Trần Thị Thanh Thanh Ch Luận văn Th c sĩ Sinh học ng 2 – V T LI U VÀ PH NG PHÁP 2.1. Thi t b , hóa ch t, v t li u 2.1.1. Thi t b và d ng c - Máy điện biến n p (BTX ECM 399) - Máy gel doc (Biorad) - Máy - Máy ly tâm l nh Centrifuge 5810R (Eppendorf) - Máy ly tâm l nh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max - Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf) - Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS) - Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad) - Máy đo quang phổ - T 37 oC - T lắc - Bể điều nhiệt - T đông sâu -80 oC - T l nh -20 oC - T mát 4oC - Cân phân tích - Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml - Cuvette 2 ml; 0,2 ml - Và các d ng c chuyên dùng khác heat block techne (Dri-block DB-2D) 2.1.2. Hóa ch t 2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid - Bộ kít tách chiết plasmid c a Qiagen 2.1.2.2. Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR Trang 15 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Th c sĩ Sinh học Bộ kít tinh s ch s n phẩm PCR c a Qiagen 2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose - Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose c a Qiagen 2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn Các enzyme cắt giới h n được cung cấp b i Biolab: SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, BglII. Các thành phần c a ph n ứng cắt được sử d ng theo hướng dẫn c a nhà s n xuất. 2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR Các thành phần cần thiết cho ph n ứng PCR được cung cấp b i Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành phần ph n ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1 Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR. Thành ph n N ng đ cuối Taq buffer 10X 1X MgCl2 25 mM 1 mM dNTPs 25 mM 0.2 mM Taq polymerase 5 U/l 0.04 U Mồi xuôi 10 mM 0.2 mM Mồi ngược 10 mM 0.2 mM H2 O Thể tích cho 1 ph n ng (V = 25 µl) 2,5 l 1 l 0,2 l 0,2 l 0,5 l 0,5 l 19,1 l 2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck). Trang 16 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.1.2.7. Thang DNA Thang DNA được cung cấp b i Fermentas bao gồm: - Thang DNA 100 bp - Thang DNA 1 kb - Thang DNA 1 kb plus (a) (b) (c) Hình 2.1. Thang DNA (a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus 2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp - Glycerol 10% - CaCl2 1M 2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện biến nạp - Glycerol 10% - Nước cất vô trùng Trang 17 Trần Thị Thanh Thanh 2.1.3. Môi tr Luận văn Th c sĩ Sinh học ng 2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami) Trypton 10 g Yeast extract 5g NaCl 10 g Nước cất đ 1000 ml 2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) BHI (Merk) 37 g Nước cất đ 1000 ml Môi trư ng th ch có thành phần như môi trư ng lỏng bổ sung thêm 1,5% agar. Các lo i kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin, kanamycin được bổ sung vào môi trư ng với nồng độ cuối là 50 µg/ml. X gal được sử d ng nồng độ cuối là 40 µg/ml. 2.1.4. Chủng vi sinh v t Các ch ng vi sinh vật sử d ng trong đề tài được cung cấp b i Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm: - Ch ng Edwardseilla ictaluri hoang d i S7 - Ch ng Escherichia coli: E.coli DH5α; E. coli DH5α λpir; E. coli SM10 λpir 2.1.5. plasmid 2.1.5.1. Plasmid pKD4 - Kích thước 3267 bp. - Mang trình tự kh i đầu sao chép ori6K gamma. - Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình tự FRT. - Được sử d ng để t o cassette 1 STEP. Trang 18 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Hình 2.2. Plasmid pKD4 2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300 - Kích thước 8958 bp. - Mang gen kháng kanamycin. - Được sử d ng làm b n mẫu để khuếch đ i đo n gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette. Hình 2.3. Plasmid pCAMBIA 1300 Trang 19 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy - Kích thước 3015 bp. - Có gắn thêm T - Mang gen kháng ampicillin và trình tự kh i đầu sao chép f1 ori. - Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α c a β galactosidase giúp chọn vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu qu nối. lọc những khuẩn l c có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh c a khuẩn l c. - Plasmid pGEM-T Easy được sử d ng để nhân dòng. Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt - Kích thước 2974 bp. - Mang gen kháng ampicillin giúp cho sự chọn lọc khuẩn l c chứa plasmid. - Mang gen gây độc eco47IR giúp cho sự chọn lọc những khuẩn l c có gen chèn. - Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đo n DNA d ng đầu bằng. - Plasmid pJET1.2/blunt được sử d ng để nhân dòng. Trang 20 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5. Plasmid pKD46 - Kích thước 6329 bp. - Mang gen kháng kanamycin. - Mang hai trình tự kh i đầu sao chép repA101ts và oriR101. Sự kh i đầu sao chép repA101ts nh y c m với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được - 37oC – 42oC. Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red được điều khiển b i promoter ParaB. Promoter ParaB tăng cư ng s n xuất λ Red khi có arabinose. - Mang gen kháng ampicillin. - Sử d ng plasmid pKD46 biến n p vào E. ictaluri để tận d ng hệ thống tái tổ hợp λ Red. Trang 21 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Hình 2.6. Plasmid pKD46. 2.1.5.6. Plasmid pGP704 - Kích thước 3705 bp. - Mang trình tự kh i đầu sao chép oriR6K, cần ph i có protein π do gen pir mã hóa mới nhân lên được. Do đó, plasmid chỉ được duy trì trong những ch ng có gen pir như E. coli DH5α λpir; E. coli SM10 λ pir. - Mang gen kháng ampicillin. Hình 2.7. Plasmid pGP704 Trang 22 Trần Thị Thanh Thanh 2.2. Ph Luận văn Th c sĩ Sinh học ng pháp nghiên c u 2.2.1. T o dòng E. coli DH5α mang đo n gen wzz của E. ictaluri 2.2.1.1. Thi t k m i Dựa vào trình tự gen wzz c a E. ictaluri (NC_012779) từ ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR1 để khuyếch đ i gen wzz kích thước 1038 bp. Mồi WF1 mang trình tự nhận biết c a SalI, mồi WR1 mang trình tự nhận biết c a EcoRI và có trình tự như sau: WF1: 5’-GTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ WR1: 5’-GAATTCTCAGATCCGTGCACGACG-3’ 2.2.1.2. Khu ch đ i và thu nh n đo n gen wzz của E. ictaluri Ly trích DNA bộ gen E. ictaluri theo quy trình sau: - Cấy 1 khuẩn l c E. ictaluri vào 5 ml môi trư ng BHI colistin, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC, 16 gi . - Li tâm 3 ml dịch nuôi cấy - Bỏ dịch nổi, lấy cặn. - Hòa tan cặn vào 1 ml nước cất vô trùng. - Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút. - Bỏ dịch nổi, thu cặn. - Bổ sung 200 µl TE 1X vô trùng, hòa tan cặn. - 6000 vòng/phút, 5 phút. 950C, 10 phút. - Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút. - Thu dịch nổi, b o qu n - 20oC. DNA bộ gen E. ictaluri được sử d ng làm b n mẫu cho ph n ứng PCR khuếch đ i đo n gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. S n phẩm PCR được tinh s ch qua cột để dòng hóa. Trang 23 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.2.1.3. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pGEM-T Easy mang đo n gen wzz (pGEMT::wzz) Taq DNA polymerase có ho t tính terminal transferase, thêm deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ c a s n phẩm PCR. Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) đầu 3’c a c hai bên. T nhô ra vị trí gắn tăng hiệu qu c a quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tự đóng vòng c a vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A c a s n phẩm PCR. Nh vậy, ph n ứng nối x y ra dễ dàng. Thành phần ph n ứng nối như sau: 2X buffer 5l S n phẩm PCR 3l pGEM-T Easy 1l DNA T4 ligase 1l Ph n ứng nối được thực hiện nhiệt độ phòng trong 1 gi . 2.2.1.4. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Các tế bào E. coli được phát triển pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có kh năng kết dính DNA (kh n p). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 t o ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nh hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trư ng không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trư ng chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn l c chứa plasmid. Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau: - Cấy 1 khuẩn l c E. coli vào 5 ml môi trư ng LB lỏng. Nuôi cấy qua đêm điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC. - Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trư ng LB lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 c a dịch nuôi cấy đ t kho ng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4). Trang 24 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Th c sĩ Sinh học Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml l nh. Ngâm trong nước đá 5 - 10 phút. Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh. 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Ly tâm thu sinh khối tế bào - Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M l nh. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M l nh. Để trên đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2 ml glycerol l nh 50% để đ t nồng độ glycerol cuối cùng là 10%. - Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm l nh nhanh trong ethanol 100o - 80oC. 2.2.1.5. Bi n n p plasmid tái t h p pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α - Trộn đều, nhẹ nhàng 10 l ph n ứng nối ( bước 2.2.1.3) vào 100 µl tế bào E. coli kh n p. Giữ trong bể đá 10 phút. - Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 42oC trong 2 phút. - Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bể đá trong 1 – 2 phút. - Cho vào 250 µl môi trư ng LB. Nuôi cấy lắc - Lấy 100 µl trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và X – gal 37oC, 1 gi . (40 µg/ml). - 37oC, qua đêm. 2.2.1.6. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c Vector pGEM-T Easy chứa gen lacZα mã hóa cho tiểu phẩn α c a enzyme β- galactosidase. Vùng MCS nằm trong gen lacZα giúp chọn lọc vector có gen chèn dựa vào màu sắc trắng/xanh c a khuẩn l c. Các tế bào E. coli biến n p được sàng lọc trên môi trư ng LB – amp – Xgal. Khuẩn l c chứa vector có gen chèn có màu trắng. Khuẩn l c chứa vector không có gen chèn có màu xanh. Trang 25 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Lựa chọn các khuẩn l c có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện c a đo n gen wzz bằng phương pháp PCR khuẩn l c với cặp mồi M13F/M13R. Cặp mồi M13F/M13R nằm hai bên MCS c a vector pGEM-T Easy cho phép xác định đo n gen wzz có được chèn vào hay không. Cặp mồi có trình tự như sau: M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’ M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’ 2.2.1.7. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện c a gen wzz trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau: Plasmid pGEM-T::wzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl SalI (20 U/µl) 1 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2 O 15 µl 2.2.1.8. Gi i trình tự gen wzz Plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz sau khi đã kiểm tra bằng ph n ứng PCR và ph n ứng cắt được dùng để gi i trình tự gen wzz bằng các cặp mồi M13F/M13R; WFsq/WRsq. Cặp mồi WFsq/WRsq có trình tự như sau: WFsq: 5’-CTGCGTAGCCCCTATTATCAGC-3’ WRsq: 5’-TGAAACGCCGCGTCCAAAACC-3’ Trang 26 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.2.2. T o chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 2.2.2.1. Chuẩn b t bào kh n p E. ictaluri bằng ph ng pháp đi n bi n n p Sử d ng điện trư ng m nh trong một th i gian ngắn sẽ làm t m th i mất tính ổn định c a màng tế bào. Khi đó, màng tế bào có kh năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trư ng xung quanh. Nh vậy mà DNA hoặc RNA có thể được chuyển vào tế bào. Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri được tiến hành như sau: - Cấy 1 khuẩn l c E. ictaluri vào 5 ml môi trư ng BHI lỏng. Nuôi cấy qua đêm - điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC. Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trư ng BHI lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC cho đến khi OD600 đ t kho ng 0,8 – 1.0. - Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml l nh. Ngâm trong nước đá 10 phút. Các thao thác tiếp theo được thực hiện trong đá lạnh 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. - Ly tâm thu sinh khối tế bào - Huyền phù sinh khối tế bào trong trong 50 ml nước l nh. Ly tâm 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối trong 50 ml glycerol l nh 10%. Ly tâm 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. (bước này được lặp l i 2 lần). - Huyền phù sinh khối trong 2 ml glycerol l nh 10% . Sau đó, chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi tube 1,5 ml. Sử d ng để biến n p ngay hoặc làm l nh nhanh trong ethanol 100o và b o qu n - 80 oC. 2.2.2.2. Bi n n p plasmid pKD46 vào E. ictaluri. - Trộn 100 ng plasmid pKD46 vào 100 µl tế bào E. ictaluri kh n p. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. - trên đá 20 phút. Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette l nh, lắc nhẹ để các tế bào lắng xuống dưới đáy. Trang 27 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Th c sĩ Sinh học Đặt cuvette vào máy điện biến n p. Chỉnh máy điện biến n p mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms. - Sau đó cho ngay 1ml môi trư ng BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới. - Nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút. - Trãi dịch tế bào lên môi trư ng BHI chứa ampicillin (50 µg/ml), colistin (50 28oC trong 48 – 72 gi . µg/ml). 2.2.2.3. Kiểm tra dòng t bào E. ictaluri mang pKD6 bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c mọc trên môi trư ng BHI – ampcillin – colistin được nuôi cấy để tách plamid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n với EcoRI. Thành phần ph n ứng cắt như sau: Plasmid kiểm tra 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2 O 16 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . 2.2.2.4. Chuẩn b t bào kh n p E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng ph ng pháp đi n bi n n p Plasmid pKD46 s n xuất enzyme tái tổ hợp λ Red. Quá trình s n xuất λ Red được tăng cư ng khi có L – arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào kh n p E. ictaluri::pKD46, L – arabinose được bổ sung để tăng cư ng sự s n xuất enzyme tái tổ hợp. Các bước chuẩn bị tế bào kh n p giống như trong m c 2.2.2.1. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối là 10 mM. Tế bào kh n p được sử d ng liền để không mất ho t tính c a enyme tái tổ hợp λ red. Trang 28 Trần Thị Thanh Thanh 2.2.3. Knockout gen wzz bằng ph Luận văn Th c sĩ Sinh học ng pháp 1 STEP Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 2.2.3.1. Thi t k m i Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đo n gen wzz c a E. ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để t o cassette 1 STEP chứa gen kháng kamamycin giữa với hai đầu là 2 trình tự tương đồng trên E. ictaluri. Mồi F1 bao gồm đo n P1 là priming site 1 c a pKD4 và đo n H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. Mồi R1 bao gồm đo n P2 là priming site 2 Trang 29 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học c a pKD4 và đo n H2 (50 bp) nằm bên ph i gen wzz. Cặp mồi F1/R1 có trình tự như sau: F1: 5’CGACAGGCATACATGTCTAACGGCCCTAGTCGGCCATAA AGGGAAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’ R1: 5’GCCCGCTGGCACGGATCGGCCAATTCCCTGTTAAGCGTT AACGCTGGCGCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’ 2.2.3.2. Ph n ng PCR t o cassette 1 STEP Thực hiện ph n ứng PCR trên b n mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để t o cassette 1 STEP. S n phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau đó, s n phẩm PCR được tinh s ch qua cột và sử d ng để biến n p vào E. ictaluri::pKD46. 2.2.3.3. Bi n n p cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 - Trộn 100 ng s n phẩm PCR vào 100 µl tế bào E. ictaluri::pKD46 kh n p vừa mới chuẩn bị. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. - trên đá 20 phút. Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette l nh, lắc nhẹ để các tế bào lắng xuống dưới đáy. - Đặt cuvette vào máy điện biến n p. Chỉnh máy điện biến n p mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms. - Sau đó cho ngay 1ml môi trư ng BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới. 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút. - Nuôi cấy lắc - Trãi dịch tế bào lên môi trư ng BHI chứa colistin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml). 28oC trong 36 – 48 gi . 2.2.4. Knockout gen wzz bằng ph ng pháp 2 STEP Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để x y ra tái tổ hợp là khác nhau mỗi loài vi khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia …chỉ cần trình tự 50 nucleotide tương đồng là đ để x y ra sự tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như Y.pseudomonas, Vibrio cholerae… đòi hỏi ph i có trình tự đo n tương đồng dài hơn Trang 30 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học mới có thể x y ra tái tổ hợp tương đồng. Do đó, bên c nh cassette 1 STEP có đo n tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide). Sử d ng phương pháp 2 STEP PCR để t o cassette 2 STEP. Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.2. Sơ đồ 2.2. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP Trang 31 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.2.4.1. Thi t k m i Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đ i đo n đầu c a gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đ i đo n cuối c a gen wzz (W2, kích thước 405 bp). WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp lo i bỏ gen kháng kanamycin những bước tiếp theo c a đề tài. Cặp mồi có trình tự như sau: WF2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG CACAGGCGATCTATCAGC-3’ WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC ACTCCCCTCTTTATGACG-3’ Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin c a pKD4 trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đ i đo n gen kháng kanamycin. KF và KR cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên. S n phẩm PCR (Km) có kích thước 863 bp. Cặp mồi có trình tự như sau: KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGATGGATTGC-3’ KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’ 2.2.4.2. Ph n ng PCR t o cassette 2 STEP Để t o cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước ph n ứng PCR (2 step PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 ph n ứng PCR để thu các đo n W1, W2 và Km. - Ph n ứng PCR sử d ng DNA E. ictaluri làm b n mẫu với cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đ i đo n W1. - Ph n ứng PCR sử d ng DNA E. ictaluri làm b n mẫu với cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đ i đo n W2. - Ph n ứng PCR sử