BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỄ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ NGỌC PHƯỢNG Niên khóa : 2012 – 2016 Tháng 6/2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỄ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.) Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN THỊ NGỌC PHƯỢNG Tháng 6/2015  MỤC LỤC CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 5 1.1. Đặt vấn đề 5 1.2. Yêu cầu đề tài 5 1.3. Nội dung thực hiện 6 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 2.1. Sơ lược về cây lúa 7 2.2. Tổng quan 8 2.2.1. Hệ vi sinh vật nội cộng sinh (Endophytic) trong vùng rễ của cây lúa 8 2.2.2. Vi khuẩn Endophytic (Endophytic bacterial) trong vùng rễ của cây lúa 9 2.3. Một số nghiên cứu trên thế giới 9 2.4. Một số nghiên cứu ở Việt Nam 10 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11 3.2. Vật liệu 11 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 11 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu 11 3.2.3. Thiết bị 11 3.2.4. Hóa chất, thuốc thử và môi trường để phân lập vi khuẩn 11 3.2.5. Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR 13 3.3. Phương pháp nghiên cứu 13 3.3.1. Thu nhận mẫu 13 3.3.2. Chuẩn bị môi trường 13 3.3.3. Khử trùng bề mặt mẫu 13 3.3.4. Phân lập và nuôi cấy 14 3.3.5. Nhuộm Gram 14 3.3.6. Khảo sát một số đặc tính sinh hóa 14 3.3.7. Tách chiết DNA 18 3.3.8. Khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng PCR 19 3.3.9. Làm sạch sản phẩm PCR 20 3.3.10. Giải trình tự 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THỜI GIAN DỰ KIẾN 21 4.1. Kết quả 21 4.2. Thời gian 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22  MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây lúa được trồng hơn 7000 năm và là cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới), đặc biệt là các dân tộc Châu Á, trong đó có Việt Nam. Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33 – 34 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia. Nghề nông nghiệp nói chung và nghề trồng lúa nước nói riêng đã góp phần giải quyết được một số vấn đề về an ninh lương thực – thực phẩm, thu nhập hộ gia đình, hạn chế được một khoảng chi phí nhập khẩu lúa gạo. Tuy nhiên, sản xuất lúa bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nhau bao gồm tác động từ môi trường, sâu bệnh hại và một số tác nhân khác như ốc, chuột, … Ngoài ra, thuốc diệt cỏ có chứa các chất độc không tan trong nước cũng là nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng lúa trong sản xuất. Endophytic là một loài sống cộng sinh trong mô thực vât, thường là nấm hoặc vi khuẩn, chúng không gây hại đến vật chủ. Những endophytic này góp phần thúc đẩy tăng trưởng thực vật, chống lại các tác nhân gây bệnh, ức chế nấm gây bệnh, cải thiện sức đề kháng và chuyển hóa một số chất độc không tan trong nước có trong thuốc diệt cỏ. Để cải thiện năng suất và chất lượng lúa trong sản xuất, người ta đã sử dụng hệ vi sinh vật nội cộng sinh (endophytic) trong vùng rễ của cây lúa. Ví dụ các dòng vi khuẩn như Bacillus, Enterobater, Micrococcus, Pseudomonas… Đó là lí do tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỂ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.)” để nhằm xác định được các hệ vi khuẩn nội cộng sinh có lợi cho sự phát triển của cây lúa đồng thời tạo bước tiến cho những nghiên cứu sau này. Yêu cầu đề tài Phân lập hệ vi sinh vật trong vùng Endophytic của rễ lúa. Xác định chủng vi khuẩn cộng sinh trong vùng Endophytic của rễ cây lúa. Xác định được ít nhất một chủng vi khuẩn có lợi đối với sự phát triển của cây lúa. Chủ yếu là chủng Pseudomonas spp. Nội dung thực hiện Khử trùng mẫu: làm sạch mẫu. Phân lập các vi khuẩn trong vùng Endophytic của rễ lúa. Xác định các loài thuộc chủng vi khuẩn có lợi trong quá trình phát triển của cây lúa (nhuộm Gram, test sinh hóa). Kiểm tra bằng PCR khuếch đại vùng gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu sau đó giải trình tự, phân tích BLAST nhằm khẳng định chính xác chủng phân lập.  TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lược về cây lúa Lúa là loài thực vật được canh tác từ lâu đời, thuộc họ Poaceae, gồm hai loài (Oryza sativa L. và Oryza glaberrima), có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận đới khu vực đông nam Châu Á và Châu Phi. Loài Oryza sativa L. là lúa trồng ở Châu Á, và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất hiện rất sớm cách đây khoảng hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho là lúa trồng xuất hiện cách đây 6000 năm, lúa trồng Châu Phi (Oryza glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3500 năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng Châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1800 – 1900 năm. Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố khá rộng, loài Oryza sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia. Diện tích gieo trồng chiếm 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha). Lúa gạo được trồng từ độ cao bằng mực nước biển đến độ cao 3000 m so với mực nước biển. Lúa gạo có thể được trồng trên nhiều loại đất khác nhau như đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn. Những dòng lúa có thể chia được thành 3 nhóm sinh thái: Indica (ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica (được trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới). Có hai dòng được canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica (Bùi Huy Đáp, 1999). Lúa trồng là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái. Thời gian trồng có thể kéo dài từ 75 – 250 ngày. Thân cao từ 70 – 150 cm, đôi khi cao hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2 – 2.5 cm) và dài 50 – 100 cm. Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30 – 50 cm. Hạt là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5 – 12 mm và dày 2 – 3 mm. Cây lúa non được gọi là mạ. Sau khi ngâm ủ, người ta có thể gieo thẳng các hạt lúa đã nảy mầm vào ruộng lúa đã được cày, bừa kỹ hoặc qua giai đoạn gieo mạ trên ruộng riêng để cây lúa non có sức phát triển tốt, sau một khoảng thời gian thì nhổ mạ để cấy trong ruộng lúa chính. Sản phẩm thu được từ cây lúa là lúa. Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngoài thu được sản phẩm chính là gạo và các phụ phẩm là cám và trấu. Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới (chủ yếu ở châu Á và châu Mỹ La Tinh), điều này làm cho nó trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ nhiều nhất. Lúa là loài cây trồng ngắn ngày nhưng cũng có thể coi là dài ngày. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước thuộc Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Ở các nước khác như Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La tinh. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2 – 3 lần (Vương Đình Tuấn, 2000). Tổng quan Hệ vi sinh vật nội cộng sinh (Endophytic) trong vùng rễ của cây lúa Endophytic là một nhóm nội cộng sinh, chúng có thể là nấm hoặc vi khuẩn, sống trong mô thực vật, không gây hại đến vật chủ. Endophytic còn được biết đến trong tảo và địa y. Các Endophytic góp phần thúc đẩy tăng trưởng vật chủ, cải thiện khả năng chịu đựng của cây, chẳng hạn tress, hạn hán, ..., cũng như cải thiện sức đề kháng của vật chủ, chống lại các tán nhân gây bệnh... Endophytic có thể đem lại lợi ích cho vật chủ bằng cách ngăn chặn hay chống lại các vi sinh vật gây bệnh từ môi trường. Sự kết hợp giữa mô thực