ìINHàHỌCàPHÂNàTỬ PGS.TS Trươ g Xuâ Liê Nội dung : 1/ Quá trình Sao chép của DNA (4T) Sao chép DNA Quá trình sửa chữa DNA 2/ Quá trình phiên mã (4T) Các loại RNA Quá trình phiên mã Mã di truyền 3/ Sinh tổng hợp protein (2T) Quá trình dịch mã Các yếu tố ức chế quá trình dịch mã SAO CHÉP DNA Mục tiêu : -Trình bày được cấu trúc phân tử của DNA và vai trò của DNA là chất liệu di truyền của tế bào -Hiểu và trình bày được quá trình sao chép DNA procaryote và eucaryote -Mô tả được quá trình sửa chữa DNA tế bào DNáà:ààChấtàliệuàdiàt u ề à ủaàsựàsố gà G C A T T A 1 nm C G C A C 3.4 nm G T G T A T A A T T A C G A Figure 16.7a, c 0.34 nm T (a) Key features of DNA structure (c) Space-filling model Protein hay DNA là chất liệu di truyền của tế bào sống ? • Trước đây, các nhà khoa học đã từng nghĩ rằng proteine là chất liệu di truyền của tế bào sống vì proteine có cấu trúc phức tạp hơn DNA : proteine có cấu tạo từ 20 loại amino axit khác nhau tạo thành những chuỗi polypeptide dài copyright cmassengale 6 Thí nghiệm của Federick Griffith 1928 hiện tượng biến nạp ( transformation) St.Pneumoniae : Dạng S có vỏ bao , chủng độc lực , Dạng R không có vỏ bao, không độc lực Vi trùng S sống Living S cells Vi trùng R sống Living R cells Vi trùng S đun chết Heat-killed (control) (control) S cells (control) Vi trùng S chết & Mixture of heat-killed vi trùng R sống S cells and living R cells RESULTS Mouse dies Chuột chết Mouse healthy Mouse healthy Chuột sống Mouse dies Living S cells Chuột are found in chết blood sample tính gây bệnh từ tế bào S bị đun chết đã truyền sang tế bào R  DNA có thể mang tín hiệu di truyền của tế bào Thí nghiệm của Oswald T. Avery’s - 1944 Cho DNA hoặc RNA của vi trùng thể S vào dung dịch nuôi cấy vi trùng R  DNA là hâ tố iế ạp a g tí hiệu di truyề hứ khô g phải RNA hay protei e 8 Thí nghiệm của Hershey-Chase Bacteriophage - 1953 1. T2 bacteriophage có cấu trúc từ DNA và protein 2. Gắn các chất phòng xạ: • • với DNA 35S với Protein 32P 3. Gây nhiễm E. coli bacteria với 2 loại phage T2 đã được đánh dấu 4. 32P được phát hiện trong vi khuẩn và các phage mới , trong khi đó 35S is không được tìm thấy trong vi khuẩn. DNA ới hí h là vật hất di truyề ủa ủa phage9 T2 Erwin Chargaff phát hiện cấu tạo của phân tử DNA 1947 DNA có cấu tạo từ 4 nucleotide Adenine, Thymine, Guanine,Cytosine A = 30.3% T = 30.3% G = 19.5% C = 19.9% Đị h luật Chargaff Adenin kết hợp với Thymine Guanine kết hợp với Cytosine T A G copyright cmassengale C 10 Rosalind Franklin : sử dụng kỹ thuật phân tích dùng tán xạ tia X chụp tinh thể DNA copyright cmassengale 11 James D. Watson & Francis H. Crick 1953 • Xây dựng thành công mô hình cấu trúc phân tử DNA dựa trên 2 phát kiến : 1. Nguyên lý Chargaff : A=T & G=C 2. Các nghiên cứu bằng tia của Rosalind Franklin & Maurice H. F. Wilkins Cấuàt DNáà à ấuàt .ààKhoả gà à ủaàDNá à oắ àk pàvớià àv gà oa àđềuà à hiềuàd ià . à hàgiữaà à u leotideààl à0. à .