- Chương 6Nuôi cấy tế bào động vậtI. - Mở đầu Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môitrường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cáchtăng số lượng và kích thước tế bào. - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sảnxuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như cáchormone sinh trưởng của người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, cácviral vaccine và các kháng thể đơn dòng. - Chẳng hạn, các kháng thể đơndòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trongcác khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinhtrưởng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xácngười chết. - Vì thế, nhiều công ty đã phải quay lại với hệ thống vật chủbiểu hiện các protein ngoại lai là các tế bào động vật có vú. - Hiện nay,khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm dược phẩm được sản xuất từ các hệthống tế bào vật chủ này.1. - Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật - Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việcsản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh,điều trị hoặc chẩn đoán (Bảng 6.1. - Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xácđối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical. - Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trongnghiên cứu độc chất học và dược học. - Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơncác tế bào vi sinh vật.Công nghệ tế bào 78 Bảng 6.1. - Các sản phẩm của nuôi cấy tế bào động vật. - Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơnlà một cơ thể đơn bào riêng biệt như vi sinh vật. - Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bềmặt.II. - Tế bào động vật Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhaubởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. - Ở môliên kết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài),đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. - Các tế bào mô cơ thường thon dàivà được gắn với nhau thành một phiến hoặc một bó bởi mô liên kết. - Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàngvà truyền xung động rất nhanh.1. - Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hìnhdạng thể lỏng. - Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịchhuyền phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởngtrong nuôi cấy in vitro. - Các tế bào không dính bám không đòi hỏi bề mặt đểsinh trưởng. - Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) (Hình 6.1a) bắtnguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đườngkính từ 10-20 µm. - Các tế bào dính bám Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thếchúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng. - Trong các ứng dụng, ngườiCông nghệ tế bào 80ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyênbào sợi (fibroblast) (Hình 6.1b và c). - Các tế bào dính bám cần có một bềmặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặc plastic. - Chai có dung tích 1 L chứakhoảng 100 mL môi trường là thích hợp cho các tế bào vừa sinh trưởng trênthành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không khí. - Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy. - Môi trường nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật có vú lớn hơn vi sinh vậtdo, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vôcơ. - Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồmcác amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muốikhoáng và glucose. - Bảng 6.2 trìnhCông nghệ tế bào 81bày thành phần và hàm lượng của các chất trong môi trường Eagle (Eagle1959), đây là một trong những môi trường được sử dụng phổ biến trongnuôi cấy tế bào động vật. - Sự hiện diện của nhiều protein khácnhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách vàCông nghệ tế bào 82tinh sạch đầu ra. - Trước đây, huyết thanh của thai bò (fetal bovine serum-FBS), được bổsung ở nồng độ 1-20%, là rất cần thiết cho sự sinh sản của các tế bào độngvật có vú. - Nhưng ngày nay, nhiều quá trình nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn đãbắt đầu thực hiện trong môi trường không có huyết thanh.IV. - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuấtcác sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệlên men. - Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thựcvật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổichất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độsinh trưởng chậm của tế bào. - Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡngphức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào nhưvi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. - Mặc dù có một số điểm khôngthuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào độngvật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. - Các dòng tế bào khác nhau nhưBHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên mentheo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viralvaccine và các sản phẩm khác. - Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắcphục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. - Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thểdùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyềnphù. - Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệthống chất mang như là microcarrier. - Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấylà CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người.1. - Hệ thống sản xuất Phát triển một quá trình sản xuất công nghiệp cho protein tái tổ hợpcủa tế bào động vật có vú thường dựa theo hệ thống được trình bày ở hình6.2. - Đầu tiên, gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiênmã (promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào. - Đồngthời, gen thứ hai (gen chọn lọc-selector, hay còn gọi là gen chỉ thị chọn lọc-selectable marker) cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bàođược biến nạp và không biến nạp. - Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trênmôi trường nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lậpcác tế bào tái tổ hợp sống sót. - Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót (xem như là các tế bào đơn)được chuyển vào bình nuôi cấy thứ hai, và quá trình nuôi cấy được pháttriển để sản xuất các quần thể vô tính (clonal populations). - Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình nuôi cấy để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i. - Các đường gợn sóng chỉ ra số lần cấy chuyển của các dòng tế bào riêng biệt để sàng lọc tế bào đưa vào sản xuất. - Các lọ nhỏ là ngân hàng tế bào được đông lạnh trong nitrogen lỏng. - Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng và tế bào vật chủ Hiện nay, môi trường thương mại dùng cho nuôi cấy tế bào có chấtlượng cao đã được một số nhà cung cấp hàng đầu sản xuất. - Tương tự môi trường, các tế bào vật chủ cũng phải được cải thiện đểchống lại các ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy làm giảm khả năng sống sótvà/hoặc tiến hành các bước chuyển gen để kích thích sinh trưởng. - Kết quảnghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm cho thấy, các tế bào vật chủ có thểđược cải thiện sinh trưởng, khả năng sống sót và sản lượng nhờ công nghệDNA tái tổ hợp. - Các proto-oncogene8, các gen điều chỉnh chu kỳ tế bào(cyclins), các gen yếu tố sinh trưởng (ví dụ yếu tố sinh trưởng giống insulin)và các gen antiapoptosis đã được đưa vào trong tế bào để tạo ra các vật chủsiêu sản xuất (superior production hosts). - Nhữngbiến đổi của dạng glyco (glycoform) đã làm tăng từ 5-10 lần các độc tố tếbào phụ thuộc kháng thể.8 Proto-oncogene: gen tiền ung thư.Công nghệ tế bào 86V. - Các kháng thể đơn dòng Các tế bào bạch huyết (lymphocytes) là các tế bào máu trắng cần chocác phản ứng miễn dịch. - Để sản xuất một lượng lớn kháng thể đồng nhất(kháng thể đơn dòng) chỉ nhận ra một cấu trúc hóa học, chúng ta phải chosinh trưởng được một dòng tế bào đặc biệt của B-lymphocyte. - Dung hợp tế bào Không giống như các tế bào tiết ra kháng thể, các tế bào myeloma (utủy) là loại tế bào khối u ác tính của hệ thống miễn dịch, có thể được nuôicấy liên tục. - Köhler và Milstein (1975) đã phát triển một phương pháp dunghợp các tế bào B-lymphocyte của lá lách với tế bào myeloma của chuột đểlai hai loại tế bào này với nhau, tế bào lai myeloma (hay hybridoma), có thểcó đặc điểm của cả hai dòng tế bào: đó là sản xuất các kháng thể đặc hiệu vàbất tử. - Vì hybridoma được bắt nguồn từ một tế bào B-lymphocyte đơn, nênnó chỉ sản xuất một loại kháng thể gọi là kháng thể đơn dòng. - Phương thức đặc trưng để dung hợp tế bào như sau (Hình 6.4. - Hệ thống miễn dịchtrong chuột đáp ứng bằng cách sản xuất các tế bào B-lymphocyte để tiết rakháng thể. - Lấy lá lách của chuột và tách các tế bào B-lymphocyte. - Vì thế, các tế bào myeloma được coi như là HPGRT-,trong khi các tế bào B-lymphocyte và hybridoma là HPGRT. - Chọn lọc các tế bào HPGRT+ bằng cách nuôi cấy hỗn hợp trên môitrường chứa HAT (hypoxanthine, aminopterin và thymidine) là chất ức chếsinh trưởng các tế bào HPGRT-. - Do đó, các tế bào myeloma sẽ chết trênmôi trường này, trong khi các tế bào hybridoma sẽ phân chia. - Tiêm kháng nguyên Các tế bào myeloma HGPRT- Tách các tế bào lá lách Dung hợp bằng PEG Chọn lọc HGPRT+ trong môi trường HAT Các tế bào hybridoma Các kháng thể đơn dòng Hình 6.4. - Phương thức dung hợp các tế bào B-lymphocyte.Công nghệ tế bào 892. - Bổ sung kháng thể đơn dòng thứ hai (Mab2) là kháng thể có đặc tínhtương phản với immunoglobulin của loại mà từ đó tế bào hybridoma bắtnguồn. - Mab1 AgCông nghệ tế bào 90VI. - Interferon-γ (IFN-γ, cókhối lượng phân tử khoảng 25 kDa, được sản xuất từ các lympho T CD4+12(h1), T CD8+ và các tế bào NK) hoạt hóa cho sự biểu hiện của các phân tửHLA lớp II, làm thúc đẩy sự biệt hóa các tế bào mono thành các đại thựcbào. - Nuôi cấy tế bào đã được sinh trưởng trong hệ lên men50 L trên môi trường không có huyết thanh và được cung cấp oxygen hòatan ở nồng độ cao để tối ưu sự sinh trưởng của tế bào. - Gen mã hóainterferon được biến nạp vào tế bào nấm men S. - Hoạt tố plasminogen mô Hoạt tố plasminogen mô (t-PA) là một ví dụ về protein trị liệu đượctổng hợp trong nuôi cấy các tế bào động vật có vú chuyển gen. - Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thườngbằng cách tiêm vào tế bào cơ (b) hoặc đẩy vào da nhờ súng bắn gen (c). - Khả năng miễn dịch sẽ được duy trì khi hoạt động nàyCông nghệ tế bào 93tạo ra các tế bào ghi nhớ (memory cells) lâu dài để sẵn sàng ngăn chận tácnhân gây bệnh. - Các vaccine cảm ứng miễn dịch theo phương thức DNA vaccine đivào tế bào đích (ví dụ: mô cơ) và sau đó hoạt động sản xuất kháng nguyêncủa tế bào thường được tìm thấy trên tác nhân gây bệnh. - Trong phản ứng thể dịch, các tế bào máu trắng được gọi là tế bào Bliên kết để giải phóng các bản sao của các protein kháng nguyên và sau đótăng lên nhiều lần. - Sự biểu hiện các đoạn protein kháng nguyên (hoặc peptide) trên cáctế bào bị xâm nhiễm có thể khởi động một đáp ứng tế bào. - Các tế bào được hoạt hóa cũngsẽ trở thành các tế bào ghi nhớ, sẵn sàng đào thải các tế bào bị xâm nhiễmbởi tác nhân gây bệnh trong tương lai.3.2. - Các tế bào T gâyđộc có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các tác nhân gây độcnội bào.Công nghệ tế bào 94phát triển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào, xu hướng cấy ghép tế bào đã trở nênngày càng phổ biến hơn. - Chẳng hạn, việc ghép các tế bào tụy sản xuấtinsulin của lợn vào người mắc bệnh tiểu đường đã được thực hiện vàonhững năm 1990, tuy nhiên kết quả vẫn chưa rõ ràng. - Một nghiên cứu gần đây đã thành công trongviệc ghép tự thân tế bào sụn. - Nhóm nghiên cứu trên đã thu nhận sinh thiết từ một phần sụn lànhcủa người bệnh, tách rời từng tế bào nhờ enzyme thủy phân. - Các tế bào nàyđược nuôi cấy và tiêm trở lại vào nơi bị tổn thương. - Trên cơ sở này, họ đã ghép tế bào tủy xươnglấy từ chuột chuyển gen lên chuột bình thường bị tổn thương cơ. - Sau vàituần, các chuột sau chạy nhanh như thỏ, với các tế bào cơ chứa nhân màuxanh.Công nghệ tế bào 95 Bảng 6.3. - Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy Trong y học, để điều trị chứng xơ vữa động mạch, người ta cần thaythế các mạch máu bị hỏng. - Gần đây, một nhóm nghiên cứu đã sản xuất thànhcông mạch máu tự nhiên bằng cách nuôi cấy tế bào động mạch chủ của bò,gồm tế bào cơ và tế bào nội mô, trên một giá thể polymer tự tiêu. - Thínghiệm tương tự với các tế bào có nguồn gốc từ lợn đã cho phép sản xuấtmạch máu mà khi đem ghép trở lại trên lợn cho những kết quả rất khả quan. - Tuy nhiên, loại tế bào đang có triển vọng nhất trong lĩnh vực này là tếbào mầm phôi. - Để sử dụng tế bào mầm phôi vào mục đích điều trị cần phải thu nhậnđược những dòng tế bào có mang bộ gen của người bệnh. - Tạo dòng trị liệu: thay thế vật liệu di truyền của noãn người bằngnhân của một tế bào trưởng thành. - Các tế bào phôi thai được thu nhận từ đó và đem nuôicấy. - Cấy nhân tế bào người vào noãn của một động vật có vú bất kỳ đãloại nhân. - Lập chương trình mới cho nhân của tế bào trưởng thành bằng cáchkết hợp tế bào mầm phôi với nhân của một tế bào sinh dưỡng. - Chính nó đã cảm ứng sự biệthóa các tế bào lân cận ngoại bì thành não và mắt, các tế bào trung bì thànhtim và tế bào nội bì thành gan. - Mô hình thử nghiệm trên tế bào đã được sử dụng trong các khảo sát vềsự chuyển hóa các chất có nguồn gốc ngoại lai nhờ hệ enzyme nội bào. - Việc nuôi cấy chung tế bào gan với tế bào biểu môcho phép duy trì chúng sống trong nhiều tuần lễ. - Một ứng dụng khác của nuôi cấy tế bào động vật là khảo sát các độctính đối với vật chất di truyền do các chất chuyển hóa trong tế bào gắn lênDNA. - Công nghệ tế bào 99
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt