- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TANNINS TỔNG TRONG THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT ĐO QUANG Cán bộ hướng dẫn : PGS. - Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020 Sinh viên Phạm Thị Hoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ TANIN Khái niệm, tính chất Phân loại Tanin thủy phân Tanin ngưng tụ Hoạt tính sinh học của tanin Hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi-rút Hoạt tính chống viêm Hoạt tính chống oxy hóa Một số phương pháp định lượng tanin Phương pháp chuẩn độ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp đo quang CÁC THỰC VẬT CHỨA NHIỀU TANIN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN Phương pháp phân tích đo quang Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy đo quang phổ Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis Phương pháp định lượng Định lượng tổng hàm lượng tanin ngưng tụ trong thực vật bằng phương pháp đo quang GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Giới hạn phát hiện (LOD Giới hạn định lượng (LOQ CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT Hóa chất Dụng cụ - thiết bị ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CHUẨN BỊ DÃY DUNG DỊCH CHUẨN CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH CHUẨN BỊ MẪU KHẢO SÁT GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN ĐO QUANG KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN . - KẾT QUẢ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP . - MeOH: Methanol DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Liên kết hidro giữa tanin với protein Hình 1.2: Cấu tạo của axit gallic, axit m - digallic và axit m - trigallic Hình 1.3: Cấu tạo của axit ellagic và corilagin Hình 1.4: Cấu tạo của các flavanol Hình 1.5: Cấu tạo của epigallocatechin gallate Hình 1.6: Cấu tạo của epicatechin gallate Hình 1.7: Cấu tạo của gallocatechin gallate Hình 1.8: Một số loài thực vật chứa nhiều tanin Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ Hình 1.10: Dạng đồ thị của phương pháp đường chuẩn Hình 1.11: Đồ thị đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn Hình 1.12: Nguyên lý phản ứng giữa tanin ngưng tụ với thuốc thử Hình 2.1: Hệ thống máy đo quang UV - Vis Hình 2.2: Hệ thống máy cô quay chân không Hình 2.3: Sơ đồ quy trình chiết mẫu lá trà hoa vàng Hình 3.1: Phổ hấp thụ của proanthocyanidin A Hình 3.2: Đường chuẩn của proanthocyanidin A DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Hàm lượng tanin trong một số loài thưc vật Bảng 1.2: Dãy dung dịch chuẩn của phương pháp thêm chuẩn Bảng 2: Bảng dãy đường chuẩn của proanthocyanidin A Bảng 3.1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quy trình định lượng.......35 Bảng 3.2: Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước có thảm thực vật đa dạng và phong phú với nhiều loài thực vật, được sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ dưỡng nâng cao sức khỏe cho con người. - Trong đó, quang phổ UV - Vis là phương pháp được sử dụng rộng rãi vì nó có độ nhạy cao, phân tích thuận tiện. - Song song với việc tìm ra các kĩ thuật mới thì việc kiểm tra lại giá trị của phương pháp phân tích với mục đích đảm bảo độ chính xác, độ tin cậy của số liệu phân tích và tăng tính ứng dụng của phương pháp đó trong thực tiễn cũng rất quan trọng. - Vì vậy, tôi chọn đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang. - Mục tiêu của đề tài: Xây dựng phương pháp và định lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết từ thực vật bằng phương pháp đo quang phổ. - Xây dựng phương pháp định lượng tanin tổng trong thực vật bằng phương pháp đo quang phổ. - Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp. - Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng tanin tổng trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng. - Phần