KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ

1. Giới thiệu chung:

Kính hiển vi điện tử là một thiết bị nghiên cứu quan trọng trong nghiên cứu về
khoa học sự sống và vật liệu (công nghệ nano). Trong lĩnh vực vi rút học, thiết bị
này cho phép quan sát được hình thái siêu cấu trúc của hầu hết các loại vi rút gây
bệnh, các đại phân tử như ADN, ARN, quan sát sự tương tác giữa vi rút gây bệnh
và tế bào vật chủ, các đặc tính hóa miễn dịch tế bào. Trong công nghệ nano, kính
hiển vi điện tử cho phép quan sát cấu trúc, đo các đặc tính, kích thước và hình dạng
của vật liệu cấu trúc nano với độ phân giải lớn hơn đáng kể so với kính hiển vi
quang học.
Giống như kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử cho hình ảnh của vật
liệu trong không gian trực tiếp. Trong khi độ phân giải của kính hiển vi quang học
thông thường là hàng trăm nanomet thì việc sử dụng kính hiển vi điện tử với hình
ảnh của các vật liệu nano là rất phù hợp. Độ phân giải của kính hiển vi được giới
hạn trong khoảng bước sóng của bức xạ sử dụng để thu hình ảnh. (Độ phân giải
không gian thường được lấy là 0,61.λ / NA; trong đó NA là khẩu độ số của hệ
thống quang học), như vậy ngay cả đối với ánh sáng UV, kính hiển vi quang học
có độ phân giải được giới hạn trong khoảng ~ 200 nm. Kính hiển vi điện tử sử dụng
năng lượng của electron )( năng lượng của electron phụ thuộc vào điện thế gia tốc
[3]
) trong vài ngàn electron-volt (eV) ( khoảng ~ 3600 eV, gấp hơn một ngàn lần so
với năng lượng của một photon của ánh sáng thấy~ 2-3 eV có độ phân giải theo lý
thuyết được tính là 0,02 nm. Tuy nhiên, vì sự quang sai của một ống kính điện tử,
độ phân giải thực tế đạt được là ít hơn đáng kể. Độ phân giải khoarng 0,1 nm có thể
thu được với một kính hiển vi điện tử.
2. Lịch sử phát triển:
 Trong những năm 20 của thế kỷ XX, có 2 trong số các thành tựu khoa học đã
tạo tiền để cho sự ra đời của kính hiển vi điện tử:

- Bằng thực nghiệm đã chứng minh sự đúng đắn của thuyết De Broglie (1924) về
tính chất sóng của hạt chuyển động.

- Năm 1926, H.Busch đã chứng minh có thể dùng điện từ trường để điều khiển
chùm tia điện tử đang chuyển động. Tác dụng điều khiển của điện từ trường đối với
chùm điện tử đang chuyển động giống tác dụng của thấu kính thuỷ tinh với ánh
sáng khả kiến.

Năm 1928 - 1929, H.Busch và E.Ruska đã đề suất nghiên cứu thấu kính điện từ
(tiếng anh: electromagnetic lense) bao gồm nguyên lý hoạt động, thiết kế chế tạo.

Năm 1932 công bố phác thảo kính hiển vi điện tử đầu tiên. [1]

Năm 1938, E.Ruska và Van Borries đã thiết kế và chế tạo thành công một
kính hiển vi điện tử cho hãng Siemens&Halske.

Độc lập với nhóm nghiên cứu trên, năm 1939, dưới sự lãnh đạo của các chuyên
gia như E.F.Burton, A.Prebus và J.Hillier, tại trường Toronto (Canada) đã cho ra
đời kính hiển vi điện tử với các thấu kính điện từ.

Ban đầu do sử dụng những thành tựu của khoa học và công nghệ cũ (trước chiến
tranh thế giới thứ 2), các kính hiển vi điện tử truyền qua ( Transmission Electron
Microscope, viết tắt là TEM) có khả năng phân giải bé hơn 2 nanomet (nm). Thời
bấy giờ kính hiển vi tốt nhất chỉ đạt độ phân giải 150 nm.