d ng pKD4 làm b n mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch đ i đo n Km. Trang 32 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Sau khi thu được các s n phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ và trộn chung 3 đo n (0,3 pmol mỗi đo n) để làm b n mẫu cho ph n ứng PCR lần 2. Ph n ứng PCR lần 2 sử d ng cặp mồi WF1/WR1 cho s n phẩm 2 STEP kích thước 1668 bp. 2.2.4.3. Bi n n p cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 Các bước biến n p cassette 2 STEP được thực hiện như đối với cassette 1 STEP trong m c 2.2.3.3. Trang 33 Trần Thị Thanh Thanh 2.2.5. Knockout gen wzz bằng ph Luận văn Th c sĩ Sinh học ng pháp sử d ng suicide plasmid pGP704 Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp sử d ng suicide plasmid pGP704 được tiến hành như trong Sơ đồ 2.3. Sơ đồ 2.3. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 Trang 34 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học 2.2.5.1. T o dòng E. coli DH5α ch a plasmid pJET1.2/blunt mang đo n đ u của gen wzz a. Thi t k m i Dựa vào trình tự c a gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FHwzz/RHwzz để khuếch đ i đo n đầu c a gen wzz (Hwzz, kích thước 388 bp). FHwzz có trình tự cắt c a SalI, RHwzz có trình tự cắt c a BamHI và có trình tự như sau: FHwzz: 5’-AAGTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ RHwzz: 5’-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3’ b. Khu ch đ i và thu nh n đo n Hwzz của E. ictaluri DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong m c 2.2.1.2. và được sử d ng làm b n mẫu cho ph n ứng PCR khuếch đ i đo n Hwzz bằng cặp mồi FHwzz/RHwzz. S n phẩm PCR có kích thước 404 bp được tinh s ch qua cột để dòng hóa. c. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pJET1.2/blunt mang đo n Hwzz (pJET::Hwzz) Vector pJET1.2/blunt là vector m ch thẳng đầu bằng. Vì vậy đo n Hwzz được chèn vào ph i đầu bằng. Do đó, trước khi nối, ph i thực hiện ph n ứng cắt đuôi A c a s n phẩm PCR do Taq DNA polymerase thêm vào. Thành phần ph n ứng như sau: 10 l 2X buffer 1 l S n phẩm PCR 6 l H2 O DNA blunting enzyme 1 l Trộn đều, nhẹ nhàng trong kho ng 30 giây và 70oC trong 5 phút để bất ho t enzyme. Sau đó, để trên đá 1 phút và bổ sung các thành phần sau để tiếp t c ph n ứng nối: Trang 35 Trần Thị Thanh Thanh pJET1.2/blunt T4 ligase Ph n ứng nối được thực hiện Luận văn Th c sĩ Sinh học 1 l 1 l nhiệt độ phòng trong 15 phút. d. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như trong m c 2.2.1.4. e. Bi n n p plasmid tái t h p pJET::Hwzz vào E. coli DH5α Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và 37oC trong 16 gi . f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c Vector pJET1.2/blunt tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới h n gây chết sau khi biến n p và không nhân lên được. Kết qu là chỉ có các dòng tái tổ hợp xuất hiện trên đĩa nuôi cấy (khuẩn l c trắng). PCR khuẩn l c bằng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra sự hiện diện c a đo n chèn Hwzz. Cặp mồi được thiết kế hai bên trình tự MCS c a pJET1.2/blunt và có trình tự như sau: FpJET : 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' g. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với SalI và BamHI để kiểm tra sự hiện diện c a Hwzz trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau: Plasmid pJET::Hwzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl SalI (20 U/µl) 1 µl H2 O 15 µl Trang 36 Trần Thị Thanh Thanh Ph n ứng cắt được thực hiện Luận văn Th c sĩ Sinh học 37oC trong 3 gi . h. Gi i trình tự đo n Hwzz Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng ph n ứng PCR và ph n ứng cắt được dùng để gi i trình tự đo n Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET. 2.2.5.2. T o dòng E. coli DH5α ch a plasmid pJET1.2/blunt mang đo n cuối của gen wzz a. Thi t k m i Dựa vào trình tự c a gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FTwzz/RTwzz để khuếch đ i đo n cuối c a gen wzz (Twzz, kích thước 405 bp). FTwzz có trình tự cắt c a BamHI, RTwzz có trình tự cắt c a XbaI và có trình tự như sau: FTwzz : 5’-AAGGATCCGTGGCACAGGCGATCTATCAGC-3’ RTwzz : 5’-AATCTAGATCAGATCCGTGCACGACG-3’ b. Khu ch đ i và thu nh n đo n Twzz của E. ictaluri DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong m c 2.2.1.2. và được sử d ng làm b n mẫu cho ph n ứng PCR khuếch đ i đo n Twzz bằng cặp mồi FTwzz/RTwzz. S n phẩm PCR có kích thước 421 bp được tinh s ch qua cột để dòng hóa. c. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pJET1.2/blunt mang đo n Twzz (pJET::Twzz) Ph n ứng nối được thực hiện như đối với đo n Hwzz trong phần c c a m c 2.2.5.1. d. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như trong m c 2.2.1.4. e. Bi n n p plasmid tái t h p pJET::Twzz vào E. coli DH5α Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và 370C trong 16 gi . f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c Trang 37 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học PCR khuẩn l c sử d ng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đo n Twzz chèn vào vector. g. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với BamHI và XbaI để kiểm tra sự hiện diện c a đo n Twzz trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau: Plasmid pJET::Twzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl XbaI (20 U/µl) 1 µl H2 O 15 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . h. Gi i trình tự đo n Twzz Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng ph n ứng PCR và ph n ứng cắt được dùng để gi i trình tự đo n Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET. 2.2.5.3. T o dòng E. coli DH5α ch a plasmid pJET1.2/blunt mang đo n đ u (Hwzz) và đo n cuối (Twzz) của gen wzz a. Ph n ng cắt gi i h n Ph n ứng cắt giới h n được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho ph n ứng nối t o plasmid tái tổ hợp pJET mang c hai đo n Hwzz và Twzz. Đầu tiên là ph n ứng cắt m vòng plasmid pJET::Hwzz bằng enzyme BamHI và XbaI. Ph n ứng cắt có thành phần như sau: Plasmid JET::Hwzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl XbaI (20 U/µl) 1 µl H2 O 15 µl Trang 38 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . Sau đó, s n phẩm cắt được tinh s ch bằng phương pháp t a với ethanol 100o để chuẩn bị cho ph n ứng nối.Tiếp theo là ph n ứng cắt plasmid pJET::Twzz cũng bằng enzyme BamHI và XbaI để thu đo n Twzz. Thành phần ph n ứng cắt như sau: Plasmid JET::Twzz 15 µl 1 X NE Buffer 2 (10 X) 5 µl BamHI (20 U/ µl) 2 µl XbaI (20 U/ µl) 2 µl H2 O 26 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . Đo n Twzz được tinh s ch qua gel agarose để chuẩn bị cho ph n ứng nối. b. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pJET1.2/blunt mang đo n Hwzz và Twzz (pJET::HTwzz) Các s n phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để t o plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz. Ph n ứng nối có thành phần như sau: Plasmid pJET::Hwzz m vòng 3µl Đo n Twzz 10µl T4 DNA ligase buffer (10X) 2µl T4 DNA ligase (400 U/µl) 1µl H2 O 4 µl Ph n ứng nối được thực hiện nhiệt độ phòng trong 45 phút. c. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như trong m c 2.2.1.4. d. Bi n n p plasmid tái t h p pJET::HTwzz vào E. coli DH5α Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và 370C trong 16 gi . e. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c Trang 39 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học PCR khuẩn l c sử d ng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz. f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với SalI và XbaI để kiểm tra plasmid tái tổ hợp. Ph n ứng cắt có thành phần như sau: Sau khi Plasmid pJET::HTwzz 10 µl NE Buffer 3 (10 X) 3µl SalI (20 U/µl) 1 µl H2 O 16 µl 37oC, 3 gi , hỗn hợp ph n ứng được t a bằng ethanol 1000 và tiếp t c cắt bằng XbaI. Thành phần và điều kiện như sau: H2 O 26 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl XbaI (20 U/µl) 1 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . 2.2.5.4. T o dòng E. coli DH5α ch a plasmid pJET1.2/blunt mang đo n gen kháng kanamycin t pCAMBIA 1300 a. Thi t k m i Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin (AF234296) c a pCAMBIA 1300 trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FKm/RKm để khuyếch đ i đo n gen kháng kanamycin 1219 bp. Cặp mồi này được gắn trình tự FRT và vị trí cắt c a enzyme BamHI có trình tự như sau: FKm: 5’-AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCG GAATAGGAACTTC CCAGCCAGCCAA-3’ RKm: 5’-AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGT Trang 40 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học ATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATCCAGT-3’ b. Khu ch đ i và thu nh n đo n gen kháng kanamycin t plasmid pCAMBIA 1300 Thực hiện ph n ứng PCR trên b n mẫu là plasmid pCAMBIA 3000 với cặp mồi FKm/RKm để khuếch đ i đo n gen kháng kanamycin. S n phẩm PCR có kích thước 1327 bp được tinh s ch qua cột để dòng hóa. c. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pJET 1.2/blunt mang đo n gen kháng kanamycin (pJET::KmR) Ph n ứng nối được thực hiện như phần c c a m c 2.2.5.1. d. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như trong m c 2.2.1.4. e. Bi n n p plasmid tái t h p pJET::KmR vào E. coli DH5α Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Gen kháng kanamycin được chèn vào giúp những dòng tế bào chứa plasmid tái tố hợp có thể kháng được kanamycin. Vì vậy, tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml), 37oC trong 16 gi . f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c PCR khuẩn l c sử d ng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đo n gen kháng kanamycin chèn vào vector. g. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với BamHI để kiểm tra sự hiện diện c a đo n gen 10µl Plasmid pJET::Km Trang 41 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học NE Buffer 3 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl H2 O 16 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . 2.2.5.5. T o dòng E. coli DH5α mang plasmid ch a cassette HTK (pJET::HTK) Cassette HTK chứa gen kháng kanamycin với hai bên là đo n đầu và đo n cuối c a gen wzz. a. Ph n ng cắt gi i h n Ph n ứng cắt giới h n được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho ph n ứng nối để t o plasmid tái tổ hợp pJET mang cassette HTK. Đầu tiên là ph n ứng cắt m vòng plasmid pJET::HTwzz bằng BamHI. Ph n ứng cắt có thành phần như sau: Plasmid JET::HTwzz 10 µl NE Buffer 3 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 2 µl H2 O 15 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . S n phẩm cắt được tinh s ch bằng phương pháp t a với ethanol 100o để chuẩn bị cho ph n ứng nối.Tiếp theo là ph n ứng cắt plasmid pJET::KmR cũng bằng enzyme BamHI để thu đo n KmR. Thành phần ph n ứng cắt như trong phần g c a m c 2.2.5.4. Đo n KmR được tinh s ch qua gel agarose để chuẩn bị cho ph n ứng nối. b. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pJET::HTK Các s n phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để t o plasmid tái tổ hợp pJET::HTK. Ph n ứng nối có thành phần như sau: Plasmid pJET::HTwzz m vòng 3 µl Đo n KmR 10 µl T4 DNA ligase buffer (10X) 2 µl T4 DNA ligase (400 u/ µl) 1 µl Trang 42 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học H2 O 4 µl Ph n ứng nối được thực hiện 16oC, qua đêm. c. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như trong m c 2.2.1.4. d. Bi n n p plasmid tái t h p pJET::HTK vào E. coli DH5α Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) và 37oC trong 16 gi . e. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c PCR khuẩn l c sử d ng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET::HTK. f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với BglIIđể kiểm tra plasmid tái tổ hợp. Ph n ứng cắt có thành phần như sau: Plasmid pJET::HTK 15 µl NE Buffer 3 (10 X) 5 µl BglII (20 U/µl) 4 µl H2 O 26 µl Ph n ứng được thực hiện 37oC trong 3 gi . 2.2.5.6. T o dòng t bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái t h p pGP704::HTK a. Ph n ng cắt gi i h n Trang 43 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học Ph n ứng cắt giới h n được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho ph n ứng nối để t o plasmid tái tổ hợp pGP704 mang cassette HTK. Đầu tiên là ph n ứng cắt m vòng plasmid pGP704 bằng enzyme BglII. Ph n ứng cắt có thành phần như sau: Plasmid pGP704 10 µl NE Buffer 3 (10 X) 3 µl BglII (20 U/µl) 2 µl H2 O 15 µl Ph n ứng cắt được thực hiện 37oC trong 3 gi . S n phẩm cắt được tinh s ch bằng phương pháp t a với ethanol 100ođể chuẩn bị cho ph n ứng nối. Tiếp theo là ph n ứng cắt plasmid pJET::HTK cũng bằng BglII để thu cassette HTK. Thành phần ph n ứng cắt như trong phần f c a m c 2.2.5.5. Cassette HTK được tinh s ch qua gel agarose để chuẩn bị cho ph n ứng nối b. Ph n ng nối t o plasmid tái t h p pGP704::HTK Các s n phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để t o plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Ph n ứng nối có thành phần như sau: Plasmid pGP04 m vòng 3µl Cassette HTK 10µl T4 DNA ligase buffer (10X) 2µl T4 DNA ligase (400 u/ µl) 1µl H2 O 4 µl Ph n ứng nối được thực hiện 16oC, qua đêm. c. Chuẩn b t bào kh n p E. coli DH5α λpir bằng ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như đối với tế bào E. coli DH5α trong m c 2.2.1.4. d. Bi n n p plasmid tái t h p pGP704::HTK vào E. coli DH5α λpir Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) và trong 16 gi . Trang 44 37oC Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học e. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c PCR khuẩn l c sử d ng cặp mồi FpGP704/RpGP704 để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Cặp mồi có trình tự như sau: FpGP704: 5'-GTTCCGCGCACATTTCC -3' RpGP704: 5'-GAATTCCCGGGAGAGCTCGATA -3' f. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các khuẩn l c cho kết qu PCR khuẩn l c dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng ph n ứng cắt giới h n. - Plasmid được tách chiết sử d ng bộ kit c a Qiagen. - Ph n ứng cắt giới h n với BglII để kiểm tra plasmid tái tổ hợp. Ph n ứng cắt có thành phần như phần a c a m c 2.2.5.6. 