àĐườ gàk hà 1962: Giải Nobel Sinh lý học và Y khoa : James D. Watson Francis H. Maurice H. F. Crick Wilkins “Khám phá liên quan đến cấu trúc phân tử của axit nucleic và ý nghĩa của nó trong việc chuyển tải thông tin chất liệu sống ". Cấu trúc oắ kép ủa DNA (double helix structure) gồ 2 ạ h polynucleotide ắt ặp ổ xung Hydrogen bond Ribbon model Partial chemical structure Computer model C à u leotideà ủaàhaiàsợiààli àkếtàvớià hauà ằ gà à ầuà h d oge àtheoà gu àtắ à ổà u gàáàvớiàT,àGàvớiàC Phosphate group Cấu trúc chuỗi polynucleotide Nitrogenous base Sugar Phosphate group Nitrogenous base (A, G, C, or T) Nucleotide Thymine (T) Sugar (deoxyribose) DNA nucleotide Polynucleotide Sugar-phosphate backbone Thymine (T) Cytosine (C) Pyrimidines Adenine (A) Guanine (G) Purines Chuỗi polypeptide có cấu trúc từ 4 loại nucleotide : Adenin A Guanine G Thymine T Cytosine C Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodister tạo thành chuỗi dài có định hướng : Đầu có nhóm phosphat tự do  5’ Đầu có nhóm hydroxyl tự do 3’ DNA là một chuỗi xoắn kép gồm 2 sợi đơn kết hợp với nhau nh liên kết hydrogen của các bases theo nguyên tắc bổ sung A-T & G-C Hướng của hai sơi đơn ngược nhau nên gọi là hai sợi đối song song 5 end Hydrogen bond 3 end 5 end 1 nm 3.4 nm 3 end 0.34 nm 3 end 5 end Quá trình sao chép của DNA Sao chép DNA Trong quá trình sao chép, hai mạch đơn của phân tử DNA mẹ được tách ra và mỗi mạch sẽ làm khuôn để tổng hợp mạch mới theo nguyên tắc bổ xung với các base trên mạch khuôn (A-T , G-C) T A T A T A C G C G C T A T A T A A T A T A T G C G C G C G A T A T A T C G C G C G T A T A T A T A T A T C G C G C A G (a) The parent molecule has two complementary strands of DNA. Each base is paired by hydrogen bonding with its specific partner, A with T and G with C. (b) The first step in replication is separation of the two DNA strands. (c) Each parental strand now serves as a template that determines the order of nucleotides along a new, complementary strand. (d) The nucleotides are connected to form the sugar-phosphate backbones of the new strands. Each “daughter” DNA molecule consists of one parental strand and one new strand. C àgiảàthu ếtàvềà u àluậtàsaoà h pà ủaàDNá • DNáààsaoà h pàt o gà u àt hàph à hiaà ủaàtếà • C à aàgiảàthu ếtàvềà u àluậtàsaoà h pà ủaàDNáà Bán bảo tồn Bảo tồn Phân tán Conservative Dispersive Tế bào mẹ Sao chép lần đầu Sao chép lần thứ hai Semi-conservative o Th à ghiệ à ủaàMeselso -Stahl Bacteria cultured in medium containing Bacteria transferred to medium containing 15N 14N DNA sample centrifuged after 20 min (after first replication) DNA sample centrifuged after 40 min (after second replication) First replication Conservative model Semiconservative model Dispersive model Less dense More dense Second replication  E.coli đượ nuôi trong môi t ườ g có 15N  DNA ẹ đượ đ h dấu ởi isotope ặ g ( 15N ).  Chu ể sang môi t ườ g nuôi ấ hỉ hứa (14N) , nucleotide ới đượ xác đị h với các isotope hẹ  DNA đượ hiết tách và ly tâm sau 20 phút (sau lầ sao chép đầu) và sau 40 phút (sau lầ sao chép thứ 2) cho thấ : => Sao chép lầ đầu : chi tạo ra ột ă g DNA lai (15N-14N), loại t ừ giả thu ết ảo tồ .  