Sau khi R.Heidenreich bằng phương pháp gia công đã tạo được những lá nhôm
đủ mỏng (~1000nm) để chùm điện tử với điện thế gia tốc 100kV có thể xuyên qua
được đã mở ra hướng mới sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu vật liệu.

Năm 1950: Latta và Hartman chế tạo ra máy cắt siêu mỏng (Ultramicrotome)
dùng lưỡi dao thủy tinh để cắt mẫu vật thành những lát mỏng cỡ vài chục nanomet
đã giúp cho phương pháp hiển vi điện tử trở lên hoàn thiện cả về phương diện thiết
bị và kỹ thuật chuẩn bị mẫu.

Năm 1994, 2 hãng điện tử Japan Electron Optical Laboratory (JEOL) và Hitachi
đã nghiên cứu chế tạo kính hiển vi điện tử JEM-ARM 1250[1] (ARM: Atomic
Resolution Microscope) có điện thế gia tốc 1250kv, đạt độ phân giải 0,105nm.

Hiện nay có hai loại kính hiển vi điện tử chủ yếu đó là kính hiển vi điện tử
truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM), ngoài ra còn có loại kết hợp
tính năng của hai loại kính trên là hiển vi điện tử quét truyền qua (STEM).
3. Kính hiển vi điện tử truyền qua- Transmission Electron Microscope
(TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị dùng để nghiên cứu vi cấu trúc
vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn
mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng
triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi
nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số[2].
Cấu tạo chính của TEM gồm cột kính với các bộ phận từ trên xuống dưới: súng
điện tử, tụ kính, buồng đặt mẫu, hệ thống thấu kính tạo ảnh (vật kính, kính trung
gian, kính phóng); buồng quan sát và bộ phận ghi ảnh. Sơ đồ cấu tạo được trình bày
trong hình 1.
- Một súng bắn điện tử để phát ra
chùm electron đơn sắc.
- Ống kính tụ điện để tập trung các
electron thành một chùm nhỏ.
- Một bình ngưng khẩu độ để hạn
chế các tia bằng cách loại bỏ các
góc cao electron.
- Một giá đỡ mẫu để đặt mẫu .
- Một vật kính để tập trung các
chùm tia truyền.
- Nút tùy kích thước khẩu độ kim
loại để tăng độ phân giải bằng cách
chặn góc cao nhiễu xạ, cũng như để
có được electron bức xạ.
- Vật trung gian và máy chiếu để
phóng to hình ảnh, cho phép ghi lại
hình ảnh đem lại bởi sự truyền các
chùm electron.
Hình 1 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của kính hiển vi
điện tử truyền qua

Cột kính có chân không cao, áp suất 10 -5-10-6 Torr đối với TEM thông thường
và cỡ 10-8-10-10 Torr đối với HR-TEM). Hệ thống bơm chân không, hệ thống điện,
điện tử, hệ thống điều khiển bằng máy tính là những bộ phận kèm theo để đảm bảo
cho quá trình làm việc liên tục của TEM. Đặc trưng cho TEM là các thông số: hệ số
phóng đại M, độ phân giải d và điện áp gia tốc U.
Nguồn phát xạ điện tử trên đỉnh của Kính hiển vi điện tử truyền (súng điện tử)
để phát ra chùm điện tử. Chùm này được tăng tốc trong môi trường chân không
cao, sau khi đi qua tụ kính để tập trung thành một chùm rất mỏng, chùm điện tử tác
động lên mẫu mỏng. Tùy thuộc vào từng vị trí và loại mẫu ( độ dày ) mà chùm điện
tử bị tán xạ ít hoặc nhiều. Mật độ điện tử truyền qua ngay dưới mặt mẫu phản ảnh
lại tình trạng của mẫu, hình ảnh được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung
gian và cuối cùng thu được trên màn huỳnh quang. Do vậy, ảnh hiển vi điện tử
truyền qua là hình ảnh bề mặt dưới của mẫu (ảnh đen trắng) thu được bởi chùm
điện tử truyền qua mẫu [2].

