- DUNG HỢP TẾ BÀO L ai tế bào sinh dưỡng là kỹ thuật tạo ra giống mới bằng dung hợp tế bào trần (protoplast fusion). - Trong kỹ thuật lai vơ tính, nhân của hai tế bào cĩ thể được giữ nguyên hoặc nhân của một trong hai tế bào bị loại bỏ. - Cả hai trường hợp, tế bào chất của hai tế bào được hợp nhất với nhau, và như vậy, cĩ nhiều đặc tính tốt do các gene trong tế bào chất điều khiển sẽ được chuyển vào con lai. - Đối với loại cây trồng nhân giống vơ tính như khoai tây, dung hợp tế bào trần và nhân dịng vơ tính sẽ tạo ra các giống khoai cĩ thể bội lẻ và cho năng suất cao hơn giống khoai tây thường. - Đối với lúa, ngơ, gene điều khiển tính bất dục đực nằm trong tế bào chất, nếu được chuyển vào giống mẹ sẽ giúp cho các nhà chọn giống tạo ra được giống bất dục đực trong chương trình chọn tạo giống lai. - Khái niệm tế bào trần Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào. - Tế bào trần thực vật được gọi là protoplast. - Tế bào trần cĩ hai đặc điểm quan trọng. - Đặc tính này chỉ cĩ ở tế bào vi khuẩn, các tế bào nguyên thủy trong mơ thực vật khơng cĩ đặc tính này. - Khi được đưa vào mơi trường cĩ đầy đủ chất dinh dưỡng thích hợp, tế bào trần cĩ khả năng tái sinh vách tế bào. - Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của tế bào trần.. - Nhờ đĩ, tế bào trần mới phục hồi được tồn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy. - Khi tế bào trần tái tạo được vách và trở lại thành tế bào nguyên thủy, chúng sẽ lại cĩ khả năng phát triển và phân chia hồn tồn giống như những tế bào bình thường. - Khi tạo ra được tế bào trần, các nhà khoa học cho thấy khả năng vơ cùng lớn của nĩ trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất. - Sử dụng tế bào trần như một đối tượng sinh học trong cơng tác lai giống. - Khi sử dụng các tế bào trần cùng lồi để lai giống, vật chất di truyền của các cá thể trong cùng một lồi cĩ thể trao đổi cho nhau. - Ngồi ra, các nhà khoa học cịn dựa vào khả năng Công nghệ sinh hoc thực vat Chương 5 Cong nghe nuôi cay te bao tran 47 tiếp nhận khơng chọn lọc các vật chất di truyền của tế bào trần để tiến hành lai khác lồi và từ đĩ tạo ra được tính đa dạng sinh học. - Sử dụng tế bào trần như cơ thể nhận các vật liệu di truyền từ các giới sinh vật khác. - Việc tái sinh tế bào trần thành cây hồn chỉnh đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất. - Sử dụng tế bào trần để sản xuất các hợp chất thứ cấp giống như phương pháp nuơi cấy tế bào đơn. - Cơng nghệ nuơi cấy tế bào trần 2.1. - Chọn mẫu và khử trùng mẫu Tế bào trần thường được tạo ra từ lá thực vật. - để loại nước ra khỏi tế bào chất. - Mục đích của việc này là tạo ra hiện tượng co nguyên sinh để màng tế bào tách khỏi vách tế bào, giúp cho quá trình xử lý vách được thuận lợi hơn. - Sau khi ngâm trong dung dịch manitol, tiến hành tách mặt dưới của lá để làm tăng diện tích tiếp xúc của enzyme với vách tế bào. - Xử lý enzyme tạo tế bào trần Trong kỹ thuật tạo tế bào trần, khơng thể sử dụng các phương pháp cơ học hoặc hĩa học để phá vỡ vách tế bào vì cần phải bảo đảm hoạt tính sinh học của tế bào. - Các chế phẩm cĩ chứa enzyme cellulase thường được sử dụng để tạo tế bào trần. - Enzyme cellulase sẽ tham gia phân cắt cellulose cĩ rất nhiều ở thành tế bào mà khơng ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác cĩ trong tế bào thực vật. - Tách tế bào trần 2.3.1. - Tách tế bào trần từ lá Tế bào trần được tách từ lá qua 4 bước: khử trùng lá, lột vỏ lớp biểu bì, xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp và cơ lập tế bào trần bằng cách lọc và ly tâm . - Mẫu sau khi vơ trùng sẽ được đưa vào để tách tế bào trần. - Để tránh tình trạng màng tế bào bị rách cần ngâm mẫu lá trong dung dịch manitol, sorbitol, glucose, sucrose 8. - 60 phút để tế bào co nguyên sinh giúp ổn định màng tế bào. - Phương pháp cơ lập một bước Các mẫu lá được ngâm trong dung dịch enzyme và để trong tối qua đêm ở 25 C s ẽ thu được hỗn hợp tế bào trần. - Tiến hành loại bỏ các mơ và cụm tế bào khơng bị enzyme phân hủy hồn tồn bằng cách hút hỗn hợp ra bằng ống hút cĩ chia độ. - Sau đĩ các tế bào trần được lọc trên màng lọc Phương pháp cơ lập hai bước Trong phương pháp này, các mẫu lá sau khi đã được lột bỏ lớp biểu bì sẽ được ngâm trong dung dịch pectinase 0,5 - 2% cĩ áp dụng thẩm thấu thích hợp và độ pH là 5,8. - Các bước tiếp theo tương tự phương pháp cơ lập một bước nhưng dịch tế bào được ngâm trong dung dịch enzyme lần thứ 2 để thu nhận hồn tồn các tế bào nhu mơ giậu. - Tách tế bào trần từ mơ sẹo. - Nguồn nguyên liệu lý tưởng để cơ lập tế bào trần là mơ sẹo đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực. - Phương pháp cơ lập tế bào trần từ mơ sẹo cũng tương tự như đối với lá nhưng nồng độ enzyme thích hợp đặc biệt là cellulase cĩ thể thấp hơn. - Các mơ sẹo đã được nuơi cấy lâu ngày khĩ cĩ thể tách tế bào trần hơn là các mơ sẹo mới vì vách tế bào dày hơn. - Vì vậy nên sử dụng mơ sẹo mới để tách tế bào trần và thời gian giữa 2 lần cấy chuyền khơng nên kéo dài quá 2 tuần trước khi tiến hành cơ lập. - Tách tế bào trần từ huyền phù tế bà o Một nguồn nguyên liệu khác để cơ lập tế bào trần là huyền phù tế bào mới được nuơi cấy và đang trong trạng thái tăng trưởng mạnh. - Để cơ lập tế bào trần, dịch huyền phù tế bào cĩ mật độ tế bào cao được cho vào ống ly tâm hình nĩn và ly tâm với tốc độ 100 vịng trong 1- 2 phút. - Sau đĩ loại bỏ phần dịch nổi và thu nhận phần tế bào cịn lại. - Phần tế bào này được cho vào mơi trường MS để rửa và ly tâm lại. - Phần trên mặt được loại bỏ và tế bào được ngâm trong 5 ml hỗn hợp các enzyme (14% cellulase và 0,5-2% pectinase) rồi đặt trên máy lắc tốc độ 75 vịng/phút và được ủ trong khoảng thời gian 2 - 6 giờ. - Sau đĩ 2 - 3 giọt (50 µl) PEG được nhỏ bên rìa giọt tế bào trần để cảm ứng sự dung hợp. - Nhỏ các giọt cĩ chứa tế bào trần lên tấm kính đậy mẫu vật đặt trong một đĩa petri để sau đĩ cĩ thể dễ dàng chuyển tế bào trần trong các bước tiếp theo. - Cách này cũng ngăn khơng cho tế bào trần dính vào thành đĩa petri và đồng thời cũng dễ dàng cho việc cố định, nhuộm màu và quan sát.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt