- Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số www.vnua.edu.vn NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO (THẠCH HỘC THIẾT BÌ) Nguyễn Thị Sơn1*, Từ Bích Thủy2, Đặng Thị Nhàn1, Nguyễn Thị Lý Anh1, Hoàng Thị Nga1, Nguyễn Quang Thạch1 1 Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường. - Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g agar/lít môi trường. - Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α-NAA. - In vitro Micropropagation of Dendrobium officinale Kimura et Migo ABSTRACT Dendrobium officinale Kimura et Migo. - In vitro propagation of D. - The results showed that the medium for in vitro seed germination was VW + 10g sucrose + 6g agar + 100ml coconut milk per liter. - Keywords: Dendrobium officinale Kimura et Migo., in vitro propagation, seed germination, nodal stems. - Dendrobium officinale Kimura et Migo. - sự tàn phá môi trường sống bởi các hoạt động (Thạch hộc Thiết bì) có trong tự nhiên với nhiều đốn gỗ và khai thác quá mức của con người đã giá trị dược học như chống ung thư, chống lão khiến cho giống lan này tiệt chủng, trở thành hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn loài có nguy cơ liệt vào danh sách các loài cần mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng được bảo vệ (Gu, 2007). - Đã pH môi trường là 5,8. - Môi trường nuôi cấy được có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút ở áp suất Dendrobium sp. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA nhiên CRD, 3 lần nhắc lại. - Nguyễn Văn Song (2011) mẫu/công thức được đo đếm và quan sát định kỳ cũng nhân nhanh in vitro loài lan rừng có nguy 2 tuần/lần. - cơ tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là Nhân giống từ hạt trên 3 loại môi trường gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là Vacin & sacarose + 2,0 mg/l BA. - Trong 3 năm gần đây Went (1949), Murashige & Shoog (1962), Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp Hyponex (N:P:K Robert Ernst (1979) dụng công nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số để tạo nguồn vật liệu ban đầu. - nhanh chồi trên môi trường nền MS. - Sử dụng Để chủ động nguồn cây giống có chất lượng các chồi thu được từ thí nghiệm trên cắt thành các đoạn thân mang 1-2-3-4 mắt ngủ và được cao, sạch bệnh phục vụ cho phát triển sản xuất đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền MS để tìm phục vụ nhu cầu nội tiêu cũng như xuất khẩu hiểu ảnh hưởng của số đốt đến sinh trưởng của thì nhiệm vụ nhân giống lan bằng phương pháp chồi. - Sử dụng đoạn thân mang 2 mắt ngủ bổ nuôi cấy mô là hướng đi đúng đắn nhằm bổ sung sung kết hợp BA với NAA theo tỷ lệ khác nhau thêm giống lan thuốc, đẩy mạnh phát triển loại nhằm tăng khả năng sinh trưởng chồi. - thu được ở thí nghiệm trên được sử dụng cấy vào các nền môi trường khác nhau sau đó bổ 2. - Sử dụng lá TB, đường kính chồi TB, hình thái chồi, Tỷ lệ quả và đoạn thân in vitro mang mắt ngủ. - Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là với mức P ≤ 0,05 bằng phần mềm Microsoft Vacin & Went (1949), Murashige & Shoog Excel, IRRISTAT 4.0 và SPSS Hyponex (N:P:K Robert Ernst g/l agar, 10-20 g/l saccarose tùy từng giai đoạn của thí nghiệm và 100 mg/l 3. - Cách làm dịch nghiền: quả táo đỏ, cà Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và rốt để cả vỏ rửa sạch, chuối tiêu chín bỏ vỏ, xay thế giới trên đã công bố kết quả nghiên cứu khử 1275 Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) Bảng 1. - Kế thừa các