Xét trên nguyên lý, ảnh của TEM vẫn được tạo theo các cơ chế quang học,
nhưng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh
TEM so với ảnh quang học là độ tương phản khác so với ảnh trong KHV quang
học và các loại KHV khác. Nếu như ảnh trong KHV có độ tương phản chủ yếu
đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng thì độ tương phản của ảnh TEM lại chủ yếu
xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử[3].

Hình 2 Ảnh trường sáng (a) và trường tối mẫu hợp kim FeSiBNbCu.

Với độ phân giải cao cỡ 2A°, độ phóng đại từ x50 tới x1.500.000, TEM đóng
vai trò quan trọng trong nghiên cứu siêu cấu trúc sinh vật, vi sinh vật và các vật liệu
nano. Với những kính hiển vi điện tử độ phân giải cao (HR-TEM) để quan sát cấu
trúc mạng của vật liệu nano thì điện thế gia tốc thường yêu cầu khoảng 150 kV trở
lên. Ở Việt Nam vẫn chưa có kính hiển vi điện tử nào hoạt động đạt độ phân giải
cao như HR-TEM tính đến thời điểm hiện tại.
 a. b.

Hình 3[4]. a.Hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua của một virus cúm Tây Ban Nha năm 1918 được
tái tạo lại. b. Virus marburg.

Dù được phát triển từ rất lâu, nhưng đến thời điểm hiện tại, TEM vẫn là một
công cụ nghiên cứu mạnh và hiện đại trong nghiên cứu về cấu trúc vật rắn, được sử
dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, khoa học vật liệu, công nghệ nano, hóa
học, sinh học, y học... và vẫn đang trong quá trình phát triển với nhiều tính năng và
độ mạnh mới.

 Ưu điểm của TEM [3]:

+ Có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tương phản, độ phân giải (kể cả
không gian và thời gian) rất cao đồng thời dễ dàng thông dịch các thông tin về cấu
trúc. Khác với dòng KHV quét đầu dò, TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong
vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh
này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử.

+ Đi kèm với các hình ảnh chất lượng cao là nhiều phép phân tích rất hữu ích
đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu.

 Nhược điểm của TEM [3]:

+ Đắt tiền: TEM có nhiều tính năng mạnh và là thiết bị rất hiện đại do đó giá
thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao ví dụ chân
không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm.
 + Đòi hỏi nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá hủy mẫu (điều này
không thích hợp với nhiều tiêu bản sinh học).

+ Việc điều khiển TEM rất phức tạp và đòi hỏi nhiều bước thực hiện chính xác
cao.

4. Kính hiển vi điện tử quét - Scanning Electron microscope ( SEM )

Cấu tạo chính của SEM gồm cột kính (súng điện tử, tụ kính, vật kính), buồng
mẫu và đầu dò tín hiệu điện tử. Cột kính có chân không cao, áp suất 10 -5-10-6 Torr
đối với SEM thông thường và 10-8-10-9 Torr đối với SEM có độ phân giải cao (FE-
SEM) . Buồng mẫu có thể nằm ở hai chế độ chân không cao hoặc thấp. Hệ thống
bơm chân không, hệ thống điện, điện tử, hệ thống điều khiển và xử lý tín hiệu là
những bộ phận đảm bảo cho sự làm việc liên tục của SEM.
Kính hiển vi điện tử quét là thiết bị có khả năng quan sát bề mặt của mẫu vật,
bao gồm: súng điện tử, tụ kính, buồng tiêu bản, hệ thống đầu dò điện tử, hệ thống
khuếch đại - máy tính và màn hình để quan sát ảnh. Chùm điện tử xuất phát từ súng
điện tử đi qua tụ kính, rồi vật kính, sau đó chùm tia hội tụ và quét trên toàn bộ bề
mặt của mẫu, sự tương tác của chùm điện tử tới với bề mặt mẫu tạo ra các tia khác
nhau (điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger, tia huỳnh quang catot,
tia X đặc trưng...). Hình ảnh hiển vi điện tử quét được phản ảnh lại bởi các điện tử
thứ cấp và điện tử tán xạ ngược thu được nhờ các đầu dò gắn bên sườn của kính.
Tia X đặc trưng có khả năng phản ánh thành phần nguyên tố trong mẫu phân tích
nhờ bộ phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS – Energy Dispersive X- ray
Spectroscopy). Đặc trưng của SEM là các thông số: độ phóng đại M, độ phân
giải d và điện áp gia tốc U.
Mặc dù không thể có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng
kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu
vật và có thể hoạt động ở chân không thấp. Một điểm mạnh khác của SEM là các
thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng.
Một điều khác là giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM
phổ biến hơn rất nhiều so với TEM[5].