vật và endophytic tạo thành một “hiệu ứng rào cản”, sản xuất các chất gây ức chế sự phát triển của các tác nhân gây hại. Endophytic có thể được xác định bằng nhiều cách, thường thông qua khuếch đại và giải trình tự DNA. Ngoài ra, còn có thể nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt. Tuy nhiên, một số endophytic không sinh bào tử khi nuôi cấy, nên việc định hình thông qua cấu trúc bào tử gặp nhiều khó khăn và thách thức. Vi khuẩn Endophytic (Endophytic bacterial) trong vùng rễ của cây lúa Vi khuẩn Endophytic là vi khuẩn nội ký sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết các dạng nội ký sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt. Vi khuẩn Endophytic thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Vi khuẩn Endophytic sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiểm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình photphat và cố định đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của vi khuẩn endophytic để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học. Một số loại vi khuẩn endophytic thường gặp như Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Enterobacter... Một số nghiên cứu trên thế giới Những tương tác có lợi giữa thực vật – vi khuẩn thúc đẩy sức khỏe, sự phát triển của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Gần đây, họ đang nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của các chất gây ô nhiễm trong đất. Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn ở rễ (Lindow & Brandl, 2003; Kuiper et al., 2004; berg et al, 2005). Vi khuẩn Endophytic cư trú trong hệ sinh thái thích hợp tương tự như các chồi mầm ở thực vật, điều này làm cho chúng trở thành các tác nhân kiểm soát sinh học (Berg et al., 2005). Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Endophytic có khả năng kiểm soát được mầm bệnh trên thực vật (Sturz & Matheson, 1996; Duijff et al., 1997; Krishnamurthy & Gnanamanickam, 1997), ở côn trùng (Azevedo et al, 2000) và cả ở tuyến trùng (Hallmann et al., 1997, 1998). Trong một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway, 1997) và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Bent & Chanway, 1998). Vi khuẩn Endophytic còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Endophytic có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel et al., 2004). Cùng với việc sản xuất các chất mới, nhiều vi khuẩn Endophytic đã cho thấy khả năng làm giảm các chất ngoại sinh (xenobiotic) hay có thể hoạt động như các vectơ mở đầu cho quá trình đó. Chúng có khả năng kháng kim loại nặng, kháng khuẩn và làm giảm các gốc hữu cơ thông qua tiếp xúc với các hợp chất trong thực vật và đất nơi chúng cư trú. Khả năng làm giảm những chất xenobiotics đang được nghiên cứu cẩn thận để cải tiến kỹ thuật khử độc bằng thực vật (Siciliano et al., 2001; Barac et al., 2004; Germaine et al., 2004, 2006; Porteous-Moore et al., 2006; Ryan et al., 2007a). Bài nghiên cứu này nhằm trình bày tổng quan về các ứng dụng tiềm năng của vi khuẩn Endophytic, đặc biệt là trong lĩnh vực khử độc bằng thực vật và nông nghiệp bền vững. Một số nghiên cứu ở Việt Nam Cao Ngọc Điệp cùng cộng sự đã tiến hành đề tài “Phân lập và nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sự sinh trưởng (Plant Growth Promoting Rhizobacteria – PGPR) từ một số loại rau ăn lá trồng tại thành phố Cần Thơ. Đề tài đã phân lập và nhận diện được bốn dòng vi khuẩn (NBT625, NBT613, NPD721, NPD855) có khả năng cố định đạm, hòa tan lân cao và dòng PBT622 có khả năng tổng hợp IAA cao đồng thời có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng, chúng được chọn để đánh giá hiệu quả của chúng trên rau ăn lá trồng trong chậu và ngoài đồng nhằm tiến tới sản xuất phân sinh học cho rau xanh.  