loại môi trường (MS, VW và H) sau 8 tuần nuôi kết quả đó chúng tôi tiến hành khử trùng quả cấy, các hạt đã nảy chồi 100% trên nền môi lan 5 tháng tuổi theo công thức: khử trùng bằng trường MS và VW. - Hạt gieo trên nền môi trường xà phòng → rửa dưới vòi nước chảy → rửa sạch VW cho tỷ lệ hạt có màu xanh cao nhất, sau 6 quả lan bằng cồn → lắc đều trong dung dịch tuần nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cao Johnson 15 phút (trong tủ cấy. - Hạt được gieo trên nền môi trường bằng nước cất (trong tủ cấy. - rửa tuần nuôi cấy. - Gắp quả ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi trường đã được Về hình thái, chồi tốt nhất trên môi trường chuẩn bị sẵn. - Vì vậy, môi trường Shoog, 1962), VW (Vacin & Went, 1949), VW + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi Hyponex. - Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu trường + 10% ND là môi trường thích hợp nhất vàng chanh. - Sau 8 tuần nuôi cấy thu được kết cho sự nảy mầm của hạt lan D. - et Migo. - Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy so với các công thức khác. - Như vậy, môi trường đến khả năng nhân nhanh cụm chồi nuôi cấy được lựa chọn trong nhân nhanh cụm chồi lan D. - officinale Kimura et Migo. - là môi Việc xác định được môi trường tối ưu để trường MS + 20g sucrose + 10% nước dừa + 6g nuôi cấy nhân nhanh chồi, làm tăng hệ số nhân, agar/lít môi trường. - đồng thời các chồi đều đạt chất lượng tốt không bị biến dị trước khi chuyển sang môi trường tạo b. - Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cây hoàn chỉnh là một yêu cầu không thể thiếu củ, quả đến khả năng nhân nhanh cụm chồi trong nhân in vitro. - đưa vào nuôi cấy trên nền môi trường MS có bổ Theo kết quả trình bày trên bảng 2 cho sung các dịch nghiền (khoai tây, cà rốt, táo, thấy: Các công thức khác nhau có ảnh hưởng chuối) qua đó xác định được ảnh hưởng của các khác nhau đến số chồi/cụm và hệ số nhân (HSN) chất bổ sung này đến khả năng nhân nhanh của chồi của giống lan nghiên cứu. - Môi trường MS cụm chồi. - (CT1) rất phù hợp cho quá trình tăng nhanh về Kết quả cho thấy ở các công thức bổ sung số lượng chồi (14,02 chồi/cụm) và HSN chồi (2,8 riêng lẻ các dịch nghiền vào môi trường nuôi cấy lần/4 tuần) trong nuôi cấy cụm chồi. - Môi trường thì CT5 (60 gam chuối chín/lít môi trường) cho ½ MS và VW cho số lượng chồi, HSN chồi thấp số chồi TB/cụm nhiều nhất (16,20 chồi/cụm) và hơn so với nền môi trường MS lần lượt là (12,29 HSN chồi cao nhất (đạt 3,24 lần). - Môi trường ½ VW (CT4) cho số trường nuôi cấy không cho kết quả vượt trội chồi/cụm (10,49 chồi) và HSN (2,1 lần) là thấp theo tính cộng hợp mà ở các công thức từ CT6- nhất sau 4 tuần nuôi cấy. - Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh cụm chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) Tỷ lệ mẫu sống CTTN Số chồi TB/bình HSN chồi (lần) Hình thái mẫu và nhân chồi. - Kết quả nhân nhanh chồi trên các môi trường nền (sau 4 tuần nuôi cấy) 1277 Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) Bảng 3. - c CT2: ĐC + 60g khoai tây/lít môi trường 15,00 3,00. - c CT3: ĐC + 60g cà rốt/lít môi trường 13,73 2,74. - c CT4: ĐC + 60g táo/lít môi trường 14,46 2,89. - b CT5: ĐC + 60g chuối/lít môi trường 16,20 3,24. - a CT6: ĐC + 60g khoai tây + 60g cà rốt/lít môi trường 13,53 2,71. - b CT7: ĐC + 60g khoai tây + 60g táo/lít môi trường 13,40 2,68. - b CT8: ĐC + 60g khoai tây + 60g chuối/lít môi trường 14,67 2,93. - b CT9: ĐC + 60g cà rốt + 60g táo/lít môi trường 14,33 