2.2.5.7. Bi n n p plasmid tái t h p pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để t o chủng E. ictaluri đ t bi n gen wzz - Plasmid pGP704::HTK được tách chiết sử d ng bộ kit c a Quiagen. - Biến n p plasmid vào E. ictaluri::pKD46 như trong m c 2.2.3.3. 2.2.5.8. T o dòng E. coli SM10 λpir ch a plasmid tái t h p pGP704::HTK a. Chuẩn b t bào E. coli SM10 λpir theo ph ng pháp hóa bi n n p Tế bào kh n p được chuẩn bị như đối với tế bào E. coli DH5α trong m c 2.2.1.4. b. Bi n n p plasmid tái t h p pGP704::HTK vào E. coli SM10 λpir Plasmid pGP704::HTK được tách chiết sử d ng bộ kit c a Quiagen. Biến n p được thực hiện như trong m c 2.2.1.5. Tế bào biến n p được trãi trên môi trư ng LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin(50 µg/ml) và gi . c. Kiểm tra dòng bi n n p bằng PCR khuẩn l c Các bước được thực hiện như trong phần e c a 2.2.5.6. Trang 45 37oC trong 16 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Th c sĩ Sinh học d. Kiểm tra dòng bi n n p bằng ph n ng cắt gi i h n Các bước được thực hiện như trong phần f c a 2.2.5.6. 2.2.5.9. T o chủng E. ictalruri đ t bi n gen wzz bằng ph ng pháp ti p h p Tiếp hợp (Joshua Lederberg và Edward Tatum khám phá vào năm 1946) là sự vận chuyển vật liệu di truyền giữa vi khuẩn cho đến vi khuẩn nhận thông qua sự tiếp xúc tế bào, chuyển gen theo hướng nằm ngang cũng giống như biến n p và t i n p, mặc dù phương pháp biến n p và t i n p không có sự tiếp xúc tế bào với tế bào. Để thực hiện được tiếp hợp, ch ng cho ph i có các yếu tố di truyền di động, thư ng là một yếu tố tiếp hợp, plasmid di động hoặc transposon. - Ch ng vi khuẩn E. coli SM10 λpir là ch ng có các kiểu gen sau: kmR, thi- 1, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA::RP4-2-Tc::Mu, λpir. - Plasmid pGP704 có nguồn gốc từ plasmid pBR322 có chứa AmpR, đã lo i bỏ điểm kh i đầu sao chép (oriE1) nhưng mang điểm kh i đầu sao chép R6K (oriR6K), bình thư ng không nhân lên được mà đòi hỏi ph i có protein П mã hóa từ gen pir. Protein П có thể cung cấp b i prophage (lambda pir) mang gen pir. Plasmid này chứa đo n 1.9-kb BamHI mã hóa mob c a RP4. Vì vậy, pGP704 có thể được di động vào trong ch ng nhận bằng các chức năng chuyển mà được cung cấp RP4, hợp nhất vào trong nhiễm sắc thể c a E. coli SM10. - Cassette chứa gen đột biến chuyển vào pGP704, biến n p vào E. coli SM10 λ pir. Trộn chung E. coli SM10 λpir và E. ictaluri, chuyển lên màng để thực hiện ph n ứng lai, sau khi lai plasmid được vào trong ch ng nhận nhưng không thể nhân lên vì thiếu gen pir, gen đột biến có thể sát nhập vào bộ gen nhiễm sắc thể bằng tái tổ hợp tương đồng mà có sự trao đổi chéo giữa gen trên plasmid và gen tương ứng trên nhiễm sắc thể. Sự chọn lọc này trên môi trư ng LB có chứa kháng sinh kanamycin và colistin. Vì plasmid pGP704 không tự nhân lên được trong ch ng nhận E. ictaluri nên tất c các khuẩn l c E. ictaluri mọc trên môi trư ng có chứa kháng sinh đã có gen đột biến. Qui trình tiếp hợp được thực hiện như sau: Trang 46 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Th c sĩ Sinh học Nuôi ch ng nhận E. ictaluri::pKD46 trên môi trư ng BHI broth có bổ sung 5 ml MgSO4 (10 mM), 2 mg bovine serum albumin (BSA)/ ml,10 µg DNase I/ml và 10mM L – arabinose. - Nuôi ch ng cho E. coli SM10 λpir mang plasmid pGP704::HTK - Trộn E. ictaluri::pKD46 với E. coli SM10 λpir lần lượt theo tỉ lệ 10:1 - Cho vào 5 ml MgSO4 (10 mM), 2 mg bovine serum albumin (BSA)/ ml và 10 µg DNase I/ml - Chuyển 2-3 ml dung dịch trộn lên màng lai cellulose acetate filter (0,45 µm pore size, 33 mm diameter; Millipore ) - Đặt màng lai lên trên môi trư ng BHI agar, chia đĩa petri làm 4 phần, mỗi phần cho 7 ml môi trư ng BHI agar (agar 2%) chứa MgSO4 (10 mM), 2 mg/ ml và 70 µg DNase I/ml và Tris (pH = 7,5), 20 mM. - 28oC , 4h - Ph lên 5 mm agar - Huyền phù vi khuẩn trong trên môi trư ng BHI lỏng có bổ sung 5 ml MgSO4 (10 mM), 2 mg bovine serum albumin (BSA)/ ml và 10 µg DNase I/ml - Votex 10 giây - Pha loãng, tr i đĩa và chọn lọc E. ictaluri đột biến trên môi trư ng BHI kanamycin-colistin 2.2.6. Lo i bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đ t bi n gen wzz Plasmid pKD46 nh y c m với nhiệt độ không nhân lên được 37oC. Vì vậy nuôi cấy điều kiện trên điều kiện 37oC sẽ giúp lo i plasmid pKD46. Nuôi cấy 1 khuẩn l c E. ictaluri đột biến gen wzz điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC, qua đêm. Sau đó tăng nhiệt độ lên 37oC, nuôi cấy qua đêm. Trãi dịch nuôi cấy trên môi trư ng BHI kanamycin. Kiểm tra plasmid pKD46 bằng cách cấy các khuẩn l c vào môi trư ng BHI ampicilin. Các khuẩn l c đã được lo i bỏ plasmid pKD46 sẽ mất kh năng kháng ampicilin và không mọc được trong môi trư ng chứa ampicillin. Trang 47