không phải đường SV: Phạm Thị Hoa 2 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp là các axit. - SV: Phạm Thị Hoa 3 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp + Thường dễ tan trong nước. - 1.1.3 Một số phương pháp định lượng tanin Có nhiều nhà khoa học trên thế giới tiến hành nghiên cứu để xác định hàm lượng tanin trong nhiều đối tượng thực vật khác nhau. - Sử dụng một số phương pháp như: chuẩn độ, đo quang, sắc ký lỏng hiệu năng cao… 1.1.3.1 Phương pháp chuẩn độ [23] Theo phương pháp của AOAC (1980), để định lượng tanin, phương pháp được thực hiện như sau: Lấy 5 ml dịch chiết được hòa tan với 12,5 ml dung dịch indigo-carmin và 375 ml nước. - Hỗn hợp được chuẩn độ với dung dịch KMnO4 làm dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng với màu hồng nhạt ở viền. - Thể tích của dung dịch KMnO4 là tổng thể tích hàm lượng tanin bao gồm cả các thành phần khác (Y). - Để xác định thành phần khác không phải tanin (X), lấy 50ml dung dịch chiết với 25 ml dung dịch gellatin. - Hỗn hợp được làm ấm cho đến khi gellatin được hòa tan hoàn toàn sau đó được làm lạnh và định mức đến vạch với dung dịch muối bão hòa, thêm 50 ml dung dịch axit và NaCl bão hòa và 5 g bột cao lanh. - Lấy 12,5 ml dịch lọc trộn với 12,5 ml thể tích dung dịch indigo carmin và 375 ml nước. - Chuẩn độ với dung dịch KMnO4 cho tới khi chuyển thành dung dịch màu hồng nhạt như trước. - Thể tích của dung dịch KMnO4 thực được sử dụng để chuẩn độ tanin được tính theo giá trị của Y và X: 1mL dung dịch chuẩn KMnO4 = 0,595 ml dung dịch axit oxalic 0,1N 1mL dung dịch axit oxalic 0,1N = 0,0042 g tanin. - Năm 2015, tác giả Jyotismita Khasnabis và các cộng sự đã tiến hành xác định hàm lượng tanin trong các loại trà khác nhau bằng phương pháp chuẩn độ. - Dịch lọc được lưu trữ ở 4oC để định lượng bằng phương pháp SV: Phạm Thị Hoa 9 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp chuẩn độ với dung dịch KMnO4 với chất chỉ thị indigo-cacmin. - [18] Năm 2009, Maria Atanassova và Valentina Christova-Bagdassarian đã tiến hành xác định hàm lượng tanin trong các loại thực vật khác nhau bằng phương pháp chuẩn độ. - Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết, dịch lọc thu được chuẩn độ bằng dung dịch KMnO 4 với chất chỉ thị indigo-cacmin. - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [3] Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, có 4 phương pháp định lượng thường dùng: Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện. - Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. - Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. - Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. - Durgawale và các cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng tanin trong loài cây họ Đậu vào năm 2016. - Phương pháp này đã được xác nhận và tuyến tính của axit tannic trong phạm vi nồng độ 0-60 mg/ml. - Phương pháp đo quang Tác giả Philip-Edouard Shay và các cộng sự sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang với thuốc thử butanol - HCl - sắt để xác định hàm lượng tanin ngưng tụ trong các loài thực vật năm 2017. - Mẫu khô được chiết bằng dung môi methanol (300mL) và được axit hóa bằng axit trifluoroacetic (TFA) SV: Phạm Thị Hoa 11 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp 0,05%. - Các bước được tóm tắt như sau: 500 µl dịch mẫu chứa tanin ngưng tụ cho tác dụng với 2000µl dung dịch thuốc thử butanol - HCl cho thêm 67mL thuốc thử sắt (NH4Fe(SO4)2 2% trong HCl 2N) và để ủ trong khoảng thời gian 2,5h ở nhiệt độ 70°C. - Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng 540 nm và xây dựng đường chuẩn trong khoảng 0- 5,5 µg/mL của axit tanic với độ dốc 0,213 A/ppm. - Vỏ quả (cây măng 7 - 13 cụt) Lá (cây ổi) 7 - 10 Vỏ quả (lựu) 20 - 30 Vỏ quả (cây chiêu 20 - 40 liêu) Ngũ bội tử 43,2 