
(Hình 12.1). Những phần đó của gene không trực tiếp mã hóa cho protein mà chứa nhiều
điểm bám DNA chủ yếu cho protein xen vào, đó là những trình tự không nhạy cảm cho
sự biểu hiện của gene hoặc cho hoạt tính của gene.
Ở mức độ DNA, những điểm mất đi (docking) gồm những điểm mà RNA
polymerase và những nhân tố gắn kết của nó bám vào, cũng như những điểm mà protein
điều hòa phiên mã đặc trưng gắn vào. Ở mức độ RNA, những docking quan trọng thêm
vào gồm điểm bám của ribosom (ribosome-binding site) trên mRNA vi khuẩn, những
điểm nối đầu 5' và 3' để gắn các exon ở eukaryote và các điểm có vai trò cho điều hòa
dịch mã và định vị mRNA đến vùng đặc biệt trong tế bào. Nhìn chung hậu quả chức năng
của bất kì đột biến điểm nào ở vùng như thế đều phụ thuộc vào việc làm gián đoạn (hoặc
tạo ra) một điểm bám. Đột biến làm gián đoạn ở những điểm đó có khả năng làm thay đổi
phần biểu hiện của gene dựa vào sự thay đổi số lượng sản phẩm được biểu hiện ở một
thời điểm nhất định hoặc ở một mô nhất định. hay bằng sự thay đổi phản ứng với những
tín hiệu (cue) của môi trường nhất định. Ngược lại, đột biến ở một vài điểm bám có thể
hoàn toàn phá hủy một giai đoạn càn cho sự biểu hiện bình thường của gene, như điểm
bám của mRNA polymerase hoặc là nhân tố splicing. Vì vậy nó làm bất hoạt sản phẩm
của gene hoặc ngăn cản sự hình thành sản phẩm.
Cần phân biệt giữa những thay đổi xảy ra của một đột biến gene đó là sự thay đổi
trình tự DNA của gene với sự thay đổi ở mức độ kiểu hình. Nhiều đột biến điểm trong
triình tự không mã hóa làm ít thay đổi hoặc không thay đổi trên kiểu hình như đột biến
giữa điểm bám DNA cho protein điều hòa hoặc thay đổi những điểm khác trong gene làm
thay đổi chức năng của chúng.
2. Cơ chế gây đột biến điểm
Khi kiểm tra dãy đột biến được gây tạo bới các tác nhân đột biến khác nhau cho thấy
mỗi tác nhân đột biến được đặc trưng bởi một đặc tính đột biến khác nhau hay
"preference" về cả một dạng đột biến nhất định và một điểm đột biến nhất định, được gọi
là điểm dễ xảy ra đột biến (mutational hot spots). Đặc tính đột biến như thế được chú ý
lần đầu tiên ở locus rII của bacteriophage T4.
Tác nhân đột biến hoạt động ít nhất qua ba cơ chế khác nhau: chúng có thể làm thay
thế một base trong DNA; làm biến đổi một base gây kết cặp nhầm với một base khác;
làm sai hỏng một base, dẫn đến không thể kết cặp với bất kỳ base nào trong điều kiện
bình thường.
Đột biến thay thế base: một vài hợp chất hóa học tương tự nitrogen base bình thường
của DNA, đôi khi chúng có thể gắn vào DNA thay cho base bình thường. Những chất
như thế được gọi là các chất tương đương với base (base analogs). Các chất tương đương
này kết cặp không như sự kết cặp của các base bình thường. Vì vậy chúng có thể gây ra
đột biến do gắn vào một nucleotide không đúng trong quá trình sao chép.
Để hiểu hoạt động của các chất tương đương base, trước hết cần phải xem xét
khuynh hướng tự nhiên của các base đối với sự hình thành các dạng khác nhau. Mỗi base
trong phân tử DNA có thể xuất hiện ở một trong số nhiều dạng được gọi là tautomers,
chúng là các đồng phân khác nhau ở vị trí vị trí nguyên tử và những liên kết giữa các
nguyên tử. Dạng keto của mỗi base thường có trong DNA (Hình 12.2), trong khi dạng
imino và enol của base là hiếm. Tautomer imino hoặc enol có thể kết cặp sai với base tạo
một kết cặp nhầm (mispair). Khả năng kết cặp nhầm như thế gây ra đột biến trong quá
trình sao chép được chú ý đầu tiên bởi Watson và Crick khi các tác giả này nghiên cứu
công thức về mô hình cấu trúc DNA.
