Nguy n Hoàng Lộc Giáo trình CÔNG NGH T BÀO Nhà xuất bản Đại học Hu Năm 2006 PGS. TS. Nguy n Hoàng Lộc Giáo trình CÔNG NGH T BÀO Nhà xuất bản Đại học Hu Năm 2006 Mục lục Lời nói đầu Chương 1. Mở đầu I. Công nghệ sinh học 1. Công nghệ DNA tái tổ hợp 2. Dung hợp tế bào 3. ng dụng c a công nghệ sinh học hiện đại II. Công nghệ tế bào 1. Chúng ta mong đợi thay đổi cái gì 2. Quá trình sinh học xảy ra với một tốc độ nh thế nào 3. Hệ thống đ ợc hoạt động và điều chỉnh nh thế nào để đạt đ ợc hiệu suất tối đa 4. Các sản phẩm đ ợc phân tách nh thế nào để có đ ợc sự tinh sạch cực đại và giá thành tối thiểu III. Quá trình sinh học 1. Các u điểm 2. Các nh ợc điểm IV. Định nghĩa sự lên men Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 2. Sinh trưởng và bất động của tế bào I. Xác định sinh tr ởng c a tế bào 1. Xác định số l ợng tế bào 2. Xác định sinh khối tế bào 3. Các ph ơng pháp gián tiếp II. Bất động tế bào 1. Gắn lên bề mặt 2. Tạo thể xốp 3. Sử dụng bao vi thể 4. Tự kết khối III. Một số thí nghiệm điển hình 1. Đ ờng cong sinh tr ởng c a nấm men 2. Đ ờng cong sinh tr ởng c a thực vật 3. Bất động tế bào thực vật Tài liệu tham khảo/đọc thêm Trang 1 2 2 2 3 3 5 6 7 7 7 8 8 8 9 10 11 11 11 13 14 16 16 16 18 18 18 18 20 21 22 201 Chương 3. Động học sinh trưởng của tế bào 23 23 24 26 26 28 29 31 31 32 Chương 4. Thiết kế hệ lên men 33 33 35 38 41 43 45 I. Mở đầu II. Định nghĩa III. Chu kỳ sinh tr ởng c a nuôi cấy mẻ 1. Pha lag 2. Pha sinh tr ởng theo hàm mũ 3. Các nhân tố ảnh h ởng đến tốc độ sinh tr ởng đặc tr ng 4. Pha tĩnh và pha chết IV. Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm I. Hệ lên men thùng khuấy 1. Hệ lên men dòng nút (PFF) hoặc mẻ (batch) 2. Hệ lên men thùng khuấy liên tục (CSTF) lý t ởng 3. ớc l ợng các thông số động học Monod 4. Hiệu suất c a CSTF 5. So sánh nuôi cấy c a hệ lên men mẻ và hệ lên men thùng khuấy liên tục II. Thu hồi tế bào 1. Thu hồi tế bào ở PFF 2. Thu hồi tế bào ở CSTF III. Các hệ lên men khác 1. Hệ lên men cột 2. Hệ lên men vòng IV. Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 5. Nuôi cấy tế bào vi sinh vật I. Tế bào vi sinh vật II. Vi khuẩn 1. Hình dạng 2. Kiểu sinh tr ởng 3. Các điều kiện vật lý ảnh h ởng đến sinh tr ởng III. Vi nấm 1. Nấm men 2. Nấm mốc IV. Môi tr ờng nuôi cấy 1. Môi tr ờng tự nhiên 46 46 49 51 52 54 55 57 58 58 61 61 61 61 62 63 63 64 65 202 2. Môi tr ờng tổng hợp 3. Khử trùng 4. Nuôi cấy V. Sản xuất kháng sinh 1. Sản xuất penicillin 2. Sản xuất streptomycin VI. Sản xuất thuốc bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 1. Insulin 2. Interferon 3. Hormone 4. Vaccine 5. Một số loại thuốc khác VII. Sản xuất enzyme Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 6. Nuôi cấy tế bào động vật I. Mở đầu 1. Các u điểm c a nuôi cấy tế bào động vật 2. Một số hạn chế c a nuôi cấy tế bào động vật II. Tế bào động vật 1. Các tế bào dịch huyền phù 2. Các tế bào dính bám III. Môi tr ờng nuôi cấy IV. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 1. Hệ thống sản xuất 2. Tối u hóa môi tr ờng dinh d ỡng và tế bào vật ch V. Các kháng thể đơn dòng 1. Dung hợp tế bào 2. Thử nghiệm kháng thể IV. Sản xuất thuốc và DNA vaccine 1. Interferon 2. Hoạt tố plasminogen mô 3. DNA vaccine VII. Tế bào động vật sử dụng trong cấy ghép VIII. Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy IX. Mô hình thực nghiệm Tài liệu tham khảo/đọc thêm 65 65 66 66 66 68 69 69 70 70 71 72 74 76 77 77 78 78 80 80 80 81 83 84 86 87 88 90 91 91 92 92 94 97 98 99 203 Chương 7. Nuôi cấy tế bào thực vật I. Mở đầu II. Tế bào thực vật III. Các loại nuôi cấy tế bào và mô thực vật 1. Sinh tr ởng không phân hóa 2. Sinh tr ởng có phân hóa IV. Môi tr ờng nuôi cấy V. Sản xuất các chất th cấp 1. Các chất th cấp dùng trong thực phẩm 2. Các chất th cấp dùng trong d ợc phẩm VI. Sản xuất các protein tái tổ hợp 1. GM-CSF ng ời 2. Kháng thể IgG1 c a chuột 3. Interleukin VII. Chọn dòng tế bào biến dị soma VIII. Dung hợp protoplast hay lai vô tính tế bào thực vật Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 8. Công nghệ DNA tái tổ hợp I. DNA và RNA II. Tạo dòng gen 1. Các trình tự DNA 2. Sự kết hợp c a các phân tử DNA III. Khả năng ổn định c a các vi sinh vật tái tổ hợp 1. Động học lên men c a các nuôi cấy tái tổ hợp 2. Nuôi cấy trong hệ thống lên men thùng khuấy liên tục 3. Các ph ơng pháp ổn định IV. Biến đổi di truyền ở tế bào thực vật 1. Kỹ thuật gen 2. Biến nạp gen V. Biến đổi di truyền ở tế bào động vật 1. Kỹ thuật gen 2. Biến nạp gen VI. Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 9. Tiệt trùng I. Các ph ơng pháp tiệt trùng 1. Nhiệt 100 100 102 104 104 105 107 108 111 114 116 117 119 119 120 120 122 123 123 127 127 129 131 133 136 138 139 140 143 144 144 145 149 150 151 151 151 204 2. Hóa chất 3. Tia cực tím 4. Sóng siêu âm 5. Lọc II. Động học c a hiện t ợng chết do nhiệt III. Tiêu chuẩn thiết kế IV. Tiệt trùng từng mẻ V. Tiệt trùng liên tục 1. Bộ phận đun nóng 2. Bộ phận giữ nóng 3. Bộ phận làm lạnh 4. Tiệt trùng không khí VI. Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 10. Khuấy trộn và thông khí I. Mở đầu 1. Con đ ờng chuyển khối II. Các khái niệm cơ bản về chuyển khối 1. Sự khuếch tán phân tử trong chất lỏng 2. Hệ số chuyển khối 3. Cơ chế c a chuyển khối III. Xác định vùng phân giới IV. Tắc nghẽn khí 1. Phun khí bằng khuấy trộn không cơ học 2. Phun khí bằng khuấy trộn cơ học V. Xác định tốc độ hấp thụ oxygen 1. Ph ơng pháp oxy hóa sodium sulfite 2. Kỹ thuật tách không khí 3. Xác định trực tiếp 4. Kỹ thuật động lực học VI. Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Phụ lục. Một số thuật ngữ cơ bản Mục lục 152 152 152 152 153 154 154 156 157 157 161 161 166 168 169 169 171 171 171 173 175 176 177 178 178 179 181 182 183 183 184 186 187 201 205 Lời nói đầu Công nghệ tế bào là một bộ phận quan trọng của công nghệ sinh học, chủ yếu nghiên cứu các quá trình nuôi cấy tế bào động-thực vật và vi sinh vật để sản xuất sinh khối, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vaccine, các chất thứ cấp…), để làm mô hình thực nghiệm khảo sát các tác động của hoá chất, làm nguyên liệu ghép tế bào và cơ quan… Mặc dù, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào chỉ được phát triển vào nửa đầu thế kỷ 20, nhưng đến nay các ứng dụng của chúng đã có những bước tiến vượt bậc nh sự đóng góp của công nghệ DNA tái tổ hợp. Bên cạnh các giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen… giáo trình công nghệ tế bào sẽ giúp sinh viên tiếp cận thêm một lĩnh vực khác của công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp những kiến thức cơ bản về các vấn đề sau: - Sinh trư ng và động học sinh trư ng của tế bào. - Thiết kế các hệ lên men. - Nuôi cấy tế bào và các ứng dụng của chúng. Giáo trình công nghệ tế bào được biên soạn theo hướng khảo sát một quá trình sinh học mang tính công nghệ nhiều hơn cả đó là quá trình lên men ứng dụng cho cả tế bào vi sinh vật, lẫn tế bào động-thực vật trong các thiết bị nuôi cấy (bioreactor/fermenter). Do đó, một số ứng dụng khác của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nói chung chúng tôi không đưa vào giáo trình này. Lĩnh vực công nghệ tế bào rất rộng và đa dạng, hơn nữa giáo trình này mới được xuất bản lần đầu tiên nên khó tránh khỏi thiếu sót hoặc chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc. Vì thế, chúng tôi rất mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn. Tác giả Chương 1 Mở đầu I. Công nghệ sinh học Đến nay có rất nhiều định nghĩa và cách diễn đạt khác nhau về công nghệ sinh học tùy theo từng tác giả và tổ chức. Tuy nhiên, công nghệ sinh học (biotechnology) có thể được định nghĩa một cách tổng quát như sau: “Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất quy mô công nghiệp mà nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật và động vật). Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ”. Nếu công nghệ sinh học được định nghĩa theo hướng trên thì nó không thể được thừa nhận là một lĩnh vực khoa học mới. B i vì, từ xa xưa loài ngư i đã biết sử dụng các vi sinh vật để lên men bánh mì và thực phẩm, cho dù họ không biết cơ chế của những biến đổi sinh học này là như thế nào. Loài ngư i cũng đã biết từ rất lâu việc lai tạo động vật và thực vật để cải thiện năng suất vật nuôi và cây trồng được tốt hơn. Vì thế, công nghệ sinh học được định nghĩa như trên được xem như công nghệ sinh học truyền thống. Tuy nhiên, trong những năm gần đây thuật ngữ công nghệ sinh học thư ng được sử dụng nhằm đề cập đến những kỹ thuật mới như DNA tái tổ hợp và dung hợp tế bào, và được xem là lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại. 1. Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Là những kỹ thuật cho phép thao tác trực tiếp nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt, có thể được sử dụng để phát triển các vi sinh vật sản xuất các sản phẩm mới cũng như các cơ thể hữu ích khác. Những kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật di truyền (genetic engineering), công nghệ di truyền (genetic technology), thao tác gen (gene manipulation), kỹ thuật gen (gene engineering) hay công nghệ gen (gene Công nghệ tế bào 2 technology)... Mục tiêu chính của công nghệ DNA tái tổ hợp là gắn một gen ngoại lai (foreign gene) mã hóa cho một sản phẩm mong muốn vào trong các dạng DNA mạch vòng (plasmid vector) và sau đó đưa chúng vào trong một cơ thể vật chủ, sao cho gen ngoại lai có thể biểu hiện để sản xuất sản phẩm của nó từ cơ thể này. 2. Dung hợp tế bào (cell fusion) Là quá trình hình thành một tế bào lai đơn (single hybrid cell) với nhân và tế bào chất từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp các đặc điểm mong muốn của cả hai loại tế bào này. Chẳng hạn, các tế bào đặc biệt của hệ thống miễn dịch có thể sản xuất ra các kháng thể hữu ích. Tuy nhiên, các tế bào này thư ng khó nuôi cấy vì tốc độ sinh trư ng của chúng rất chậm. Mặt khác, các tế bào khối u nhất định nào đó có các đặc điểm bất tử và phân chia nhanh. Bằng cách dung hợp hai tế bào này, một tế bào lai hybridoma có thể được tạo ra mang cả hai tính trạng trên. Các kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-Mabs) được sản xuất từ các tế bào lai, được dùng để chẩn đoán, điều trị bệnh và tinh sạch protein. 3. ng dụng c a công nghệ sinh học hiện đại Các ứng dụng của công nghệ sinh học hiện đại là rất nhiều (Bảng 1.1). Các dược phẩm hiếm và đắt triền trước đây như insulin để chữa bệnh đái tháo đư ng, hormone sinh trư ng ngư i để điều trị bệnh còi của trẻ em, interferon để chống viêm nhiễm, vaccine phòng bệnh và các kháng thể đơn dòng dùng để chẩn đoán... có thể được sản xuất bằng các tế bào được biến đổi di truyền hoặc các tế bào lai rẻ tiền với số lượng lớn. Các con giống sạch bệnh hoặc khoẻ mạnh hơn, các vật nuôi dùng làm thực phẩm có sản lượng cao có thể được phát triển, các loài cây trồng quan trọng có thể được biến đổi di truyền để có các tính trạng chống chịu stress, chống chịu chất diệt cỏ và kháng côn trùng. Hơn nữa, công nghệ DNA tái tổ hợp có thể được ứng dụng để phát triển các vi sinh vật được biến đổi di truyền (genetically modification) sao cho chúng có thể sản xuất các hợp chất hóa học khác nhau với sản lượng cao hơn các vi sinh vật bình thư ng. Công nghệ tế bào 3 Bảng 1.1. Các ứng dụng của công nghệ sinh học hiện đại. Lĩnh vực Các sản phẩm hoặc các ứng dụng Dược phẩm Kháng sinh, kháng nguyên (kích thích các đáp ứng kháng thể), endorphin (chất dẫn truyền thần kinh), γglobulin (ngăn cản sự viêm nhiễm), hormone sinh trư ng ngư i (điều trị trẻ em bị bệnh còi), albumin huyết thanh ngư i (điều trị chấn thương cơ thể), các nhân tố điều hòa miễn dịch, insulin, interferon (điều trị bệnh viêm nhiễm), interleukin (điều trị các bệnh nhiễm trùng và ung thư), lymphokine (phản ứng miễn dịch điều chỉnh), kháng thể đơn dòng (chẩn đoán hoặc phân phối thuốc), peptide hoạt hóa thần kinh (bắt chước các peptide điều khiển sự đau của cơ thể), các nhân tố hoạt hóa plasminogen của mô (hòa tan các cục máu đông), vaccine. Chăn nuôi-Thú y Phát triển các con giống sạch bệnh và mạnh khoẻ hơn, các gia súc cho thịt có sản lượng cao hơn. Trồng trọt Chuyển các tính trạng chống chịu stress, kháng côn trùng và chất diệt cỏ vào các loài cây trồng, phát triển các giống cây trồng có khả năng tăng quá trình quang hợp và cố định đạm, phát triển các thuốc trừ sâu sinh học và các vi khuẩn nhân không đóng băng (non-ice nucleating). Các hóa chất đặc biệt Các amino acid, enzyme, vitamin, lipid, các chất thơm được hydroxyl hóa, các polymer sinh học. Các ứng dụng môi trư ng Ngâm chiết khoáng, cô đặc kim loại, kiểm soát sự ô nhiễm, phân hủy chất thải độc và thu hồi dầu loang. Các hóa chất thương mại Acetic acid, acetone, butanol, ethanol, nhiều sản phẩm khác từ các quá trình biến đổi sinh khối. Điện tử sinh học Biosensor, biochip. Công nghệ tế bào 4 II. Công nghệ tế bào Các công nghệ DNA tái tổ hợp hoặc dung hợp tế bào được kh i đầu b i những nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối cùng có thể phát triển thành một loại tế bào mới có thể sản xuất sản phẩm với số lượng ít ỏi qui mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, các kết quả nói trên lại rất có ý nghĩa thương mại và vì thế nó đòi hỏi phải phát triển thành quy trình công nghiệp với một công nghệ khả thi và có hiệu quả kinh tế. Để phát triển một quá trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm thành một quy trình công nghiệp lớn, chúng ta không thể chỉ đơn thuần tăng kích thước của bình nuôi cấy (vessel) lên. Ví dụ: quy mô phòng thí nghiệm là 100 mL, một bình tam giác nhỏ nuôi trên một máy lắc là phương thức lý tư ng để nuôi cấy tế bào. Nhưng đối với hoạt động quy mô lớn 2.000 L, chúng ta không thể sử dụng một bình nuôi khác có thể tích lớn hơn và lắc nó, mà cần phải thiết kế một hệ lên men (fermenter) hay còn gọi là nồi phản ứng sinh học (bioreactor) hiệu quả để nuôi cấy tế bào trong những điều kiện tối ưu nhất. Vì thế, công nghệ tế bào (một trong những lĩnh vực chính của công nghệ sinh học) có vai trò rất quan trọng trong thương mại hóa các sản phẩm của nó. Để minh họa vai trò của công nghệ tế bào, có thể xem một quá trình sinh học đặc trưng bao gồm các tế bào vi khuẩn như trình bày hình 1.1. Các nguyên liệu thô (thư ng là sinh khối) được xử lý và trộn với các thành phần cần thiết khác để tế bào có thể sinh trư ng tốt trong một hỗn hợp dịch lỏng, môi trư ng nuôi cấy được khử trùng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống và đưa vào bình nuôi cấy hình trụ lớn, thiết bị đặc trưng với cánh khuấy, vách ngăn, hệ thống thông khí và các bộ phận cảm biến để điều chỉnh các điều kiện lên men. Một chủng vi sinh vật thuần khiết được đưa vào trong một bình nuôi cấy. Các tế bào kh i đầu sinh sản theo hàm mũ sau một th i gian nhất định của pha lag và đạt tới nồng độ tế bào cực đại khi môi trư ng đã bị sử dụng hết. Sự lên men sẽ dừng lại và các thành phần sẽ được hút ra để thu hồi sản phẩm và tinh sạch chúng. Quá trình này được hoạt động theo kiểu lên men mẻ (batch culture) hoặc liên tục (continuous culture). Khi tiến hành một quá trình sinh học (bioprocessing) trên quy mô lớn cần lưu ý: - Phải thu được các chất xúc tác sinh học tốt nhất (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực vật, hoặc enzyme) cho một quá trình mong muốn. Công nghệ tế bào 5 - Tạo ra môi trư ng tốt nhất có thể cho sự xúc tác bằng cách thiết kế các bioreactor/fermenter thích hợp và cho nó hoạt động trong một phương thức tối ưu. - Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hỗn hợp phản ứng trong một phương thức kinh tế nhất. Các nhiệm vụ đặt ra bao gồm thiết kế và phát triển một quá trình sinh học. Các vấn đề cơ bản được đòi hỏi cho công việc này như sau: Nuôi cấy stock Nguyên liệu thô Nuôi cấy lắc Chuẩn bị môi trường Hệ lên men kết hạt Khử trùng Hệ lên men sản xuất Không khí Thu hồi Tinh sạch Các sản phẩm Xử lý nước thải Hình 1.1. Một quá trình sinh học đặc trưng. 1. Chúng ta mong đợi thay đổi cái gì Để trả l i câu hỏi này, cần phải có những hiểu biết về các khoa học cơ bản của quá trình công nghệ. Đó là vi sinh vật học, hóa sinh học, di truyền học, sinh học phân tử... Chúng ta cần phải tìm hiểu các vấn đề này trong một phạm vi nhất định. Điều quan trọng đây là các chất xúc tác sinh học được chọn lọc hoặc sửa đổi di truyền phải thích hợp cho các hoạt động sản xuất quy mô lớn. Công nghệ tế bào 6 2. Quá trình sinh học xảy ra với một tốc độ như thế nào Nếu một quá trình nhất định có thể sản xuất một sản phẩm, thì điều quan trọng cần biết là quá trình đó sẽ xảy ra với tốc độ như thế nào. Động học của quá trình sẽ chi phối các tốc độ phản ứng dưới ảnh hư ng của các điều kiện vật lý và hóa học nhất định. Chúng ta cần nắm vững hóa động học (chemical kinetics) để thiết kế nồi phản ứng (reactor) thích hợp. Các kỹ thuật tương tự được ứng dụng để giải quyết động học enzyme (enzyme kinetics) hoặc động học tế bào (cell kinetics). Để thiết kế một hệ lên men hiệu quả cho các chất xúc tác sinh học hoạt động, điều quan trọng cần biết là tốc độ phản ứng bị ảnh hư ng như thế nào b i các điều kiện hoạt động không giống nhau. Điều này bao gồm cả nghiên cứu về nhiệt động học (thermodynamics), các hiện tượng vận chuyển, các tương tác sinh học, khả năng ổn định của các dòng tế bào vi sinh vật (hoặc tế bào động vật và thực vật) dùng làm nguyên liệu sản xuất... 3. Hệ thống được hoạt động và điều chỉnh như thế nào để đạt được hiệu suất tối đa Để sự hoạt động và điều chỉnh hệ thống được tối ưu, chúng ta cần phải phát triển các bộ cảm biến trực tuyến (on-line sensor) chính xác. Thuật toán tối ưu trực tuyến cần được xây dựng và tối ưu hóa để tăng cư ng khả năng hoạt động của các quá trình sinh học và đảm bảo rằng những quá trình này được hoạt động một cách kinh tế nhất. 4. Các sản phẩm được phân tách như thế nào để có được sự tinh sạch cực đại và giá thành tối thiểu Đối với bước này, quá trình bio-downstream (phân tách sinh học), chúng ta có thể sử dụng các kỹ thuật phân tách khác nhau được phát triển trong các quá trình hóa học như chưng cất, hấp thụ, tách chiết, hấp phụ, sấy khô, lọc, kết tủa và ngâm chiết. Hơn nữa, song song với các kỹ thuật phân tách tiêu chuẩn này, chúng ta cần thiết phát triển các kỹ thuật mới thích hợp để phân tách các nguyên liệu sinh học. Nhiều kỹ thuật đã được phát triển để phân tách hoặc phân tích các nguyên liệu sinh học quy mô phòng thí nghiệm, như là sắc ký (chromatography), điện di (electrophoresis) và thẩm tách (dialysis). Các kỹ thuật này cần được nghiên cứu thêm sao cho chúng có thể hoạt động hiệu quả trên quy mô công nghiệp. Công nghệ tế bào 7 III. Quá trình sinh học Các ứng dụng công nghiệp của các quá trình sinh học là sử dụng các tế bào sống hoặc thành phần của chúng để thực hiện những thay đổi vật lý và hóa học. So với các quá trình hóa học truyền thống, các quá trình sinh học có những ưu điểm và nhược điểm như sau: 1. Các ưu điểm - Điều kiện phản ứng nhẹ nhàng. Điều kiện phản ứng cho các quá trình sinh học là nhẹ nhàng-ôn hòa. Đặc trưng là nhiệt độ phòng, áp suất khí quyển và pH môi trư ng khá trung tính. Kết quả, sự hoạt động ít nguy hiểm và điều kiện sản xuất ít phức tạp hơn so với các quá trình hóa học đặc biệt. - Tính đặc hiệu. Một chất xúc tác enzyme có tính đặc hiệu cao và xúc tác chỉ một hoặc một số ít các phản ứng hóa học. Sự đa dạng của các enzyme hiện có có thể xúc tác cho một phạm vi rất rộng các phản ứng khác nhau. - Tính hiệu lực. Tốc độ của một phản ứng được xúc tác bằng enzyme thư ng nhanh hơn nhiều so với khi phản ứng này thực hiện nh các chất xúc tác không phải sinh học. Chỉ một lượng nhỏ enzyme được yêu cầu cũng đủ để sản xuất một hiệu quả mong muốn. - Các tài nguyên có thể đổi mới. Nguyên liệu thô chủ yếu của các quá trình sinh học là sinh khối (biomass) cung cấp cả bộ khung carbon lẫn năng lượng cần cho sự tổng hợp các hóa chất hữu cơ. - Công nghệ DNA tái tổ hợp. Là những kỹ thuật sửa đổi hệ thống di truyền nhằm nâng cao năng suất sinh học. Sự phát triển của những kỹ thuật này hứa hẹn các khả năng khổng lồ để cải thiện các quá trình sinh học. 2. Các nhược điểm - Các hỗn hợp sản phẩm phức tạp. Trong các trư ng hợp nuôi cấy tế bào (vi sinh vật, thực vật hoặc động vật). Các phản ứng đa enzyme xảy ra trong một chuỗi tuần tự hoặc song song, hỗn hợp sản phẩm cuối cùng chứa khối lượng tế bào, nhiều sản phẩm trao đổi chất phụ, và một phần còn lại của các chất dinh dưỡng ban đầu. Khối lượng tế bào cũng chứa các thành phần khác nhau của tế bào. - Các môi trường nước loãng. Các thành phần có giá trị thương mại chỉ được sản xuất với một lượng nhỏ trong môi trư ng nước nên sự phân Công nghệ tế bào 8 tách chúng là rất đắt tiền. B i vì các sản phẩm của các quá trình sinh học thư ng mẫn cảm với nhiệt, do đó các kỹ thuật phân tách truyền thống không thể sử dụng mà phải phát triển các kỹ thuật phân tách mới cho các mục đích sản xuất trên quy mô lớn. - Sự nhiễm bẩn. Hệ thống lên men có thể dễ dàng bị nhiễm bẩn, do nhiều vi khuẩn và nấm mốc có thể sinh trư ng rất mạnh trong hầu hết các môi trư ng nuôi cấy. Vấn đề tr nên khó khăn hơn khi nuôi cấy tế bào động vật và thực vật b i vì chúng cần một th i gian sinh trư ng dài ngày và tốc độ sinh trư ng của chúng chậm hơn rất nhiều so với tốc độ sinh trư ng của vi khuẩn và nấm mốc trong môi trư ng nhiễm bẩn. - Khuynh hướng hay biến đổi. Các tế bào có khuynh hướng đột biến do sự thay đổi môi trư ng và có thể mất đi một vài đặc điểm gây thiệt hại cho sự thành công của quá trình sản xuất. Các enzyme tương đối mẫn cảm hoặc là các phân tử không ổn định và đòi hỏi sự cẩn thận trong khi sử dụng chúng. IV. Định nghĩa sự lên men Thông thư ng, sự lên men (fermentation) được định nghĩa là quá trình sản xuất ethanol hoặc lactic acid từ glucose (C6H12O6). - Quá trình sản xuất ethanol. Là quá trình mà một số nấm men phân giải các loại đư ng trong môi trư ng yếm khí để sản xuất rượu ethanol. - Quá trình sản xuất lactic acid. Là quá trình mà một số enzyme như lactodehydrogenase phân giải các chất trung gian như NADH (trong đư ng phân yếm khí) thành lactic acid chứ không thành ethanol. Lên men lactic được dùng trong công nghệ chế biến sữa để làm phomát và sữa chua. nấm men 2C2H5OH + 2CO2 C6H12O6 các enzyme C6H12O6 2CH3CHOHCOOH Tuy nhiên, ngày nay ngư i ta đã m rộng định nghĩa cho khái niệm này như sau: “Lên men là quá trình sử dụng các enzyme biến đổi những hợp chất hữu cơ” theo Webster’s New College Dictionary (A Merriam-Webster Công nghệ tế bào 9 1977) và đây là định nghĩa mà chúng tôi sử dụng trong giáo trình này dùng để mô tả các quá trình nuôi cấy các tế bào vi sinh vật, động vật và thực vật trong các hệ lên men hay các nồi phản ứng sinh học. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 2. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 3. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 4. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 5. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2nd ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 10 Chương 2 Sinh trưởng và bất động của tế bào I. Xác định sinh trưởng của tế bào Trong các hệ thống sinh học, mọi sự sinh tr ởng đều có thể đ ợc định nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần hóa học. Tăng đơn thuần khối l ợng không thể phản ánh đầy đủ sự sinh tr ởng, do tế bào có thể chỉ tăng hàm l ợng các sản phẩm dự trữ của chúng nh là glycogen, poly-βhydroxybutyrite. Sự sinh tr ởng cân bằng (balanced growth) đ ợc định nghĩa là sự sinh tr ởng mà trong suốt quá trình đó sự nhân đôi sinh khối xảy ra cùng với sự nhân đôi của tất cả các đặc tính xác định khác của quần thể nh là protein, DNA, RNA và n ớc nội bào. Mặt khác, quá trình nuôi cấy trải qua sự sinh tr ởng cân bằng duy trì một thành phần hóa học không đổi. Trong một môi tr ờng dinh d ỡng thích hợp mà sau đó tế bào sẽ trở nên thích nghi thì nó sẽ ở trong trạng thái sinh tr ởng cân bằng. Tiếp theo quá trình sinh tr ởng, cần phải xác định số l ợng tế bào. Sự sinh tr ởng của tế bào có thể đ ợc xác định bằng số l ợng tế bào, sinh khối tế bào hoặc hoạt tính tế bào. 1. Xác định số lượng tế bào 1.1. Đếm bằng kính hiển vi Số l ợng tế bào trong quần lạc có thể đ ợc đếm d ới kính hiển vi bằng cách đếm các tế bào đ ợc đ a vào trong một buồng đếm đặc biệt. Có hai loại buồng đếm đ ợc dùng để đếm số l ợng tế bào trong một mẫu dịch lỏng: - Haemocytomete. Buồng đếm tế bào máu dùng cho những tế bào có đ ờng kính ≥ 3 µm (Hình 2.1). - Petroff-Hausser counting chamber. Buồng đếm Petroff-Hausser đ ợc dùng chủ yếu cho vi khuẩn. Cả hai loại buồng đếm có các đ ờng kẻ ô vuông đặc tr ng trên bề mặt của tấm kính (lam kính). Khung đỡ trên mỗi mặt của tấm đếm (grid) giữ một tấm kính phủ (cover glass) cách tấm đếm một khoảng cách đã biết (ví dụ: 0,1 mm) sao cho thể tích của ô vuông đ ợc biết chính xác. Một mẫu dịch huyền phù tế bào cần đếm đ ợc cho chảy qua d ới tấm phủ và làm Công nghệ tế bào 11 đầy buồng đếm. Sau đó, đếm số l ợng tế bào trên một đơn vị diện tích của đ ờng kẻ d ới kính hiển vi. Các dịch huyền phù đậm đặc cũng có thể đếm đ ợc nếu chúng đ ợc pha loãng thích hợp. Một số u điểm của ph ơng pháp đếm trực tiếp: - Chỉ cần các thiết bị tối thiểu. - Các kết quả thu đ ợc nhanh. - Có thể quan sát các đặc điểm hình thái của cơ thể. Đưa mẫu vào Tấm kính phủ Độ sâu của mẫu 0,1 mm Buồng đếm Khung đỡ tấm kính Hình 2.1. Buồng đếm haemocytometer. Một số nh ợc điểm của ph ơng pháp đếm trực tiếp: - Th ờng rất khó phân biệt các tế bào chết và tế bào sống. - Không thích hợp cho các dịch huyền phù có mật độ thấp. - Các tế bào có kích th ớc nhỏ th ờng khó quan sát d ới kính hiển vi và có thể không thấy khi đếm. - Ph ơng pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và nhầm lẫn trong quá trình đếm. - Không thích hợp đối với các tế bào xếp thành cụm nh là mycelium (thể sợi nấm). 1.2. Đếm các tế bào phát triển trên đĩa nuôi cấy (petri dish) Các tế bào phát triển đ ợc định nghĩa là tế bào có thể phân chia và tạo ra khuẩn lạc. Có hai cách để thực hiện ph ơng pháp đếm trên đĩa petri: ph ơng pháp đĩa trải (spread plate) và ph ơng pháp đĩa rót (pour plate). Với ph ơng pháp đĩa trải, một thể tích nhỏ hơn 100 µL đ ợc trải khắp bề mặt agar. Với ph ơng pháp đĩa rót, mẫu vật đ ợc trộn với agar nóng Công nghệ tế bào 12 chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC) và đ ợc rót trên đĩa vô trùng. Các đĩa sau đó đ ợc nuôi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, và số l ợng khuẩn lạc đ ợc đếm trực tiếp. Điều quan trọng là số l ợng các khuẩn lạc phát triển trên đĩa phải không quá lớn hoặc không quá nhỏ. Để thu đ ợc một số l ợng tế bào thích hợp trên một đơn vị diện tích thì mẫu vật phải đ ợc pha loãng. Tr ờng hợp cần pha loãng nhiều, ng ời ta th ờng sử dụng kỹ thuật pha loãng tuần tự (serial dilution). Ví dụ: để thực hiện pha loãng 1/106, thì có thể thực hiện ba lần pha loãng liên tiếp 1/100 hoặc sáu lần pha loãng liên tiếp 1/10. 1.3. Đếm bằng máy đếm Để tránh sự đơn điệu khi đếm trực tiếp bằng kính hiển vi, có thể sử dụng ph ơng pháp đếm bằng máy đếm. Kỹ thuật này cho phép không chỉ đếm đ ợc số l ợng tế bào, mà còn đo cả kích th ớc tế bào. Nh ợc điểm của ph ơng pháp này là nó không thể phân biệt giữa tế bào và các phần tử bẩn khác. Kỹ thuật này cũng khó sử dụng với các cơ thể dạng chuỗi và không đem lại kết quả tốt với các cơ thể dạng hệ sợi (ví dụ nh nấm). 2. Xác định sinh khối tế bào 2.1. Trọng l ợng khô của tế bào Trọng l ợng khô tế bào có thể đ ợc xác định trực tiếp bằng cách lấy một l ợng tối thiểu của dịch huyền phù tế bào để ly tâm. Sau khi đổ thể nổi, tế bào đ ợc rửa bằng n ớc cất để loại bỏ tất cả các chất hòa tan. Dịch huyền phù đ ợc ly tâm một lần nữa và các tế bào sau khi kết đặc lại đ ợc sấy khô trong tủ sấy và cân để xác định trọng l ợng. Đây là ph ơng thức trực tiếp nhất để xác định số l ợng sinh khối tế bào. Tuy nhiên, cách xác định nh thế tốn nhiều thời gian và dễ bỏ qua những thay đổi nhỏ của sinh khối tế bào. Kỹ thuật này chỉ có thể sử dụng đối với những dịch huyền phù dày đặc và tế bào phải đ ợc rửa sạch hoàn toàn khỏi những chất ngoại sinh bám vào. 2.2. Độ đục của dịch huyền phù tế bào Sinh khối tế bào cũng có thể đ ợc xác định bằng ph ơng pháp quang học thông qua xác định l ợng ánh sáng bị tán xạ bởi dịch huyền phù tế bào. Kỹ thuật này dựa trên cơ sở lập luận rằng các phần tử nhỏ tán xạ ánh sáng một cách t ơng xứng, trong các giới hạn nhất định, tới nồng độ của chúng. Khi tia sáng xuyên qua dịch huyền phù của tế bào, thì l ợng ánh sáng truyền Công nghệ tế bào 13 qua bị giảm đi do kết quả của sự tán xạ, nh vậy đó chính là ph ơng pháp xác định mật độ tế bào. Việc đo độ đục của dịch huyền phù tế bào th ờng đ ợc thực hiện trên máy quang phổ để đọc các đơn vị hấp thụ (A). Khả năng hấp thụ (absorbency) đ ợc định nghĩa là số logarithm của tỷ lệ giữa c ờng độ ánh sáng va chạm vào dịch huyền phù tế bào (Io) và c ờng độ ánh sáng đ ợc truyền qua bởi dịch huyền phù (I): A = log Io I Đ ờng cong chuẩn (standard curve) có thể thu đ ợc bằng cách đo độ hấp thụ (A) của mẫu với nồng độ tế bào đã biết tr ớc. Việc đo th ờng đ ợc thực hiện ở b ớc sóng từ 600-700 nm. 3. Các phương pháp gián tiếp Ph ơng pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa trên phép tính hệ số tỷ l ợng toàn phần (overall stoichiometry) cho sự sinh tr ởng và tạo thành sản phẩm, có thể đ ợc trình bày trong một dạng chung nh sau: nguồn carbon + nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2 + H2O + sản phẩm + nhiệt Sự thay đổi sinh khối tế bào có thể đ ợc kiểm soát gián tiếp bằng cách xác định sự tiêu thụ chất dinh d ỡng, tạo thành sản phẩm, các thành phần tế bào, giải phóng nhiệt hoặc các tính chất vật lý khác của dịch nuôi cấy tế bào. 3.1. Sự tiêu thụ chất dinh d ỡng Cần chọn một chất dinh d ỡng mà chất này không bao giờ đ ợc sử dụng để tổng hợp sản phẩm trao đổi chẩt. Phosphate, sulfate hoặc magnesium có thể là những chọn lựa tốt. Khi sinh khối tế bào là sản phẩm chính, thì nồng độ của nguồn carbon còn lại trong môi tr ờng có thể đ ợc đo để đánh giá sinh khối tế bào. Công nghệ tế bào 14 3.2. Tạo thành các sản phẩm Điều quan trọng là cần kiểm tra sản phẩm tạo thành có đ ợc kết hợp với sự sinh tr ởng hay không. Một số sản phẩm đ ợc tạo thành sau khi sinh khối tế bào đạt tới pha tĩnh (stationary phase) của chu kỳ sinh tr ởng và vì thế, không đ ợc kết hợp với sự sinh tr ởng. Sự giải phóng CO2 có thể đ ợc xác định và nó có quan hệ tỷ l ợng đối với sự sinh tr ởng của tế bào. Một sản phẩm hoàn toàn chung cho mọi phản ứng lên men là ion H+. L ợng kiềm bổ sung vào dịch lên men sẽ duy trì độ pH thích hợp cho sinh tr ởng. 3.3. Các thành phần tế bào Đối với các nuôi cấy trải qua sự sinh tr ởng cân bằng, thì các thành phần tế bào thuộc nhóm đại phân tử nh là protein, RNA và DNA có thể đ ợc xác định thay cho sinh khối tế bào. Tuy nhiên, cần phải thận trọng do tỷ lệ của những nguyên liệu này trong tế bào có thể thay đổi theo thời gian nếu nuôi cấy không trải qua sự sinh tr ởng cân bằng. 3.4. Giải phóng nhiệt Sự sinh tr ởng của tế bào phát ra nhiệt. L ợng nhiệt phát ra tùy thuộc vào hiệu suất sử dụng năng l ợng carbon. Vì thế, việc xác định nhiệt độ của hệ lên men có thể kết hợp gián tiếp với sự sinh tr ởng của tế bào. Tuy nhiên, l ợng nhiệt toàn phần tích lũy trong hệ lên men phụ thuộc vào hiệu quả phối hợp của các nguồn sinh nhiệt và mất nhiệt khác nhau nh : nhiệt từ quá trình khuấy và bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành của hệ lên men và nhiệt nhạy (sensible heat) trong luồng không khí. Vì thế, để xác định sinh tr ởng bằng sự giải phóng nhiệt, cần phải thiết lập cân bằng năng l ợng của hệ lên men mặc dù đây một công việc không dễ dàng. 3.5. Độ nhớt Sinh tr ởng của cơ thể hệ sợi (nấm) hoặc sự tạo thành polysaccharide đã làm tăng độ nhớt của dịch lên men (fermentation broth). Vì thế, việc xác định độ nhớt của dịch lên men rất hữu ích trong các quá trình lên men ở quy mô công nghiệp. Độ nhớt biểu kiến đo đ ợc ở tốc độ dịch chuyển cố định có thể đ ợc dùng để đánh giá nồng độ tế bào hoặc nồng độ sản phẩm. Công nghệ tế bào 15 II. Bất động tế bào Ph ơng pháp bất động (immobilization) các tế bào hoàn chỉnh có nhiều u điểm hơn các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống. Bằng cách bất động tế bào, việc thiết kế quy trình đơn giản hơn khi các tế bào đ ợc gắn với các phần tử lớn hoặc trên các bề mặt đ ợc phân tách dễ dàng khỏi dòng sản phẩm. Điều này đảm bảo hoạt động liên tục của hệ lên men không bị nguy cơ rửa trôi tế bào. Sự bất động cũng có thể cung cấp các điều kiện có lợi cho sự phân hóa tế bào và sự truyền đạt thông tin giữa các tế bào, bằng cách ấy đã thúc đẩy sản phẩm có sản l ợng các chất trao đổi thứ cấp cao. Sự bất động có thể bảo vệ tế bào bằng cách làm giảm các sự cố liên quan tới lực tr ợt (shear forces) gây tổn th ơng tế bào. Các ph ơng pháp bất động tế bào có thể đ ợc phân chia thành bốn nhóm chính đ ợc tóm tắt ở bảng 2.1. 1. Gắn lên bề mặt Các tế bào có thể gắn lên bề mặt của mảnh gỗ nhỏ, collagen, microcarrier, hoặc các nhựa tổng hợp trao đổi ion (resin). Một ví dụ của kiểu bất động này là sử dụng các microcarrier cho các tế bào động vật. u điểm chính của microcarrier là nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn để gắn tế bào. Vật liệu cho microcarrier bao gồm các nhựa tổng hợp trao đổi ion, các hạt nhỏ dựa trên cơ sở dextran đ ợc bọc bằng gelatin, các hạt polyacrylamide, các hạt polystyrene, các hạt thủy tinh rỗng, các hạt cellulose hình trụ, và các giọt floruacarbon nhỏ đ ợc ổn định bằng polylysine. Hiện nay, các microcarrier dựa trên dextran đ ợc sử dụng rộng rãi nhất để bất động tế bào động vật. 2. Tạo thể xốp Ph ơng pháp này cho phép các tế bào khuếch tán trong các thể xốp đã có sẵn nh cordierite và pore glass (hạt thủy tinh có nhiều lỗ rỗng nhỏ), ở trong đó chúng sẽ sinh tr ởng và đ ợc giữ lại. u điểm chính của ph ơng pháp này là các vật liệu tạo thể xốp đã có sẵn chống chịu đ ợc sự phân hủy trong các bình nuôi có khuấy từ hơn các loại vật liệu tạo thể xốp khác (alginate, acrylamide…), và thể xốp th ờng không có hại đối với tế bào. Tuy nhiên, ph ơng pháp này gặp khó khăn trong việc h ớng tới nồng độ cao của tế bào do thể tích lỗ thủy tinh (pore) bị giới hạn bởi chúng đ ợc làm sẵn bằng các loại vật liệu tạo thể xốp đặc tr ng. Công nghệ tế bào 16 Bảng 2.1. Các ph ơng pháp bất động tế bào. Ph ơng pháp Vật liệu Gắn lên bề mặt Mảnh gỗ mỏng, collagen1, microcarrier2, các nhựa trao đổi ion, các oxide kim loại Tạo thể xốp Cordierite, pore glass, acrylamide, alginate, collagen, κ-carrageenan Bao vi thể Polylysine, ethylcellulose, emulsion3, màng tổng hợp Tự kết khối Các tiểu thể hệ sợi, polyelectrolytes4, nhân tố liên kết ngang Một ph ơng thức khác là bọc các tế bào bằng thể xốp đ ợc tạo thành trong điều kiện in situ. Các vật liệu thuộc gelatin khác nhau nh acrylamide, alginate, collagen, và κ-carrageenan, có thể đ ợc trộn với dịch huyền phù tế bào và tạo gel trong các dạng và kích th ớc khác nhau. Một ph ơng thức đơn giản khác là tạo các hạt hình cầu dạng gel alginate-calcium là nh sau: Các tế bào dịch huyền phù sau khi cô lại sẽ đ ợc trộn với alginate để tạo ra một nồng độ alginate cuối cùng từ 1-3% (w/v) và hỗn hợp alginate-tế bào đ ợc bơm bằng kim tiêm thuốc vào dung dịch calcium chloride. Các hạt đ ợc tạo thành ngay tức thời có đ ờng kính từ 1-5 mm tùy thuộc vào nồng độ tế bào và alginate của dung dịch và kích th ớc của mũi kim tiêm. Cần l u ý thêm là phải duy trì sự vô trùng trong suốt quá trình bất động tế bào. Nh ợc điểm chính của việc sử dụng alginate để bất động tế bào là để lọt các tế bào từ sự phân chia tế bào xuất hiện bên trong các hạt riêng rẽ. Việc lọt tế bào có thể đ ợc giảm thiểu hoặc bằng cách tăng nồng độ của alginate hoặc calcium chlorite trong các hạt hoặc bằng cách tạo ra các hạt 1 Collagen: chất tạo keo. Microcarrier: một tiểu thể có kích th ớc hiển vi (th ờng là một hạt polymer đ ờng kính khoảng 200 µm) để các tế bào trong nuôi cấy dịch huyền phù gắn vào và sinh tr ởng. 3 Emulsion: dạng nhũ t ơng. 4 Polyelectrolytes: các chất đa điện phân. 2 Công nghệ tế bào 17 nhỏ. Tuy nhiên, việc tăng nồng độ của alginate hoặc calcium chloride trong hạt có thể làm giảm tốc độ khuếch tán cơ chất thông qua gel và có thể ảnh h ởng đến khả năng sống sót của các tế bào đ ợc bao bọc. 3. Sử dụng bao vi thể Các tế bào có thể đ ợc bất động bằng các bao vi thể (microcapsule) có màng hoặc màng bán thấm không cố định hoặc cố định. u điểm của kỹ thuật đóng vỏ bao là tạo một diện tích bề mặt lớn cho sự tiếp xúc của cơ chất và tế bào. Màng bán thấm chỉ cho đi qua một cách chọn lọc những thành phần có trọng l ợng phân tử thấp. Các màng dạng sợi rỗng tạo thành một cấu trúc hình ống th ờng đ ợc sắp hàng nh là các bó sợi song song bên trong một buồng hình trụ. Các tế bào đ ợc giữ lại trên thành của các sợi rỗng trong khi môi tr ờng dinh d ỡng đ ợc thông khí luân chuyển quanh các sợi. Loại màng này có thể cung cấp thêm sự bảo vệ chống nhiễm bẩn môi tr ờng. Tuy nhiên, nh ợc điểm chính của hệ thống màng này là giá thành cao, sự tắc nghẽn của màng đã làm trở ngại cho việc chuyển khối và gây khó khăn trong việc thông khí. 4. Tự kết khối Các tế bào tự kết khối hoặc kết thành cụm nh len cũng có thể đ ợc xem nh là các tế bào đ ợc bất động do kích th ớc lớn của chúng có u điểm t ơng tự nh sự bất động bằng các ph ơng pháp khác. Trong khi nấm mốc sẽ tạo ra các tiểu thể tự nhiên, thì các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men lại cần đến sự kết cụm. Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo hoặc các nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) có thể đ ợc bổ sung để tăng c ờng quá trình. III. Một số thí nghiệm điển hình 1. Đường cong sinh trưởng của nấm men Trong thí nghiệm này, chủng nấm men sẽ đ ợc nuôi cấy trong bình tam giác thuỷ tinh, và sự thay đổi nồng độ tế bào sẽ đ ợc kiểm soát bằng cách dùng ba kỹ thuật khác nhau: đếm d ới kính hiển vi, xác định khối l ợng khô, độ đục của dịch huyền phù tế bào. Công nghệ tế bào 18 1.1. Nguyên liệu - Một chủng nấm men bất kỳ sinh tr ởng trong nuôi cấy dịch huyền phù. Chúng ta có thể thu chủng nấm men từ một phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc mua một chủng đặc biệt từ công ty. - Glucose, dịch chiết nấm men, NH4Cl, MgSO4, CaCl2 và chất chống tạo bọt để pha môi tr ờng. - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette vô trùng - Đèn Bunsen - Nồi khử trùng - Tủ ấm - Hemocytometer - Ly tâm - Cân hóa chất - Máy quang phổ 1.2. Ph ơng thức tiến hành - Chuẩn bị môi tr ờng nuôi cấy theo bảng 2.2. Rót 50 mL/bình vào 2 bình tam giác loại 125 mL. Bảng 2.2. Môi tr ờng sinh tr ởng đặc tr ng của nấm men. Glucose 100 g Dịch chiết nấm men 8,5 g NH4Cl 1,32 g MgSO4 0,11 g CaCl2 0,06 g Chất chống tạo bọt 0,2 mL N ớc Công nghệ tế bào bổ sung vừa đủ 1 L 19 - Nút bình tam giác bằng một trong số vật liệu sau: giấy nhôm, nút plastic chịu nhiệt, nắp inox, hoặc bông không thấm n ớc. - Khử trùng bình tam giác đựng môi tr ờng ở 121oC trong 20 phút. - Tiếp mẫu (inoculate) 1 mL dịch nuôi cấy nấm men tr ớc đó vào bình tam giác chứa môi tr ờng vô trùng. Tiến hành cẩn thận để khỏi bị nhiễm bẩn pipette, nắp đậy và bình tam giác trong suốt quá trình tiếp mẫu. Để giảm thiểu cơ hội nhiễm bẩn, nên đốt nắp đậy và cổ của bình tam giác sau khi lấy nắp ra để cấy nấm men vào. - Đặt bình tam giác vào trong tủ ấm ở 37oC. - Lấy 2 mL mẫu ở các khoảng thời gian khác nhau trong quá trình nuôi cấy để xác định nồng độ tế bào bằng cách đếm trên kính hiển vi, xác định trọng l ợng khô và đo độ đục (mật độ quang) bằng máy quang phổ. Thời gian lấy mẫu phải đ ợc sắp xếp sao có thể thu đ ợc cho đ ờng cong sinh tr ởng tốt thể hiện cả ba phase sinh tr ởng (xem ch ơng 3). Tr ớc khi lấy mẫu phải trộn tất cả các thành phần trong bình tam giác bằng cách lắc. 2. Đường cong sinh trưởng của thực vật 2.1. Nguyên liệu - Một dòng tế bào dịch huyền phù của thực vật sinh tr ởng tốt. Ph ơng thức sau đây dựa trên cơ sở nuôi cấy tế bào thuốc lá. Nếu chọn dòng tế bào khác thì cần thay đổi môi tr ờng. - Hỗn hợp muối khoáng của Murashige-Skoog (1962) (Bảng 7.2), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), KH2PO4, inositol, thiamine.HCl, và sucrose để pha chế môi tr ờng. - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette loại miệng rộng vô trùng (10 mL) - Tủ nuôi tế bào thực vật kèm máy lắc - Cân hóa chất - Ly tâm - Eppendorf tube 2.2. Ph ơng thức tiến hành - Chuẩn bị môi tr ờng muối khoáng của Murashige-Skoog, 0,2 mg/L 2,4-D, 0,18 g/L KH2PO4, 0,1 g/L inositol, 1 mg/L thiamine.HCl và 30 g/L Công nghệ tế bào 20 sucrose5. Điều chỉnh pH tới 5,8 bằng KOH 1N và phân phối môi tr ờng vào hai bình tam giác loại 125 mL, sao cho mỗi bình tam giác chứa 30 mL. - Đậy nắp bình tam giác và khử trùng ở 121oC trong 20 phút. - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi tr ờng với 1,5 mL của dịch huyền phù tế bào 7 ngày tuổi và đặt trong tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc và lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng 8 giờ/ngày ở c ờng độ 2.000 lux. - Lấy 1,5 mL dịch nuôi cấy mỗi ngày đã đ ợc trộn kỹ và cho vào Eppendorf tube để cân, ly tâm tube ở 9.000 vòng/phút trong 4-5 phút và loại thể nổi. Cân lại tube và tính toán phần trăm trọng l ợng tế bào ẩm. Đặt tube trong tủ sấy ở 70oC trong hai ngày và cân lại để tính toán trọng l ợng khô. - Vẽ đồ thị sự thay đổi nồng độ tế bào khô và t ơi (ẩm) theo thời gian. 3. Bất động tế bào thực vật 3.1. Nguyên liệu - 30 mL tế bào dịch huyền phù thuốc lá sinh tr ởng bằng ph ơng pháp đã mô tả trong thí nghiệm tr ớc. - Alginate - CaCl2 - Bơm nhu động - Nồi áp suất - Cân hóa chất 3.2. Ph ơng thức tiến hành - Trộn 0,875 g alginate, 5 mL môi tr ờng nuôi cấy thực vật và 25 mL n ớc và khử trùng. - Đợi cho 30 mL dịch nuôi cấy huyền phù của tế bào thực vật lắng xuống, loại bỏ thể nổi. B ớc này th ờng mất khoảng 10 phút. - Bổ sung hỗn hợp alginate và trộn với các tế bào đã đ ợc cô lại. Môi tr ờng này chỉ có tính chất tham khảo. Thông th ờng các loài thực vật khác nhau với các mục đích nuôi cấy khác nhau, sẽ có các nhu cầu dinh d ỡng khác nhau. Khi đó, chúng ta phải thiết kế các môi tr ờng nuôi cấy có tính đặc hiệu cao hơn. 5 Công nghệ tế bào 21 - Bơm hỗn hợp alginate-tế bào qua một ống silicon vô trùng (1,6 mm ID) và cung cấp từng giọt vào trong bình tam giác chứa 200 mL dung dịch vô trùng của CaCl2 0,12 M. Các giọt nhỏ sẽ phản ứng ngay lập tức với CaCl2 để tạo ra các hạt hình cầu có đ ờng kính khoảng 3,75-4,5 mm. - Giữ các hạt trong dung dịch CaCl2 khoảng 1 giờ để đảm bảo phản ứng kết tủa đã xảy ra hoàn toàn. - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi tr ờng thực vật với khoảng 30 hạt tế bào thực vật đã đ ợc bất động và đặt nó trong tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc và lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng 8giờ/ngày ở c ờng độ 2.000 lux. - Chúng ta có thể xác định nồng độ tế bào khô và ẩm của các tế bào tự do trong dịch huyền phù và các tế bào đ ợc bất động trong suốt quá trình nuôi cấy mẻ. Để xác định nồng độ tế bào của các tế bào đ ợc bất động, cần phải hòa tan các hạt trong potassium phosphate 1 M trong 24 giờ. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 2. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 3. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 4. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 5. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. nd 6. Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 22 Chương 3 Động học sinh trưởng của tế bào I. Mở đầu Hiểu biết đầy đủ động học sinh trư ng của các tế bào thực vật, động vật và vi sinh vật là rất cần thiết để thiết kế và hoạt động các hệ lên men. Động học tế bào có quan hệ với tốc độ sinh trư ng tế bào và chịu ảnh hư ng của các điều kiện vật lý và hóa học. Động học tế bào là kết quả của hệ thống các phản ứng hóa sinh và các quá trình vận chuyển phức tạp, bao gồm nhiều pha và các hệ thống nhiều thành phần. Trong suốt th i gian sinh trư ng, hỗn hợp không đồng nhất của các tế bào già và non thay đổi liên tục và tự thích nghi với môi trư ng dinh dưỡng là yếu tố cũng thay đổi liên tục trong các điều kiện vật lý và hóa học. Nói chung, mô hình toán học chính xác của động học sinh trư ng là không có thể có được. Thậm chí một mô hình thực tế cũng khó tiếp cận b i vì nó có thể chứa nhiều thông số không thể xác định. Vì thế, chúng ta cần giả định có thể đạt được những mô hình đơn giản như vậy sẽ hữu ích hơn cho việc thiết kế hệ thống lên men (xem chương 4) và dự báo hiệu suất. Các mô hình khác nhau có thể được phát triển trên cơ s các giả định về các thành phần và quần thể tế bào như trình bày trong bảng 3.1. Ngoài các giả định đối với tế bào, môi trư ng được thiết kế sao cho chỉ một thành phần có thể giới hạn tốc độ phản ứng, còn tất cả các thành phần khác hiện diện các nồng độ đủ cao mà những thay đổi nhỏ của chúng không ảnh hư ng rõ rệt đến tốc độ phản ứng. Các hệ thống lên men cũng được kiểm soát sao cho các thông số môi trư ng như pH, nhiệt độ và nồng độ oxygen hòa tan được duy trì một mức độ không đổi. Trong chương này, các phương trình động học tế bào bắt nguồn từ mô hình được phân phối, không cấu trúc. Các phương trình này được ứng dụng để thiết kế và phân tích các hệ lên men lý tư ng. Công nghệ tế bào 23 Bảng 3.1. Các mô hình khác nhau của động học tế bào. Các thành phần tế bào Quần thể Được phân phối (distributed) Bị cô lập (segregated) Không cấu trúc Được cấu trúc (unstructured) (structured) Các tế bào được đại diện b i một thành phần đơn, phân phối không đồng đều trong quá trình nuôi cấy. Các tế bào bao gồm nhiều thành phần phức tạp phân phối không đồng đều trong quá trình nuôi cấy. Các tế bào được đại diện b i một thành phần đơn, và tạo thành một hỗn hợp không đồng nhất. Các tế bào bao gồm nhiều thành phần phức tạp và tạo thành hỗn hợp không đồng nhất. II. Định nghĩa Trước tiên, chúng ta hãy định nghĩa một số thuật ngữ dùng cho sinh trư ng của tế bào. Nếu đề cập đến nồng độ tế bào mà không kèm theo bất kỳ một ghi chú đặc điểm nào, thì nó có thể được hiểu theo nhiều nghĩa khác nhau. Đó có thể là số lượng tế bào, trọng lượng tươi tế bào, hoặc trọng lượng khô tế bào trên một đơn vị thể tích. Trong chương này, chúng ta thống nhất các thuật ngữ sau: CX: nồng độ tế bào, trọng lượng khô tế bào trên một đơn vị thể tích. CN: mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào trên một đơn vị thể tích. ρ: mật độ tế bào, trọng lượng tươi tế bào trên một đơn vị thể tích của khối lượng tế bào. Từ đó, có thể định nghĩa tốc độ sinh trư ng của tế bào theo một số cách khác nhau như sau: dCX/dt: sự thay đổi nồng độ khô của tế bào theo th i gian. rX: tốc độ sinh trư ng của tế bào trên cơ s trọng lượng khô. dCN/dt: sự thay đổi mật độ số lượng tế bào theo th i gian. rN: tốc độ sinh trư ng của tế bào trên cơ s số lượng. δ: tốc độ phân chia của tế bào trên cơ s số lượng d log 2 C N / dt Công nghệ tế bào 24 Dư ng như dC X / dt và rX luôn luôn giống nhau, nhưng thực ra không phải như vậy. Giá trị dC X / dt là sự thay đổi nồng độ tế bào trong hệ lên men, là yếu tố có thể bao gồm hiệu quả của tốc độ dòng chảy đi vào và đi ra, sự tái sinh tế bào, và các điều kiện hoạt động khác của hệ lên men. Trong khi đó rX là tốc độ sinh trư ng thực tế của tế bào. Hai giá trị này chỉ giống nhau trong trư ng hợp hoạt động lên men mẻ. Tốc độ sinh trư ng dựa trên số lượng tế bào và tốc độ sinh trư ng dựa trên trọng lượng tế bào không nhất thiết phải giống nhau, b i vì kích thước trung bình của các tế bào có thể rất khác nhau khi chuyển từ pha sinh trư ng này đến pha sinh trư ng khác. Khi sinh khối của một tế bào riêng biệt tăng lên mà không có sự phân chia, thì tốc độ sinh trư ng dựa trên trọng lượng tế bào cũng tăng lên, trong khi tốc độ sinh trư ng dựa trên số lượng tế bào lại giữ nguyên. Tuy nhiên, trong suốt th i gian sinh trư ng theo hàm mũ, pha sinh trư ng mà chúng ta quan tâm nhất dưới quan điểm của công nghệ, thì tốc độ sinh trư ng dựa trên số lượng tế bào và tốc độ sinh trư ng dựa trên trọng lượng tế bào có thể được giả định là tương đương nhau. Trong một số trư ng hợp tốc độ sinh trư ng bị nhầm lẫn với tốc độ phân chia, là khái niệm được định nghĩa như là tốc độ phân chia tế bào trên một đơn vị th i gian. Nếu tất cả tế bào trong bình nuôi cấy th i điểm t = 0 (CN = CNo) phân chia chỉ sau một th i gian nhất định, thì quần thể tế bào sẽ tăng lên C N 0 ×2 lần. Nếu các tế bào được phân chia n lần sau th i gian t, thì số lượng tổng số của tế bào sẽ là: C N = C N 0 × 2n (3.1) Và tốc độ phân chia trung bình là: δ = n t (3.2) Vì n = log 2 C N − log 2 C N 0 theo phương trình 3.1, nên tốc độ phân chia trung bình sẽ là: δ = Và tốc độ phân chia Công nghệ tế bào ( 1 log 2 C N − log 2 C N 0 t ) (3.3) th i gian t là: 25 δ= d log 2 C N dt (3.4) Vì thế, tốc độ sinh trư ng (được định nghĩa là sự thay đổi số lượng tế bào theo th i gian) chính là độ dốc của đư ng cong CN theo t. Trong khi đó, tốc độ phân chia là độ dốc của đư ng cong log2CN theo t. Như đã giải thích, tốc độ phân chia là hằng số trong suốt th i gian sinh trư ng theo hàm mũ, trong khi đó tốc độ sinh trư ng lại không như vậy. Vì thế, hai khái niệm này không được nhầm lẫn với nhau. III. Chu kỳ sinh trưởng của nuôi cấy mẻ Nếu nuôi cấy các vi sinh vật đơn bào trong môi trư ng vô trùng sạch và đo mật độ số lượng tế bào theo th i gian thì trên đồ thị của nó ta có thể thấy có sáu pha sinh trư ng và chết của tế bào (Hình 3.1), đó là: - Pha lag. Là th i gian khi sự thay đổi số lượng tế bào bằng không. - Pha sinh trưởng nhanh. Số lượng tế bào bắt đầu tăng và tốc độ phân chia đạt đến cực đại. - Pha sinh trưởng theo hàm mũ. Số lượng tế bào tăng theo hàm mũ khi tế bào bắt đầu phân chia, tốc độ sinh trư ng tăng lên trong suốt pha này, nhưng tốc độ phân chia tỷ lệ với d ln C N / dt , là hằng số giá trị cực đại của nó, như được minh họa hình 3.1. - Pha sinh trưởng chậm. Khi tốc độ sinh trư ng đạt đến cực đại, thì giai đoạn tiếp theo là pha sinh trư ng chậm trong đó cả hai tốc độ sinh trư ng và tốc độ phân chia đều giảm. - Pha tĩnh. Quần thể tế bào đạt đến giá trị cực đại và sẽ không tăng thêm nữa. - Pha chết. Sau khi các chất dinh dưỡng của tế bào cạn kiệt, tế bào sẽ bắt đầu chết và số lượng tế bào sống sót sẽ giảm. 1. Pha lag Pha lag (hoặc pha tĩnh kh i đầu hoặc tiềm tàng) là th i kỳ kh i đầu của quá trình nuôi cấy, trong suốt th i kỳ này sự thay đổi số lượng tế bào là bằng không hoặc không đáng kể. Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên, Công nghệ tế bào 26 nhưng tế bào có thể sinh trư ng bằng cách tăng kích thước trong suốt th i kỳ này. A B C D E F 12 ln C N 10 8 t 1,5 C N × 10−5 1,0 0,5 0 t 0,3 0,2 0,1 d ln C N dt 0 t -0,1 -0,2 Hình 3.1. Đư ng cong sinh trư ng đặc trưng của các cơ thể đơn bào. (A) pha lag, (B) pha sinh trư ng nhanh, (C) pha sinh trư ng theo hàm mũ, (D) pha sinh trư ng chậm, (E) pha tĩnh, (F) pha chết. Độ dài của pha lag tùy thuộc vào nhiều nhân tố, chẳng hạn như loại và tuổi của cơ thể vi sinh vật (hoặc tế bào động-thực vật), và các điều kiện nuôi cấy. Pha lag thư ng xuất hiện do tế bào phải điều chỉnh với môi trư ng mới trước khi sự sinh trư ng có thể bắt đầu. Nếu vi sinh vật được cấy từ môi trư ng có nồng độ chất dinh dưỡng thấp vào môi trư ng có nồng độ chất Công nghệ tế bào 27 dinh dưỡng cao, thì pha lag thư ng kéo dài. Nếu nó được chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp thì thư ng không xuất hiện pha lag. Một nhân tố quan trọng khác ảnh hư ng đến độ dài của pha lag là lượng mẫu được đưa vào nuôi cấy (inoculum size). Nếu một lượng nhỏ tế bào được đưa vào một thể tích lớn thì chúng sẽ có một pha lag dài. trư ng hợp nuôi cấy tế bào trên quy mô lớn, thì th i gian của pha lag càng ngắn càng tốt. Vì thế, để đưa mẫu vào (còn gọi là tiếp mẫu) quy trình lên men công nghiệp, chúng ta cần phải có một dãy các nồi lên men có lượng mẫu lớn dần để giảm thiểu ảnh hư ng của pha lag. Vào giai đoạn kết thúc pha lag, khi sự sinh trư ng của tế bào bắt đầu, thì tốc độ phân chia tế bào tăng lên từ từ và đạt đến giá trị cực đại th i kỳ sinh trư ng theo hàm mũ, như trình bày bằng sự tăng lên góc uốn cong B trong hình 3.1. Th i kỳ chuyển tiếp này được gọi chung là pha sinh trư ng nhanh và thư ng được xem như là một phần của pha lag. 2. Pha sinh trưởng theo hàm mũ (pha logarithm) các cơ thể đơn bào, sự nhân đôi tăng dần của số lượng tế bào cho kết quả tốc độ sinh trư ng tăng lên liên tục trong quần thể. Nuôi cấy vi khuẩn trải qua sự sinh trư ng cân bằng kiểu như phản ứng hóa học bậc một tự xúc tác. Vì thế, tốc độ tăng trư ng của quần thể tế bào mọi th i điểm tỷ lệ với mật độ số lượng (C N ) của tế bào hiện diện tại th i điểm đó. dC N = µC N dt (3.5) 1 dC N d ln C N × = CN dt dt (3.6) rN = (gi trư đổi trư Trong đó: hằng số µ được biết như là tốc độ sinh trư ng đặc trưng ). Không nên nhầm lẫn tốc độ sinh trư ng đặc trưng với tốc độ sinh ng (có các đơn vị và ý nghĩa khác hẳn). Tốc độ sinh trư ng là sự thay của mật độ số lượng tế bào theo th i gian, trong khi đó tốc độ sinh ng đặc trưng là: -1 µ= Đó là sự thay đổi theo logarithm tự nhiên của mật độ số lượng tế bào theo th i gian. So sánh phương trình (3.4) và (3.6) cho thấy: Công nghệ tế bào 28 µ= d ln C N ⎛ d log 2 C N ⎞ = ln 2⎜ ⎟ = δ ln 2 dt dt ⎝ ⎠ (3.7) Vì vậy, tốc độ sinh trư ng đặc trưng µ bằng ln2 lần tốc độ phân chia δ. Nếu µ là hằng số theo th i gian trong suốt th i kỳ sinh trư ng theo pha hàm mũ, thì phương trình (3.5) có thể được lấy tích phân từ t0 tới t khi đó: ∫ CN C N0 Hay: dC N = ∫ µ dt CN t0 t (3.8) C N = C N 0 exp[µ(t − t 0 )] Trong đó: C N 0 là mật độ số lượng tế bào (3.9) t0 khi sự sinh trư ng hàm mũ bắt đầu. Phương trình (3.9) cho thấy sự tăng lên của số lượng tế bào theo hàm mũ đối với th i gian. Th i gian cần thiết để gấp đôi quần thể, được gọi là th i gian nhân đôi (td), có thể ước lượng từ phương trình (3.9), bằng cách đặt C N = 2C N 0 và t0 = 0 , giải theo t ta có: td = ln 2 1 = µ δ (3.10) Th i gian nhân đôi tỷ lệ nghịch với tốc độ sinh trư ng đặc trưng và bằng số nghịch đảo của tốc độ phân chia. 3. Các nhân tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng đặc trưng 3.1. Nồng độ cơ chất Một trong những phương trình được sử dụng rộng rãi nhất thể hiện ảnh hư ng của nồng độ cơ chất (chất dinh dưỡng) lên µ là phương trình Monod: µ= Công nghệ tế bào µ max C S K S + CS (3.11) 29 Trong đó: C S là nồng độ của cơ chất giới hạn (limiting substrate) trong môi trư ng và K S là hệ số hệ thống. Mối quan hệ này được trình bày bằng đồ thị trong hình 3.2. Giá trị của K S tương đương với nồng độ của chất dinh dưỡng khi tốc độ sinh trư ng đặc trưng bằng một nữa giá trị cực đại của nó (µmax). Theo phương trình Monod, sự tăng lên về sau của nồng độ chất dinh dưỡng khi µ đạt đến µ max đã không ảnh hư ng đến tốc độ sinh trư ng đặc trưng, như đã trình bày hình 3.2. Tuy nhiên, tốc độ sinh trư ng đặc trưng sẽ giảm xuống khi nồng độ chất dinh dưỡng tăng lên vượt quá một mức độ nhất định. 3.2. Nồng độ sản phẩm Khi các tế bào sinh trư ng, chúng sẽ sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất và có thể tích lũy trong môi trư ng. Sinh trư ng của các vi sinh vật thư ng bị ức chế b i các sản phẩm này, ảnh hư ng của các sản phẩm này có thể được bổ sung vào phương trình Monod như sau: µ = µ max ⎜⎜ ⎛ ⎞ ⎛ KP ⎟⎟ × ⎜⎜ ⎠ ⎝ K P + CP ⎛ CS µ = µ max ⎜⎜ ⎝ K S + CS ⎞ ⎛ C ⎟⎟ × ⎜⎜1 − P ⎠ ⎝ C Pm CS ⎝ K S + CS ⎞ ⎟⎟ ⎠ (3.12) hoặc: ⎞ ⎟⎟ ⎠ n (3.13) Trong đó: KP là hệ số nồng độ sản phẩm và CP là nồng độ sản phẩm. Cả hai phương trình trên đã mô tả sự ức chế sản phẩm khá tốt. CPm được ký hiệu là nồng độ cực đại của sản phẩm, là yếu tố làm cho các tế bào không thể sinh trư ng do sự ức chế sản phẩm. 3.3. Các điều kiện khác Tốc độ sinh trư ng đặc trưng của các tế bào cũng bị ảnh hư ng b i pH môi trư ng, nhiệt độ và sự cung cấp oxygen. Nhiệt độ và pH tối ưu của các loại tế bào khác nhau (động-thực vật và vi sinh vật) là cũng khác nhau. Công nghệ tế bào 30 µ max 1,2 µ Hình 3.2. Sự phụ thuộc của tốc độ sinh trư ng đặc trưng vào nồng độ của chất dinh dưỡng giới hạn sinh trư ng. µmax = 0,935/gi ; KS = 0,22×10-4 mol/L. 0,8 0,4 KS 0 CS × 104 , M 2 4 6 4. Pha tĩnh và pha chết Sinh trư ng của quần thể tế bào thư ng bị hạn chế hoặc do sử dụng hết toàn bộ các chất dinh dưỡng có sẵn hoặc do sự tích lũy các sản phẩm độc của sự trao đổi chất. Kết quả là tốc độ sinh trư ng giảm và sự sinh trư ng cuối cùng đã dừng lại. th i điểm này nuôi cấy được gọi là pha tĩnh. Giai đoạn chuyển tiếp giữa pha hàm mũ và pha tĩnh bao gồm một th i kỳ sinh trư ng không cân bằng và trong suốt th i kỳ này các thành phần khác nhau của tế bào được tổng hợp các tốc độ không bằng nhau. Kết quả là các tế bào trong pha tĩnh có một thành phần hóa học khác với các tế bào trong pha hàm mũ. Pha tĩnh thư ng được tiếp theo b i pha chết mà trong đó các cơ thể trong quần thể bị chết. Sự chết xuất hiện hoặc do sự suy yếu của việc bảo quản năng lượng của tế bào, hoặc do sự tích lũy các sản phẩm độc tố. Giống như sự sinh trư ng, sự chết là một hàm mũ. Trong một số trư ng hợp, cơ thể không chỉ chết mà còn phân hủy, một quá trình còn được gọi là sự phân giải. IV. Các ký hiệu C N0 nồng độ, khối lượng trên một đơn vị thể tích nuôi cấy, kg/m3 mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào/m3 mật độ số lượng tế bào tại th i điểm t0, số lượng tế bào/m3 CP CPm nồng độ sản phẩm nồng độ cực đại của sản phẩm C CN Công nghệ tế bào 31 CS CX dCX/dt dCN/dt KP KS n r rX rN t td δ δ µ µ max ρ nồng độ cơ chất nồng độ tế bào, trọng lượng khô tế bào trên thể tích kg/m3 sự thay đổi nồng độ khô của tế bào theo th i gian sự thay đổi mật độ số lượng tế bào theo th i gian hệ số nồng độ sản phẩm hệ số hệ thống cho động học Monod, kg/m3 số lượng tế bào tốc độ tốc độ sinh trư ng của tế bào trên cơ s trọng lượng khô tốc độ sinh trư ng của tế bào trên cơ s số lượng th i gian, s th i gian nhân đôi, s tốc độ phân chia của tế bào, s-1 tốc độ phân chia tế bào trung bình, s-1 tốc độ sinh trư ng đặc trưng, s-1 hoặc kg/m3/s tốc độ sinh trư ng cực đại, s-1 hoặc kg/m3/s mật độ tế bào, kg/m3 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc. New York, USA. 2. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 3. Chia TF. 2003. Engineering Applications in Biology. Updated 1st ed. McGraw-Hill Education, Singapore. 4. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 5. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 6. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 7. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2nd ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. 8. Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 32 Chương 4 Thiết kế hệ lên men I. Hệ lên men thùng khuấy Nồi ph n ứng sinh học (bioreactor) hay còn gọi là hệ lên men (fermenter) là lo i thiết bị mà trong nó sự biến đổi hóa sinh đ ợc tiến hành b i các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào in vivo (enzyme). Trong ch ơng này, nồi ph n ứng sinh học để nuôi cấy các tế bào sống đ ợc gọi là hệ lên men để phân biệt các nồi ph n ứng sinh học dùng cho các enzyme. Trong phòng thí nghiệm, các tế bào th ng đ ợc nuôi cấy trong các bình tam giác trên máy lắc. Lắc nhẹ bình tam giác rất hiệu qu để t o ra dịch huyền phù tế bào, tăng c ng sự oxy hóa thông qua bề mặt chất lỏng và trợ giúp sự chuyển khối (mass transfer) của các chất dinh d ỡng mà không gây nguy hiểm cho cấu trúc tế bào. bọt vách ngăn đun nóng làm lạnh turbin dẹt không khí vô trùng Hình 4. 1. Sơ đồ hệ lên men dùng cho s n xuất penicillin. Đối với ho t động s n xuất quy mô lớn, thì hệ thống lên men thùng khuấy (stirred-tank fermenter, STF) đ ợc sử dụng rộng rãi nhất để thiết kế cho quá trình lên men công nghiệp. Nó có thể đ ợc dùng cho c hai tr ng hợp lên men hiếu khí (aerobic) và yếm khí (anaerobic) trong một ph m vi rộng các lo i tế bào khác nhau bao gồm vi sinh vật, động vật và thực vật. Công nghệ tế bào 33 Hình 4.1 giới thiệu sơ đồ hệ lên men dùng trong s n xuất penicillin. C ng độ pha trộn (mixing intensity) có thể rất khác nhau bằng cách chọn lo i cánh khuấy (impeller) thích hợp và các tốc độ khuấy khác nhau. Việc sục khí và khuấy cơ học trong hệ lên men rất tốt cho nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sự oxy hóa, sự pha trộn môi tr ng và truyền nhiệt. STF cũng có thể đ ợc dùng cho các môi tr ng có độ nhớt cao. Nó là một trong những hệ lên men quy mô lớn đầu tiên đ ợc phát triển trong công nghiệp d ợc. Đặc điểm và tiềm năng của STF đ ợc nghiên cứu rộng rãi. Do hệ lên men thùng khuấy th ng đ ợc làm bằng thép không rỉ và ho t động trong điều kiện ôn hòa nên tuổi thọ của thiết bị rất lâu. Nh ợc điểm của hệ lên men thùng khuấy bắt nguồn từ u điểm của nó. Bộ phận (cánh) khuấy rất hiệu qu trong việc pha trộn các thành phần của hệ lên men, nh ng l i tiêu thụ một l ợng lớn công suất và có thể gây nguy hiểm cho những hệ thống tế bào nuôi cấy mẫn c m với lực tr ợt (shear force) nh tế bào động vật có vú hoặc tế bào thực vật. Lực tr ợt của chất lỏng trong hỗn hợp đ ợc t o ra b i gradient tốc độ của các thành phần tốc độ (h ớng tâm và tiếp tuyến) của chất lỏng khi r i khỏi vùng cánh khuấy. Khi chất lỏng r i khỏi vùng trung tâm, thì tốc độ của nó vị trí trên và d ới cánh khuấy (có kho ng cách bằng chiều rộng cánh khuấy) sẽ gi m kho ng 85% và t o ra một vùng tr ợt cao. Khi tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy trên đ ng kính của nó tăng thì profile tốc độ ít có d ng đặc tr ng của parabol mà tr nên tù hơn và nó t o ra lực tr ợt ít hơn do gradient tốc độ lớn dần lên. Vì thế, bằng cách tăng chiều rộng cánh khuấy, có thể ứng dụng thành công STF trong nuôi cấy tế bào động vật hoặc tế bào thực vật. Nhiều hệ lên men quy mô phòng thí nghiệm đ ợc làm bằng thủy tinh có nắp bằng thép không rỉ. Các thùng lên men lớn hơn đ ợc làm bằng thép không rỉ. Tỷ lệ chiều cao trên đ ng kính của thùng lên men (vessel) hoặc là 2/1 hoặc là 3/1 và th ng đ ợc khuấy bằng hai hoặc ba turbine khuấy (cánh khuấy). Trục cánh khuấy đ ợc gắn trên nắp hoặc từ đáy của thùng bằng giá đỡ. Tỷ lệ đ ng kính cánh khuấy (DI) trên đ ng kính của thùng (DT) th ng là từ 0,3-0,4. Trong tr ng hợp hệ lên men có hai cánh khuấy, thì kho ng cách giữa cánh khuấy thứ nhất với đáy của vessel và kho ng cách giữa hai cánh khuấy bằng 1,5 đ ng kính cánh khuấy. Kho ng cách này gi m xuống còn 1,0 so với đ ng kính cánh khuấy trong tr ng hợp hệ lên men có ba cánh khuấy. Bốn vách ngăn (baffles) cách đều nhau th ng Công nghệ tế bào 34 đ ợc thiết kế để ngăn c n sự hình thành dòng xoáy làm gi m hiệu suất pha trộn. Chiều rộng của vách ngăn th ng bằng 1/10 đ ng kính của thùng (tank). tr ng hợp hệ lên men hiếu khí (aerobic fermenter), thì một bộ phun lỗ đơn (single orifice sparger) hoặc một bộ phun vòng đ ợc sử dụng để sục khí cho hệ lên men. Bộ phận phun đ ợc đặt vị trí giữa cánh khuấy cuối cùng và đáy của vessel. Độ pH trong hệ lên men có thể đ ợc duy trì bằng cách dùng dung dịch đệm hoặc bộ điều chỉnh pH (pH controller). Nhiệt độ đ ợc điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt và làm l nh tự động. 1. Hệ lên men dòng nút (plug-flow fermenter, PFF) hoặc mẻ (batch fermenter) Một hệ lên men khuấy lý t ng ph i có kh năng pha trộn tốt sao cho các thành phần đồng nhất trong một kết cấu mọi th i điểm. Một hệ lên men lý t ng khác là hệ lên men dòng nút, một d ng t ơng đồng của hệ lên men mẻ. Trong hệ lên men dòng ống (tubular-flow fermenter), chất dinh d ỡng (cơ chất) và tế bào đi vào một đầu của ống hình trụ và tế bào sẽ sinh tr ng trong khi chúng đi qua ống này. Do ống dài và thiếu bộ phận khuấy nên đã ngăn c n sự pha trộn hoàn toàn của chất lỏng, vì thế tính chất của dòng ch y thay đổi trong hai chiều tiếp tuyến và h ớng tâm. Tuy nhiên, sự biến thiên trong chiều h ớng tâm nhỏ hơn chiều tiếp tuyến. Một hệ lên men dòng ống mà không có những biến thiên h ớng tâm thì đ ợc gọi là hệ lên men dòng nút (PFF). Thực tế, hệ lên men PFF rất khó xây dựng. Cho dù hệ lên men PFF tr ng thái ổn định (steady state) đ ợc ho t động trong một kiểu liên tục, thì nồng độ tế bào của hệ lên men mẻ lý t ng sau th i gian t sẽ giống nh nồng độ tế bào của hệ lên men PFF tr ng thái ổn định vị trí chiều dọc nơi mà th i gian l u (residence time) τ bằng t (Hình 4.2). Vì thế, sự phân tích sau đây ứng dụng cho c hai, hệ lên men mẻ lý t ng và PFF tr ng thái ổn định. Nếu môi tr ng lỏng đ ợc tiếp mẫu bằng nuôi cấy kết h t (seed culture), thì tế bào sẽ bắt đầu sinh tr ng theo hàm mũ sau pha lag. Trong hệ lên men mẻ, sự thay đổi nồng độ tế bào bằng tốc độ sinh tr ng tế bào: dC X = r X = µC X dt Công nghệ tế bào (4.1) 35 CXo Cso F V, CX , CS C X = CX o Cs = Cso F to t = to CS f τp t CX Cs (a) CX f (b) Hình 4.2. Sơ đồ (a) hệ lên men thùng khuấy mẻ và (b) hệ lên men dòng nút. Để thu đ ợc ph ơng trình hiệu suất của lên men mẻ, chúng ta cần lấy tích phân ph ơng trình (4.1) sẽ đ ợc: ∫ CX CX 0 t X dC X dC X = ∫ = ∫ dt = t − t 0 rX µC X t0 CX C (4.2) 0 Cần l u ý rằng, ph ơng trình (4.2) chỉ đ ợc ứng dụng khi rX > 0. Vì thế, t 0 (trong ph ơng trình 4.2) không ph i là th i gian của nuôi cấy ban đầu sau khi tiếp mẫu, mà là th i gian tế bào kh i động sinh tr ng, là giai đo n pha sinh tr ng bắt đầu tăng nhanh. Theo ph ơng trình (4.2), th i gian sinh tr ng từng mẻ t − t 0 chính là diện tích phía d ới đ ng cong 1/rX theo C X giữa C X 0 và C X (Hình 4.3). Đ ng cong liên tục hình 4.3 đ ợc tính toán bằng ph ơng trình Monod và vùng có màu tối bằng t − t 0 . Th i gian sinh tr ng từng mẻ ít khi đ ợc ớc l ợng bằng đồ thị này vì để xác định nó thì dựa vào đ ng cong t theo C X là đơn gi n hơn. Tuy nhiên, biểu diễn bằng đồ thị sẽ thuận tiện trong việc so sánh tiềm năng của các cấu hình hệ lên men khác nhau (sẽ đ ợc th o luận sau). Lúc này chỉ l u ý rằng, đ ng cong có màu tối d ng chữ U là đặc tr ng của các phản ứng xúc tác tự động: S+X→X+X Công nghệ tế bào 36 3 2 1 rX 1 0 2 4 6 8 CX Hình 4.3. Đồ thị của th i gian sinh tr ng từng mẻ t − t 0 (vùng tối). Đ liên tục biểu diễn mô hình Monod với µ max = 0,935/gi ; K S = 0,71 g/L; ng cong YX/S = 0,6; C X 0 = 1,6 g/L; và CS 0 = 10 g/L. Tốc độ kh i đầu của phản ứng xúc tác tự động chậm do nồng độ của X thấp. Tốc độ ph n ứng tăng lên khi các tế bào sinh s n và sau đó sẽ đ t đến tốc độ tối đa. Khi l ợng cơ chất gi m và các s n phẩm độc đ ợc tích lũy, thì tốc độ ph n ứng gi m xuống giá trị thấp hơn. Nếu động học Monod (Monod kinetics) biểu diễn thích hợp tốc độ sinh tr ng trong suốt pha hàm mũ, thì chúng ta có thể thay thế ph ơng trình (3.11) ch ơng 3 vào ph ơng trình (4.2) để có đ ợc: ∫ CX CX 0 t ( K S + C S )dC X = ∫ dt µ max C S C X t0 (4.3) Ph ơng trình (4.3) có thể tính đ ợc tích phân nếu chúng ta biết mối quan hệ giữa CS và CX. Ng i ta đã quan sát thấy rằng số l ợng sinh khối tế bào đ ợc s n xuất tỷ lệ với l ợng cơ chất giới h n đ ợc tiêu thụ. Hiệu suất sinh tr ng ( Y X/S ) đã đ ợc định nghĩa nh sau: YX/S = C X − CX0 ∆C X = − ∆C S − (C S −C S0 ) (4.4) Thay ph ơng trình (4.4) vào ph ơng trình (4.3), tích phân của ph ơng trình tổng hợp này sẽ đ a ra mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và th i gian: Công nghệ tế bào 37 (t − t 0 )µ max ⎛ ⎞ C CS K S YX / S K S YX / S ln 0 =⎜ + 1⎟ ln X + ⎜ C X + C S YX / S ⎟ CX C X 0 + C S0 YX / S CS 0 0 ⎝ 0 ⎠ (4.5) 2. Hệ lên men thùng khuấy liên tục (continuous stirred-tank fermenterCSTF) lý t ởng Quần thể tế bào có thể tiếp tục giai đo n sinh tr ng hàm mũ trong một th i gian dài bằng cách duy trì hệ thống nuôi cấy liên tục. Hình 4.4 trình bày sơ đồ hệ lên men thùng khuấy liên tục (CSTF). Buồng sinh tr ng (thùng lên men hay bình nuôi) đ ợc kết nối với bình chứa môi tr ng vô trùng. Khi quá trình sinh tr ng bắt đầu thì môi tr ng s ch đ ợc cung cấp liên tục từ bình chứa môi tr ng. Hệ thống nuôi cấy liên tục có thể ho t động nh là một chemostat (thể ổn định hóa tính) hoặc turbidostat (thể ổn định độ đục). Trong chemostat tốc độ dòng ch y đ ợc cài đặt một giá trị đặc biệt và tốc độ sinh tr ng của nuôi cấy sẽ điều chỉnh tốc độ dòng ch y này. Nói chung, ho t động chemostat dễ dàng hơn turbidostat, do nó có thể đ ợc thực hiện bằng cách đặt máy bơm một tốc độ dòng ch y không đổi, trong khi turbidostat đòi hỏi một thiết bị c m quang (optical sensing device) và một bộ điều chỉnh (controller). Tuy nhiên, turbidostat đ ợc giới thiệu khi hệ lên men liên tục cần đ ợc tiến hành các tốc độ pha loãng cao gần với điểm rửa trôi (washout point), khi ta có thể ngăn c n sự rửa trôi bằng cách điều hòa tốc độ dòng ch y trong tr ng hợp thất thoát tế bào thông qua dòng ch y ra ngoài v ợt quá sự sinh tr ng tế bào trong hệ lên men. F CXi Csi V, CX , CS CX F C s Hình 4.4. Sơ đồ hệ lên men thùng khuấy liên tục (CSTF). Công nghệ tế bào 38 Cân bằng nguyên liệu cho tế bào trong CSTF (Hình 4.4) có thể đ ợc viết nh sau: FC X i − FC X + VrX = V dC X dt (4.6) Trong đó: rX là tốc độ sinh tr ng tế bào trong hệ lên men và dC X / dt biểu diễn sự thay đổi nồng độ tế bào trong hệ lên men theo th i gian. Đối với CSTF ho t động tr ng thái ổn định, thì sự thay đổi nồng độ tế bào theo th i gian là bằng không (dCX / dt = 0) do các tế bào trong bình nuôi chỉ sinh tr ng đủ nhanh để thay thế những tế bào bị hao hụt theo dòng ch y ra ngoài, và ph ơng trình (4.6) tr thành: τm = V C X − C Xi = F rX (4.7) Ph ơng trình (4.7) cho thấy th i gian l u cần thiết (τm) bằng diện tích hình chữ nhật có chiều rộng C X − C X i và chiều cao 1 / rX trên đ ng cong 1 / rX theo CX. Hình 4.5 biểu diễn đ ng cong 1 / rX theo CX. Diện tích hình chữ nhật đ ợc tô đậm trong hình bằng th i gian l u trong CSTF khi dòng ch y vào là vô trùng. Minh họa th i gian l u bằng đồ thị có thể giúp chúng ta so sánh hiệu qu của các hệ lên men. Hệ lên men có th i gian l u ngắn hơn (để đ t tới một nồng độ tế bào nhất định) là hiệu qu hơn. Ho t động tối u của hệ lên men dựa trên sự minh họa đồ thị này sẽ đ ợc th o luận trong phần tiếp theo. 4 1 rX 3 2 1 0 2 4 6 CX Hình 4.5. Minh họa bằng đồ thị ớc l ợng th i gian l u cho CSTF. Đ ng biểu diễn mô hình Monod với µ max = 0,935/gi ; K S = 0,71 g/L; Y X/S = 0,6; CS i = 10 g/L; và C X i = 0. Công nghệ tế bào 39 Nếu dòng ch y vào là vô trùng (C X i = 0), và tế bào trong CSTF đang sinh tr ng theo hàm mũ (rX = µC X ) thì ph ơng trình (4.7) sẽ tr thành: τm = µ 1 = 1 D (4.8) Trong đó: D đ ợc biết nh là tốc độ pha loãng và có giá trị bằng nghịch đ o của th i gian l u ( τ m ). Vì thế, đối với CSTF tr ng thái ổn định có chất dinh d ỡng vô trùng, thì tốc độ sinh tr ng đặc tr ng bằng tốc độ pha loãng. Mặt khác, tốc độ sinh tr ng đặc tr ng của tế bào có thể đ ợc điều chỉnh bằng cách thay đổi tốc độ dòng ch y môi tr ng. Nếu tốc độ sinh tr ng có thể đ ợc biểu diễn bằng ph ơng trình Monod, thì sau đó: D=µ= τm 1 = µ max C S K S + CS (4.9) Từ ph ơng trình (4.9), CS có thể đ ợc tính toán bằng th i gian l u đã biết và các thông số động học Monod nh sau: CS = τ m µ max − 1 KS (4.10) Tuy nhiên, cần chú ý rằng ph ơng trình (4.10) chỉ có giá trị khi τ m µ max > 1 . Nếu τ m µ max < 1 , tốc độ sinh tr ng của tế bào sẽ thấp hơn tốc độ tế bào thất thoát theo dòng ch y ra ngoài. Do đó, tất c tế bào trong hệ lên men sẽ bị rửa trôi, và ph ơng trình (4.10) sẽ không có giá trị. Nếu hiệu suất sinh tr ng (YX / S ) là hằng số, thì sau đó: C X = YX / S (C Si − CS ) (4.11) Thay ph ơng trình (4.10) vào ph ơng trình (4.11) sẽ cho hiệu suất t ơng quan đối với CX nh sau: ⎞ ⎛ KS ⎟⎟ C X = YX / S ⎜⎜ C Si − τ µ − 1 m max ⎠ ⎝ Công nghệ tế bào (4.12) 40 T ơng tự: ⎛ ⎞ KS ⎟⎟ CP = CPi + YP / S ⎜⎜ CS i − τ µ − 1 m max ⎠ ⎝ (4.13) Trong đó: CP là nồng độ s n phẩm, CPi là nồng độ s n phẩm đ a vào. Một lần nữa, ph ơng trình (4.12) và (4.13) chỉ có giá trị khi τ m µ max > 1 . Trong phần này, chúng ta đặt cân bằng nguyên liệu cho nồng độ tế bào và thu đ ợc các ph ơng trình khác nhau cho CSTF. Các ph ơng trình t ơng tự cũng có thể thu đ ợc bằng cách đặt các cân bằng nguyên liệu cho nồng độ cơ chất và nồng độ s n phẩm. 3. ớc l ợng các thông số động học Monod Đẳng thức tốc độ sinh tr ng đặc tr ng và tốc độ pha loãng của CSTF tr ng thái ổn định (ph ơng trình 4.9) tiện lợi trong nghiên cứu nh h ng của các thành phần khác nhau của môi tr ng lên tốc độ sinh tr ng đặc tr ng. Bằng cách đo nồng độ cơ chất tr ng thái ổn định với các tốc độ dòng ch y khác nhau, các mô hình động học khác nhau có thể đ ợc thử nghiệm và giá trị của các thông số động học có thể đ ợc ớc l ợng. Sắp xếp l i ph ơng trình (4.9) có thể thu đ ợc mối quan hệ tuyến tính nh sau: µ 1 = µmax KS × 1 1 + CS µmax (4.14) Trong đó: µ bằng tốc độ pha loãng (D) cho chemostat. Nếu một tế bào nhất định tuân theo động học Monod, thì đồ thị 1 / µ theo 1 / CS sẽ đem l i giá trị µ max và KS (bằng cách đọc phần bị chặn và độ dốc của đ ng thẳng). Đồ thị này có u điểm cho thấy mối quan hệ giữa biến độc lập (CS) và biến phụ thuộc µ. Tuy nhiên, 1 / µ sẽ tiến tới ∞ nếu nồng độ cơ chất gi m dẫn đến trọng l ợng v ợt quá mức để đo khi nồng độ cơ chất thấp và trọng l ợng không đủ để đo khi các nồng độ cơ chất cao. Ph ơng trình (4.9) có thể sắp xếp l i để đ a ra các mối quan hệ tuyến tính ứng dụng thay cho ph ơng trình (4.14) nhằm ớc l ợng tốt hơn các thông số trong những tr ng hợp nhất định: Công nghệ tế bào 41 µ CS = µ max KS + µ max µ = µ max − K S CS (4.15) µ (4.16) CS Tuy nhiên, giới h n của phép tính gần đúng này (để xác định các thông số động học) gặp khó khăn khi sử dụng CSTF. Đối với tr ng hợp vận hành theo từng mẻ, chúng ta thậm chí có thể dùng bình tam giác lắc trên máy lắc để vận hành nhiều mẻ với các điều kiện khác nhau trong cùng một th i gian. Vận hành theo từng mẻ trong nồi lên men có khuấy cũng không khó khăn lắm, do không có các kết nối đi vào và đi ra (ngo i trừ bộ phận cung cấp không khí) và th i gian vận hành ngắn, ít có nguy cơ của sự nhiễm bẩn hệ lên men. Để vận hành CSTF, chúng ta cần có các nguồn cung cấp dinh d ỡng và tích trữ s n phẩm đ ợc kết nối vô trùng với hệ lên men. Tốc độ của các dòng ch y vào và ra khỏi hệ lên men cần đ ợc kiểm soát một cách chính xác. Thỉnh tho ng, việc kiểm soát tốc độ dòng ch y ra có thể gặp khó khăn do sự t o bọt và kết khối của các tế bào. Do th i gian vận hành ít nhất một vài ngày hoặc thậm chí c tuần để đ t tới tr ng thái ổn định (cũng gây ra sự biến đổi tốc độ pha loãng), cho nên luôn có rủi ro cao đối với hệ lên men do bị nhiễm bẩn. Th ng xuyên gặp khó khăn trong việc đ t tới tr ng thái ổn định b i đột biến của tế bào và kh năng thích nghi với môi tr ng mới của chúng. Hơn nữa, do hầu hết các hệ lên men quy mô lớn đ ợc tiến hành trong kiểu từng mẻ, cho nên các thông số động học đ ợc xác định b i nghiên cứu chemostat ph i dự báo đ ợc sự sinh tr ng trong kiểu lên men này. Tuy nhiên, bằng chứng (kiểm tra và xác minh) mô hình động học và ớc l ợng các thông số động học bằng cách vận hành chemostat là ph ơng pháp đáng tin cậy nhất do điều kiện môi tr ng không thay đổi của nó. Các số liệu của vận hành theo từng mẻ có thể đ ợc dùng để xác định các thông số động học, cho dù nó không ph i là ph ơng thức đ ợc giới thiệu cao. Tốc độ sinh tr ng đặc tr ng trong suốt quá trình vận hành theo từng mẻ có thể đ ợc ớc l ợng bằng cách đo độ dốc của đ ng cong nồng độ tế bào theo th i gian các điểm khác nhau. Nồng độ cơ chất cần thiết đ ợc đo cùng các điểm nơi mà độ dốc đ ợc đọc. Sau đó các đồ thị theo các ph ơng trình (4.14), (4.15) và (4.16) có thể đ ợc xây dựng để xác định Công nghệ tế bào 42 các thông số động học. Tuy nhiên, giá trị của các thông số thu đ ợc trong ph ơng pháp này cần thiết đ ợc kh o sát cẩn thận xem chúng có trong ph m vi hợp lý cho các tế bào đ ợc kiểm tra hay không. 4. Hiệu suất của CSTF Thông th ng, hiệu suất của hệ lên men đ ợc hiểu nh là số l ợng s n phẩm đ ợc s n xuất trên một đơn vị th i gian và thể tích. Nếu dòng ch y vào là vô trùng (C X i = 0) thì hiệu suất sinh khối tế bào bằng C X / τ m , chính là độ dốc của đ 4.6). ng thẳng OAB của đ ng cong CX theo τm (Hình 10 8 6 C CX B 4 A 2 0 O 0 D 2 τm 4 6 Hình 4.6. Sự thay đổi nồng độ tế bào và cơ chất nh là một hàm của th i gian l u. Hiệu suất bằng độ dốc của đ ng thẳng OAB . Đ ng cong đ ợc vẽ bằng mô hình Monod với µmax = 0,935/gi ; KS = 0,71 g/L; YX/S = 0,6; và C S i = 10 g/L. Hiệu suất điểm A bằng hiệu suất điểm B. điểm A nồng độ tế bào của dòng ch y ra thấp nh ng th i gian l u l i ngắn, vì thế môi tr ng có thể ch y qua dễ dàng hơn. Ng ợc l i, điểm B nồng độ tế bào của dòng ch y ra cao nh ng th i gian l u l i dài vì thế chỉ có một l ợng nhỏ của môi tr ng ch y qua. Điểm A là vùng không ổn định vì rất gần với điểm rửa trôi D, và vì chỉ cần một sự dao động nhỏ trong th i gian l u cũng có thể đem l i một sự thay đổi lớn trong nồng độ tế bào. Khi độ dốc của đ ng thẳng Công nghệ tế bào 43 tăng lên thì hiệu suất sẽ tăng và độ dài của AB gi m. Độ dốc của đ ng thẳng sẽ đ t giá trị cực đ i khi nó là đ ng tiếp tuyến của đ ng cong CX. Vì thế, giá trị hiệu suất cực đ i bằng độ dốc của đ ng OC . Hiệu suất cực đ i sẽ đ t đ ợc điểm D. Điều kiện ho t động để đ t hiệu suất cực đ i CSTF có thể ớc l ợng theo đồ thị bằng cách dùng đ ng cong 1 / rX theo CX. Hiệu suất cực đ i có thể thu đ ợc khi th i gian l u là tối thiểu. Vì th i gian l u bằng diện tích của hình chữ nhật với chiều rộng CX và chiều cao 1 / rX trên đ ng cong 1 / rX theo CX, cho nên nó sẽ đ t tối thiểu khi 1 / rX là tối thiểu (Hình 4.7). 4 1 rX 3 2 1 0 2 4 6 CX Hình 4.7. Minh họa bằng đồ thị CSTF với hiệu suất cực đ i. Đ ng liên tục biểu diễn cho mô hình Monod với µmax = 0,935/gi ; KS = 0,71 g/L; YX/S = 0,6; C Si = 10 g/L; và C X i = 0 . Điều cần l u ý là điều chỉnh các ph ơng trình cho nồng độ tế bào và th i gian l u để sao cho hiệu suất tế bào đ t cực đ i. Hiệu suất tế bào cho CSTF tr ng thái ổn định với chất dinh d ỡng vô trùng là: τm CX = rX = µ max C S C X K S + CS (4.17) Hiệu suất đ t cực đ i khi drX / dC X = 0, sau khi thay thế CS = CS i − C X / YX / S vào ph ơng trình (4.17), lấy tích phân theo CX và đặt ph ơng trình tổng hợp bằng 0, chúng ta thu đ ợc nồng độ tế bào tối u (C X ,opt ) cho hiệu suất cực đ i nh sau: Công nghệ tế bào 44 α C X , opt = YX / S CS i α +1 (4.18) Trong đó: α= Vì: C S = C Si − K S + C Si (4.19) KS CX nên nồng độ cơ chất tối u (CS, opt) sẽ là: YX / S C S ,opt = C Si α +1 (4.20) Thay ph ơng trình (4.20) vào ph ơng trình (4.17) để thu đ ợc một th i gian l u tối u (τm,opt) nh sau: τ m ,opt = α µ max (α − 1) (4.21) 5. So sánh nuôi cấy của hệ lên men mẻ và hệ lên men thùng khuấy liên tục Nh đã đề cập, th i gian l u cần thiết để nuôi cấy mẻ hoặc PFF tr ng thái ổn định đ t tới một nồng độ tế bào nhất định là: τ b = t0 + ∫ CX CX0 dC X rX (4.22) Trong đó: t0 là th i gian cần thiết để đ t tới pha sinh tr ng theo hàm mũ. Diện tích bên d ới của đ ng cong 1 / rX theo CX, giữa C X i và CX là bằng τ b − t1 nh đã đ ợc trình bày hình 4.3. Mặt khác, th i gian l u CSTF đ ợc biểu diễn b i ph ơng trình (4.17) bằng diện tích hình chữ nhật với chiều rộng C X − C X i , và chiều cao 1 / rX . Công nghệ tế bào 45 Vì đ ng cong 1 / rX theo CX có d ng hình chữ U nên chúng ta có thể có một vài nhận xét cho hệ lên men đơn nh sau: - Hầu hết các hệ lên men s n xuất là một CSTF ho t động với nồng độ tế bào mà đó giá trị của 1 / rX là tối thiểu (Hình 4.8 a) do nó đòi hỏi th i gian l u ngắn nhất. - Nếu nồng độ cuối cùng của tế bào đ ợc h ớng tới trong pha tĩnh, thì hệ lên men mẻ là chọn lựa tốt hơn CSTF, vì th i gian l u cần thiết cho nuôi cấy mẻ (Hình 4.8 b) là ngắn hơn của CSTF. a 1 rX b 1 rX CX CX Hình 4.8. Minh họa bằng đồ thị th i gian l u đ ợc yêu cầu (vùng tối) cho: (a) CSTF và (b) hệ lên men mẻ. II. Thu hồi tế bào Đối với ho t động liên tục của PFF và CSTF, các tế bào thất thoát cùng với dòng ch y ra (outlet) đã h n chế hiệu suất của hệ lên men. Vì thế, hiệu suất có thể đ ợc c i thiện bằng cách thu hồi (recycling) tế bào từ dòng ch y ra để đ a tr l i hệ lên men. 1. Thu hồi tế bào ở PFF PFF đòi hỏi sự hiện diện ban đầu của tế bào trong dòng ch y vào (inlet) nh là một hệ lên men mẻ đòi hỏi đ a mẫu vào ban đầu. Ph ơng thức kinh tế nhất để cung cấp tế bào trong dòng ch y vào là thu hồi một phần của Công nghệ tế bào 46 dòng ch y ra đ a tr l i dòng ch y vào với (hoặc không có) thiết bị tách r i tế bào. Hình 4.9 mô t sơ đồ thu hồi tế bào PFF. Không giống nh CSTF, PFF không đòi hỏi thiết bị tách r i tế bào để thu hồi, vì sự hiện diện của nó không làm tăng đáng kể hiệu suất của hệ lên men. Ph ơng trình hiệu suất của PFF với động học Monod có thể đ ợc viết nh sau: τp V = = (1 + R ) F 1 + R ∫ CX f C X' dC X = rX ∫ CX f C X' ( K S + C S )dC X µ max C S C X (4.23) Trong đó: τ p là th i gian l u dựa trên tốc độ dòng ch y của toàn bộ hệ thống. Th i gian l u thực tế trong hệ lên men lớn hơn τ p do tốc độ dòng ch y tăng lên nh thu hồi tế bào. CXi F Csi (1 + R)F C’X C’s RF CXR , Csf Hình 4.9. Sơ đồ thu hồi tế bào Nếu hiệu suất sinh tr B CXf Csf L CXL = 0 Csf PFF. ng là không đổi thì: C S = C S' − 1 Y X/S (C X − C X' ) (4.24) Thay ph ơng trình (4.24) vào trong ph ơng trình (4.23) cho CS và lấy tích phân ta sẽ có kết qu sau: τ p µ max ⎞ CX f ⎛ K Y K S YX / S C S' ⎟ 1 ln ln + = ⎜⎜ ' S X/S + ' ⎟ C' 1+ R C X' + C S' Y X / S C S f X ⎠ ⎝ C X + C S Y X/S Công nghệ tế bào (4.25) 47 Trong đó: C X' và C S' có thể đ ợc ớc l ợng từ sự cân bằng tế bào và cơ chất điểm phối trộn của dòng ch y vào và dòng ch y thu hồi nh sau: C X' = C S' = C X i + RC X R 1+ R (4.26) C Si + RC S R 1+ R (4.27) Nồng độ tế bào của dòng ch y ra, có thể đ ợc ớc l ợng từ toàn bộ sự cân bằng tế bào nh sau: CX f = β 1 [C Xi + Y X/S (C Si − C S f ) ] (4.28) Nồng độ tế bào của dòng ch y thu hồi có thể đ ợc ớc l ợng từ sự cân bằng tế bào trên bộ lọc nh sau: CXR = 1+ R − β CX f R (4.29) Trong đó: β là tỷ lệ x (bleeding) đ ợc định nghĩa nh sau: β= B F (4.30) Hình 4.10 trình bày hiệu qu của tốc độ thu hồi (R) trên th i gian l u của hệ thống PFF có thu hồi. L u ý rằng th i gian l u đ ợc tính toán dựa trên tốc độ dòng ch y vào, đó là th i gian l u thực sự của hệ lên men. Th i gian l u thực tế trên hệ thống PFF là không quan trọng b i vì nó sẽ gi m xuống khi tăng tốc độ thu hồi. Khi β = 1, tốc độ x sẽ bằng tốc độ dòng ch y, và tốc độ dòng ch y của phần đ ợc lọc L là bằng 0, vì thế dòng ch y thu hồi không đ ợc lọc. Th i gian l u sẽ là vô h n nếu R bằng 0 và gi m rõ rệt khi R tăng lên. Trong tr ng hợp này tỷ lệ thu hồi tối u có thể trong kho ng 0,2. Một đ ng cong khác trong hình 4.10 là cho β = B / F = 1,8. Th i gian l u cần thiết có thể gi m bằng cách tập trung dòng ch y thu hồi từ 2540% khi R trong kho ng 0,2-1,0. Khi R ≤ 1,2, thì một đo n của đ ng Công nghệ tế bào 48 cong đ ợc biểu diễn bằng dấu chấm, b i vì khó có thể gi m tỷ lệ thu hồi xuống d ới 0,2 khi β = 0,8. 