Lầ sao chép thứ 2 tạo ra ả hai ă g DNA hẹ và DNA lai loại t ừ giả thu ết sao chép phân tán và ủ g hộ giả thu ết bán ảo tồ . DNA sao chép theo quy luật bán bảo tồn DNA sao chép theo quy luật bán bảo tồn ìaoà h pàDNáàtheoà u àluậtà à ảoàtồ Sợi khuôn gốc • Mỗiàph àtửà o à hỉà a gà ộtàsợià ới Sợi hợp Sợimới mớitổng tổng hợp Chĩa ba sao chép Vùng đang sao chép • ìợiàDNáàgố àđượ à d gàl àkhu àđểà tổ gàhợpàsợià ới Chĩa ba sao chép • Tế bào Eucaryote có hiều điể khởi đầu sao chép Sợi khuôn gốc Sợi mới tổng hợp Vùng đang sao chép DNA Replication • Sao chép DNA thực hiện nhanh và chính xác • DNA xoắn kép được tách ra làm khuôn tổng hợp hai mạch mới • Nhiều enzyme tham gia vào quá trình sao chép • Quá trình được bắt đầu từ một điểm khởi sự sao chép (origins of replication) nơi hai mạch của DNA tách ra Tế bào procaryote chỉ có một điểm khởi đầu sao chép Điể khởi đầu sao hép • Tế ào Eu aryote ó hà g tră Origin of replication đế hà g ghì điể Parental (template) strand khởi đầu 0.25 µm Daughter (new) strand Quá trình sao chép bắt đầu từ 1 Replication begins sites một vị trí được gọiatlàspecific điểm khởi where thechép two nơi parental strands đầu sao hai mạch của separate and form replication DNA mẹ tách ra hình thành vòng bubbles. sao chép Bubble Replication fork 2 The bubbles expand laterally, as Vòng sao chép sẽ lan dần theo DNA replication proceeds in both hai hướng do quá trình sao chép directions. được thực hiện trên cả hai mạch 3 Eventually, replication Vòng saothe chép lan tỏa cho bubbles fuse, and synthesis of đến khi các chĩa ba sao the daughter is xúc với chép kế strands cận tiếp complete. nhau Two daughter DNA molecules (a) In eukaryotes, DNA replication begins at many sites along the giant DNA molecule of each chromosome. (b) In this micrograph, three replication bubbles are visible along the DNA of a cultured Chinese hamster cell (TEM). Cơ chế nhân đôi của DNA (DNA Replication) • • • • DNA polymerase III không tự bắt đầu tổng hợp chuỗi polypetide mà cần có một đoạn mồi ngắn . đầu 3’ của mạch khuôn, RNA primase nối các ribonucleotide bắt cặp bổ xung tạo nên đoạn mồi ngắn) DNA polymerase III gắn tiếp các desoxinucleotides vào đầu 3’ của đoạn mồi và tiếp tục ,kéo dài mạch mới theo hướng 5’-3’ DNA polymerase 1 sẽ cắt đoạn RNA mồi và thay vào đó các desoxinucleotide tương ứng Mạch DNA mới được tổng hợp DNA pol III gắnIIIcác DNA polymerase adds nucleotide đoạn mồi nucleotides tovào primer DNA polymerase I degrades DNA pol I phá hủy đoạn the RNA primer and RNA mồi & thay thế bằng replaces it with DNA DNA Sơi DNA con mới được tổng hợp Cơ chế sao chép của DNA • • • • Nucleotides gắn vào theo nguyên tắc bổ xung với các base trên mạch khuôn Mạch DNA mới được kéo dài theo chiều 5’  3’ Nusleotide được hoạt hóa nhờ ATP để thành nucleoside triposphat trước khi gắn vào nhóm OH tự do ở đầu 3’ của sợi polynucleotide đang được tổng hợp DNA polymerase có tính đặc hiệu cao chỉ thêm nucleotide vào đầu 3’OH của mạch đang được tổng hợp Mạch mới Mạch khuôn 5 end 3 end 5 end 3 end Sugar Base Phosphate DNA polymerase 3 end Pyrophosphate 3 end Nucleoside triphosphate 5 end 5 end Quá trình sao chép DNA Giai đoạn kh i sự : 1. Proteine B đặc hiệu nhận biết và gắn vào điểm kh i sự sao chép (ori) 2. Enzyme gyrase ( topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn 2 phía của proteine B 3. Enzyme helicase làm đứt các mối liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp tạo thành chẻ ba sao chép 4. Các proteine SSB ( Single Strand Binding) gắn vào các mạch đơn DNA giữ cho chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho lai ngẫu nhiên hoặc xoắn lại để việc sao chép được dễ dàng Giai đoạn nối dài : Để bắt đầu tổng hợp mạch mới, DNA polymerase III cần có một đoạn mồi. RNA primese tổng hợp một đoạn RNA mồi ngắn bắt cặp bổ xung với các nucleotide đầu 3’ của mạch khuôn . DNA polymerase di chuyển dọc theo mạch khuôn từ đầu 3’ đền 5’ để tạo nên mạch mới bổ sung theo hướng 5’3’ Phân tử DNA gồm hai mạch đối song song, khi tách ra để sao chép tạo một chẻ ba sao chép ( replication fork ). Mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’3’ nên trên một mạch khuôn quá trình tổng hợp sẽ hướng từ ngoài vào chẻ ba được gọi là mạch trước (leading strand), còn mạch khuôn kia sẽ tổng hợp mạch sau ( lagging strand) theo chiều từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài bằng cách tạo ra các đoạn DNA ngắn (Okazaki ) rồi nối lại với nhau Các Enzymes trong sao chép DNA Helicase tách sợi DNA xoắn kép DNA polymerase III nối các nucleotide tạo thành mạch mới Proteine giữ cho hai mạch tách rời nhau DNA polymerase I (Exonuclease) cắt bỏ đoạn mồi và thay vào đó các base thích hợp Primase tổng hợp đoạn mồi bắt cặp với mạch khuôn Ligase nối các đoạn Okazaki và hàn kín mạch Các men & proteine tham gia vào quá trình sao chép  DNA helicases ắtà ầuà ốiàh d oà t hàhaià ạ hà ủaààsợiàDNáà  Single-stranded DNA binding proteins giữà hoàhaiàsơiàkhu  RNA primase tổ gàhợpàđoạ à ồiàRNáà gắ àđểà  DNA polymerase III gắ à àt hà ời à u leotidesàsẽàgắ àtiếp. à u leotideàk oàd iàđoạ à ồiàtheoà hiềuàà ’-- ’à  DNA polymerase I ắtààđoạ à ồiàRNáàv àtha àv oàđấ àDNá  DNA ligase ốiàliề à àđoạ àDNáàth hà ạ hàli Overall direction of replication Leading strand DNA pol III Replication fork Primase DNA pol III Primer 5 3 Parental DNA Lagging strand àtụ . Leading Origin of replication strand Lagging strand Lagging strand Leading strand OVERVIEW DNA ligase DNA pol I 3 5 • Trên một mạch khuôn từ đầu 3’, Cơ chế sao chép của DNA 3 DNA mới được tổng hợp liên tục tạo nên mạch trước (leading) và chỉ cần một đoạn mồi 5 Parental DNA Leading strand 5 3 Okazaki fragments Lagging strand • 3 Trên mạch khuôn kia , mạch DNA 5 mới được gọi là mạch sau hay DNA pol III mạch chậm (Lagging) cũng được Template strand tổng hợp theo chiều 5’-3’ nên sự tổng hợp sẽ gián đoạn đi từ chẻ ba hướng ra ngoài và cần nhiều đoạn Leading strand Lagging strand mồi để tạo thành các phân đoạn DNA (Okazaki) . Các đoạn Okazaki được gắn lại với nhau nh men ligase Template strand DNA ligase Overall direction of replication Replication 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ ori 5’ 3’ 5’ Helicase gắn vào mạch DNA ở vị trí và tách hai mạch của phân tử DNA Binding proteins giữ cho hai mạch khuôn tách rời Primase protein tổng hợp đoạn RNA ngắn (mồi) bổ sung với DNA Replication Overall direction Hướng sao chép of replication 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ DNA polymerase III nối các DNA nucleotides vào đoạn mồi RNA. 3’ 5’ Replication Hướng sao chép Overall direction of replication 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ DNA polymerase kiểm soạt và sửa chữa những nucleotide gắn sai. Replication Overall direction Hướng sao chép of replication 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Mạch trước (Leading strand) tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’. 