Sự kết cặp nhầm có thể sinh ra ngẫu nhiên, nhưng cũng có thể sinh ra khi base bị ion
hóa. Tác nhân gây đột biến 5-Bromouracil (5-BrU) là chất tương đương với thymine, có
brome ở vị trí carbon số 5 thay cho nhóm -CH 3 của thymine. Hoạt tính của nó dựa trên
quá tình inolization và ionization. Ở dạng keto, 5-BrU kết cặp với adenin như trường hợp
thymine. Tuy nhiên, sự có mặt của nguyên tử bromine làm thay đổi một cách có ý nghĩa
sự phân bố electron ở vòng base. Vì vậy 5-BrU có thể chuyển sang dạng enol và dạng
ion, và nó có thể kết cặp với guanine như trường hợp cytosine tạo ra cặp 5-BrU-G. Trong
lần nhân đôi tiếp theo G kết cặp với C, tạo cặp G-C thay cho cặp A-T. Kết quả gây ra đột
biến đồng hoán. Tương tự 5-BrU cũng có thể gây ra đột biến đồng hoán A-T thay cho cặp
G-C.
Hình 12.2 Chứng minh một vài kết cặp nhầm có thể xảy ra do kết quả của sự thay đổi
1 tautomer thành 1 tautomer khác
Một hóa chất gây đột biến khác là 2-amino-purine (2-AP), là hóa chất tương đương
adenine, có thể kết cặp với thymine. Khi bị proton hóa, 2-AP có thể kết cặp nhầm với
cytosine, có thể gây ra thế hệ sau đột biến đồng hoán G-C thay cho A-T do kết cặp nhầm
với cytosine trong lần sao chép tiếp theo.
Thay thế base (base alteration)
Hình 12.3 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá
Một vài tác nhân đột biến không gắn vào DNA, mà lại làm biến đổi base gây ra sự
kết cặp sai. Tác nhân alkyl được sử dụng phổ biến như là tác nhân đột biến, chẳng hạn
như ethylmethanesulfonate (EMS) và nitrosoguanidine (NG) gây đột biến theo cách này.
Những tác nhân như thế sẽ thêm nhóm alkyl (nhóm ethyl trong trường hợp EMS và
nhóm methyl trong trường hợp NG) ở nhiều vị trí trên cả 4 base. Tuy nhiên, đột biến hầu
như chỉ xảy ra khi nhóm alkyl được thêm vào ở oxy số 6 của guanine tạo ra O-6-
alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine (Hình 12.3). Kết
quả sinh ra đột biến đồng hoán G-C→A-T trong lần sao chép tiếp theo.
Tác nhân xen vào giữa (intercalating agents) là nhóm tác nhân quan trong khác gây
biến đổi DNA. Nhóm của các hợp chất này bao gồm proflavin, acridin cam và một nhóm
các hợp chất hóa học khác. Các tác nhân này là nhóm các phân tử bắt chước các cặp base
và có thể xen vào giữa các nitrogen base ở lõi chuỗi xoắn kép DNA. Ở vị trí xen vào này
chúng gây sự thêm vào hoặc mất đi một cặp nucleotide.
Sai hỏng base: Một số lớn tác nhân đột biến gây sai hỏng một hoặc nhiều base. Vì
vậy không thể kết cặp với base đặc trưng. Kết quả làm cản trở sự sao chép vì DNA
polymerase không thể tiếp tục quá trình tổng hợp DNA qua những base sai hỏng. Ở
E.coli quá trình này xảy ra đòi hỏi hoạt tính của hệ thống SOS. Hệ thống này được kích
thích như là một phản ứng khẩn cấp ngăn cản sự chết tế bào khi DNA bị sai hỏng nặng.