2,87. - b CT10: ĐC + 60g cà rốt + 60g chuối/lít môi trường 14,13 2,83. - b CT11: ĐC + 60g táo + 60g chuối/lít môi trường 13,33 2,67. - ĐC = Môi trường MS + 100ml ND+ 20g sucrose + 6g agar/lít môi trường chồi thấp hơn CT5. - Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy hợp các chất tự nhiên vào cùng môi trường đoạn thân in vitro mang mắt ngủ nhân chồi không mang lại hệ số nhân chồi 3.2.1. - Ở độ tin cậy 95%, số chồi/cụm thu được và HSN chồi đạt được in vitro đến sinh trưởng chồi sau 8 tuần nuôi cấy ở công thức 5 cao hơn so Cây lan in vitro được cắt thành những đoạn với các công thức khác. - Môi trường MS + mang 1-2-3-4 mắt ngủ và được đưa vào nuôi cấy 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối trên môi trường nền MS để tìm hiểu ảnh hưởng chín/lít môi trường là tối ưu cho nhân nhanh của số đốt trên đoạn thân in vitro đến sinh cụm chồi loài lan nghiên cứu. - hangianum Gurss.) khi nhân chiều cao chồi, đường kính chồi, số chồi và màu nhanh chồi cho biết cần bổ sung lượng chuối sắc lá xanh tốt hơn hẳn so với các công thức còn cao hơn, lên đến 100g chuối/lít môi trường lại. - Ảnh hưởng của số trên đoạn thân đến sinh trưởng chồi in vitro (sau 8 tuần) Chiều cao chồi Số chồi TB/đoạn Đường kính chồi CTTN Màu sắc lá TB (cm) thân (mm) CT1: Đoạn thân mang 1 mắt ngủ xanh nhạt CT2: Đoạn thân mang 2 mắt ngủ xanh đậm CT3: Đoạn thân mang 3 mắt ngủ xanh nhạt CT4: Đoạn thân mang 4 mắt ngủ xanh nhạt LSD CV Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch 3.2.2. - Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến chồi/mẫu và chiều cao chồi thu được trên môi sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ trường chứa BA và αNAA cao hơn so với công in vitro thức đối chứng. - Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi Môi trường MS có bổ sung BA (0,5 mg/l môi cấy. - hình thái với các tổ hợp của BA và NAA ở các Như vậy, môi trường MS + 20g sucrose + nồng độ khác nhau. - 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 6g Kết quả bảng 5 cho thấy, bổ sung nồng độ agar/lít môi trường là thích hợp cho việc phát BA kết hợp với αNAA hợp lý vào môi trường sinh chồi giống lan D. - officinale Kimura et nuôi cấy là rất hiệu quả cho tái sinh chồi giống Migo. - Ảnh hưởng của BA + NAA đến sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ in vitro (sau 8 tuần) Chiều cao Số chồi Số lá TB Màu sắc Đường CTTN chồi (cm) TB/đoạn thân (lá) lá kính thân CT1: ĐC xanh nhạt mảnh CT2: ĐC + 0,3 mg/l BA + 0,1 mg/l αNAA xanh nhạt mảnh CT3: ĐC + 0,3 mg/l BA + 0,2 mg/l αNAA xanh nhạt mảnh CT4: ĐC + 0,3 mg/l BA + 0,3 mg/l αNAA xanh nhạt mảnh CT5: ĐC + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l αNAA xanh nhạt mập CT6: ĐC + 0,5 mg/l BA + 0,2 mg/l αNAA xanh đậm mập CT7: ĐC + 0,5 mg/l BA + 0,3 mg/l αNAA xanh nhạt mập LSD CV Ghi chú: ĐC = Môi trường MS + 20g sucrose + 10% nước dừa (ND)+ 6g agar/lít môi trường CT1 CT6 Hình 3. - Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến sinh trưởng của đoạn thân mang 2 mắt ngủ in vitro (sau 8 tuần) 1279 Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) 3.3. - Tạo cây hoàn chỉnh giá trị cao hơn so với các môi trường khác là 2,8cm. - Vậy, nuôi cấy chồi lan D. - Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi Kimura et Migo. - trên môi trường RE + 10g cấy đến khả năng tạo rễ của chồi sucrose + 6g agar + 0,3g THT/lít môi trường là Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình tối ưu để tạo cây hoàn chỉnh. - nhân nhanh in vitro. - Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA hành lấy chồi thu được từ các thí nghiệm trên đến khả năng sinh rễ của chồi tách riêng rẽ cấy trên 7 môi trường nền khác Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, nhau, mỗi công thức cấy 3 bình, mỗi bình cấy 5 auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế chồi, mỗi chồi có chiều cao 3cm, 3 lá. - Những auxin thường dùng sau 30 ngày nuôi cấy được thể hiện qua bảng 6. - rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là Kết quả bảng 6 cho thấy: sau 30 ngày nuôi αNAA, IAA… Để tăng khả năng ra rễ cho chồi cấy, ở tất cả các công thức với nền môi trường giống lan D. - tôi đã tiến hành thí nghiệm với 5 công thức trên Trên nền môi trường RE (CT5) cho số rễ nhiều nền môi trường RE có bổ sung nồng độ α-NAA nhất là 3,53 rễ/chồi. - Sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi bình/rễ, nuôi cấy trên môi trường RE cũng cho thu được kết quả như sau: Bảng 6. - Ảnh hưởng của nền môi trường đến khả năng ra rễ của chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) Tỷ lệ chồi tạo rễ. - trên môi trường RE có bổ sung αNAA (sau 30 ngày nuôi cấy) Các công thức có bổ sung αNAA và ĐC sau Môi trường RE + 10g sucrose+ 6g agar+ 10 ngày nuôi cấy đều cho số chồi tạo rễ đạt 0,3g THT + 0,5 αNAA/lít môi trường là tối ưu ở 100% nhưng số rễ/cây và chiều dài rễ ở các công giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh giống lan D. - với tỷ lệ cây ra rễ đạt 0,5mg αNAA/lít môi trường nuôi cấy cho số rễ 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi. - chiều dài nhiều nhất là 4,51 rễ/chồi và chất lượng rễ là tốt rễ trung bình là 3,19cm sau 30 ngày nuôi cấy. - Tuy nhiên, trên môi trường có bổ sung αNAA nhiều hơn (CT4, CT5) hoặc ít hơn (CT2) TÀI LIỆU THAM KHẢO thì cây có số rễ ít hơn và chất lượng rễ kém hơn. - Vậy, trên môi trường RE +10g sucrose+ 6g agar Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng + 0,3g THT/lít môi trường bổ sung 0,5mg Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010). - Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P. - αNAA/lít môi trường vào môi trường nuôi cấy hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở chồi lan D. - Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. - Môi trường VW + 10g sucrose + 6g agar + Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001). - Vi nhân 100ml ND/lít môi trường là tối ưu ở giai đoạn nuôi giống phong lan nhóm Dendrobium trên quy mô cấy khởi động hạt lan D. - officinale Kimura et công nghiệp, nhân giống in vitro. - Môi trường Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh, nuôi cấy tối ưu để nhân nhanh cụm chồi giống Hoàng Minh Tú (2008). - là MS + 100ml nhanh giống địa lan Hồng hoàng (Cymbidium ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít iridioides) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. - tuần nuôi cấy. - Nhân nhanh in vitro Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum. - Tạp chí khoa đoạn thân mang mắt ngủ: Đoạn thân in vitro học ĐH Huế . - mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + Thế Mai (2012). - Nhân giống in vitro loài lan 0,5mg/l αNAA+ 6g agar/lít môi trường là thích Dendrobium fimbriatum Hook. - 1281 Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor plantima lanceolata var. - Axenic seed Tissue culture of Dendrobium officinale Kimura germination and in vitro seedling development of et Migo., Subtropical Plant Science . - In vitro micropropagation of orchid, S.Gu, X