3’ 5’ Replication 3’ Hướng sao chép 3’ 5’ 5’ Okazaki fragment 3’ 5’ 3’ 5’ Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn Okazaki theo chiều 5’-3’ 3’ 5’ Replication 3’ Hướng sao chép 3’ 5’ 5’ Okazaki fragment 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn DNA 5’ - 3’ (Okazaki fragments). Replication Overall direction of replication 3’ 3’ 5’ 5’ Okazaki fragment 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn DNA 5’ - 3’ (Okazaki fragments Replication 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn DNA 5’ - 3’ (Okazaki fragments Replication 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’5’ 3’ 5’ Mạch trước tổng hợp liên tục theo chiều 5’-3’ Mạch sau tổng hợp gián đoạn các đoạn DNA 5’ - 3’ (Okazaki fragments) Replication 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’5’ 3’ 5’ DNA polymerase I nhờ có hoạt tính Exonuclease loại bỏ đoạn mồi RNA Replication 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’5’ 3’ 5’ DNA polymerase I nhờ hoạt tính Polymerase lắp các dexoribonucleotide phù hợp thay thế Ligase sẽ xúc tác tạo các cầu nối giữa các phân tử đường-phosphat trên mỗi mạch cơ bản hay còn gọi là mạch xương sống ( backbone ). Replication Fork Overview Overall direction of replication Leading strand Lagging strand DNA pol III Replication fork 5 3 Parental DNA Primase Primer Lagging strand Lagging Leading Origin of replication strand strand OVERVIEW Leading strand DNA ligase DNA pol I DNA pol III 3 5 Qu àt hàsửaàsaià • Sửa sai trong sao chép – DNA polymerase (DNA pol III) có thể gắn sai nucleotide base với tần xuất 10-4 bases. – DNA pol có khả năng nhận biết các sai lầm và tức th i sửa chữa những sai sót nh hoạt tính polymerase & 3’exonuclease những nucleotide bị gắn nhầm sẽ được loại bỏ và thay bằng các nucleotide phù hợ[  tỷ lệ nhầm trên các mạch mới tổng hợp chỉ khoảng 10-8 – Sửa chữa gắn không phù hợp : những base gắn không đúng vị trí có thể được thay thế cho đúng . Sửa sai khi không sao chép Phân tử DNA có thể bị biến đổi ngay cả khi không sao chép b i các yếu tố hóa học, phóng xạ…Các biến đổi này xảy ra v i tần xuất khá cao. Nh các cơ chế sửa sai nên tần số đột biến được duy trì mức độ thấp Các enzyme nhận biết gắn vào trình tự sai và cắt r i đoạn sai và mạch đơn đúng được dùng làm khuôn để tổng hợp lại chỗ bị cắt cho đúng R àso tàv àsửaà hữaààDNá • DNA polymerases rà soát ạ hàDNáà ớiàsaoà h pàv à tha àthếà hữ gà u leotideà sai • ìửaà hữaàsaiàdoàkh gàph à hợp,à à e àsẽàtha àthếà à aseàđ gàt o gà à ặpà ase • Cắtààđểàsửaà,à e àsửaà hữaà u leasesà ắtàđoạ àhưàhỏ gààà v àtổ gàhợpàđoạ àDNáàtha à thếà ới 1 A thymine dimer distorts the DNA molecule. 2 A nuclease enzyme cuts the damaged DNA strand at two points and the damaged section is removed. Nuclease DNA polymerase 3 Repair synthesis by a DNA polymerase fills in the missing nucleotides. DNA ligase 4 DNA ligase seals the Free end of the new DNA To the old DNA, making the strand complete. ìửaàlỗiàDNá Sai sót trên mạch DNA bên trái DNA nucleoses cắt vùng sai sót DNA polymerase tổng hợp một đoạn mới bên mạch trái dùng mạch phải làm khuôn DNA ligase nối liền chỗ đứt mạch trái Có rất nhiều enzyme đặc hiệu làm nhiệm vụ dò tìm và sửa chữa sai sót trên phân tử DNA