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015. Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Vật liệu Vật liệu thí nghiệm Mẫu rễ lúa thu thập từ các ruộng lúa trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh. Vật liệu nghiên cứu Các dụng cụ cơ bản trong nghiên cứu: đĩa petri, bình xịt cồn, que cấy, ống đong các loại, cốc thủy tinh các loại, bình tam giác các loại, micropipet, ống nghiệm, bình chứa môi trường, cối nghiền mẫu, ống hút, găng tay, ống eppendorf, các vật liệu nghiên cứu khác, v.v… Thiết bị Kính hiển vi, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy, bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng, máy ly tâm, máy PCR, cân điện tử, bộ điện di, các thiết bị khác, v.v… Hóa chất, thuốc thử và môi trường để phân lập vi khuẩn Cồn 75%, NaClO 5%, NH4OH, nước cất Thuốc thử Kovacs, Methyl Red, dung dịch -naphtol 5% trong ethanol, dung dịch KOH 40% trong nước, Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%. Môi trường MR – VP (môi trường Clark – Club) Peptone 5 g/l K2HPO4 5 g/l Dextrose 5 g/l Môi trường Simmons citrate agar NH4H2PO4 1 g/l NaCl 5 g/l MgSO4 0.2 g/l K2HPO4 1 g/l Natri citrate 2 g/l Bromothymol blue 0.08 g/l Agar 12.5 g/l Môi trường MIU (Motility Indol Urea) Tryptone 30 g/l KH2PO4 1 g/l NaCl 5 g/l Phenol red 1% 2.5 ml Agar 4g (thạch mềm) Môi trường Yeast manitol agar (YEM) Yeast extract 1g/l Manitol 10g/l K2PO4 0.5g/l MgSO4 0.2g/l NaCl 0.1g/l CaCO3 1g/l Agar 15g/l Môi trường dinh dưỡng (nutrient agar) Pepton 5g/l Chiết xuất từ thịt bò/ nấm men 3g/l NaCl 5g/l Agar 15g/l Nước cất 1l Môi trường Pseudomonas Isolation Agar Pepton 20g/l MgCl2 1.4g/l K2SO4 10g/l Irgasan 0.025g/l Agar 13.6g/l Các dung dịch nhuộn Gram Crystal Violet Lugol Fuchsin hay Safranin Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR TE Hóa chất dùng để khuếch đại DNA: Bufer, MgCl2, dNTPs, Taq polymerase, mồi, nước cất 2 lần Dung dịch nạp 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy điện di TAE (Tris HCl:acetate:EDTA) Phương pháp nghiên cứu Thu nhận mẫu Dùng dao nhỏ cắt phần rễ lúa sau khi đã làm sạch vùng đất bám trên bề mặt. Bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong phòng thí nghiệm. Chuẩn bị môi trường Các môi trường Yeast Manitol Agar, nito tự do, môi trường dinh dưỡng được cân và hoàn tan trong nước cất, thanh trùng bằng cách đun sôi. Sau đó, các môi trường đưa vào hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Các môi trường được cho vào các đĩa petri vô trùng. Khử trùng bề mặt mẫu Rễ được rửa kỹ với nước cất vô trùng để loại bỏ lớp đất bám trên bề mặt. Các mẫu sau đó được khử trùng bề mặt với quy trình như sau: rửa với cồn 75% trong 3 phút, tiếp theo rửa trong NaClO 5% trong 5 phút, và cuối cùng rửa lại 5 lần với nước cất vô trùng. Sau đó, mẫu được làm khô bằng khăn giấy vô trùng. Phân lập và nuôi cấy Mẫu vô trùng được nghiền trong dung dịch đệm KH2PO4. Pha loãng 5 lần sau đó cho 100dung dịch đã pha loãng vào môi trường YEM đã chuẩn bị sẵn, trang đều đến khi mẫu khô. Nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC trong 24 giờ để vi khuẩn phát triển. Sau 24 giờ, quan sát hình dạng khuẩn lạc. Nhuộm Gram Phương pháp Hucker cải tiến Lấy một ít khuẩn lạc, cho giọt nước vào và dàn mỏng lên lam kính. Cố định vết bôi bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn, để khô. Nhỏ lên một giọt Crystal Violet chờ một phút rồi rửa sạch thuốc nhuộm bằng nước cất vô trùng và dùng giấy thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin hay Safranin 2 – 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính dầu 100X. Khảo sát một số đặc tính sinh hóa Phản ứng Methyl Red (MR) Nguyên tắc: phản ứng này dùng để phân biệt 2 