a. b.

Hình 4 Một số hình ảnh chụp bằng SEM

a. Đầu kiến b. Tóc
5. Kính hiển vi điện tử quét - Scanning Electron microscope ( SEM )
Kính hiển vi điện tử quét truyền qua là loại kính hiển vi điện tử có khả năng kết
hợp cả hai tính năng quét và truyền qua, tức là có khả năng vừa phản ánh cầu trúc
bên trong của mẫu đồng thời cũng có thể phản ánh được bề mặt, thành phần của
mẫu vật. Tuy nhiên, loại kính này thường dùng nguồn điện tử là nguồn phát xạ
trường (field emission gun), chân không trong toàn bộ cột kính phải rất cao cỡ 10-
9
– 10-10 Torr. Loại kính này sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu vật liệu, ít sử dụng
đối với các tiêu bản sinh vật.
 6. Kết Luận
Ở nước ta, kính hiển vi điện tử hiện nay vẫn là thiết bị quí hiếm, đắt tiền, có
rất ít đơn vị được trang bị đồng bộ về kính hiển vi điện tử, thiết bị chuẩn bị mẫu
và những người có kỹ năng vận hành và khai thác tính năng của kính. Do vậy, một
số đơn vị được trang bị kính nhưng không khai thác được hoặc khai thác bị hạn
chế, gây ra tình trạng lãng phí lớn về thiết bị.
Hiển vi điện tử là một phương pháp nghiên cứu tương đối phức tạp và có nhiều
kỹ thuật khác nhau, tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu, các thiết bị
phụ trợ và hoá chất cũng rất chuyên dụng. Vì vậy, người sử dụng kính hiển vi điện
tử trong nghiên cứu y sinh không những phải am hiểu về siêu cấu trúc tế bào, sinh
hoá, vi sinh, miễn dịch, kiến thức chuyên ngành mà còn cần phải hiểu về các kỹ
thuật chuẩn bị mẫu, khai thác thông tin từ hình ảnh và kiến thức nhất định về vật lý,
hoá học. Mỗi người khi cần nghiên cứu bằng phương pháp hiển vi điện tử thì phải
biết được điều kiện cần chuẩn bị mẫu, chế độ quan sát trên kính, và những thông tin
cần khai thác. Sau khi nhận được những hình ảnh hiển vi điện tử thì phải biết cách
xử lý để làm nổi bật được mục đích nghiên cứu của mình.
7. Tài liệu tham khảo
1. https://vi.wikipedia.org/wiki/K%C3%ADnh_hi%E1%BB%83n_vi_%C4%91
i%E1%BB%87n_t%E1%BB%AD#cite_note-1
2. Nanophotonics- Paras N. Prasas
3. http://www.impe-qn.org.vn/impe-
qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1064&ID=2074
4. https://vi.wikipedia.org/wiki/Virus
5. https://vi.wikipedia.org/wiki/K%C3%ADnh_hi%E1%BB%83n_vi_%C4%91
i%E1%BB%87n_t%E1%BB%AD_qu%C3%A9t