Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối Nguyễn Quốc Tuấn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tách được β’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-γ’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ng hóa học. Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid toàn phần trong lá và nụ vối c a một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc. Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. ng dụng phương pháp xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc. Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối Content M Đ U Cây Vối, một loại cây quen thuộc c a làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn β0 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm β01γ-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xơy dựng ph ng pháp định tính, định l ng flavonoid trong nụ vƠ lá v i”. Kết quả c a đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường. Các mục tiêu c a đề tƠi g m có: • Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid. • Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối. CH NG 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan về cơy v i 1.1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb. - Họ Sim (Myrtaceae). 1.1.2 Đặc điểm thực v t Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân n t nẻ, màu nâu đen. Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 11,5 cm, dai, c ng, phiến lá hình trái xoan hay hình tr ng, dài 8-β0 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Quả hình cầu hay hơi hình tr ng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt. a) Cây vối b) Nụ vối tươi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.1.3 ThƠnh ph n hóa học Lá Vối ch a rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)- -ocimen, myrcen, (E)- -ocimen. Trong lá vối có ch a flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol. Vỏ cây ch a triterpen nhóm ursan là acid usolic. Nụ vối ch a nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học. 1.1.4 Tác dụng sinh học c a các flavonoid trong lá vƠ nụ v i Các flavonoid còn có khả tạo ph c với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do b c xạ. 2 Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol. - Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone phơn l p từ nụ v i có tác dụng c ch sự phát triển c a TB ung th với các dòng TB ung th khác nhau. - Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng c chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết trên chuột gây bệnh tiểu đường. - Tác dụng chống oxy hóa: c chế các enzym α-glucosidase. - Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua c chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase. 1.2 Các ph ng pháp định tính, định l ng flavonoid 1.2.1 Ph ng pháp định tính a) Phương pháp ống nghiệm Phản ứng với hơi amoniac Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể quan sát sự biến đổi màu này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại. Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda). Phản ng do sự có mặt nhân -penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl đặc và bột Magie kim loại. Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1 gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím [6]. Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%. Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen. b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách . 1.2.2 Ph ng pháp định l a) Phương pháp cân: chất ít tạp chất. ng flavonoid ng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch b) Ph ng pháp trắc quang Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng c a một dung dịch ph c tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng c a phép đo dựa trên định luật Lamber-Beer: A = K.C 3 Trong đó: A: Độ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phân tích Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10 -5 – 10-7M và là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến. Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ng cyanidin, phản ng kết hợp với muối diazoni, tạo ph c màu với AlCl3, muối titan… Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích. c) Ph ng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau c a các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Thời gian lưu c a một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ. CH NG 2: Đ I T NG, N I DUNG NGHIÊN C U 2.1. Đ i t ng nghiên c u Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc. Sau đó phơi và sấy ở 500C cho đến khô. Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu 2.2 N i dung nghiên c u - Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tính, định lượng. - Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối. - Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối. 2.3 Thi t bị, dụng cụ vƠ hóa ch t, dung môi 2.3.1 Thi t bị, dụng cụ - Cân kỹ thuật Precisa XT 6β0M - Cân phân tích Precisa XT 220A - Máy cất quay Buchi B481 - T sấy Binder – FD 115 - Đèn tử ngoại - Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản) - Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTARγ. - Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 2.3.2 Hóa ch t, dung môi 4 - Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng. - Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GFβ54 (Merck). - Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck). - Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC. CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Chi t xu t vƠ phơn l p m t flavonoid chính từ nụ v i 3.1.1. Chi t xu t d c liệu vƠ phơn đo n Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm γ lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô cách th y, thu được cao toàn phần (119β g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đ 0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ γ.1: 3.1.2 Phân l p flavonoid chính trong cao phơn đo n ethyl acetat Cân khoảng γ00g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể tích β50 ml để h ng dung dịch ra khỏi cột, thu được γβ bình (β00 ml). Tất cả các bình h ng đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình γ.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và cô cách th y đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g). a) Hình ảnh SKLM b) Hình ảnh chất CO-1 Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối 5 3.1.3. Xác định c u trúc ch t phân l p Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 1β5-1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập được có độ tinh khiết 98,β1% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình γ.β 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 83 251 206 966 581 381 144 252 545 258 165 179 113 259 142 300 197 358 314 146 102 116 160 506 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 2476 5242 1199 1875 691 1457 34016 100 22 24 Minutes Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1 Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H] +, có m/z = 299; ở [M-H]+ có m/z = β97, tương ng với khối lượng phân tử c a chất rắn CO-1 là M = 298 amu. Công th c cấu tạo c a chất CO-1 được trình bày trong hình γ.γ. Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy c a CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 1β5-127oC. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối. 3.2 Xơy dựng ph ng pháp định tính flavonoid trong lá vƠ nụ v i 3.2.1 Định tính bằng ph n ng hóa học B ng 3.1: K t qu định tính flavonoid trong nụ vƠ lá v i 3.2.2 Định tính bằng TLC 3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siêu âm γ0 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định tính. 6 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH (hàm lượng khoảng 1 mg/ml). b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:β:2:1 (v:v:v ) Hệ β: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:β (v:v:v:v ) Hệ γ: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v ) Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:γ:1,5:1 (v:v:v) Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (R f =0,47) đặc trưng c a flavonoid. Như vậy có thể sử dụng hệ γ làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối. 3.2.3 Định tính bằng HPLC * Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng β5,00 ml methanol, đem siêu âm γ0 phút, làm lặp β lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định hàm lượng. * Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng β5,00 ml methanol, đem siêu âm γ0 phút, làm lặp β lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định m c thành 10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký. * Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác 1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ c a CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký. 7 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat 9: 341 nm, 8 nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat 80 Area 200 9: 341 nm, 8 nm lavoi lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat 400 Area Area 300 60 200 0 2 4 6 10 12 14 16 18 20 22 2 0 4 6 61169 429 452 254 140 93 171 155 3252 2988 5471 1672 1178 1307 425 227 77788 54358 5215 4829 5537 3529 52777 68840 63088 0 8 35304 1885 83 251 206 966 581 252 545 258 165 179 113 259 142 300 197 358 314 146 102 116 160 100 1652910 0 506 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 5242 1199 1875 691 1457 34016 20 37467 107289 40768 31034 145292 597620 40 100 0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2 0 4 6 8 Minutes Minutes 12 14 16 18 20 Minutes Sắc ký đồ c a lá vối (L) Sắc ký đồ c a nụ vối (N) Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) 10 Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu tR. 3.3 Xơy dựng ph ng pháp định l ng flavonoid trong lá vƠ nụ v i 3.3.1 Xơy dựng bằng ph ng pháp trắc quang 3.3.1.2 Đ lặp l i c a ph ng pháp Để xác định độ lặp lại c a phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên. Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang 1 2 3 4 5 6 mm u(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831 Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193 STT S liệu th ng kê -2 SD = 0,83.10 ; RSD = 4,45% Kết quả ở bảng γ.β cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 4,45% (< 5%). 3.3.1.3 Xơy dựng đ ng chuẩn Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng γ.γ Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.6). Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1 N ng đ (mg/l) 12 24 36 48 72 100 A510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 8 Đ h p thụ quang y = 0.0033x + 0.0026 R2 = 0.999 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 20 40 60 80 100 120 N ng đ CO-1 (mg/l) Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1 Từ kết quả ở bảng γ.5 và hình γ.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ c a chất đối chiếu CO-1 từ 1β-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0.00γγx + 0.00β6 với hệ số tương quan R2 = 0.9990. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 tính được độ lệch chuẩn c a phương trình hồi quy là S y= 0,00366 và SA= 5,04.10-5 ; SB = 0,00β8. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571 ph ng trình h i quy đ y đ : y = (0,0033 ± 1,30.10 -4)x + (0,0026± 0,0072) Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180, γ60 và 450 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng γ.6. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình γ.7). Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin 45 90 180 360 450 Đ h p thụ quang A510(Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 Đ h p thụ quang N ng đ (mg/l) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 y = 0.0024x + 0.0022 R2 = 0.9993 0 100 200 300 400 500 N ng đ Catechin (mg/l) Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin Kết quả ở bảng γ.6 và hình γ.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ c a chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0,00β4x + 0,00β với hệ số tương quan R2 = 0.999γ. Tra bảng được t(0,95; 4) = β,776. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 ta tính được độ lệch chuẩn c a phương trình hồi quy như sau: Sy = 0,01289 và Sa= 3,70.10-5 ; Sb = 0,01013. Ph ng trình h i quy đ y đ lƠ: y = (0,0024 ± 1,07.10 -4)x + (0,002 ± 0,0028) 3.3.1.4 Giới h n ph ng pháp. a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ: 9 Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng cách lấy vào 10 bình định m c cỡ 10 ml: Cho vào bình có ch a sẵn khoảng 4 ml nước cất + 0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + 2 ml NaOH 1M sau đó định m c bằng nước cất hai lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang c a dãy dung dịch trên ở bước sóng 510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng γ.7. Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004 Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình: AO = 0,0026 Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,84γ.10-3 Giới hạn phát hiện LOD và LOQ c a phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu: 0,843.103 SY LOD = 3. = 3. = 0,77 mg/l 0, 0033 b 0,843.103 SY LOQ = 10. = 10. = 2,55 mg/l 0, 0033 b Giới hạn phát hiện LOD và LOQ c a phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn: LOD = 3. 0,843.103 SY = 3. = 1,05 mg/l 0, 0024 b 0,843.103 SY = 10. = 3,51 mg/l LOQ = 10. 0, 0024 b b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên c a đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa. Đối với chất đối chiếu CO-1: Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1 N ng đ CO-1 (mg/l) 48 72 100 110 120 130 A510 0,160 0,231 0,332 0,351 0,376 0,381 10 Độ hấp thụ quang Giới hạn LOL 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 50 100 150 Nồng độ CO-1 (m g/l) Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1 Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1β0 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị c a độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy kho ng tuy n tính c a phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ 2,55 ậ 120 mg/l. Đối với chất chuẩn catechin: Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin N ng đ catechin (mg/l) 500 900 1000 1100 1200 1300 A510 1,217 2,246 2,534 2,712 2,798 2,834 Độ hấp thụ quang Giới hạn LOL 3 2 1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Nồng độ catechin (m g/l) Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin Kết quả ở bảng γ.7 và hình γ.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị c a độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy kho ng tuy n tính c a phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là khoảng từ 3,51 ậ 1000 mg/l. 3.3.1.5 Đ đúng c a ph ng pháp Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác 1β mg/l. Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở bảng γ.7 Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp STT 1 2 3 11 4 5 6 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 12,367 12,000 12,700 11,700 11,700 12,000 A510 HƠm l ng S liệu th ng kê Ta có ttn = 12  12, 78 0,86 2 6 m = 12,78; SD = 0,86 = 2,22 Tra bảng t(0,95;5) = β,57 > t tn = 2,22. Như vậy : tc > ttn : Không có sự khác nhau về kết quả c a giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở m c ý nghĩa α = 0,95, t c là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Ph ng pháp không mắc sai s hệ th ng. 3.3.1.6 Đ n định c a ph ng pháp Tiến hành đo độ hấp thụ quang c a chất CO-1 có nồng độ 1β mg/l và c a catechin có nồng độ 100 mg/l. Sau đó dùng hàm chuẩn studen (t) để đánh giá. Kết quả được thể hiện ở bảng γ.9 Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1 1 2 3 4 5 6 CO-1 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 Catechin 0,242 0,242 0,243 0,242 0,241 0,243 STT A510 Ta có : Đối với chất CO-1: A510 1 = 0,0422 ; S1 = 11,70.10-4 Đối với chất catechin : A510 2 = 0,2422 ; S2 = 7,54.10-4 Ta có: Ftn = S12 (11, 70.104 )2 = = 1,55 > 1 . Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5). (7,54.104 )2 S22 Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng. K t qu định l ng flavonoid toƠn ph n trong nụ vƠ lá v i Hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối được tính theo khối lượng chất chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g). Được tính trong 1 g khối lượng mẫu dược liệu khô tuyệt đối. Giá trị kết quả c a hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại γ lần và kết quả ở bảng γ.1β được biểu diễn : m ± SD Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần STT Tên m u (n i thu hái) mm u (g) HƠm l ng HƠm l ng flavonoid toƠn ph n flavonoid toƠn ph n tính theo Catechin tính theo (mg/g) CO-1 (mg/g) Các m u lá 12 1 Bắc Giang 1,0028 30,33 ± 1,060 22,42 ± 1,060 2 Bắc Ninh 1,0017 20,73 ± 1,040 15,44 ± 1,040 3 Hà Đông (HN) 1,0028 21,81 ± 1,230 16,23 ± 1,230 4 Hòa Bình 1,0180 29,70 ± 1,320 21,99 ± 1,320 5 Phú Thọ 1,0066 23,74 ± 1,160 17,62 ± 1,160 6 Quảng Ninh 1,0221 22,61 ± 0,840 16,81 ± 0,840 7 Thái Bình 1,0380 22,69 ± 0,840 16,87 ± 0,840 1,0020 39,23 ± 1,630 28,91 ± 1,630 Các m u nụ 8 Chợ Đồng Xuân(HN) 9 Hưng Yên 1,0014 42,11 ± 1,630 30,99 ± 1,630 10 Nam Định 1,0032 40,93 ± 2,230 30,13 ± 2,230 11 Hải Dương 1,0045 39,23 ± 2,200 28,88 ± 2,200 12 Hà Đông (HN) 1,0052 34,98 ± 1,620 25,79 ± 1,620 13 Hà Nam 1,0066 38,51 ± 1,160 28,36 ± 1,160 14 Thái Nguyên 1,0013 37,43 ± 1,620 27,57 ± 1,650 Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối trong khoảng 15,44γ – ββ,418 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ β5,791 – 30,995 mg/g. Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá vối trong khoảng β0,7β8 – γ0,γγ1 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ γ4,978 – 42,114 mg/g. Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ vối cao hơn so với hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá vối. 3.3.2 Xơy dựng ph ng pháp định l ng flavonoid chính bằng HPLC 3.3.2.1 Kh o sát tính thích h p c a hệ th ng Để đánh giá tính thích hợp c a hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu đối chiếu có nồng độ 0,05γ mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả khảo sát tính thích hợp c a hệ thống được ghi ở bảng γ.11. Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống L n tiêm Th i gian l u Diện tích pic 1 9,12766 2190950 13 Các thông s th ng kê 2 9,07053 2186244 SD = 21052 3 9,18479 2205546 RSD = 0,95 (%) 4 9,47704 2245278 5 9,53417 2214240 6 9,41771 2213154 Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp và đảm bảo sự ổn định c a phép phân tích định lượng CO-1. 3.3.2.2 Kho ng tuy n tính c a ph ng pháp Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký như điều kiện đã mô tả. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng γ.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình 3.12. Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch N ng đ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s) 1 0,11 4575033 2 0,055 2483455 3 0,0275 1138335 4 0,011 529218 5 0,0055 269653 6 0 27465 Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn và tính toán DiÖn tÝch PÝc 5000000 Ph- ¬ng tr×nh: Y = A + B * X 4000000 Th«ng sè Gi¸ trÞ Sai sè -----------------------------------------------------------A 54599.803 46041.88268 B 4.16056E7 890693.07305 ------------------------------------------------------------ 3000000 2000000 R SD N P -----------------------------------------------------------0.99908 83327.81606 6 <0.0001 ------------------------------------------------------------ 1000000 0 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Nång ®é (mg/ml) Hình 3.10: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối 14 Δa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739 Δb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935 Phương trình hồi quy đầy đ c a đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng như sau : y = a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x107 ± 1898815,935). CC.01 (1) 3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại c a phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu ch a chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,04β mg/ml (Bảng γ.1γA) và mẫu thực nụ vối Hưng yên (Bảng γ.1γB). Bảng 3.13A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1 L n tiêm 1 2 3 4 5 6 SPIC (AU.s) 1663046 1712229 1725100 1730613 1666705 1727390 Các thông s th ng kê SD = 31102; RSD = 1,82(%) Bảng3.13 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực Tên m u thử S m u định l ng HƠm l ng tìm th y % Các s liệu th ng kê Nụ vối Hưng Yên 6 1,86 SD = 0,0346 ; RSD = 1,696% 3.3.2.4 Đ đúng c a ph ng pháp Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ c a chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Hiệu suất thu hồi được tính theo công th c sau : H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn được thêm vào Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Tên m u S l n L ng L ng tìm % tìm l i đ thử định l ng thêm vào (mg) l iđ c trung bình trung bình Mẫu nụ vối Hưng Yên 6 0,044 0,043 97,73 c S liệu th ng kê RSD = 2,16 % Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi lại cao hơn 90% có thể chấp nhận được. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao. 3.3.2.5 Giới h n c a ph ng pháp 15 Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu c a chất phân tích. Tiến hành phân tích theo các điều kiện đã lựa chọn, ở nồn độ 0,0γ1 μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD) c a phương pháp (Bảng γ.β0) thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng 2-3. Ta có S/N = 2H 2.0, 6 = =3 0, 4 h Hình 3.11: Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD Qua bảng γ.β0 và hình γ.1β xác định được giới hạn phát hiện (LOD) c a phương pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml. Như vậy suy ra giới hạn định lượng LOQ = γ,γ × LOD = 0,10βγ μg/ml. Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên c a đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và diện tích píc không còn tuyến tính nữa. Bảng 3.15: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL N ng Đ (mg/ml) 0,11 0,1375 0,22 0,275 0,367 0,55 Diện tích Píc 4575033 7119423 12105281 14809513 16490167 20791750 Giới hạn LOL Diện tích Píc 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ CO-1 (m g/m l) Hình 3.12: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL Từ kết quả (Bảng 3.15 và Hình 3.12) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm trong khoảng 0,1-β75 μg/ml. Bảng 3. 16: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối STT Tên m u Kh i Đ 16 SPic (A HƠm l ng ch t CO-1 (nơi thu hái) Các m u nụ v i l ng cân (g) ẩm (%) U.s) (mg/g) (% kl/kl) 1 Chợ Đồng Xuân (HN) 1,0709 12,62 1324731 16,81 ± 0,058 1,68 2 Hưng Yên 1,0007 11,18 1377958 18,61 ± 0,184 1,86 3 Nam Định 1,0113 11,14 1022567 13,45 ± 0,160 1,35 4 Hải Dương 1,0032 7,65 1143549 14,69 ± 0,093 1,47 5 Hà Đông (HN) 1,0057 6,77 1048407 13,24 ± 0,030 1,32 6 Hà Nam 1,0266 8,00 1066353 13,36 ± 0,125 1,34 7 Thái Nguyên 1,0003 7,85 1067456 13,74 ± 0,173 1,37 8 Các m u lá v i Bắc Giang 1,0020 9,30 3447931 4,661 ± 0,058 0,47 9 Bắc Ninh 1,0017 11,50 3158279 4,376 ± 0,053 0,44 10 Hà Đông (HN) 1,0028 11,10 3178280 4,377 ± 0,029 0,44 11 Hòa Bình 1,0180 15,10 3379762 4,792 ± 0,030 0,48 12 Phú Thọ 1,0066 8,70 3449983 4,625 ± 0,045 0,46 13 Quảng Ninh 1,0221 11,50 3312138 4,493 ± 0,023 0,49 14 Thái Bình 1,0380 10,90 3258986 4.327 ± 0,029 0,43 Kết quả định lượng các mẫu thu hái tại một số địa phương ở miền bắc Việt Nam cho biết hàm lượng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng 0,4γ - 0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm lượng trong nụ vối trong khoảng 1,γβ – 1,86%. Kết quả nghiên c u này gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu vối sử dụng cho y học cổ truyền. 17 K T LU N 1. Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid. Xác định được độ tinh khiết c a flavonoid chính bằng HPLC (98,21%). 2. Đã xây dựng được phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng các phản ng hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đã đưa ra các phản ng định tính flavonoid trong nụ và lá vối gồm: phản ng với các thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl3. Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid trong sắc ký bản mỏng (TLC) gồm: Hệ 1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ β: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v). Định tính được flavonoid chính bằng HPLC thông qua thời gian lưu (tR = 9,3 phút) và so sánh với chất đối chiếu CO-1 được tách từ nụ vối. γ. Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid: a) Bằng phương pháp trắc quang Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO1 (được tách từ nụ vối) và theo catechin. Xác định được khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định lượng flavonoid là ; Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng c a phép đo nằm trong khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ = β,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và LOD = 1,05 mg/l, LOQ = γ,51 mg/l (theo chất chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ ổn định c a phương pháp phù hợp. Đã xác định được hàm lượng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lá vối thu hái ở các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lượng trong các mẫu nụ là β5,791 – 30,995 mg/g, mẫu lá 15,44γ – ββ,418 mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1). Tính theo chất chuẩn catechin : mẫu nụ là γ4,978 – 4β,114 mg/g, mẫu lá β0,7β8 – 30,331 mg/g. Kết quả đã đánh giá được hàm lượng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê. b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đưa ra được điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định lượng flavonoid chính trong nụ và lá vối Xác định được khoảng tuyến tính (0,1 – β75 μg/ml) và lập đường chuẩn c a flavonoid. Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,0γ1 μg/ml) và giới hạn định lượng c a phép đo (LOQ = 0,10βγ μg/ml) . Đánh giá được sai số và độ lặp lại c a phép đo. 18 Đã xác định được hàm lượng c a 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone trong một số mẫu lá (4,3272 – 4,7924 mg/g) và nụ vối (13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hái ở các tỉnh phía Bắc. References I. Ti ng việt 1. Bộ Y tế (β005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội. tr. 7β-79. 2. Bộ Y tế (β007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội. tr.1γ-20. 3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn – Viện Dược liệu (β004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II NXB Y học, tr. 1065-1066. 4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1γγ0. 5. Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học β004. 6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y Học. 7. Đào Thị Thanh Hiền (β000), “Góp phần nghiên cứu cây vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 8. Trần T Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (β00γ), Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội. 9. Trần Hùng (β007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược Tp HCM. 10. Đỗ Tất Lợi (β001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, tr. 4βγ. 11. Phạm Luận (β000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN 12. Phạm Luận (β004), Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN 13. Hoàng Thị Lý (2011), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu nụ vối, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường đại học Dược Hà nội. 14. Trương Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Văn Chuyển, Nagashima Fumie “Tác dụng chống oxy hóa của nụ vối trên ống nghiệm và trên chuột tiểu đường” Tạp chí Y học dự phòng, β009, số 5 (104). 19 15. Hoàng Thị Tuyết Nhung (β01β), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận án Tiến sỹ Trường Đại học Dược Hà Nội. 16. Nguyễn Văn Ri, giáo trình môn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN 17. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế và Bộ giáo dục Hà Nội. 18. Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính (β010). “Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nụ và hoa cây vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr. et Perry) ở Nghệ An”. Tạp chí Dược học 405, tr. 44-46. 