loại vi khuẩn về hình thức biến dưỡng glucose. Loại 1: lên men thật mạnh đường glucose tạo các chất acid cuối cùng rất bền và cho phản ứng MR (+). Loại 2: lên men glucose thành các chất trung gian không bền. Các chất này biến thành các chất trung tính cuối cùng (chất acetoin) và cho phản ứng MR (-). Môi trường và thuốc thử: Môi trường MR – VP (môi trường Clark – Lubs, dạng môi trường đông khô). Thuốc thử Methyl Red: Methyl Red 0.02g Ethanol 95% 50ml Nước cất 50ml Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường MR – VP, ủ trong 24 – 28 giờ ở 37oC, thêm 5 giọt thuốc thử Methyl Red và lắc đều. Đọc kết quả: Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ Phản ứng (-): môi trường có màu vàng Phản ứng Voges Proskauer (VP) Nguyên tắc: có loại vi khuẩn biến dưỡng đường glucose thành một chất trung tính là acety-methyl-carbinol hay acetoin, chất này bị oxy hóa trong môi trường kiềm và kết hợp với -naphtol để cho phức chất có màu hồng đỏ. Môi trường và thuốc thử: Môi trường MR – VP (môi trường Clark – Lubs) Thuốc thử: dung dịch -naphtol 5% trong ethanol, dung dịch KOH 40% trong nước Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trường MR – VP ủ 37oC trong 24 – 28 giờ. Sau thời gian ủ thêm vào 1.8 ml -naphtol 5% (hay 15 giọt trong 1ml môi trường) và 0.6 ml KOH 40% trong nước (hay 10 giọt trong 1 ml môi trường) lắc đều và để yên 5 – 10 phút. Đọc kết quả: phản ứng (+) khi có màu hồng đỏ xuất hiện. Vài loại vi khuẩn cho phản ứng (+) chậm và yếu nên cần phải hơ nhẹ vừa nóng (để ống nghiệm hơi nghiêng) mới xuất hiện màu. Phản ứng Simmons citrate Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất trong môi trường tổng hợp vô cơ. Khi citrate biến dưỡng đến giai đoạn cuối cùng là CO2, có một sự mất cân bằng về ion (có sự phóng thích NH3) và do đó môi trường bị kiềm hóa chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương đậm. Môi trường: môi trường thạch Simmons citrate (dạng đông khô) được điều chế theo thể thạch nghiêng, thành phần môi trường có chứa chỉ thị màu xanh bromothymol. Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn trên thạch nghiêng, chú ý cấy từ khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường đặc, không nên cấy từ môi trường lỏng vì sẽ cho phản ứng (+) giả. Ủ các ống môi trường ở 37oC trong 18 – 24 giờ. Đọc kết quả: Phản ứng (+): vi khuẩn mọc trên mặt thạch nghiêng với sự đổi màu sang màu xanh dương hoàn toàn, chút ít hay không. Phản ứng (-): vi khuẩn không mọc trên mặt thạch và không đổi màu môi trường. Phản ứng Indol Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng phân giải tryptophan trong môi trường thành indol. Nhân pyrol của indol sẽ kết hợp với p-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovacs tạo thành một phức chất dạng quinon màu đỏ tía trên mặt thoáng của môi trường. Môi trường và thuốc thử: Môi trường: Tryptophan water gồm 15 tryptone trong 1 lít nước cất, pH = 7.3, phân phối vào ống nghiệm, hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Môi trường kết hợp: MIU (Motility-Indol-Urea). Thuốc thử Kovacs: p- dimethylamino benzaldehyde 10g Amyl hoặc butanol 150 ml HCl đậm đặc 50 ml Lưu ý: thuốc thử đựng trong chai nâu và luôn đậy kín, khi thuốc thử đổi màu nâu sẫm thì đổ bỏ. Phương pháp cấy: Đối với môi trường nước tryptone: dùng que cấy lấy vi khuẩn cần kiểm tra cho vào ống nghiệm chứa môi trường nước peptone. Nếu dùng môi trường MIU: dùng que cấy đã lấy vi khuẩn đâm thẳng vào giữa mặt thạch một đường dài bằng ¾ chiều sâu của thạch. Ủ 37oC trong 18 – 24 giờ. Sau thời gian ủ, nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovacs vào môi trường. Đọc kết quả: Phản ứng (+): một vòng màu đỏ sẫm xuất hiện trên bề mặt môi trường. Phản ứng (-): bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử. Phản ứng catalase Nguyên tắc: nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi sinh vật hô hấp kỵ khí tùy ý. Catalase giúp vi sinh vật kỵ khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy không khí bởi sự hình thành chất H2O2. Catalase xúc tác phản ứng: 2 H2O2 2 H2O + O2 Thuốc thử: Hydrogen peroxide 30% (superoxal) giữ lạnh trong chai sẫm màu, tránh sáng. Dung dịch đệm phosphate (M/15), pH = 7.0. Phương pháp thử: Thử trên lame: dùng kim cấy lấy tâm của khuẩn lạc thuần khiết (18 – 20 giờ ủ trên môi trường thích hợp) đặt lên lame kính sạch, rồi nhỏ giọt H2O2 30% lên trên. Việc dùng kim hoặc khuyên cấy trộn lẫn H2O2 vào vi sinh vật là không thuần khiết. Thử trong ống nghiệm: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật cấy dày trên mặt thạch nghiêng (không dùng môi trường thạch máu). Quan sát các bóng khí xuất hiện tức thì và ghi nhận kết quả. Phương pháp lamelle: dùng kim cấy lấy tâm của khuẩn lạc lên lam kính, nhỏ một giọt H2O2 0.5% lên và đậy lại bằng lamelle. Theo dõi bóng khí bị giữ lại dưới lamelle. Đọc kết quả: Catalase (+): tạo O2, các bóng khí xuất hiện tức thì (hoặc trong vòng 10 giây). Catalase (-): không tạo O2, không có bóng khí. Phản ứng Oxydase Nguyên tắc: nhằm xác định sự có mặt của enzyme cytocrom oxydase của vi khuẩn. Đây là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyển e- đến oxy phân tử để tạp thành nước trong chuỗi hô hấp. Giống vi khuẩn và thuốc thử: Vi khuẩn kiểm tra được nuôi trên môi trường thạch đến khi phát triển thành khuẩn lạc. Thuốc thử: Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% (dung dịch không màu). Đọc kết quả: để xác định hoạt tính oxydase có 2 cách: Cách 1: người ta nhỏ vài giọt dung dịch Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% (trong nước) lên trên các khuẩn lạc mọc trong đĩa thạch. Khuẩn lạc của các vi sinh vật có hoạt tính oxydase sẽ bị nhuộm đỏ và sau 10 – 30 phút chuyển thành đen. Cách 2: nhỏ vài giọt thuốc thử lên trên giấy lọc. Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cần kiểm tra bôi lên trên giấy lọc có tẩm dung dịch thuốc thử phản ứng oxydase. Phản ứng (+) sẽ tạo màu đỏ tím trong vòng 10 – 30 phút. Tách chiết DNA (theo L. Suang et al, có chỉnh sửa) DNA được tách từ ​​vi khuẩn sử dụng Genomic kit (GeniSpin, Biosyntech Sdn Bhd, Malaysia.). Cho khuẩn lạc vào tube có chứa 100 l đệm TE. Tiếp tục cho 100 l (10 mg mL-1) lysozyme vào và ủ trong 10 phút ở 30°C. Sau đó tiến hành ly tâm trong 5 phút ở 4000 vòng ở nhiệt độ phòng và loại dịch nổi. Cho 25 l dung dịch proteinase K (15 mg ml-1). Tiến hành vortex để trộn đều và ủ ở 55°C trong 1 giờ. Sau khi ly giải, 25 l RNase A (25 mg mL-1) được thêm vào và ủ trong 2 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ các RNA. Sau loại bỏ RNA, tiến hành vortex và ủ ở 70°C trong 10 phút. 200 l ethanol 70% được thêm vào hỗn hợp và được vortex. Toàn bộ mẫu sau đó đã được ly tâm ở 8000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng và được rửa lại một lần nữa bằng ethanol. Cuối cùng kết tủa DNA trong 50 l đệm TE (Tris-EDTA) và lưu trữ ở -20°C cho đến khi sử dụng. Khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng PCR Sử dụng cặp mồi xuôi 5’-GAGTTTGMTCCTGGCTCA-3’ và mồi ngược 5’-TACGGYTACCTTACGACT-3’ (Bioneer, USA) được lấy từ vi khuẩn Escherichia coli (Embley and Stackebrant, 1994). Quá trình khuếch đại được thực hiện bằng việc sử dụng Eppendorf AG, máy chu kỳ nhiệt 22331 (Hamburg). Hỗn hỗn 50 l gồm 0.2 units Taq polymerase, 20pmol mồi xuôi, 20pmol mồi ngược, 1.25mM dNTPs, 10x dung dịch đệm PCR, 2 g/ml DNA mẫu và 29.8 l nước PCR. Đối chứng âm gồm tất cả ở trên ngoại trừ DNA mẫu. Tương tự, đối chứng dương bao gồm tất