Lá (trà hoa vàng) 15 - 30 SV: Phạm Thị Hoa 13 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.8: Một số loài thực vật chứa nhiều tanin 1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS ĐỊNH LƯỢNG TANIN 1.3.1 Phương pháp phân tích đo quang [2] Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó. - 1.3.1.1 Nguyên tắc của phép đo phổ UV - VIS Phổ hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS nm) là phổ hấp thụ của các chất tan ở trạng thái dung dịch đồng thể của chất trong một dung môi nhất định như nước, methanol, benzen, toluen, chloroform, hay một số chất mà phân tử của nó trong điều kiện bình thường nó tồn tại ở trạng thái hơi như khí CH4, NH3, CO2. - Chuẩn bị dung dịch mẫu: Nếu các chất phân tích có hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này ta phải hòa tan nó vào trong một dung môi phù hợp, tạo ra dung dịch trong và đồng thể, như một số chất hữu cơ: Benzen, phenol, nitrophenol, naphthalen, anthracene. - Những chất không có phổ hấp thụ quang UV-VIS: Trường hợp này chủ yếu là các ion kim loại, hay các anion, chúng ta phải cho các chất này tác dụng với một thuốc thử R nào đó trong một dung môi và ở điều kiện thích hợp để tạo ra một hợp chất phức bền có khả năng hấp thụ quang UV-VIS nhạy, sau đó đo phổ của dung dịch phức thu được. - Hay bơm dòng khí mẫu qua cuvet trong khi đo với một tốc độ hằng định (phương pháp đo dòng chảy. - Đo phổ: SV: Phạm Thị Hoa 14 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Cho mẫu vào cuvet và chiếu chùm sáng kích thích phù hợp vào cuvet có dung dịch mẫu của hợp chất cần phân tích, để cho các phân tử chất phân tích hay sản phẩm phức của nó hấp thụ tia bức xạ. - Cuvet: Cuvet là dụng cụ chứa dung dịch phân tích hoặc dung môi. - Các tín hiệu ghi, đo được xử lý và cho ra kết quả giá trị độ hấp thụ quang tương ứng của dung dịch. - Hình 1.9: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của máy đo quang phổ 1.3.1.3 Phạm vi ứng dụng của phép đo phổ UV-Vis Phương pháp đo quang UV-Vis đã và đang được ứng dụng rất phổ biến. - Vì nó là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và máy móc lại không đắt tiền, phù hợp cho việc phân tích định lượng nhiều chất với hàm lượng nhỏ, ví dụ như: SV: Phạm Thị Hoa 17 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp - Để xác định các chất. - Song phương pháp đo phổ UV-Vis có độ chọn lọc kém. - 1.3.1.4 Phương pháp định lượng Trong phương pháp đo quang phổ, phương pháp thường dùng để định lượng là: phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn a) Phương pháp đường chuẩn. - Cơ sở định lượng của phương pháp: Dựa vào phương trình định luật Lambert - Beer: A = .L.C Trong đó: A là độ hấp thụ quang của dung dịch cần đo. - là hệ số hấp thụ phân tử, C là nồng độ chất, L là bề dày của lớp dung dịch (bề dày của cuvet. - Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn và các mẫu phân tích: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác (thông thường chuẩn bị với 5 nồng độ khác nhau nằm trong vùng tuyến tính của mối quan hệ A. - SV: Phạm Thị Hoa 18 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp - Chọn các điều kiện đo phổ: Nghiên cứu chọn điều kiện phù hợp nhất để đo phổ UV-VIS của chất phân tích trong dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân tích, như các thông số máy đo Ax, điều kiện đo, thời gian đo, loại cuvet. - Đo phổ các mẫu chuẩn và mẫu phân tích: Đo phổ hấp thụ quang UV- VIS của dãy dung dịch chuẩn và mẫu phân tích theo các điều kiện đã chọn. - Dựng đường chuẩn và xác định nồng độ C x: Từ các cặp giá trị A - C tương ứng của các dung dịch chuẩn, ta dựng đường chuẩn trong hệ tọa độ A - C, hàm Ax. - A Ax O Cx C Hình 1.10: Dạng đồ thị của phương pháp đường chuẩn Dựa vào phương trình đường chuẩn: y = ax + b, ta tính được nồng độ của các mẫu phân tích Trong đó: x, y lần lượt là nồng độ (Cx) và độ hấp thụ quang (A) A−b Cx = a b) Phương pháp thêm chuẩn. - Như vậy, nếu mẫu phân tích có nồng độ là C x thì chúng ta sẽ có dãy mẫu chuẩn là C0, C1, C2, C3, C4, C5 như bảng sau: SV: Phạm Thị Hoa 20 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Bảng 1.2: Dãy dung dịch chuẩn của phương pháp thêm chuẩn STT Dãy mẫu chuẩn Độ hấp thụ Aλ đo được Dãy chuẩn M0 C0 = CX + 0 A0 M1 C1 = CX + C1 A1 M2 C2 = CX + C2 A2 M3 C3 = CX + C3 A3 M4 C4 = CX + C4 A4 M5 C5 = CX + C5 A5 Các mẫu phân tích CX2 AX2 CX3 AX3 CX4 AX4. - CXn AXn Đo các giá trị độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn vừa pha ở bước sóng cực đại được các giá trị độ hấp thụ quang A tương ứng. - SV: Phạm Thị Hoa 21 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp A A0 Cx O C1 Cx C2 C3 C4 C (mg/ml) Hình 1.11: Đồ thị đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn 1.3.2 Định lượng tổng hàm lượng tanin ngưng tụ trong thực vật bằng phương pháp đo quang * Nguyên tắc: Cho các hợp chất tanin trong mẫu cao chiết thực vật tác dụng với hỗn hợp hai thuốc thử: thuốc thử butanol - HCl và thuốc thử sắt (NH 4Fe(SO4)2) trong dung dịch axit sẽ thu được dung dịch có màu đỏ. - Đo màu của dung dịch ở bước sóng 550 nm. - Sơ đồ phản ứng: Tanin ngưng tụ + HCl đặc Dung dịch có màu đỏ Butanol SV: Phạm Thị Hoa 22 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp HO O+ Ar OH Ar OH OH H. - R R butanol,100o Anthocyanidin (màu đỏ) HO Ar HO O Ar OH OH R' R’ Hình 1.12: Nguyên lý phản ứng giữa tanin ngưng tụ với thuốc thử 1.4 GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [4] 1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD. - Định nghĩa: Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. - Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng. - Cách xác định: Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tùy thuộc vào phương pháp áp dụng là phương pháp công cụ hay không công cụ. - Dựa trên độ lệch chuẩn: SV: Phạm Thị Hoa 23 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Cách 1: Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất phân tích). - LOD • Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy • Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R • Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R. - Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp sắc ký, điện di. - SV: Phạm Thị Hoa 24 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. - Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đường nền + Dựa trên đường chuẩn: Chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn. - Định nghĩa: SV: Phạm Thị Hoa 25 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. - LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng. - Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp. - Pha chế dung dịch: Pha dung dịch chuẩn gốc proanthocyanidin A2 : Cân 4 mg bột chất chuẩn proanthocyanidin A2 vào ống eppendroff rồi pha trong DMSO (dimethyl sulfoxide) 800 l thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 5 mg/ml. - Pha dung dịch chuẩn proanthocyanidin A2: Pha loãng 180 l dung dịch chuẩn gốc trong vừa đủ 1620 l MeOH thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 500 g/ml. - Quy trình chiết mẫu: Mẫu trà hoa vàng (phần lá) Rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô mẫu ở to = 60oC Nghiền nguyên liệu thành dạng bột + Ngâm với EtOH 90% theo tỷ lệ 1/20 + Siêu âm (t = 15 phút) Lọc Thu lấy bã, loại bỏ dịch lọc Sấy bã nguyên liệu ở to = 60oC Chiết bã với dung môi MeOH theo tỷ lệ 1/20, t = 90 phút Loại bỏ bã, thu lấy dịch chiết Dịch chiết tanin Thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không Cao MeOH (trà hoa vàng) SV: Phạm Thị Hoa 30 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.15: Sơ đồ quy trình chiết mẫu lá trà hoa vàng 2.3 CHUẨN BỊ DÃY DUNG DỊCH CHUẨN Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 9 nồng độ là µg/ml. - Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn 500 g/ml: Hút chính xác V (l) MeOH lần lượt vào các ống nghiệm chịu nhiệt, tiếp đó thêm vào tiếp chính xác V0 (l) dung dịch chuẩn tương ứng với các nồng độ C (g/ml). - C : Nồng độ của dung dịch proanthocyanidin A2 chuẩn làm việc (g/ml). - V0 : Thể tích dung dịch proanthocyanidin A2 gốc được pha vào (l). - SV: Phạm Thị Hoa 31 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp VMeOH : Thể tích methanol (l). - Thêm vào 500 l mỗi dung dịch 3000 l thuốc thử BuOH - HCl trộn đều rồi thêm tiếp 100 l thuốc thử sắt. - Trộn thật đều rồi ủ các dung dịch ở 90oC trong thời gian 60 phút. - Các dung dịch cũng được ủ trong thời gian và nhiệt độ giống như các dung dịch chuẩn. - 2.5 CHUẨN BỊ MẪU KHẢO SÁT GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP. - Hút chính xác 480 µl MeOH lần lượt cho vào các ống nghiệm chịu nhiệt, rồi thêm tiếp vào 20 µl dung dịch làm việc của proanthocyanidin A2 (500 g/ml). - Dung dịch cũng được ủ trong thời gian 60 phút và ở nhiệt độ 90 oC, rồi tiến hành đo độ hấp thụ quang của 10 mẫu. - n−1 2.6 XỬ LÝ SỐ LIỆU Kết quả đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn được xử lý trên phần mềm Excel. - Từ các giá trị nồng độ và độ hấp thụ quang của dãy dung dịch proanthocyanidin A2, xây dựng được đường chuẩn có dạng y = a.x+b, trong đó: x,y lần lượt là nồng độ và độ hấp thụ quang của dung dịch proanthocyanidin A2, a là độ dốc của đường chuẩn, b là hệ số chặn. - Dựa vào phương trình đường chuẩn và độ hấp thụ quang của các dung dịch mẫu thử, có thể xác định hàm lượng tanin tổng tương đương proanthocyanidin A2 trong mẫu đo theo công thức: A i−b TC = a .C Trong đó: Ai là độ hấp thụ quang của mẫu thử i a, b là hệ số độ dốc và hệ số chặn của đường chuẩn y = a.x + b C là nồng độ mẫu thử (mg/ml) TC: hàm lượng tanin tổng tương đương proanthocyanidin A2, mg ProA2E /g mẫu cao chiết. - Chuẩn bị thuốc thử như mục 2.3.1 và dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn như mục 2.3.2 + Phản ứng tạo màu định lượng tanin tổng: Lấy 500 l dung dịch mẫu, sau đó thêm vào 3000 µl thuốc thử BuOH-HCl, trộn đều rồi thêm tiếp 100 µl thuốc thử sắt. - Sau khi tiến hành pha một dãy các dung dịch tiêu chuẩn để xây dựng đường chuẩn ta tiến hành đo độ hấp thụ quang ở các điều kiện đã chọn. - Vậy khoảng tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng từ 20 - 500 g/ml. - KẾT QUẢ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) CỦA PHƯƠNG PHÁP Kết quả xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp được trình bày theo bảng 3.2: SV: Phạm Thị Hoa 37 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.4: Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) STT Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ quang (A Độ lệch chuẩn (SD) 0,0043 LOD (µg/ml) 6,45 LOQ (µg/ml) 19,54 * Tính kết quả: Độ lệch chuẩn. - KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG TỔNG TANIN NGƯNG TỤ TRONG MỘT SỐ MẪU CAO CHIẾT TRÀ HOA VÀNG Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng hàm lượng tổng tanin ngưng tụ có trong một số mẫu cao chiết trà hoa vàng. - SV: Phạm Thị Hoa 40 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang. - Xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích với lượng proanthocyanidin A2 chuẩn nằm trong khoảng từ 20 - 500 g/ml. - Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích: LOD = 6,45 g/ml, LOQ = 19,54 g/ml 4. - [2]: Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích phổ phân tử, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội, tr. - [4]: Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr. - 143 SV: Phạm Thị Hoa 42 MSV Khoa Công nghệ Hóa Khóa luận tốt nghiệp [11]: S. - SV: Phạm Thị Hoa 45 MSV