19. Tạ Thị Thảo, giáo trình môn học, Thống kê trong hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQGHN. β0. Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học hoa Khọc Tự Nhiên - ĐHQG HCM β1. Viện Dược liệu (β008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 1129, 39-49, 66-76. 22. Viện Dược liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (β009), Cây thuốc Nghệ an, tr. 606-608. βγ. Viện Dược liệu (β006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 494. β4. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội. II. Ti ng anh 25. Arvouet A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an extract of Propolis and identification of the major compounds”, J. Pharm. Belgg., Vol. 49 pp. 462-468. 26. Brás H. de Oliveira , Tomoe Nakashima ,José D. de Souza Filho and Fabiano L. Frehse (2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium littorale” J. Braz. Chem. Soc., Vol. 12, No. 2, pp. 243-246. 27. Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee Woo, Tran Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds”, Archives of Pharmacal Research 33(10), pp. 1665-1670. 28. Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran Manh Hung (2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity” Bull. Korean Chem. Soc., Vol.31, No.8. pp. 2392-2394 20 29. Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian (2005), “In vivo antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp. 70-74. 30. Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian (2004), “In vitro anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines”, Pharmacological Research 50(5), pp. 505-510. 31. Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp. 445–447 32. C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive Chalcone and tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South African Journal of Botany, 71 (3&4) pp. 312-315. 33. Dao Trong Tuan et al. (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1) neuraminidase”. Journal of Natural Products 73, pp. 1636-1642. 34. Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell (2000), “Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V. kalakhensis Khatt. Maxt & Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol. 53, No.1, pp. 63-68. 35. Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang (2005), “In vitro and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy 17(3), pp. 309-314. 36. Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor xenograft model”, Journal of the science of food and agriculture 92(1), pp. 135-140. 37. James M. Harnly, Robert F. Doherty, Gary R. Beecher, Oanne M.Holden, David B. Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid Content of U.S. Fruits, Vegetables, and Nuts” J. Agric. Food Chem. 54, pp. 9966ứ9977. 38. Lui Alberto Lira Soares, Valquíria Link Bassani, George González Ortega & Pedro Ros Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality Control of Aqueous Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat. Am. J. Pharm. 22 (3), pp. 203-207. 39. L.-Tao, Z-T.Wang, E.-Y.Zhu, Y.-H.Lu, D.-Z.Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African Journal of Botany 72 (2006), pp. 163-166. 21 40. Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar (2004), “Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoids and phenolic acids” Croat. Chem. Acta 77(1-2), pp. 361-366. 41. Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez & M A Dar “Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin Contents in Acetone and nhexane Extracts of Ageratum conyzoides” International Journal of ChemTech Research CODEN( USA): IJCRGG ISSN : 0974-4290 Vol. 4, No.3, pp. 996-999 42. Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology 46, pp. 3632–3639. 43. Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H. (1983), “Effects of UV-B radiation on plants during mild water stress-II. Effects on growth, protein and flavonoid contcent”, Z. Pflanzenphysiol. 110, pp. 459-467. 44. T. Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S and Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana heyneana Wall. using L16 Orthogonal design” Nature and Science, 6(3), 2008, ISSN: 15450740 45. Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1), pp. 69-76. 46. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007), “Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their relationship with polyphenol contents”, Journal of Nutritional Science and Vitaminology 53(3), pp. 267-276. 47. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (β008), “Thin layer Chromatography in Phytochemistry”, CRC Press, Florida. pp. 3-15. 22