* Cơ chế của đột biến ngẫu nhiên
Đột biến ngẫu nhiên xảy ra do nhiều nguyên nhân: gồm sai hỏng trong quá trình sao
chép DNA, các tổn thương ngẫu nhiên, sự chen vào của yếu tố di động. Đột biến ngẫu
nhiên hiếm nên khó xác định cơ chế cơ bản. Tuy nhiên, một vài hệ thống chọn lọc cho
phép thu được đột biến ngẫu nhiên và phân tích ở mức độ phân tử. Từ bản chất của
những thay đổi trình tự có thể suy ra quá trình dẫn đến đột biến ngẫu nhiên.
Những sai hỏng ngẫu nhiên (spontaneous lesions) đến DNA có thể sinh ra đột biến.
Hai tổn thương ngẫu nhiên thường xuất hiện nhất: depurination và deamination, trong đó
depurination phổ biến hơn.
Depurination do tác dụng của aflatoxin, làm mất một base purine. Ngoài ra, quá trình
mất purine cũng xảy ra một cách tự nhiên. Một tế bào động vật mất ngẫu nhiên khoảng
10.000 purine của DNA trong một thế hệ tế bào khoảng 20 giờ ở 37 oC. Nếu tổn thương
này được giữ lại, dẫn đến sai hỏng di truyền đáng kể vì trong quá trình sao chép, vị trí
mất purine không thể định rõ được loại base nào. Trong những điều kiện nhất định một
base có thể chèn vào tạo ra đột biến.
Deamination của cytosine tạo ra uracil. Uracil sẽ kết cặp với adenin trong quá trình
sao chép, kết quả tạo ra đột biến đồng hoán G-C→ A-T. Deamination 5-methylcytosine
tạo ra thymine (Hình 12.4). Quá trình sao chép tạo ra đột biến đồng hoán chuyển C thành
T.
Ngoài 2 quá trình gây sai hỏng như trên, sự oxy hóa tạo ra các base bị sai hỏng là
dạng tổn thương thứ ba.. Dạng oxygen hoạt động như gốc superoxid (O2.-), hydrogen
peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (.OH) được tạo ra do sản phẩm của quá trình chuyển
hóa (aerobic metabolism). Các dạng này có thể gây tổn thương oxy hóa đến DNA, kết
quả tạo ra đột biến.
Hình 12.4 Deamination của Cytosine (a) và 5-methylcytosine
Các sai hỏng trong sao chép DNA cũng là nguồn đột biến khác.
Thay thế base: sai hỏng trong sao chép DNA có thể xảy ra khi có một cặp nucleotide
ghép không chính xác (như A-C) tạo ra trong quá trình tổng hợp DNA dẫn đến sự thay
thế một base.
Đột biến thêm vào và mất base: Một loại sai hỏng sao chép khác dẫn đến thêm vào
hoặc mất đị một hoặc một số cặp base. Trong trường hợp số base thêm vào hoặc mất đi
không chia hết cho 3, sẽ tạo ra đột biến dịch khung trong vùng mã hóa protein.
1.1. Quang phục hoạt (photoreactivation) hay sửa sai nhờ ánh sáng (light repair)
Sau khi xử lý tia tử ngoại gây đột biến, nếu đưa ra ánh sáng thì phần lớn sai hỏng
được phục hồi nhờ enzyme photolyase. Enzyme này gắn vào photodimer cắt nó thành các
monomer dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời có bước sóng 320-370 nm. Sau đó phục
hồi các base ban đầu. (Hình 12.5).
Hình 12.5 Sự tạo thành và sự loại bỏ dimer thymine
1.2. Sửa sai bằng làm mất nhóm alkyl (dealkylation)
Enzyme alkyltransferasecos thể sửa trực tiếp các sai hỏng. Chúng cắt nhóm alkyl từ
chất nitrosoguanine và ethylmethnesulfonate và gắn vào vị trí O-6 guanine.
Enzyme methyltransferase của E. coli có khả năng chuyển nhóm methyl từ chất O-6
methylguanine sang gốc cistein trên phân tử protein. Tuy nhiên hệ thống sửa sai này có
thể bảo hòa nếu mức độ alkyl hóa đủ cao.