cả ở trên và DNA mẫu nhận biết Pseudomonas putida sử dụng dựa trên phân tích 16S rDNA. Hỗn hợp phản ứng phải chịu điều kiện tối ưu gồm: ban đầu biến tính ở nhiệt độ 94°C trong 5 phút, biến tính ở 94°C khoảng 45 giây, mồi bắt cặp ở 43°C khoảng 2 phút, chuỗi kéo dài phản ứng 72°C khoảng 1.5 phút và cuối cùng kéo dài ở 72°C khoảng 5 phút. Các chu kỳ biến tính, bắt cặp, kéo dài được lặp lại khoảng 35 chu kỳ. Sản phẩm khuếch đại được tách trên gel agarose 1% (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) trong dung dịch đệm 1X TAE và nhuộm bởi ethidium bromide (Sambrook et al., 1989). Làm sạch sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được làm sạch bằng việc sử dụng bộ Kit chuẩn QIAquick PCR (Qiagen, Germany). Sản phẩm khuếch đại được tách trên gel agarose 1% (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) trong dung dịch đệm 1X TAE và nhuộm bởi ethidium bromide (Sambrook et al., 1989). Giải trình tự Chuỗi trình tự được kiểm tra và điều chỉnh khi cần thiết bằng cách sử dụng chương trình Pro Chromas trên các vùng bảo tồn. Chuỗi trình tự gen 16S rDNA được so sánh với chuỗi trình tự trên cơ sở dữ liệu bằng việc sử dụng chương trình BLAST trên website NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) nhằm xác định sự tương đồng với trình tự trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gen (Shayne et al., 2003). Cây di truyền được mô tả bởi phương pháp Maximum likelihook. Phân tích mồi bằng việc sử dụng chương trình MEGA4 cho 100 lần lặp lại được thực hiện để xác định ước lượng tin cậy cho cây hình học to-po.  KẾT QUẢ VÀ THỜI GIAN DỰ KIẾN Kết quả Phân lập được hệ vi sinh vật trong vùng endophytic của rể lúa. Xác định được dòng vi khuẩn Psedomonas spp. có lợi cho sự phát triển của cây lúa Xác định thêm một vài dòng khác như Mircococcus, Bacillus, Enterobacter, ... Thời gian Thời gian dự kiến hoàn thành đề tài vào khoảng thời gian từ tháng 7 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015.  TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Ngọc Đệ, 2008, Giáo trình cây lúa, Trường Đại học Cần Thơ. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011, Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuyên Chi bằng kỹ thuật PCR, Tạp chí khoa học, 18a 168-176. Ngô Thanh Phong, 2012, Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long, Trường Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp, Trần Thị Giang và Nguyễn Thị Quyên, 2014, Phân lập và nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sự sinh trưởng (PGPR) từ một số loại rau ăn lá trồng tại Thành phố Cần Thơ, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 35: 65-73. Bộ môn Công nghệ Sinh học, 2013, Thực hành Sinh học vi sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh Pham Quang Hung and K. Annapurna, 2004, isolation and characterization of endophytic bacteria in soybean (glycinesp.), 12: 92-101. Mbai FN, Magiri E.N, Matiru V.N, Ng’ang’a J, Nyambati V.C.S., 2013, Isolation and Characterisation of Bacterial Root Endophytes with Potential to Enhance Plant Growth from Kenyan Basmati Rice, American International Journal of Contemporary Research, Vol. 3 No. 4. Van Thi Phuong Nhu and Cao Ngoc Diep, 2014, Isolation, characterization and phylogenetic analysis of endophytic bacteria in rice plant cultivated on soil of Phu Yen province (Vietnam), American Journal of Life Sciences, 2(3): 117-127. Robert P. Ryan, Kieran Germaine, Ashley Franks, David J. Ryan & David N. Dowling, 2007, Bacterial endophytes: recent developments and applications, minireview, FEMS Microbiol Lett 278(2008) 1–9. Tài liệu Internet https://duybiotech.wordpress.com/tag/endophytic-bacteria/ http://en.wikipedia.org/wiki/Endophyte 1 4