* Sửa sai bằng cắt bỏ (excision repair pathway)
Phần lớn các cơ chế sửa sai khác thực hiện theo lối cắt bỏ (excistion repair) không
cần ánh sáng nhờ các nuclease, sau đó thay vào các base đúng. Có thể xảy ra theo nhiều
cách:
+ Cắt các base (base excision repair) Sự cắt bỏ các base sai hỏng nhờ các enzyme
DNA glycosylase. Các enzyme này nhận biết các base bị biến đổi và các điểm mất purine
hay mất pyrimidine và thủy giải liên kết N-glycosilic nối base với đường. Rồi enzyme AP
endonuclease cắt liên kết đường và phosphate gần base bị biến đổi. Sau đó enzyme thứ
ba, deoxyribophosphodiesterase loại bỏ từng nucleotide kế tiếp nhau ở đoạn bị hỏng. Sau
đó, DNA polymerase lấp đầy khoảng trống với các nucleotide bổ sung với sợi khuôn còn
lại. Enzyme DNA ligase sẽ gắn các khe hở giữa 2 đầu 3'-5' (Hình 12.6).
Trong tế bào tồn tại một số DNA glycosylase. Chẳng hạn, enzyme uracil-DNA
glycosylase cắt uracil khỏi DNA. Uracil tạo thành do đột biến mất nhóm amin ngẫu nhiên
ở cytosine, dẫn đến đột biến đồng hoán thay C bằng T. Enzyme này phát hiện ra uracil
trên DNA như là một bất thường, chúng sẽ cắt bỏ và sửa sai.
+ Cắt các nucleotide: Sự cắt bỏ vùng có nhiều pyrimidine dimer được thực hiện nhờ
enzyme exinuclease (enzyme rạch mạch hay enzyme tạo khấc trên DNA) như phức hợp 3
enzyme được mã hóa bới gene uvr ABC của E. coli. Phức hợp này cắt đoạn 12 nucleotide
trên một mạch: 8 nucleotide từ một đầu bị sai hỏng và 4 nucleotide của đầu còn lại.
Khoảng trống của 12 nucleotide này sẽ được lấp đầy nhờ enzyme DNA polymerase I dựa
vào mạch đơn bổ sung kia của trình tự DNA gốc. DNA ligase sẽ gắn vào các khe hở.
Một hệ thống sửa sai quan trọng đã phát hiện tính chất bổ sung đối song song của 2
mạch đơn DNA để phục hồi đoạn sai hỏng trở lại trạng thái bình thường ban đầu. Trong
hệ thống này, đoạn DNA sai hỏng bị cắt bỏ và thay bằng một đoạn nucleotide mới được
tổng hợp bổ sung với sợi khuôn đối diện. Sự sửa sai xảy ra qua sợi khuôn và nguyên tắc
của sao chép DNA bảo đảm sự sửa sai hoàn thành với độ chính xác cao - đó là sự giải
phóng sai hỏng (error-free). Có 2 hệ thống chủ yếu để loại bỏ sai hỏng: Hệ thống sửa
chữa sai hỏng phát hiện ra trước khi sao chép và hệ thống sửa chửa sai hỏng phát hiện
trong quá trình diễn biến sao chép (sửa sai sau sao chép).
+ Sửa sai đứt mạch kép (repair of double-strand break)
Khi cả 2 sợi của chỗi xoắn kép bị đứt ở cùng một vị trí, được gọi là đột biến đứt
mạch đôi, có thể gây ra sai hình nhiễm sắc thể, làm chết tế bào hoặc tạo ra trạng thái tiến
ung thư. Tế bào sử dụng nhiều protein và con đường sửa sai đứt gãy mạch đôi là thực
hiện tái tổ hợp trong giảm phân. Quá trình sửa chữa do trao đổi chéo trong giảm phân xảy
ra như sau (Hình 12.7):
Trên một nhiễm sắc thể xảy ra sự đứt mạch đôi và kết quả ăn mòn các đầu mút ở
đoạn ngắn của DNA sợi đơn. Đầu 3' của một trong những sợi này "xâm lấn" vào một
chromatid.
Đoạn xâm lấn làm mồi cho tổng hợp các base bị mất của nó nhờ sử dụng sợi đối
song song của chromatid như là sợi khuôn. Sự tổng hợp mới này sẽ tạo ra một vòng sợi
đơn lai với một sợi đơn không xâm lấn. Vì vậy tạo ra một vùng dị hợp tử nhỏ "Aa" và sử
dụng như mạch khuôn để khôi phục các base bị mất trên sợi đó. DNA polymerase sẽ lấp
đầy chỗ trống và enzyme ligase sẽ nối các đầu mút xảy ra trong cấu trúc đặc biệt giống
với trao đổi chéo 2 sợi đơn. Cấu trúc này cũng chứa các đoạn bắt cặp không tương đồng
đơn giản.
Trao đổi chéo sợi đơn được gọi là cấu trúc Holliday (Holliday structure) do Holliday
phát hiện vào những năm 1960.
+ Hệ thống SOS
Ở tế bào vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote bị sai hỏng nặng do chiếu tia uv, tia X hoặc
do tác dụng của các hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa sai khẩn cấp được khởi động. Ở
E. coli, hệ thống này có liên quan với hai protein được mã hóa bởi gene lexA và recA.
Protein lexA là một chất ức chế, nó gắn vào hộp SOS, chồng lấp các promotor của các
gene SOS, ngăn cản sự phiên mã nhóm các gene của hệ thống SOS. Một vài sản phẩm
của DNA bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa enzyme protease recA. Protein recA bị hoạt hóa
sẽ cắt bỏ protein lexA, cho phép các gene của hệ thống SOS phiên mã. Phản ứng của hệ
thống SOS xảy ra trong thời gian ngắn nhưng phức tạp. Nó bao gồm các quá trình làm
tăng hoạt tính tái tổ hợp, thay đổi trong khởi sự sao chép, ức chế nuclease và kích thích
phục hồi sao chép và chuyển sai hỏng thành sửa sai úp sấp (error-prone replication). Tế
bào bây giờ sẽ xảy ra sự sao chép DNA nhanh hơn bình thường. Nếu sửa sai không kịp,
tế bào phải chấp nhận hoặc bị đột biến hoặc bị chết.
Trình tự Số bản sao trong E. coli Chiều Đoạn lặp lại đảo
xen vào dài (bp) ngược (bp)
IS1 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể 768 18-23
IS4 1-2 bản sao trên nhiễm sắc thể, 1400 16-18
IS5 Chưa biết 1250 Ngắn
Hình 12.8 Đặc trưng về cấu trúc của transposon hỗn hợp (composite transposon) và
transsposon đơn giản (simple transposon)
Transposon hỗn hợp (composite transposon) chứa nhiều gene nằm giữa 2 trình tự IS
gần nhau, có hướng ngược nhau tạo ra tình tự lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR).
Một trong 2 yếu tố IS mã hóa cho transposase xúc tác cho sự chuyển vị của cả
transposon. Chẳng hạn Tn10 là transposon hỗn hợp mang gene mã hóa cho tính kháng
kháng sinh tetracyline. Gene này nằm giữa hai yếu tố IS10 có hướng ngược nhau.
Transposon đơn giản (simple transposon) ở giữa các trình tự IR, nhưng những trình
tự này ngắn (<50 bp) và không mã hóa cho transposase. Sự chuyển vị của chúng không
phải là kết quả của sự liên kết với yếu tố IS. Các transposon đơn giản mã hóa transposase
riêng thêm vào để mang các gene của vi khuẩn. Tn3 là một transposon đơn giản (Hình
12.8).
Transposon hỗn hợp và transposon đơn giản đều chứa các gene thêm vào liên quan
đến chức năng mới ở tế bào vi khuẩn. Cả hai loại này thường được gọi chung là
transposon. Transposon dài hơn yếu tố IS, thường chứa vài kb), chúng chứa các gene mã
hóa cho protein thêm vào.
Hãy cho biết acid amin nào sẽ được tìm thấy ở codon có nucleotid bị thay đổi như
trên?
10. Ở bắp, tần số đột biến của locus R (màu cây) rất câo: 492 đột biến trên 106 giao
tử. Gene tạo màu đỏ của nội nhủ Pr có tần số đột biến là 11 đột biến trên 10 6 giao tử. Hãy
cho biết cần phải phân tích bao nhiêu cây mới tìm được 1 đột biến kép của 2 gen trên?