8 6 τp = V F 4 β=1 2 0 0,0 β = 0,8 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 R Hình 4.10. nh h ng của tốc độ thu hồi (R) và tỷ lệ x ( β = B / F ) lên th i gian l u (τp = V/F gi ) của hệ thống PFF có thu hồi. Đ ng cong đ ợc vẽ bằng mô hình Monod với µmax = 0,935/gi ; KS = 0,71 g/L; YX/S = 0,6; C S i = 10 g/L; C S f = 1,3 g/L; và C X i = 0. Việc phân tích trong phần này và các phần sau cũng có thể đ ợc ứng dụng trong các bể lắng tế bào nh là một bộ phận phân tách tế bào. Dòng ch y ra của bể lắng tế bào sẽ bằng F = B+L và nồng độ của nó sẽ là ( B / F ) × C X f = βC X f . 2. Thu hồi tế bào ở CSTF Hiệu suất tế bào trong CSTF tăng lên cùng với việc tăng tốc độ pha loãng và đ t đến giá trị cực đ i. Nếu tốc độ pha loãng tăng lên quá điểm cực đ i, thì hiệu suất của hệ lên men sẽ gi m đột ngột và tế bào sẽ bắt đầu bị pha loãng do tốc độ sinh s n tế bào kém hơn sự hao hụt tế bào dòng ch y ra. Một ph ơng thức c i thiện hiệu suất hệ lên men là thu hồi tế bào bằng cách tách r i tế bào khỏi dòng ch y s n phẩm bằng hệ lọc dòng ch y ngang (cross-flow filter unit) (Hình 4.11). Nồng độ cao của tế bào (đ ợc duy trì bằng cách thu hồi tế bào) sẽ làm tăng hiệu suất tế bào khi tốc độ sinh tr ng tỷ lệ t ơng ứng với nồng độ tế Công nghệ tế bào 49 bào. Tuy nhiên, ph i có giới h n trong việc tăng hiệu suất tế bào với việc tăng nồng độ tế bào b i vì trong môi tr ng có nồng độ tế bào cao, thì tốc độ chuyển khối chất dinh d ỡng sẽ bị gi m do việc dồn vào một nơi quá đông và gây kết khối của tế bào. Việc duy trì nồng độ quá cao của tế bào cũng không có lợi b i vì bộ phận lọc sẽ th ng xuyên bị hỏng hơn tr ng hợp nồng độ tế bào cao. F CXi Csi L CXL = 0 Csf B CX f Csf V Hình 4.11. Sơ đồ thu hồi tế bào CSTF. Nếu tất c tế bào đ ợc thu hồi tr l i trong hệ lên men, thì nồng độ tế bào sẽ tăng liên tục theo th i gian và tr ng thái ổn định sẽ không bao gi đ t đ ợc. Vì thế, để ho t động của CSTF có sự thu hồi tr ng thái ổn định, chúng ta cần có một dòng x (Hình 4.11). Ph ơng trình cân bằng nguyên liệu cho tế bào trong hệ lên men có bộ phận thu hồi tế bào có d ng nh sau: FC X i − BC X + VµC X = V dC X dt (4.31) Cần l u ý rằng, tốc độ dòng ch y thực tế đi vào và đi ra khỏi bộ phận lọc không quyết định hoàn toàn đến sự cân bằng tất c nguyên liệu. Đối với CSTF tr ng thái ổn định có sự thu hồi tế bào và chất dinh d ỡng vô trùng, thì: βD = Công nghệ tế bào β =µ τm (4.32) 50 Lúc này βD thay cho D và bằng tốc độ sinh tr D = 1 tế bào không đ ợc thu hồi, vì thế β = µ. ng đặc tr ng. Khi Nếu tốc độ sinh tr ng có thể biểu diễn bằng động học Monod, thì thay thế ph ơng trình (3.11) ch ơng 3 vào ph ơng trình (4.32) ta có: CS = βK S τ m µ max − β (4.33) CS chỉ có nghĩa khi τ m µ max > β . Nồng độ tế bào trong hệ lên men có thể đ ợc tính toán từ giá trị của CS nh sau: CX = β YX / S (C Si − C S ) (4.34) Hình 4.12 cho thấy nh h ng của tỷ lệ x lên hiệu suất tế bào đối với mô hình Monod. Khi β bị gi m xuống từ 1 (không thu hồi) tới 0,5 thì hiệu suất tế bào đ ợc tăng lên gấp đôi. 10 8 β = 0,05 Không thu hồi Hình 4.12. nh h ng của tỷ lệ x lên hiệu suất tế bào (βDCX). DC X 6 4 2 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 D III. Các hệ lên men khác Nhiều hệ lên men khác đã đ ợc đề xuất và thử nghiệm. Các hệ lên men này đ ợc thiết kế để c i thiện hoặc nh ợc điểm của hệ lên men thùng khuấy (tiêu thụ công suất lớn) hoặc các yêu cầu đặc biệt của một quá trình lên men nhất định nh : sục khí tốt hơn, chuyển nhiệt hiệu qu , tách hoặc giữ l i tế bào, bất động tế bào, gi m bớt thiết bị và giá thành của s n phẩm, và th ng không đ ợc thiết kế cho quy mô lớn. Công nghệ tế bào 51 Các hệ lên men th ng đ ợc phân lo i dựa trên cơ s các kiểu bình nuôi của chúng nh là thùng, cột, hoặc các hệ lên men vòng (loop). C hai hệ lên men thùng và cột đ ợc xây dựng trên cơ s bình nuôi hình trụ. Có thể phân lo i dựa theo tỷ lệ chiều cao (H) trên đ ng kính (D) nh sau: H/D < 3 cho hệ lên men thùng. H/D > 3 cho hệ lên men cột. Hệ lên men vòng là hệ lên men thùng hoặc cột có vòng l u thông chất lỏng, (có thể là ống thông gió (draft) giữa hoặc là một cái vòng gắn bên ngoài hệ lên men). Có thể phân lo i các hệ lên men theo một cách khác dựa trên cơ s các thành phần của hệ lên men đ ợc phối hợp nh thế nào: b i khí nén, b i bộ phận chuyển động cơ học bên trong, hoặc b i bơm chất lỏng bên ngoài. Các hệ lên men tiêu biểu trong mỗi lo i đ ợc trình bày b ng 4.1, và các u điểm và nh ợc điểm của ba lo i hệ lên men cơ b n đ ợc trình bày b ng 4.2. Bảng 4.1. Phân lo i các hệ lên men. Nguồn trộn sơ cấp Lo i bình nuôi Khí nén Thùng Cột Vòng - Các bộ phận chuyển động bên trong Thùng khuấy Bơm bên ngoài - Cột bong bóng Nhiều giai đo n Khay sàng (rây) Cột hình nón (hoặc đợt) Đệm nhồi Áp lực không khí Vòng chân vịt đẩy lên theo chu kỳ Vòng tia 1. Hệ lên men cột (column fermenter) Hệ lên men đơn gi n nhất là hệ lên men cột bong bóng (còn gọi là hệ lên men tháp-tower fermenter), th ng bao gồm một bình trụ dài, có bộ phận phun khí d ới đáy (Hình 4.13 a-c). Các thành phần của hệ lên men đ ợc trộn bằng cách tăng số l ợng bong bóng lên, cũng là yếu tố có thể cung cấp oxygen cần thiết cho tế bào. Khi các tế bào lắng xuống, nồng độ Công nghệ tế bào 52 cao của tế bào có thể đ ợc duy trì phần thấp hơn của cột mà không có bất kỳ một thiết bị nào để tách r i chúng. Tuy nhiên, hệ lên men cột bong bóng th ng bị h n chế tr ng hợp lên men hiếu khí và việc tăng các bong bóng không thể cung cấp một sự pha trộn đầy đủ cho sự sinh tr ng tối u. Chỉ có phần thấp hơn của cột có thể duy trì nồng độ tế bào cao dẫn đến sự lên men ban đầu nhanh đ ợc tiếp theo b i sự lên men chậm hơn do các cơ chất mong muốn bị gi m đi. Khi nồng độ tế bào tăng lên trong hệ lên men, cần có l u tốc không khí cao để duy trì dịch huyền phù tế bào và sự pha trộn. Tuy nhiên, l u tốc không khí tăng lên có thể gây ra sự t o bọt nhiều và việc duy trì các bong bóng khí trong cột dẫn đến làm gi m hiệu suất của hệ lên men. Khi bong bóng tăng lên nhiều trong cột chúng có thể kết thành một khối nhanh chóng làm gi m tốc độ chuyển oxygen. Vì thế, các hệ lên men cột có thể không thay đổi đ ợc và h n chế một ph m vi khá hẹp các điều kiện ho t động. Bảng 4.2. u điểm và nh ợc điểm của cấu hình ba hệ lên men cơ b n. u điểm Lo i Thùng khuấy 1. Linh ho t và dễ thích ứng Lực đẩy không khí 1. Tiêu thụ công suất lớn 2. Ph m vi mật độ pha trộn rộng 3. Có thể sử dụng môi tr nhớt cao Cột bong bóng Nh ợc điểm 2. Gây tổn h i cho các tế ng có độ bào mẫn c m với lực tr ợt 3. Giá thành thiết bị cao 1. Không có các bộ phận chuyển động 1. Pha trộn kém 2. Đơn gi n 2. T o bọt d thừa 3. Giá thành thiết bị thấp 4. Nồng độ tế bào cao 3. Giới h n đối với hệ thống có độ nhớt thấp 1. Không có các bộ phận chuyển động 1. Pha trộn kém 2. Đơn gi n 2. T o bọt d thừa 3. Hiệu suất hút khí cao 3. Giới h n đối với hệ thống có độ nhớt thấp 4. Chuyển nhiệt tốt Để khắc phục nh ợc điểm của hệ lên men cột, một vài kiểu thiết kế khác đã đ ợc đề xuất. Hệ lên men cột hình chóp ng ợc (Hình 4.13 b) có thể Công nghệ tế bào 53 duy trì l u tốc không khí cao trên một đơn vị diện tích phần thấp hơn của hệ lên men mà đó có nồng độ tế bào cao. Một vài khay sàng lọc có thể đ ợc cài đặt trong cột (Hình 4.13 c) để tăng hiệu qu tiếp xúc khí-chất lỏng và phá vỡ sự kết khối của bong bóng khí. Để tăng c ng sự pha trộn mà không có các phần chuyển động bên trong, dịch lên men (môi tr ng) có thể đ ợc bơm ra ngoài và quay vòng (tuần hoàn) bằng cách dùng một bơm chất lỏng bên ngoài (Hình 4.13 d và e). Không khí (a) (b) (c) (d) (e) Hình 4.13. Các hệ lên men cột: (a) cột bong bóng (bubble column), (b) cột hình nón (tapered column), (c) cột bong bóng có khay sàng lọc (sieve-tray bubble column), (d) cột bong bóng có khay sàng lọc với bơm bên ngoài, (e) cột nhồi (packed-bed) với bơm bên ngoài. 2. Hệ lên men vòng (loop fermenter) Hệ lên men vòng là hệ lên men thùng (tank fermenter) hoặc cột (column fermenter) có vòng l u thông chất lỏng, nó có thể là một ống thông gió giữa hoặc là một cái vòng bên ngoài. Tùy thuộc vào sự l u thông chất lỏng đ ợc t o ra nh thế nào, mà hệ lên men đ ợc phân lo i thành ba kiểu: lực đẩy không khí (air-lift), vòng khuấy (stirred loop) và vòi phun (jet loop) (Hình 4.14). Sự l u thông chất lỏng của hệ lên men dùng lực đẩy nh vào việc phun không khí để t o ra sự khác nhau về mật độ giữa phần giàu bong bóng của chất lỏng trong tấm đứng (riser) và phần đ ợc rút hết bong bóng nặng hơn của chất lỏng trong đáy thùng (downcomer) (Hình 4.14 a). Sự pha trộn và l u thông chất lỏng trong thùng lên men có thể đ ợc tăng c ng bằng cách gắn thêm một bộ phận bơm bên ngoài (Hình 4.14 b). Tuy nhiên, việc bổ sung Công nghệ tế bào 54 bơm đã làm gi m u điểm của hệ lên men nh lực đẩy không khí là hiệu suất năng l ợng thấp và đơn gi n. Hệ lên men áp lực chu kỳ ICI (Imperial Chemical Industries Ltd., England) là một hệ lên men dùng lực đẩy không khí với một vòng bên ngoài (outer loop) đ ợc phát triển cho lên men hiếu khí đòi hỏi có sự chuyển nhiệt. Môi tr ng và không khí đ ợc đ a vào trong các phần cao hơn và thấp hơn (Hình 4.14 c). Không khí phục vụ cho hai mục đích: cung cấp oxygen cần thiết cho sự sinh tr ng của tế bào và t o ra sự l u thông tự nhiên của chất lỏng trong hệ lên men thông qua một cái vòng. Bộ phận trao đổi nhiệt để làm l nh môi tr ng lỏng đ ợc cài đặt vào trong cái vòng đó. Hệ lên men này đã đ ợc chứng minh là t o ra một tốc độ hấp thụ oxygen cao trên một đơn vị thể tích. Không khí (a) (b) (c) Hình 4.14. Các hệ lên men vòng: (a) lực đẩy không khí, (b) lực đẩy không khí có bơm bên ngoài, (c) áp lực chu kỳ ICI. IV. Các ký hiệu B β tốc độ ch y của dòng x , m3/s tỷ lệ x , đ ợc định nghĩa nh B/F CP nồng độ s n phẩm CPi nồng độ s n phẩm đ a vào CS nồng độ cơ chất ' S C nồng độ cơ chất điểm phối trộn của dòng ch y vào và dòng ch y thu hồi Công nghệ tế bào 55 C S0 nồng độ cơ chất t i th i điểm t0 CS f nồng độ cơ chất sau khi ra khỏi hệ lên men C Si nồng độ cơ chất đ a vào CS ,opt nồng độ cơ chất tối u CX C ' X nồng độ tế bào nồng độ tế bào hồi điểm phối trộn của dòng ch y vào và dòng ch y thu C X0 nồng độ tế bào t i th i điểm t0 CX f nồng độ tế bào sau khi ra khỏi hệ lên men C Xi nồng độ tế bào đ a vào CX L nồng độ tế bào thu hồi qua lọc CX R nồng độ tế bào của dòng ch y thu hồi C X , opt nồng độ tế bào tối u D F tốc độ pha loãng, s-1 tốc độ dòng ch y, m3/s τm th i gian l u, s τb th i gian l u cần thiết để nuôi cấy mẻ hoặc PFF tr ng thái ổn định KS L µ đ t tới một nồng độ tế bào nhất định hệ số hệ thống tốc độ dòng ch y qua lọc, m3/s tốc độ sinh tr ng đặc tr ng, s-1 hoặc kg/m3/s R rX V YP/S tốc độ sinh tr ng cực đ i tốc độ thu hồi tốc độ sinh tr ng tế bào thể tích làm việc của hệ lên men, m3 hiệu suất s n phẩm/cơ chất τ m,opt th i gian l u tối u, s τp th i gian l u dựa trên tốc độ dòng ch y của toàn bộ hệ thống µ max Công nghệ tế bào 56 YX/S X hiệu suất sinh tr ng/cơ chất tế bào trên cơ s trọng l ợng khô Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc. New York, USA. 2. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 3. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 4. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 5. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA. nd 6. Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 57 Chương 5 Nuôi cấy tế bào vi sinh vật Mặc dù cho đến thế kỷ 19 vai trò c a vi sinh vật trong những biến đ i sinh học vẫn không được thừa nhận, nhưng con ngư i đã sử dụng vi sinh vật từ rất lâu trong việc chế biến thực phẩm, th c uống có c n, sản xuất sữa, dệt vải... Ngày nay, việc sử dụng vi sinh vật rộng rãi hơn trước đây rất nhiều. Chúng không chỉ được dùng trong các quá trình vi sinh vật truyền thống mà còn cho các quá trình mới như sản xuất dược phẩm, hóa chất công nghiệp, enzyme, hóa chất nông nghiệp, xử lý nước thải, lọc khoáng và các công nghệ DNA tái t hợp. Chương này chỉ tập trung giới thiệu các ng dụng c a nuôi cấy tế bào vi sinh vật trong sản xuất dược phẩm (đặc biệt là dược phẩm DNA tái t hợp) và sản xuất enzyme. I. Tế bào vi sinh vật Tất cả các cơ thể sống được Haekel (1866) phân loại thành giới động vật (animal kingdom), giới thực vật (plant kingdom) và sinh vật đơn bào (protist) như trình bày trong bảng 5.1. Các protist được xem là các cơ thể sống tương đối đơn giản so với thực vật và động vật. Chúng bao g m tảo, động vật nguyên sinh, nấm và vi khuẩn. Sự phát triển c a kính hiển vi điện tử đã cho phép các nhà khoa học thừa nhận rằng cấu trúc đơn vị c a tất cả các cơ thể sống được phân chia trong hai loại: sinh vật tiền nhân (prokaryotes) và sinh vật nhân thật (eukaryotes). Các tế bào tiền nhân là đơn vị cấu trúc trong hai nhóm vi sinh vật: vi khuẩn và tảo lam (còn gọi là vi khuẩn lam-cyanobacteria). Các tế bào tiền nhân có kích thước nhỏ và đơn giản như trình bày hình 5.1, nó không được chia thành ngăn b i các hệ thống màng đơn vị (unit membrane systems). Các tế bào chỉ có hai vùng bên trong được phân biệt cấu trúc là: tế bào chất và vùng nhân (hoặc dịch nhân). Tế bào chất có các chấm dạng hạt màu tối chính là thành phần ribosome, bao g m protein và ribonucleic acid (RNA). Ribosome là nơi xảy ra các phản ng hóa sinh quan trọng cho sự t ng hợp protein. Vùng nhân có dạng không đều, rất biệt lập mặc dù nó không được giới hạn b i màng. Vùng nhân ch a deoxyribonucleotic acid Công nghệ tế bào 58 (DNA) mang thông tin di truyền xác định sự sản xuất protein và các chất khác c a tế bào cũng như xác định các cấu trúc c a nó. Bảng 5.1. Phân loại các cơ thể sống. Động vật Đa bào Nhân thật1 Thực vật Đơn bào Sinh vật đơn Tảo (Algae) bào2 Động vật nguyên sinh (Protozoa) Nhân thật Nấm (Fungi) Nấm mốc (Molds) Nấm men (Yeasts) Tiền nhân3 Vi khuẩn (Bacteria) Thành tế bào Màng tế bào Ribosome Vùng nhân Tế bào chất Hình 5.1. Minh họa một tế bào đặc trưng c a sinh vật tiền nhân. Các tế bào prokaryote được bao quanh b i thành tế bào (cell wall) và màng tế bào (cell membrane), thành tế bào thư ng dày hơn màng tế bào, bảo vệ tế bào khỏi các ảnh hư ng từ bên ngoài. Màng tế bào (hoặc màng tế bào chất) là một hàng rào chọn lọc giữa phần bên trong tế bào và môi 1 Nhân thật: còn gọi là nhân chuẩn. Sinh vật đơn bào: còn gọi là sinh vật nguyên sinh. 3 Tiền nhân: còn gọi là nhân sơ. 2 Công nghệ tế bào 59 trư ng bên ngoài. Các phân tử lớn nhất được biết đã đi qua màng này là các đoạn DNA và các protein có trọng lượng phân tử thấp. Màng tế bào có thể được gấp lại và m rộng trong tế bào chất. Màng tế bào như là bề mặt mà trên đó các chất khác c a tế bào được gắn vào và giữ nhiều ch c năng quan trọng c a tế bào. Màng tế bào Lysosome Tế bào chất Màng nhân Hạch nhân Không bào Ty thể Nhân Nhiễm sắc thể Lưới nội sinh chất Ribosome Hình 5.2. Minh họa một tế bào đặc trưng c a sinh vật nhân thật. Các tế bào eukaryote ph c tạp hơn, chúng là cấu trúc đơn vị động vật, thực vật, protozoa, nấm và tảo. Tế bào eukaryote có các hệ thống màng đơn vị bên trong để tách biệt nhiều thành phần ch c năng c a tế bào như trình bày hình 5.2. Các tế bào eukaryote lớn hơn và ph c tạp hơn các tế bào prokaryote từ 1.000-10.000 lần. Nhân được bao bọc chung quanh b i một màng đôi có các lỗ nhỏ rộng từ 40-70 µm, bên trong nhân ch a các nhiễm sắc thể. Nhân điều hòa các tính chất di truyền và tất cả các hoạt động sống c a tế bào. Nhiễm sắc thể dài và là các thể sợi mảnh, ch a các gen sắp xếp trên một chuỗi mạch thẳng trong các nucleoprotein (protein cộng nucleic acid). Tế bào chất ch a một số lớn các hạt gọi là ribosome cần thiết trong các phản ng liên tục để t ng hợp các nguyên liệu tế bào. Ribosome được tập trung một cách đặc biệt dọc theo bề mặt xù xì c a lưới nội sinh chất, một mạng lưới không đều c a các kênh nối liền nhau được phân định với màng. Ty thể ch a các enzyme vận chuyển điện tử sử dụng oxygen trong quá trình sản sinh ra năng lượng. Không bào và lysosome là các cơ quan tử giúp cách ly các phản ng hóa học khác nhau trong tế bào. Công nghệ tế bào 60 II. Vi khuẩn 1. Hình dạng Vi khuẩn là những cơ thể sống đơn bào có kích thước hiển vi. Hiện nay, ngư i ta đã biết được khoảng 1.500 loài trong tất cả môi trư ng tự nhiên. Đư ng kính đặc trưng c a tế bào vi khuẩn trong khoảng 0,5-1 µm. Chiều dài c a vi khuẩn rất khác nhau. Vi khuẩn xuất hiện trong các dạng như sau: cocci (có dạng hình cầu hoặc hình tr ng), bacilli (có dạng hình trụ hoặc hình que), spirilla (có dạng cuộn xoắn ốc). 2. Kiểu sinh trưởng Vi khuẩn sinh sản ch yếu theo phương th c phân đôi (binary fission) như được minh họa trong hình 5.3. Quá trình này bao g m một số bước sau: kéo dài tế bào, lõm vào c a thành tế bào, phân phối nguyên liệu c a nhân, bắt đầu hình thành một vách ngăn ngang, phân phối nguyên liệu tế bào vào trong hai tế bào, và phân chia thành hai tế bào mới. Đây là quá trình sinh sản vô tính. 3. Các điều kiện vật lý ảnh hưởng đến sinh trưởng Ba nhân tố vật lý ch yếu ảnh hư ng đến sinh trư ng c a vi khuẩn là nhiệt độ, oxygen và độ pH. Do sự sinh trư ng và hoạt tính c a vi khuẩn biểu thị sự hoạt động c a enzyme, và do tốc độ c a các phản ng enzyme tăng lên cùng với việc tăng nhiệt độ, cho nên tốc độ sinh trư ng c a vi khuẩn sẽ phụ thuộc vào nhiệt độ. Tùy thuộc vào phạm vi nhiệt độ mà chúng sinh trư ng, vi khuẩn sẽ được gọi là psychrophiles4, mesophiles5 hoặc thermophiles6. Phạm vi nhiệt độ mà mỗi nhóm có khả năng sinh trư ng và nhiệt độ tối ưu được trình bày trong bảng 5.2. Các khí quan trọng ch yếu trong nuôi cấy vi khuẩn là oxygen và CO2. Có thể chia ra bốn loại vi khuẩn tùy theo sự phản ng c a chúng đối với oxygen như sau: - Vi khuẩn hiếu khí sinh trư ng trong sự có mặt c a oxygen tự do. - Vi khuẩn kỵ khí sinh trư ng trong điều kiện không có oxygen tự do. Psychrophiles: vi khuẩn ưa lạnh (dưới -20oC). 5 Mesophiles: vi khuẩn ưa nhiệt trung bình. 6 Thermophiles: vi khuẩn ưa nhiệt độ cao. 4 Công nghệ tế bào 61 - Vi khuẩn kỵ khí tùy ý sinh trư ng trong điều kiện có oxygen tự do hoặc không. - Vi khuẩn ưa ít oxygen sinh trư ng trong sự có mặt một lượng rất ít oxy tự do. Hình 5.3. Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi. Bảng 5.2. Phạm vi nhiệt độ thích hợp cho sinh trư ng c a các loại vi khuẩn khác nhau. Phạm vi nhiệt độ cho sinh trư ng Nhiệt độ tối ưu Psychrophiles -7 ~ 35oC 20 ~ 30oC Mesophiles 7 ~ 45oC 30 ~ 40oC Thermophiles 40 ~ 75oC 45 ~ 60oC Loại vi khuẩn Đối với hầu hết vi khuẩn, độ pH tối ưu cho sinh trư ng nằm trong khoảng 6,5-7,5. Mặc dù, một vài vi khuẩn có thể sinh trư ng phạm vi pH cực đoan, nhưng hầu hết các loài giới hạn cực đại và cực tiểu nằm trong khoảng giữa pH 4 và pH 9. III. Vi nấm Nấm nói chung là các thực vật không có chlorophyll và vì thế không thể tự t ng hợp các chất dinh dưỡng cho chúng. Chúng rất khác nhau về kích thước và hình dạng, từ nấm men đơn bào (single-cell yeast) đến nấm ăn đa bào (multicellular mushroom). Trong số chúng, nấm men và nấm mốc là những loại nấm công nghiệp quan trọng. Công nghệ tế bào 62 1. Nấm men Nấm men được phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng được tìm thấy trong trong quả, hạt và các loại thực phẩm có ch a đư ng khác. Chúng cũng có trong đất, trong không khí, trên da và trong ruột động vật. Do nấm men không có chlorophyll (diệp lục tố), cho nên chúng phụ thuộc vào thực vật bậc cao và động vật để có được năng lượng cho các hoạt động sống. Nấm men nói chung là các cơ thể đơn bào, có hình dạng từ hình cầu đến hình tr ng. Kích thước c a chúng rộng từ 1-5 µm và dài từ 5-30 µm. Thành tế bào tế bào non thư ng mỏng và tr nên dày tế bào già. Kiểu sinh trư ng ph biến nhất nấm men là nảy ch i (budding), đây là một quá trình sinh sản vô tính như minh hoạ hình 5.4. Một ch i nhỏ (hoặc tế bào con-daughter cell) được tạo thành trên bề mặt c a tế bào trư ng thành. Ch i sinh trư ng và được làm đầy các nguyên liệu nhân và tế bào chất từ tế bào bố mẹ. Khi ch i lớn bằng bố mẹ, thì bộ máy nhân cả hai tế bào được thay đ i và tế bào được phân cắt. Tế bào con có thể bám vào tế bào bố mẹ, thư ng là ngay sau khi tế bào phân chia. Nấm men quan trọng nhất là các ch ng c a Saccharomyces cerevisiae được dùng trong sản xuất rượu vang, bia và bột n bánh mì. Hình 5.4. Kiểu sinh trư ng đặc trưng c a nấm men bằng cách nảy ch i. 2. Nấm mốc Nấm mốc là loại nấm dạng sợi (Hình 5.5). Một tế bào sinh sản đơn hoặc bào tử (bào tử hạt đính-conidia) được nảy mầm để tạo thành một sợi dài gọi là sợi nấm (hyphae) phân cành lặp lại khi nó kéo dài một cấu trúc sinh dưỡng gọi là hệ sợi nấm (mycelium). Hệ này bao g m một khối tế bào chất đa nhân trong một hệ thống các ống phân cành nhiều và c ng. Do hệ Công nghệ tế bào 63 sợi nấm có khả năng sinh trư ng vô hạn, cho nên nó có thể đạt tới các kích thước vĩ mô. Sợi nấm Bào tử (bào tử đính) Hình 5.5. Kiểu sinh trư ng c a nấm sợi bằng cách phân cành. Các loại nấm mốc quan trọng nhất trong công nghiệp là Aspergillus và Penicillium. Mốc được sử dụng trong sản xuất kháng sinh, hóa chất công nghiệp, enzyme, và các thực phẩm b sung. IV. Môi trường nuôi cấy Sự sinh trư ng c a quần thể vi khuẩn trong môi trư ng dinh dưỡng nhân tạo được gọi là nuôi cấy (cultivation). Một kiểu nuôi cấy chỉ ch a một loại vi sinh vật được gọi là nuôi cấy thuần khiết (pure culture). Nuôi cấy hỗn hợp (mixed culture) là một loại nuôi cấy ch a nhiều hơn một loại vi sinh vật. Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật là như sau: - Chuẩn bị môi trư ng nuôi cấy cho phép vi sinh vật có thể sinh trư ng tốt nhất. - Khử trùng môi trư ng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống có trong bình nuôi cấy. - Cấy vi sinh vật vào trong môi trư ng đã chuẩn bị. Để nuôi cấy vi sinh vật, môi trư ng nuôi cấy phải được chuẩn bị trong những loại bình nuôi được sử dụng ph biến nhất, chẳng hạn ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri hoặc n i lên men. Có hai loại môi trư ng nuôi cấy chính: môi trư ng tự nhiên (dựa trên kinh nghiệm) và môi trư ng t ng hợp (thành phần hóa học xác định). Nói chung, các môi trư ng dinh dưỡng rất Công nghệ tế bào 64 khác nhau về hình thái (dạng rắn hoặc lỏng) và thành phần, tùy thuộc vào loại vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. 1. Môi trường tự nhiên Là những loại môi trư ng dựa trên cơ s c a kinh nghiệm, mà không dựa trên sự hiểu biết chính xác về thành phần các chất dinh dưỡng và tác động c a chúng. Môi trư ng tự nhiên thư ng ch a peptone, dịch chiết thịt bò, hoặc dịch chiết nấm men. Khi sử dụng môi trư ng rắn, có thể b sung các tác nhân làm rắn vào môi trư ng như gelatin hoặc agar. Ví dụ về môi trư ng rắn và môi trư ng lỏng dùng cho sinh trư ng c a nhiều loại vi sinh vật dị dưỡng là tương đối đơn giản, ph biến là canh dinh dưỡng (nutrient broth) và agar dinh dưỡng (nutrient agar). Thành phần c a chúng như sau: - Canh dinh dưỡng: 3 g nước chiết thịt bò, 5 g peptone, 5 g dịch chiết nấm men và nước b sung tới 1 L. - Agar dinh dưỡng: cùng thành phần như canh dinh dưỡng nhưng có thêm 15 g agar và nước b sung tới 1 L. 2. Môi trường tổng hợp Môi trư ng ch a các dung dịch pha loãng c a hóa chất tinh khiết, được biết là các hợp chất hữu cơ và/hoặc vô cơ. Chúng thư ng được sử dụng cho các mục đích nghiên c u hơn là để sản xuất. Môi trư ng có thể đơn giản như là muối ammonium vô cơ cộng với các muối khoáng và đư ng, hoặc ph c tạp như là casein tinh sạch được b sung thêm các vitamin, muối khoáng và đư ng. 3. Khử trùng Môi trư ng dinh dưỡng thích hợp được chọn để nuôi cấy một loại vi sinh vật đặc biệt sẽ được rót vào các bình nuôi cấy. Nếu sử dụng các ống nghiệm hoặc bình tam giác, thì chúng phải được úp bằng một nắp đậy thích hợp cho phép có sự trao đ i khí với khí quyển nhưng vẫn ngăn cản các cơ thể ngoại lai rơi vào môi trư ng. Các loại nắp khác nhau được dùng trong phòng thí nghiệm bao g m: nút bông, bọt plastic, nắp vặn, nắp kim loại và giấy nhôm. Môi trư ng sau đó phải được khử trùng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống trong bình ch a môi trư ng. Phương pháp khử trùng ph biến nhất là Công nghệ tế bào 65 khử trùng bằng hơi nước dưới áp suất cao trong n i khử trùng (autoclave). Nói chung, autoclave hoạt động áp suất 15 psi 121oC. Th i gian khử trùng tùy thuộc vào bản chất c a nguyên liệu, loại bình ch a và thể tích c a môi trư ng. Ví dụ, đối với ống nghiệm ch a môi trư ng lỏng có thể khử trùng từ 15-20 phút 121oC. 4. Nuôi cấy Nuôi cấy là sự tiếp mẫu (vi sinh vật) vào bình ch a môi trư ng dinh dưỡng vô trùng. Sự tiếp mẫu khi nuôi cấy trên môi trư ng rắn có agar được thực hiện bằng que cấy có vòng kim loại đầu (metal wire hoặc loop) được khử trùng nhanh trước khi sử dụng bằng cách đốt nóng trên đèn c n. Cấy chuyển trong nuôi cấy lỏng thư ng được thực hiện bằng Pasteur pipette. Sự tiếp mẫu thư ng được tiến hành trong t cấy vô trùng (laminar flow cabinet) để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn. Điều quan trọng là phải nắm vững các kỹ thuật hút pipette thích hợp cho việc tiếp mẫu và lấy mẫu trong quá trình nuôi cấy. V. Sản xuất kháng sinh 1. Sản xuất penicillin Sản xuất penicillin là một trong những ng dụng thương mại quan trọng đã thành công trong việc phát triển các quá trình nuôi cấy vi sinh vật quy mô phòng thí nghiệm thành quy mô sản xuất công nghiệp. Giữa năm 1941 và 1945, sản xuất penicillin c a Mỹ tăng từ chỗ hầu như không có gì đến 650 tỷ đơn vị7 trên một tháng, trong khi đó giá c a nó giảm từ 20 USD trên 100.000 đơn vị xuống còn 60 cent. Hiệu suất c a penicillin cũng đã được tăng lên hàng ngàn lần nh vào những yếu tố sau: - Cải thiện thành phần môi trư ng-nước chiết ngâm ngô được dùng làm chất kh i động sinh trư ng, dùng lactose thay cho glucose, và b sung phenylacetic acid. - Phát triển các kỹ thuật nuôi cấy chìm. - Tạo ra các ch ng đột biến c a Penicillium chrysognum bằng phương pháp chiếu xạ tia cực tím và tia X. 7 Một đơn vị (unit) tương đương 0,6 µg c a chuẩn quốc tế cho hoạt tính penicillin. Công nghệ tế bào 66 - Các phương pháp hiện đại c a các kỹ thuật phân tách và tinh sạch đầu ra (downstream processing)8. Ngày nay, hiệu suất c a penicillin thậm chí còn cao hơn nữa b i kỹ thuật chọn lọc các thể đột biến tốt hơn, cũng như cải thiện môi trư ng và các kỹ thuật lên men hợp lý hơn. 1.1. Các bước chính c a kỹ thuật sản xuất penicillin - Chuẩn bị và khử trùng môi trường. Môi trư ng đặc trưng ch a nước chiết ngâm ngô (4-5% trọng lượng khô), b sung ngu n nitrogen như là bột đậu nành, dịch chiết nấm men, chất lỏng giống nước sau khi sữa chua đông lại; ngu n carbon là lactose, và một số loại đệm khác. - Tiếp mẫu (cấy gây). Các bào tử đã đông khô sinh trư ng trên môi trư ng thạch nghiêng được cấy gây vào môi trư ng lỏng trong bình tam giác để nuôi cấy lắc, tiếp theo là nuôi cấy kết hạt th cấp và sơ cấp, và nuôi cấy trong hệ lên men quy mô lớn có thể tích tăng lên nhiều lần. Việc tăng dần thể tích c a nuôi cấy kết hạt được thực hiện để tạo ra một lượng mẫu đ lớn đưa vào nuôi cấy sao cho mỗi bước được rút ngắn hợp lý và thiết bị quy mô lớn được sử dụng hiệu quả. - Nuôi cấy. Hệ lên men có cánh khuấy được sử dụng trong kiểu lên men mẻ có cung cấp dinh dưỡng (fed-batch culture) là glucose và nitrogen trong suốt quá trình nuôi cấy. Kích thước đặc trưng c a bình nuôi khoảng từ 40.000-200.000 L. Oxygen được cung cấp bằng phương pháp phun không khí tốc độ 0,5-1,0 thể tích không khí/thể tích chất lỏng/phút. Công suất đưa vào để quay turbine và phun khí là khoảng 1-4 W/L. Độ pH được duy trì 6,5. Trong lên men penicillin đặc trưng hầu hết sinh khối tế bào cần thiết được thu trong suốt 40 gi đầu tiên. Penicillin bắt đầu được sản xuất pha sinh trư ng hàm mũ và tiếp tục được sản xuất cho tới khi nó đạt tới pha tĩnh. Sự sinh trư ng phải được tiếp tục một tốc độ tối thiểu nhất định để duy trì sản lượng penicillin cao. Đây là lý do tại sao glucose và nitrogen được cung cấp liên tục trong suốt quá trình lên men mặc dù chúng đã được b sung vào môi trư ng ngay từ đầu. Penicillin sau khi được tế bào sản xuất đã tiết vào môi trư ng nuôi cấy. 8 Downstream processing: là các bước c a quá trình sinh học tiếp theo sau sự lên men và/hoặc nuôi cấy tế bào, một chuỗi các hoạt động phân tách và tinh sạch cần thiết để thu được sản phẩm thuốc theo yêu cầu m c độ tinh sạch cần thiết. Công nghệ tế bào 67 - Quá trình downstream. Sau khi loại bỏ hệ sợi nấm mốc, penicillin được phân tách từ canh trư ng (môi trư ng nuôi cấy) bằng phương th c chiết dòng nước ngược hai giai đoạn liên tục với amyl hoặc butyl acetate. 2. Sản xuất streptomycin Streptomycin là một kháng sinh dùng ph biến trong y học, thú y và bảo vệ thực vật. Streptomycin được phát hiện vào năm 1944 từ dịch nuôi cấy một ch ng xạ khuẩn Streptomyces griseus (còn gọi là Actinomyces streptomycin). Giống xạ khuẩn sinh streptomycin khi nuôi cấy chìm phát triển thành hai pha: - Pha th nhất (pha sinh trư ng mạnh). Các bào tử nảy ch i và mọc thành sợi sau 6-8 gi , mỗi bào tử mọc một ch i, khuẩn ty thư ng thẳng và phân nhánh rất yếu, tế bào chất ưa kiềm. - Pha th hai (khuẩn ty không phát triển). Cuối ngày th ba sợi xạ khuẩn bị chia nhỏ và bắt đầu tự phân. Những giống sinh streptomycin thư ng không n định. Do đó, trong tương lai cần có sự can thiệp c a công nghệ DNA tái t hợp (xem chương 8) nhằm tạo ra những giống có hoạt lực cao và n định để đưa vào sản xuất. Giữ bào tử dạng đông khô trong khoảng năm năm có thể còn 96-99% hoạt lực, trong cát thạch anh tới ba năm, trên môi trư ng thạch nước đậu 5oC tới một năm. Các ngu n carbon mà giống Streptomyces có thể đ ng hóa được và sinh kháng sinh là glucose, tinh bột, dextrin, maltose, fructose, galactose, manose. Trong thực tế, glucose và tinh bột được dùng làm ngu n nguyên liệu trong sản xuất streptomycin. 2.1. Các phương pháp sản xuất streptomycin Lên men streptomycin được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm. Quá trình lên men này cũng giống như lên men các loại kháng sinh khác, bao g m các giai đoạn: nhân giống và lên men chính. - Nhân giống. Giống xạ khuẩn được bảo quản dạng bào tử. Cấy bào tử vào môi trư ng nhân giống trong bình tam giác, lắc 180-220 vòng/phút 26-28oC/30-70 gi , sau đó cho tiếp vào các n i nhân giống (có sục khí và khuấy), nuôi tiếp cho phát triển sinh khối 20-40 gi . Nhiệm vụ chính trong giai đoạn nhân giống là tạo ra một khối lượng lớn khuẩn ty xạ khuẩn ưa kiềm có khả năng phát triển mạnh trong giai đoạn lên men chính và tạo thành một lượng lớn kháng sinh. Công nghệ tế bào 68 - Lên men. Lên men streptomycin là quá trình lên men hai pha điển hình. Nhiệt độ lên men khoảng 26-28oC, th i gian lên men 96 gi . Trong th i gian lên men cần phải thông khí và khuấy trộn môi trư ng. Lượng không khí th i qua môi trư ng trung bình là 1 thể tích/1 thể tích môi trư ng. Khuấy môi trư ng liên tục trong suốt cả quá trình lên men (kể cả khi nhân giống) nếu ngừng khuấy chỉ trong một th i gian ngắn sẽ làm giảm hiệu suất streptomycin. Độ pH trong những gi đầu có giảm chút ít sau đó tăng dần. VI. Sản xuất thuốc bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 1. Insulin Ngày nay, việc sản xuất insulin quy mô công nghiệp có lẽ là một trong những thành công n i bật nhất, sớm nhất c a công nghệ sinh học hiện đại. Insulin là một protein được tuyến tụy tiết ra nhằm điều hòa lượng đư ng trong máu. Cơ thể thiếu hụt insulin trong máu sẽ làm rối loạn hầu hết các quá trình trao đ i chất cơ thể, dẫn đến tích tụ nhiều đư ng trong nước tiểu. Trong cơ thể, insulin được t ng hợp dưới dạng proinsulin g m ba chuỗi polypeptide: A, B và C. Khi proinsulin chuyển thành insulin, chuỗi C được loại bỏ, hai chuỗi A và B nối với nhau b i hai cầu disulfide (-S-S-). Để điều trị bệnh này ngư i ta thư ng tiêm insulin cho ngư i bệnh. Chế phẩm insulin này được tách chiết từ tuyến tụy c a gia súc. Tuy nhiên, để có được 100 gram insulin ngư i ta phải sử dụng tụy c a 4.000-5.000 con bò. Vì vậy, giá thành c a insulin trước đây là rất cao. Mặt khác, vì cấu tạo c a insulin bò hơi khác với insulin ngư i nên trong máu c a bệnh nhân được điều trị bằng insulin bò bao gi cũng xuất hiện kháng thể đối với insulin bò. Điều này gây ra một số hậu quả không mong muốn làm giảm một phần hoạt tính c a insulin cũng như giảm th i gian tác động c a thuốc. Boger (1978) lần đầu tiên sử dụng công nghệ DNA tái t hợp thông qua vi khuẩn E. coli đã thu nhận được một lượng lớn insulin. Cụ thể, ngư i ta đã chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin c a ngư i sang cho E. coli. Vi khuẩn E. coli tái t hợp gen được nuôi cấy trong n i lên men có dung tích 1.000 L, sau một th i gian ngắn có thể thu được 200 g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 con bò. Thành công này đã cho thấy gen c a ngư i có thể làm việc một cách hiệu quả trong genome c a vi sinh vật. Hai sản phẩm thương mại c a insulin (được sản xuất từ nấm men S. cerevisiae tái t hợp) hiện đang được sử dụng là: Actrapid và Novolog (NovoNordisk). Công nghệ tế bào 69 2. Interferon Interferon có bản chất protein, là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh do interferon có ph tác dụng kháng virus rộng. Thông thư ng để thu nhận interferon, ngư i ta phải tách chiết chúng từ huyết thanh c a máu nên rất tốn kém. Bằng phương pháp công nghệ DNA tái t hợp tương tự như insulin, hiện nay ngư i ta có thể thu nhận một lượng lớn interferon thông qua các cơ thể vi sinh vật đã được tái t hợp gen để phục vụ cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng như viêm gan B, viêm gan C, một số bệnh ung thư do virus... Gilbert (1980) đã đoạt giải thư ng Nobel nh thành công trong việc thu nhận interferon từ E. coli đã được tái t hợp gen mã hóa interferon. Đến năm 1981, Đại học Washington (Mỹ) đã thành công trong việc thu nhận interferon từ nấm men S. cerevisiae có hiệu suất cao gấp 10.000 lần so với tế bào E. coli tái t hợp. 3. Hormone 3.1. Hormone sinh trư ng ngư i (human growth hormone-HGH) Thông thư ng, HGH c a động vật có vú được sản xuất từ tuyến yên c a các động vật non và trong suốt th i gian trước khi chúng trư ng thành. HGH có tác dụng tăng tốc độ sinh trư ng và kích thích cơ thể tăng khối lượng cơ. ngư i sau 30 tu i, sản xuất hormone sinh trư ng sẽ dừng lại, nếu tiêm HGH sau độ tu i này sẽ gây ra sự phát triển cơ bắp và lượng mỡ giảm xuống. Hormone sinh trư ng ngư i là protein ch a khoảng 191 amino acid, thiếu nó cơ thể ngư i sẽ bị lùn. Trước đây hormone phát triển được tách từ tuyến yên c a ngư i chết. Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH và muốn chữa khỏi cho một ngư i lùn phải cần lượng HGH thu được từ 100-150 tử thi. Điều này cho thấy một tr ngại rất lớn khi chữa trị ch ng lùn cho trẻ em. Hiện nay, HGH đã được sản xuất bằng công nghệ DNA tái t hợp thông qua E. coli với một hiệu suất rất lớn (1 L dịch lên men c a E. coli thu được HGH tương đương với lượng chất này thu được từ 60 tử thi). Đây là một trong những protein được sản xuất bằng công nghệ sinh học hiện đại sớm nhất. HGH tái t hợp khác với HGH bình thư ng b i một amino acid, do E. coli không có khả năng loại bỏ gốc methionine kh i đầu mà nó thư ng bị loại sau khi dịch mã trong tế bào ngư i. Công nghệ tế bào 70 Insulin và hormone sinh trư ng ngư i là các protein tương đối đơn giản vì không bị glycosyl hóa và biến đ i nhiều hậu dịch mã, nên có thể dùng E. coli (prokaryote) làm tế bào vật ch để sản xuất chúng. Đối với những protein đòi hỏi quá trình glycosyl và biến đ i hậu dịch mã thì không thể sử dụng tế bào prokaryote làm tế bào vật ch trong công nghệ DNA tái t hợp mà phải sử dụng các tế bào eukaryote như: nấm men, nấm mốc, thực vật hoặc động vật. 3.2. Somatostatin Đây là loại hormone đặc biệt, thư ng được t ng hợp trong não động vật và ngư i với một hàm lượng vô cùng thấp. Somatostatin có vai trò điều hòa hormone sinh trư ng và insulin đi vào máu, kiểm tra sự t ng hợp hai loại hormone này. Quy trình sản xuất loại sản phẩm sinh học đặc biệt quý này cũng bao g m các bước ch yếu sau đây: + Phân lập gen mã hóa somatostatin hoặc t ng hợp trong ống nghiệm. + Tạo dòng gen somatostain bằng cách gắn gen này vào vector plasmid để chuyển gen vào E. coli. Mỗi mẻ nuôi cấy 7,5 L vi khuẩn E. coli này sẽ cho ra 5 mg somatostatin nguyên chất. Trước đây, muốn có khối lượng hormone này phải tiến hành cả năm trên nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu. 4. Vaccine Trong sản xuất vaccine, cho đến th i gian gần đây, ngư i ta vẫn sử dụng vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể ngư i và vật nuôi. Những vaccine được sản xuất theo cách này có một vài hạn chế, chẳng hạn vaccine sống nhược độc có khả năng quay tr lại dạng độc hoặc hoạt lực c a nó giảm khá nhanh trong cơ thể ngư i và vật nuôi. Đến nay, nh công nghệ DNA tái t hợp ngư i ta đã sản xuất được protein vỏ c a một số loại virus như virus bệnh dại và viêm gan B. Sản xuất vaccine kỹ thuật gen là một lĩnh vực phát triển mạnh hiện nay c a công nghệ DNA tái t hợp. Đây là loại vaccine được bào chế từ vi khuẩn đã được chuyển gen mã hóa t ng hợp một protein kháng nguyên c a một loại virus hay một loại vi khuẩn gây bệnh nào đó. Hiện nay, các loại vaccine kỹ thuật gen được sử dụng cho ngư i bao g m vaccine viêm gan B, vaccine dại kiểu mới, vaccine tả kiểu mới, vaccine sốt rét và vaccine bệnh phong. Công nghệ tế bào 71 Virus viêm gan B có vỏ ngoài lypoprotein. Kháng nguyên bề mặt là protein ch yếu c a vỏ ngoài, được phát hiện trong máu ngư i bị nhiễm. Ngư i ta biến nạp gen t ng hợp kháng nguyên c a virus viêm gan B vào vi khuẩn E. coli sau đó sản xuất sinh khối quy mô lớn các vi khuẩn E. coli mang gen tái t hợp này, biến E. coli thành nhà máy sản xuất kháng nguyên để làm vaccine. Một số sản phẩm thương mại c a kháng nguyên bề mặt viêm gan B (được sản xuất từ nấm men S. cerevisiae tái t hợp) hiện đang được sử dụng là: Ambirix (GlaxoSmithKline), Comvax (Merck), HBVAXPRO (Aventis Pharma), Hexavac (Aventis Pasteur), Infanrix-Penta (GlaxoSmithKline), Pediarix (GlaxoSmithKline), Procomvax (Aventis Pasteur), Twinrix (GlaxoSmithKline). 5. Một số loại thuốc khác Hiện nay có gần 140 loại protein trị liệu đã được cho phép sử dụng Mỹ và châu Âu. Các protein trị liệu có thể được chia làm hai loại: 1) các protein không bị biến đ i hậu dịch mã, và 2) các protein cần quá trình hậu dịch mã (hầu hết là kiểu N-glycosylation9) để có ch c năng sinh học đầy đ . Các protein không có quá trình glycosyl hóa (glycosylation)10, hậu dịch mã, biểu hiện đặc hiệu hoặc trong vi khuẩn E. coli hoặc trong nấm men và hiện nay chúng chiếm khoảng 40% thị trư ng protein trị liệu. Tuy nhiên, một số trong chúng đã biểu hiện cả hai hệ thống, chẳng hạn như insulin tái t hợp được sản xuất cả trong E. coli (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA) lẫn trong nấm men (Novolog, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Đan Mạch). Sản xuất các protein tái t hợp thư ng đòi hỏi quá trình Nglycosylation trạng thái tự nhiên c a chúng, trong hầu hết trư ng hợp chúng cần các vật ch biểu hiện là động vật có vú (hệ thống có khả năng bắt chước glycosylation c a ngư i). Các vật ch prokaryote như E. coli không glycosyl hóa protein được, và các hệ thống biểu hiện thuộc eukaryote bậc thấp như nấm men hoặc các tế bào côn trùng thư ng ít n định để thực hiện 9 N-glycosylation: các oligosaccharide liên kết cộng hóa trị với protein nguyên tử nitrogen. 10 Glycosyl hóa: là quá trình b sung một hoặc nhiều phân tử carbohydrate (gốc đư ng) vào một phân tử protein (glycoprotein) sau khi nó được t ng hợp nh ribosome. Công nghệ tế bào 72 glycosylation c a động vật có vú. Tuy nhiên, việc nuôi cấy các tế bào động vật có vú gặp nhiều khó khăn như: môi trư ng dinh dưỡng đắt tiền, th i gian nuôi cấy dài ngày, tế bào rất mẫn cảm với các lực trượt c a hệ lên men... (xem chương 6). Do đó, các yêu cầu sinh trư ng cho vật ch biểu hiện các chế phẩm sinh-dược không được cải thiện đã buộc các công ty phải quay lại với các hệ thống biểu hiện c a nấm men và nấm sợi (eukaryote) do chúng có khả năng cung cấp hiệu suất protein cao (> 1 g/L) trong các quá trình lên men ngắn ngày, để có thể tăng quy mô sản xuất (lên tới 100 m3). Tất cả các protein trị liệu dựa trên cơ s nấm men hiện nay được sản xuất trong loài nấm men S. cerevisiae (Bảng 5.3), nhưng các loài nấm men khác cũng đã được phát triển để sản xuất protein trị liệu. Nấm men Pichia pastoris trước đây được công ty Philips Petroleum (Bartlesville, OK, USA) sử dụng như là một hệ thống sản xuất protein đơn bào, nhưng sau đó đã được biến đ i di truyền để biểu hiện các protein ngoại lai. Hơn 120 protein tái t hợp đã được biểu hiện trong loại vật ch này, khá nhiều trong số đó có ngu n gốc từ ngư i và động vật có vú. Gần đây hơn, nấm men P. pastoris cũng được dùng để biểu hiện các protein trị liệu (đang được thử nghiệm lâm sàng) (Bảng 5.3). Công ty Genencor (Palo Alto, CA USA) trước đây đã sử dụng các nấm sợi Aspergillus niger và Trichoderma reesei cho sản xuất quy mô lớn các enzyme công nghiệp tái t hợp. Nhưng gần đây họ cũng đã cố gắng biểu hiện các protein trị liệu (ví dụ: các IgG hoàn chỉnh) A. niger. Kháng thể này được sản xuất với hàm lượng < 1 g/L, được lắp ráp chính xác và liên kết với kháng nguyên. Thành công tương tự với biểu hiện kháng thể nguyên vẹn cũng đã thu được P. pastoris, tuy nhiên hàm lượng khá thấp < 40 mg/L. Ngư i ta cũng đã ch ng minh kháng thể được sản xuất trong A. niger có tập tính dược động học (pharmacokinetic behavior) và hoạt tính ADCC11 tương tự với các kháng thể có ngu n gốc từ các tế bào động vật có vú. Công ty Berna Biotechnology (Bern, Switzerland) cũng đã phát triển phương pháp biểu hiện protein thích hợp dựa trên cơ s nấm men methylotrophic Hansenula polymorpha, đây là loài đang được nghiên c u để sản xuất các vaccine tái t hợp. ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity): Khả năng gây độc tế bào qua trung gian tế bào phụ thuộc vào kháng thể. 11 Công nghệ tế bào 73 Bảng 5.3. Một số protein trị liệu khác được sản xuất bằng công nghệ DNA tái t hợp Tên thương mại Elitex Glucagen Leukine Refuldan Regranex rh Revasc Protein Angiostatin Elastase inhibitor Endostatin Epidermal growth factor analog Insulin-like growth factor-1 Human serum albumin Kallikrein inhibitor A. Các sản phẩm thương mại Protein tái t hợp Công ty Urate oxidase Sanofi-Synthelabo Glucagon Novo Nordisk 12 Berlex GM-CSF Hirudin/lepirudin13 Hoechst Yếu tố sinh trư ng có Ortho-McNeil ngu n gốc tiểu huyết Phama (US), cầu Janssen-Cilag(EU) Hirudin/desirudin14 Aventis B. Các sản phẩm chưa hoàn chỉnh Chỉ định Công ty Yếu tố chống hình thành u mạch Bệnh xơ nang Yếu tố chống hình thành u mạch Bệnh tiểu đư ng Thiếu hụt yếu tố 1 sinh trư ng giống insulin n định thể tích máu trong các vết bỏng/sốc U mạch di truyền Hệ thống biểu hiện S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae EntreMed Hệ thống biểu hiện P. pastoris Dyax P. pastoris EntreMed P. pastoris Transition Therapeutis P. pastoris Cephalon P. pastoris Mitsubishi Pharma (formely Welfide) P. pastoris Dyax P. pastoris VII. Sản xuất enzyme ng dụng thương mại chính c a các enzyme vi sinh vật là trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia mặc dù enzyme đã được thừa nhận trong 12 GM-CSF (granolocyte-macrophage colony stimulating factor): yếu tố kích thích quần lạc đại thực bào c a tế bào bạch cầu hạt. 13 Chất chống đông máu. 14 Chất chống đông máu. Công nghệ tế bào 74 các ng dụng chẩn đoán và điều trị bệnh. Hầu hết các loại enzyme được t ng hợp trong pha log c a nuôi cấy mẻ và được xem như các chất trao đ i sơ cấp. Tuy nhiên, trong một số trư ng hợp amylase (Bacillus stearothermophillus) được sản xuất b i nuôi cấy idiophase vì thế có thể xem là tương đương với các chất trao đ i th cấp. Các enzyme có thể được sản xuất từ động-thực vật cũng như các ngu n vi sinh vật, nhưng sản xuất bằng lên men vi sinh vật là phương pháp kinh tế và thích hợp nhất. Hơn nữa, hiện nay nh công nghệ DNA tái t hợp ngư i ta có thể chuyển gen vào các tế bào vi sinh vật để sản xuất các enzyme c a động-thực vật. Các tiến bộ c a công nghệ DNA tái t hợp đã m rộng phạm vi các sản phẩm lên men tiềm tàng c a vi sinh vật. Có khả năng đưa các gen từ các cơ thể bậc cao vào các tế bào vi sinh vật như là các tế bào nhận để t ng hợp các protein (bao g m enzyme) ngoại lai. Các tế bào vật ch dùng trong những trư ng hợp này là E. coli, S. cerevisiae và một số loại nấm men khác. Trong quá trình sinh trư ng c a vi sinh vật, enzyme được hình thành trong tế bào và một số được tiết ra môi trư ng xung quanh. Trong sản xuất ch yếu là sản phẩm c a enzyme ngoại bào, còn nếu muốn tách enzyme nội bào thì phải phá vỡ tế bào. Các vi sinh vật được dùng trong sản xuất enzyme g m có vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và xạ khuẩn. Các chế phẩm enzyme được sản xuất từ vi sinh vật đã được ng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, ch yếu là các enzyme th y phân dùng trong công nghiệp thực phẩm như: - Amylase dùng trong sản xuất đư ng mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, chế biến dextrin với dịch đư ng để sản xuất th c ăn cho ngư i già và trẻ em, trong sản xuất nước quả và trong y học. - Protease th y phân protein c a sữa để chế biến những món ăn kiêng đặc biệt, được dùng trong thuộc da, sản xuất bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ và trong y học. Protease vi sinh vật có thể sử dụng cùng với amylase trong chế biến th c ăn gia súc. - Pectinase là nhóm enzyme th y phân pectin tạo thành galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, methanol… - Cytolase là hệ enzyme có hoạt tính cao có thể phân h y hemicellulose, pentozan, lignin… Các enzyme này được gọi chung là cytolase (bao g m cellulase, hemicelllulase, pentosinase). - Invertase là enzyme nội bào được dùng rộng rãi trong sản xuất bánh kẹo, rượu mùi, kem, mật ong nhân tạo. Nó làm tăng vị ngọt khi th y phân Công nghệ tế bào 75 đư ng saccharose thành fructose và glucose, làm tăng độ hòa tan c a saccharose trong sản phẩm. Trong một tương lai gần, enzyme sẽ được sử dụng rộng rãi trong y học để làm đầu dò (probe) cho các thiết bị phân tích y khoa và để chữa bệnh. Hiện nay, một số enzyme như: glucooxydase, hexokinase, esterase, urease, cholesteroloxydase, alcoholdehydrogenase… đã được sử dụng khá ph biến trong y học. Điển hình nhất là sử dụng glucooxydase cố định trên bề mặt điện cực platinum trong thiết bị phân tích hàm lượng glucose máu. Trong y học, enzyme còn được sử dụng để chữa trị một số bệnh liên quan đến sự thiếu hụt c a một số enzyme trong cơ thể ngư i, hoặc dùng enzyme để loại bỏ những cục thịt, mỡ dư thừa gây nguy hiểm cho một số bộ phận c a cơ thể ngư i. Chẳng hạn: dùng enzyme streptokinase và urokinase để làm tan máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Trần Thị Thanh. 2003. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng. 1999. Những kiến th c cơ bản về công nghệ sinh học. NXB Giáo dục, TP H Chí Minh. 3. Babey F and Mujacic. 2004. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotech. 22: 1399-1408. 4. Cutler SJ and Cutler HG. 2000. Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals. CRC Press LLC, USA. 5. Gerngross TU. 2004. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature Biotech. 22: 1409-1414. 6. Klefenz H. 2002. Industrial Pharmaceutical Biotechnology. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany. 7. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 8. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA. nd Công nghệ tế bào 76 Chương 6 Nuôi cấy tế bào động vật I. Mở đầu Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trư ng dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trư ng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các hormone sinh trư ng của ngư i, interferon, hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các kháng thể đơn dòng. Theo phương pháp truyền thống các hợp chất hóa sinh này được sản xuất bằng cách sử dụng các động vật sống hoặc được tách chiết từ xác ngư i chết. Chẳng hạn, các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trong các khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinh trư ng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xác ngư i chết. Tuy nhiên, số lượng thu được từ các phương pháp này rất hạn chế vì thế việc ứng dụng rộng rãi chúng trong điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Một vài sản phẩm gen của động vật có vú cũng có thể được sản xuất b i hệ thống vi khuẩn bằng cách dùng công nghệ DNA tái tổ hợp. Tốc độ sinh trư ng nhanh, thành phần môi trư ng đơn giản và rẻ tiền của nuôi cấy tế bào vi khuẩn khiến chúng có nhiều ưu điểm hơn so với nuôi cấy tế bào động vật có vú. Tuy nhiên, vi khuẩn lại thiếu khả năng sửa đổi hậu dịch mã (post-translational modifications) bao gồm việc phân giải protein, liên kết các tiểu đơn vị (subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phosphoryl hóa (phosphorylation) các gốc amino acid. Những Công nghệ tế bào 77 sửa đổi này rất quan trọng ảnh hư ng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm. Ví dụ, quá trình glycosyl hóa (glycosylation) có thể giúp bảo vệ protein chống lại sự phân giải chúng, duy trì khả năng ổn định cấu trúc và biến đổi kháng nguyên. Vì thế, nhiều công ty đã phải quay lại với hệ thống vật chủ biểu hiện các protein ngoại lai là các tế bào động vật có vú. Hiện nay, khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm dược phẩm được sản xuất từ các hệ thống tế bào vật chủ này. 1. Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật - Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán (Bảng 6.1). - Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical). - Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thư ng vào trong tế bào soma mang gen tương ứng bị khiếm khuyết để chữa bệnh do sự khiếm khuyết đó gây ra). Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang. - Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất học và dược học. - Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn: + Da nhân tạo để chửa bỏng. + Mô gan để chữa bệnh viêm gan. + Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đư ng. 2. Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thư ng gặp các khó khăn sau: - Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật. Công nghệ tế bào 78 Bảng 6.1. Các sản phẩm của nuôi cấy tế bào động vật. Nhóm I Nhóm II Enzyme Urokinase, hoạt tố plasminogen mô (t-PA)1T Hormone Hormone sinh trư ng (GH)2 Các nhân tố sinh trư ng Các cytokine khác Vaccine3 Bệnh dại, bệnh quai bị, bệnh s i ngư i… Veterinary-FMD Cattle’s Disease ... vaccine, Nhóm III Kháng thể đơn dòng Các công cụ chẩn đoán Nhóm IV Virus côn trùng Thuốc trừ Baculovirus Nhóm V Các chất điều hòa miễn Interferon và interleukin dịch Nhóm VI Các tế bào nguyên vẹn sâu sinh học New cho Thử nghiệm độc chất học - Tốc độ sinh trư ng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một th i gian dài thư ng gặp nhiều khó khăn hơn. - Các tế bào động vật được bao bọc b i màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thư ng thấy vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ. 1 Tissue plasminogen activator (tPA): một protein chuyên hóa trong tế bào của động vật có vú có tính năng kích thích plasminogen là tiền chất của mô dạng không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động dùng để điều trị các cơn đau tim. 2 Growth hormone (GH): (a) chuỗi polypeptide hormone do miền trước của tuyến yên tiết ra điều chỉnh tăng kích thước cơ thể. (b) bất kỳ chất nội tiết nào tham gia điều chỉnh sinh trư ng trong các cơ thể động vật hay thực vật. 3 Vaccine: kháng nguyên đã làm mất khả năng gây bệnh nhưng còn giữ khả năng sinh kháng thể để tiêm chủng gây miễn dịch phòng bệnh. Vaccine có thể gồm một độc tố không hoạt động hoặc một chất không độc bằng cách sử dụng các vi khuẩn hoặc virus đã chết hoặc giảm độc. Có nhiều cách tiêm chủng: dưới da, xuyên da, tiêm bắp, gây sẹo hoặc uống qua đư ng miệng. Công nghệ tế bào 79 - Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trư ng nuôi cấy thư ng đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền. - Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn bào riêng biệt như vi sinh vật. - Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trư ng khi được gắn trên một bề mặt. II. Tế bào động vật Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau b i các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thư ng được phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biểu mô tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài. mô liên kết, các tế bào thư ng được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài), đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. Các tế bào mô cơ thư ng thon dài và được gắn với nhau thành một phiến hoặc một bó b i mô liên kết. Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động động vật bậc cao. Các tế bào mô thần kinh gồm có thân bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần m rộng dài và mảnh được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng và truyền xung động rất nhanh. 1. Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hình dạng thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trư ng trong nuôi cấy in vitro. Các tế bào không dính bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trư ng. Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) (Hình 6.1a) bắt nguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đư ng kính từ 10-20 µm. Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trư ng dịch lỏng theo phương thức tương tự vi khuẩn. 2. Các tế bào dính bám Hầu hết các tế bào động vật bình thư ng là các tế bào dính bám, vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trư ng. Trong các ứng dụng, ngư i Công nghệ tế bào 80 ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast) (Hình 6.1b và c). Các tế bào dính bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trư ng như là thủy tinh hoặc plastic. Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụng rộng rãi nhất. Các chai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ ấm. Chai có dung tích 1 L chứa khoảng 100 mL môi trư ng là thích hợp cho các tế bào vừa sinh trư ng trên thành chai vừa tiếp xúc với môi trư ng và không khí. Tuy nhiên, chai trục lăn chỉ dùng cho quy mô phòng thí nghiệm vì diện tích bề mặt trên một đơn vị thể tích của chai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm2/L). Hình 6.1. Các tế bào động vật thư ng được sử dụng trong nuôi cấy. (a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trư ng trên các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, bao vi thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kích thước hiển vi gọi là microcarrier. III. Môi trường nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật có vú lớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trư ng. Môi trư ng đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trư ng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trư ng cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương của động vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy. Bảng 6.2 trình Công nghệ tế bào 81 bày thành phần và hàm lượng của các chất trong môi trư ng Eagle (Eagle 1959), đây là một trong những môi trư ng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào động vật. Bảng 6.2. Thành phần môi trư ng Eagle (1959). Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) 3. Vitamin 1. L-Amino acid Arginine 105 Choline 1 Cystine 24 Folic acid 1 Glutamine 292 Inositiol 2 Histidine 31 Nicotinamide 1 Isoleucine 52 Pantothenate 1 Leucine 52 Pyridoxal 1 Lysine 58 Riboflavin 0,1 Methionine 15 Thiamine 1 Phenylalanine 32 Threonine 48 4. Muối Tryptophan 10 NaCl 6800 Tyrosine 36 KCl 400 Valine 46 CaCl2 200 MgCl2.6H2O 200 NaH2PO4. 2H2O 150 NaHCO3 2000 2. Carbohydrate Glucose Serum 1000 5-10% Huyết thanh dùng trong môi trư ng nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma. Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trư ng hợp có thể ảnh hư ng xấu đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và Công nghệ tế bào 82 tinh sạch đầu ra. Vì lý do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trư ng không có huyết thanh. Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố sinh trư ng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh. Trước đây, huyết thanh của thai bò (fetal bovine serum-FBS), được bổ sung nồng độ 1-20%, là rất cần thiết cho sự sinh sản của các tế bào động vật có vú. Nhưng ngày nay, nhiều quá trình nuôi cấy tế bào quy mô lớn đã bắt đầu thực hiện trong môi trư ng không có huyết thanh. IV. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ s nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau. Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trư ng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trư ng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trư ng để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác. Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone. Môi trư ng chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen. Công nghệ tế bào 83 Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng. Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trư ng trong dịch huyền phù. Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier. Các dòng tế bào động vật có vú thư ng được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của ngư i. 1. Hệ thống sản xuất Phát triển một quá trình sản xuất công nghiệp cho protein tái tổ hợp của tế bào động vật có vú thư ng dựa theo hệ thống được trình bày hình 6.2. Đầu tiên, gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiên mã (promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào. Đồng th i, gen thứ hai (gen chọn lọc-selector, hay còn gọi là gen chỉ thị chọn lọcselectable marker) cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào được biến nạp và không biến nạp. Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trên môi trư ng nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lập các tế bào tái tổ hợp sống sót. Các gen chỉ thị chọn lọc được dùng phổ biến nhất là dihydrofolate reductase (DHFR), một enzyme tham gia trong quá trình chuyển hóa nucleotide, và glutamine synthetase (GS). Trong cả hai trư ng hợp, sự chọn lọc xảy ra khi thiếu chất chuyển hóa thích hợp trong môi trư ng (hypoxantine và thymidine, trong trư ng hợp của DHFR hoặc glutamine trong trư ng hợp GS), do đó đã ngăn cản sự sinh trư ng của các tế bào không biến nạp. Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót (xem như là các tế bào đơn) được chuyển vào bình nuôi cấy thứ hai, và quá trình nuôi cấy được phát triển để sản xuất các quần thể vô tính (clonal populations). Cuối cùng, các dòng riêng biệt được đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp để chọn ra dòng có khả năng sản xuất cao nhất. Từ những dòng này, một dòng tế bào có tốc độ sinh trư ng thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp. Quá trình nuôi cấy sau đó sẽ được thiết lập và tối ưu hóa cho sản xuất. Chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc. Mouse myeloma: tế bào u tủy của chuột. 6 Baby hamster kidney: tế bào thận của chuột đồng sơ sinh. 7 Human embryo kidney: tế bào thận của phôi ngư i. 4 5 Công nghệ tế bào 84 Công nghệ tế bào Sàng lọc Phát triển quá trình Chuyển gen Tạo thành mạch thẳng Chuyển nhiễm Chọn lọc Các dòng tế bào vô tính Tối thiểu 12 tháng 85 Hình 6.2. Sinh sản và phát triển dòng tế bào cho các quá trình nuôi cấy để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn (protein o.i.). Các đư ng gợn sóng chỉ ra số lần cấy chuyển của các dòng tế bào riêng biệt để sàng lọc tế bào đưa vào sản xuất. Các lọ nhỏ là ngân hàng tế bào được đông lạnh trong nitrogen lỏng. Các bình nuôi xoay (spinner flask) mô tả các hệ thống nuôi cấy quy mô nhỏ để tối ưu hóa quy trình, và các hệ lên men mô tả các quá trình sản xuất quy mô lớn. 2. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng và tế bào vật chủ Hiện nay, môi trư ng thương mại dùng cho nuôi cấy tế bào có chất lượng cao đã được một số nhà cung cấp hàng đầu sản xuất. Tuy nhiên, việc sản xuất protein tái tổ hợp cũng cần phải được tối ưu hóa bằng cách khảo sát trên nhiều công thức môi trư ng dinh dưỡng. Thông thư ng, một quá trình sản xuất riêng biệt đòi hỏi một vài công thức môi trư ng khác nhau, trong đó mỗi công thức được thiết kế cho một phase đặc trưng của sự sinh trư ng. Các môi trư ng cho tốc độ sinh trư ng nhanh đòi hỏi cấy chuyển 3-5 ngày/lần. Quá trình sản xuất mẻ (6-8 ngày) hoặc mẻ m rộng (10-21 ngày) dài hơn nhiều so với th i gian cấy chuyển đặc trưng. Phát triển môi trư ng thích hợp là vô cùng quan trọng và phải được thiết kế trên một cơ s riêng biệt, đối với mỗi quá trình và mỗi dòng tế bào. Tương tự môi trư ng, các tế bào vật chủ cũng phải được cải thiện để chống lại các ảnh hư ng của điều kiện nuôi cấy làm giảm khả năng sống sót và/hoặc tiến hành các bước chuyển gen để kích thích sinh trư ng. Kết quả nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm cho thấy, các tế bào vật chủ có thể được cải thiện sinh trư ng, khả năng sống sót và sản lượng nh công nghệ DNA tái tổ hợp. Các proto-oncogene8, các gen điều chỉnh chu kỳ tế bào (cyclins), các gen yếu tố sinh trư ng (ví dụ yếu tố sinh trư ng giống insulin) và các gen antiapoptosis đã được đưa vào trong tế bào để tạo ra các vật chủ siêu sản xuất (superior production hosts). Cải thiện sự biến đổi và sản xuất protein hậu dịch mã là một phát triển đầy hứa hẹn khác. Chẳng hạn, ngư i ta thấy hiệu lực của các kháng thể có thể được cải thiện bằng cách tăng cư ng hiệu lực của cơ quan phản ứng miễn dịch tự nhiên của chúng. Sự biểu hiện dư thừa (over expression) được ổn định của N-acetylglucosaminyl-transferase-III, một enzyme không được biểu hiện tự nhiên trong các tế bào CHO và NS0, trong các tế bào sản xuất kháng thể tái tổ hợp đã kích thích tạo các IgG nồng độ cao và các oligosaccharide không fucosyl hóa (fucosylation) trong vùng Fc. Những biến đổi của dạng glyco (glycoform) đã làm tăng từ 5-10 lần các độc tố tế bào phụ thuộc kháng thể. 8 Proto-oncogene: gen tiền ung thư. Công nghệ tế bào 86 V. Các kháng thể đơn dòng Các tế bào bạch huyết (lymphocytes) là các tế bào máu trắng cần cho các phản ứng miễn dịch. Các B-lymphocyte, loại sản xuất kháng thể, hiện diện trong lá lách, các u bạch huyết (lympho nodes) và máu. Khi một chất ngoại lai đi vào trong cơ thể của động vật có xương sống, thì các tuyến Blymphocyte sản xuất nhanh và tiết ra các phân tử protein gọi là immunoglobulin hay còn gọi là kháng thể (antibody). Các kháng thể có các vị trí kết hợp có thể nhận ra hình dạng của yếu tố quyết định đặc hiệu trên bề mặt của chất ngoại lai, còn gọi là kháng nguyên (antigent). Kết quả là các kháng thể có thể liên kết với kháng nguyên đặc hiệu, trung hòa và đào thải các chất ngoại lai. Do tính đặc hiệu của chúng trong việc nhận dạng các tế bào hoặc phân tử đặc biệt nên kháng thể đã là những công cụ rất quan trọng để các nghiên cứu viên và thầy thuốc lâm sàng phát hiện sự hiện diện và nồng độ của thuốc, các sản phẩm của virus và vi khuẩn, hormone và các kháng thể khác trong máu. Có 5 loại kháng thể là immunoglobulin G, A, M, D và E. Hình 6.3. minh họa cấu trúc của một loại kháng thể immunoglobulin G (IgG), có cấu trúc protein dạng hình chữ Y bao gồm một cặp chuỗi nặng (heavy chain)9 và một cặp chuỗi nhẹ (light chain)10 được liên kết b i các cầu nối disulfide. Mỗi chuỗi có 2 vùng: (1) vùng có thể thay đổi được, vùng này khác nhau tùy thuộc vào mỗi loại kháng thể và chúng chứa các vị trí liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau, (2) vùng không thể thay đổi được, đặc trưng cho các kháng thể của một phân lớp nhất định. Bản chất của liên kết kháng thể-kháng nguyên tương tự với bản chất của phức hợp cơ chấtenzyme. Có nhiều dòng khác nhau của B-lymphocyte và mỗi dòng sản xuất ra các kháng thể khác nhau nhận ra các yếu tố quyết định kháng nguyên đặc hiệu. Vì thế, khi một động vật được tiêm một tác nhân miễn dịch, thì nó phản ứng bằng cách sản xuất ra một hỗn hợp kháng thể đa dạng hầu như không thể phân chia được. Để sản xuất một lượng lớn kháng thể đồng nhất (kháng thể đơn dòng) chỉ nhận ra một cấu trúc hóa học, chúng ta phải cho sinh trư ng được một dòng tế bào đặc biệt của B-lymphocyte. Tuy nhiên, 9 Heavy chain: mạch polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 55 kDa. Light chain: mạch polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 23 kDa. 10 Công nghệ tế bào 87 ngư i ta nhận thấy là các tế bào tiết (tạo) ra kháng thể không thể duy trì được trên môi trư ng nuôi cấy. Kháng nguyên Vị trí liên kết kháng nguyên Yếu tố quyết định kháng nguyên Chuỗi nặng Vị trí liên kết kháng nguyên Vùng có thể thay đổi Chuỗi nhẹ Vùng không thể thay đổi (a) Cấu trúc cơ bản của phân tử kháng thể (b) Vị trí liên kết kháng nguyên có kháng thể liên kết Hình 6.3. Cấu trúc kháng thể immunoglobulin G (IgG). 1. Dung hợp tế bào Không giống như các tế bào tiết ra kháng thể, các tế bào myeloma (u tủy) là loại tế bào khối u ác tính của hệ thống miễn dịch, có thể được nuôi cấy liên tục. Köhler và Milstein (1975) đã phát triển một phương pháp dung hợp các tế bào B-lymphocyte của lá lách với tế bào myeloma của chuột để lai hai loại tế bào này với nhau, tế bào lai myeloma (hay hybridoma), có thể có đặc điểm của cả hai dòng tế bào: đó là sản xuất các kháng thể đặc hiệu và bất tử. Vì hybridoma được bắt nguồn từ một tế bào B-lymphocyte đơn, nên nó chỉ sản xuất một loại kháng thể gọi là kháng thể đơn dòng. Phương thức đặc trưng để dung hợp tế bào như sau (Hình 6.4): - Tiêm kháng nguyên được chọn vào trong chuột. Hệ thống miễn dịch trong chuột đáp ứng bằng cách sản xuất các tế bào B-lymphocyte để tiết ra kháng thể. - Lấy lá lách của chuột và tách các tế bào B-lymphocyte. - Nuôi các tế bào myeloma thích hợp thiếu HPGRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase), đột biến HPGRT-, một marker di truyền để chọn các tế bào lai sau khi dung hợp. Công nghệ tế bào 88 - Dung hợp các tế bào B-lymphocyte với các tế bào myeloma bằng cách trộn chúng trong môi trư ng chứa 40-50% polyethylene glycol (PEG). Môi trư ng sẽ chứa các hỗn hợp của B-lymphocyte, myeloma, và các tế bào hybrid-myeloma. Các B-lymphocyte chứa HPGRT, như vậy các hybridoma cũng chứa HPGRT. Vì thế, các tế bào myeloma được coi như là HPGRT-, trong khi các tế bào B-lymphocyte và hybridoma là HPGRT+. - Chọn lọc các tế bào HPGRT+ bằng cách nuôi cấy hỗn hợp trên môi trư ng chứa HAT (hypoxanthine, aminopterin và thymidine) là chất ức chế sinh trư ng các tế bào HPGRT-. Do đó, các tế bào myeloma sẽ chết trên môi trư ng này, trong khi các tế bào hybridoma sẽ phân chia. Các Blymphocyte không dung hợp sẽ chết do khoảng th i gian sống bị hạn chế của chúng. Tiêm kháng nguyên Các tế bào myeloma HGPRT- Tách các tế bào lá lách Dung hợp bằng PEG Chọn lọc HGPRT+ trong môi trường HAT Các tế bào hybridoma Các kháng thể đơn dòng Hình 6.4. Phương thức dung hợp các tế bào B-lymphocyte. Công nghệ tế bào 89 2. Thử nghiệm kháng thể Các kháng thể đơn dòng có thể được phân tích bằng kỹ thuật thử nghiệm pha rắn như các thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme linked immunosorbent assays-ELISA) hoặc các thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (radioimmuno assays-RIA). Các phương thức thử nghiệm đặc trưng như sau (Hình 6.5): - Đưa dung dịch kháng nguyên đặc hiệu (Ag) vào các giếng của đĩa microtitre có khả năng hút bám kháng nguyên bằng sự tương tác kỵ nước không đặc hiệu. Bổ sung một loại protein không gây cản tr liên kết kháng nguyên-kháng thể sau này, như là bovine serum albumin (BSA) để chiếm các vị trí gắn còn lại trên giếng. - Bổ sung dung dịch kháng thể đơn dòng thứ nhất (Mab1) là kháng thể đặc hiệu vào giếng. Kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên trên bề mặt rắn. - Bổ sung kháng thể đơn dòng thứ hai (Mab2) là kháng thể có đặc tính tương phản với immunoglobulin của loại mà từ đó tế bào hybridoma bắt nguồn. Một enzyme (E) cho phương pháp ELISA hoặc đánh dấu đồng vị phóng xạ cho phương pháp RIA được gắn đồng hóa trị với kháng thể thứ hai. - RIA: đo hoạt tính phóng xạ bằng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiography) hoặc bằng phương pháp đếm nhấp nháy của hệ thống nâng đỡ rắn (solid scintillation counter). - ELISA: Bổ sung cơ chất thích hợp và đo mật độ quang (OD) sản phẩm của nó trên máy quang phổ bước sóng thích hợp. E Mab2 Hình 6.5. Sơ đồ thử nghiệm kháng thể ELISA. Enzyme sẽ được thay thế bằng đánh dấu hoạt tính phóng xạ trong trư ng hợp thử nghiệm RIA. Mab1 Ag Công nghệ tế bào 90 VI. Sản xuất thuốc và DNA vaccine 1. Interferon Interferon là một loại cytokine (protein) do tế bào động vật sinh ra mỗi khi chúng bị virus xâm nhập, interferon không đặc hiệu và có tác dụng ức chế sinh sản của virus, ảnh hư ng đến sinh trư ng và phát triển (sự phân hóa) của các tế bào khối u và tế bào bình thư ng nhất định nào đó. Interferon có thể được coi như một loại thuốc hữu hiệu chống các bệnh nhiễm virus và kể cả một vài dạng ung thư. Cơ thể động vật sản xuất hai loại interferon là interferon I và interferon II. Interferon I có hoạt tính kháng virus bao gồm interferon-α (IFN-α, khối lượng phân tử khoảng từ 17-26 kDa, được bạch cầu sản xuất) và interferon-β (IFN-β, khối lượng phân tử khoảng 21 kDa, được nguyên bào sợi sản xuất). Cả hai loại IFN-α và IFN-β có tác dụng chống lại sự sinh sản của tế bào, đặc biệt là IFN-α, kích thích hoạt động các tế bào giết tự nhiên (NK) làm tăng biểu hiện các phân tử HLA11 lớp I. IFN-α được ứng dụng để điều trị ung thư có hiệu quả (đặc biệt là ung thư máu ác tính, ung thư biểu mô tế bào thận), điều trị bệnh nhiễm virus viêm gan B và C mạn tính (có thể chữa khỏi từ 40-50% số bệnh nhân). Interferon-γ (IFN-γ, có khối lượng phân tử khoảng 25 kDa, được sản xuất từ các lympho T CD4+12 (h1), T CD8+ và các tế bào NK) hoạt hóa cho sự biểu hiện của các phân tử HLA lớp II, làm thúc đẩy sự biệt hóa các tế bào mono thành các đại thực bào. Các interferon riêng biệt có các phạm vi hoạt động khác nhau trong các loài khác nhau. α-interferon đã chứng tỏ hiệu quả chống lại bệnh hairycell leukemia và viêm gan C. Ngoài ra, nó còn có hoạt tính chống viêm gan B mạn tính, cũng như điều trị bướu sinh dục và một vài bệnh ung thư như ung thư máu và tủy xương. Thuốc xịt mũi chứa α-interferon cung cấp một số chất bảo vệ chống bệnh cảm lạnh do các rhinovirus gây ra. Trong một th i gian dài, việc cung cấp interferon ngư i cho nghiên cứu bị hạn chế do kỹ thuật tách chiết rất tốn kém. Đến năm 1979, Klein và 11 HLA (Human Leucocyte Antigen): kháng nguyên tế bào bạch cầu ngư i, còn có nghĩa là MHC (phức hệ tương hợp mô chủ yếu-Major Histocompatibility Complex) của ngư i. 12 CD (Clusters of Differentiation): cụm biệt hóa kháng nguyên. Là những phân tử bộc lộ trên bề mặt tế bào, được nhận biết b i những kháng thể đơn dòng đặc hiệu với chúng. Số lượng CD hiện nay của các tế bào hệ miễn dịch đã được tìm ra lên đến hàng trăm loại (CD1÷CD247). Công nghệ tế bào 91 cộng sự đã xây dựng hệ thống sản xuất ổn định cho interferon của lymphoid ngư i bằng kỹ thuật nuôi cấy dịch huyền phù của African Burkitt's lymphoma có nguồn gốc từ dòng tế bào Namalva với sự cảm ứng bằng virus gây bệnh New Castle. Nuôi cấy tế bào đã được sinh trư ng trong hệ lên men 50 L trên môi trư ng không có huyết thanh và được cung cấp oxygen hòa tan nồng độ cao để tối ưu sự sinh trư ng của tế bào. Trung bình 3,35 units interferon/mL đã được thu hồi trong sản phẩm cuối cùng chưa tinh sạch. Tuy nhiên, ngày nay việc tách chiết một lượng lớn interferon đã tr nên thuận lợi hơn nhiều nh công nghệ DNA tái tổ hợp. Gen mã hóa interferon được biến nạp vào tế bào nấm men S. cerevisiae (eukaryote) có khả năng sản xuất interferon với sản lượng rất cao. Thành công này đã làm giảm đáng kể giá thành của interferon, m ra cơ hội sử dụng loại thuốc này trong điều trị các bệnh viêm nhiễm virus và một vài dạng ung thư. 2. Hoạt tố plasminogen mô Hoạt tố plasminogen mô (t-PA) là một ví dụ về protein trị liệu được tổng hợp trong nuôi cấy các tế bào động vật có vú chuyển gen. t-PA là một protease có tác dụng phân hủy các sợi tơ huyết fibrin (dạng hoạt hóa của protein gây đông máu fibrinogen13, protein không tan đã đông kết thành các sợi để hình thành một cục máu đông) được sử dụng để chữa bệnh nghẽn mạch máu. Bệnh nhân bị những cơn đau tim thư ng được uống t-PA vì nó phá tan những cục máu nhỏ có khả năng làm tắc mạch. Các nghiên cứu gần đây cho thấy có thể sử dụng các tuyến sữa của động vật chuyển gen để sản xuất các protein hiếm của ngư i. Chẳng hạn, gen t-PA được đưa vào phôi chuột bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, sau đó phôi chuột được cấy vào chuột cái tạo thành chuột chuyển gen có khả năng tiết t-PA ngư i qua sữa. 3. DNA vaccine Còn gọi là vaccine DNA tái tổ hợp, đây là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và kh i động một phản ứng miễn dịch. Nhiều vaccine 13 Fibrinogen: protein huyết tương do các tế bào nhu mô gan tổng hợp, tiền chất của fibrin, hoạt hóa để hình thành một cục máu đông khi mạch máu bị chấn thương. Công nghệ tế bào 92 phòng virus hiện nay (s i, tê liệt, dại…) đều được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh vật. Hình 6.6 minh họa mô hình sản xuất và điều trị bằng liệu pháp vaccine DNA tái tổ hợp: Phân lập một hoặc nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại (a). Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thư ng bằng cách tiêm vào tế bào cơ (b) hoặc đẩy vào da nh súng bắn gen (c). Các gen được chọn lựa mã hóa cho các kháng nguyên, các chất có thể gây ra một đáp ứng miễn dịch, thư ng được sản xuất b i tác nhân gây bệnh. Gen sản xuất kháng nguyên Plasmid a Kim tiêm b Nguyên liệu di truyền Plasmid đã được sửa đổi c Tác nhân gây bệnh Cơ Da Súng bắn gen Hình 6.6. Mô hình sản xuất và điều trị bằng liệu pháp DNA vaccine. 3.1. Phương thức hoạt động của các DNA vaccine Các DNA vaccine kích thích phản ứng miễn dịch bảo vệ để chống lại tác nhân ngoại nhiễm hoặc tác nhân gây bệnh, chủ yếu bằng hai cách của hệ thống miễn dịch: nhánh thể dịch (yếu tố tấn công các tác nhân gây bệnh bên ngoài tế bào), và nhánh tế bào (yếu tố đào thải các tế bào bị xâm nhiễm b i tác nhân gây bệnh). Khả năng miễn dịch sẽ được duy trì khi hoạt động này Công nghệ tế bào 93 tạo ra các tế bào ghi nhớ (memory cells) lâu dài để sẵn sàng ngăn chận tác nhân gây bệnh. Các vaccine cảm ứng miễn dịch theo phương thức DNA vaccine đi vào tế bào đích (ví dụ: mô cơ) và sau đó hoạt động sản xuất kháng nguyên của tế bào thư ng được tìm thấy trên tác nhân gây bệnh. - Trong phản ứng thể dịch, các tế bào máu trắng được gọi là tế bào B liên kết để giải phóng các bản sao của các protein kháng nguyên và sau đó tăng lên nhiều lần. Nhiều thế hệ sau của tế bào đã tiết ra các phân tử kháng thể (trong suốt quá trình xâm nhiễm) và chúng sẽ kết thành cụm trên tác nhân gây bệnh để đánh dấu nó và sau đó là phá hủy. - Sự biểu hiện các đoạn protein kháng nguyên (hoặc peptide) trên các tế bào bị xâm nhiễm có thể kh i động một đáp ứng tế bào. Sự liên kết các phức hợp kháng nguyên sẽ cảm ứng các tế bào máu trắng (cytotoxic T cells14) sinh sôi nẩy n để giết chết các tế bào được liên kết hoặc những yếu tố khác biểu hiện các chuỗi peptide tương tự. Các tế bào được hoạt hóa cũng sẽ tr thành các tế bào ghi nhớ, sẵn sàng đào thải các tế bào bị xâm nhiễm b i tác nhân gây bệnh trong tương lai. 3.2. Thử nghiệm các DNA vaccine trên ngư i Bảng 6.3 liệt kê một số DNA vaccine được thử nghiệm trên ngư i. Tất cả các vaccine ứng viên trong các thử nghiệm giai đoạn đầu để kiểm tra độ an toàn và đáp ứng miễn dịch đã được sử dụng để điều trị tốt. Không có thử nghiệm nào không có kết quả trong việc ngăn ngừa bệnh. Hầu hết các nghiên cứu này vẫn đang tiếp tục. VII. Tế bào động vật sử dụng trong cấy ghép Đây là lĩnh vực ứng dụng mới của nuôi cấy tế bào động vật có vú. Trước đây, để khắc phục các sai hỏng của cơ thể, ngư i ta sử dụng các tác nhân như thuốc, mô hay cơ quan ghép, bộ phận giả. Ngày nay, cùng với sự Cytotoxic T cells: các tế bào T gây độc, là những tế bào tiêu diệt các tế bào khác. Tất cả các tế bào T gây độc đều là các T-CD8 chỉ nhận biết MHC-lớp I, nhưng tế bào T-CD4 cũng có thể diệt các tế bào khác một số trư ng hợp. Các tế bào T gây độc có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các tác nhân gây độc nội bào. 14 Công nghệ tế bào 94 phát triển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào, xu hướng cấy ghép tế bào đã tr nên ngày càng phổ biến hơn. Chẳng hạn, việc ghép các tế bào tụy sản xuất insulin của lợn vào ngư i mắc bệnh tiểu đư ng đã được thực hiện vào những năm 1990, tuy nhiên kết quả vẫn chưa rõ ràng. Nghiên cứu này nếu thành công sẽ giúp bệnh nhân không còn phụ thuộc vào việc tiêm thư ng xuyên insulin, đồng th i loại bỏ tối đa các hậu quả của bệnh. Nguyên tắc tương tự cũng được áp dụng cho trư ng hợp các tổn thương thần kinh. Một công trình gần đây cho thấy việc ghép các tế bào thần kinh lấy từ thể vân của thai cho phép phục hồi các chức năng của não cũng như chức năng vận động khỉ Macaque trước đó có mang các biểu hiện giống chứng bệnh múa giật Huntington của ngư i. Bên cạnh đó, kỹ thuật ghép tế bào tự thân cũng rất được quan tâm. Ngư i ta hy vọng bằng cách ghép cho bệnh nhân các tế bào nguồn tạo máu sẽ khắc phục được tình trạng không hoạt động của tủy xương (chẳng hạn trư ng hợp bị chiếu xạ liều cao do tai nạn). Các tế bào này trước đó được thu nhận từ chính ngư i bệnh, cho sinh sản và biệt hóa trong môi trư ng nhân tạo có chứa các nhân tố sinh trư ng và sau đó được tiêm tr lại cho ngư i bệnh với số lượng lớn. Một nghiên cứu gần đây đã thành công trong việc ghép tự thân tế bào sụn. Trước đây, để chữa các bệnh thương tổn đầu gối, ngư i ta buộc phải sử dụng các bộ phận giả. Tuy nhiên, giải pháp này tỏ ra không hiệu quả lắm: các vật liệu sinh học dùng để chế tạo bộ phận giả (thư ng là polyethylene) rất kém bền so với đòi hỏi vận động nhiều của khớp gối nên cứ sau 15 năm lại phải thay. Mặt khác, do tế bào sụn không có khả năng sinh sản để bù đắp thương tổn nên không thể dựa vào sự tái sinh tự nhiên. Nhóm nghiên cứu trên đã thu nhận sinh thiết từ một phần sụn lành của ngư i bệnh, tách r i từng tế bào nh enzyme thủy phân. Các tế bào này được nuôi cấy và tiêm tr lại vào nơi bị tổn thương. đó, chúng sản sinh và tái tạo một lớp sụn lành thay cho phần hư hỏng. Kỹ thuật này được áp dụng thành công trên vài trăm ngư i bệnh và đã được thương mại hóa rộng rãi. Theo một số tác giả thì tủy xương có thể tiết vào trong máu các tế bào có khả năng biệt hóa thành sợi cơ. Trên cơ s này, họ đã ghép tế bào tủy xương lấy từ chuột chuyển gen lên chuột bình thư ng bị tổn thương cơ. Sau vài tuần, các chuột sau chạy nhanh như thỏ, với các tế bào cơ chứa nhân màu xanh. Công nghệ tế bào 95 Bảng 6.3. Một số DNA vaccine được thử nghiệm trên ngư i. stt Vaccine Protein được mã hóa b i các gen vaccine Kết quả miễn dịch 1 Ngăn chận viêm gan Kháng nguyên bề mặt Các đáp ứng tế bào và thể B viêm gan B dịch 2 Ngăn chận Herpes đơn 3 Ngăn chận HIV 4 Ngăn cúm 5 Ngăn chận bệnh sốt Circumsporozoite Các đáp ứng tế bào rét protein (protein hạt bào tử vòng) 6 Liệu pháp HIV 7 Các liệu pháp cho Carcinoembryonic ung thư biểu mô do antigen (CEA) adenovirus vú và ruột kết Các đáp ứng tế bào 8 Các liệu pháp cho B Immunoglobulin cell lymphoma Các đáp ứng thể dịch 9 Liệu pháp cho T cell receptor cutaneous T cell lymphoma (CTCL) Các phân tích miễn dịch đang tiến hành (thử nghiệm đã kết thúc) 10 Liệu pháp cho ung Kháng nguyên màng đặc Các phân tích miễn dịch thư tuyến tiền liệt hiệu của tuyến tiền liệt đang tiến hành chận Công nghệ tế bào các Herpes glycoprotein Các protein vỏ và điều hòa, hoặc các protein lõi và các enzyme cần thiết trong sao chép HIV Các phân tích miễn dịch đang tiến hành Các đáp ứng tế bào (một cách cơ bản, tất cả các gen chắc chắn sẽ được thử nghiệm trong một vaccine) bệnh Hemaglutinin (ngưng kết Các phân tích miễn dịch tố hồng cầu) đang tiến hành (thử nghiệm đã kết thúc) Các protein vỏ và điều Các đáp ứng thể dịch hòa; hoặc các protein trong thử nghiệm đầu tiên TAT, NEF và điều hòa (đã được kết thúc), các đáp ứng tế bào trong một thử nghiệm khác 96 VIII. Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy Trong y học, để điều trị chứng xơ vữa động mạch, ngư i ta cần thay thế các mạch máu bị hỏng. Các mạch máu nhân tạo kém bền trong khi khâu nối và rất dễ bị tắc nghẽn. Gần đây, một nhóm nghiên cứu đã sản xuất thành công mạch máu tự nhiên bằng cách nuôi cấy tế bào động mạch chủ của bò, gồm tế bào cơ và tế bào nội mô, trên một giá thể polymer tự tiêu. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng một thiết bị hoạt động như quả tim thật và tác động lên các mạch đang hình thành giống hệt như trong điều kiện tự nhiên. Thí nghiệm tương tự với các tế bào có nguồn gốc từ lợn đã cho phép sản xuất mạch máu mà khi đem ghép tr lại trên lợn cho những kết quả rất khả quan. Tuy nhiên, loại tế bào đang có triển vọng nhất trong lĩnh vực này là tế bào mầm phôi. Tế bào mầm phôi chuột đã được sử dụng từ lâu, nhưng phải đến cuối thế kỷ 20 ngư i ta mới thu nhận được tế bào mầm phôi ngư i bằng hai cách khác nhau: từ tế bào phôi nang và từ tế bào mầm nguyên thủy. Các nhà khoa học cho rằng các tế bào vốn có tính toàn thể này (totipotency) có khả năng tái tạo mô và cơ quan mới, thậm chí có thể chặn đứng cả quá trình lão hóa nếu cơ thể được cung cấp chúng thư ng xuyên. Một ứng dụng thực tế hơn là việc điều trị cho những cặp vô sinh không có khả năng sản sinh tế bào sinh dục. Để sử dụng tế bào mầm phôi vào mục đích điều trị cần phải thu nhận được những dòng tế bào có mang bộ gen của ngư i bệnh. Hiện nay, có ba cách tiếp cận chính: - Tạo dòng trị liệu: thay thế vật liệu di truyền của noãn ngư i bằng nhân của một tế bào trư ng thành. Biện pháp này, về nguyên tắc tương tự như kỹ thuật tạo dòng cừu Dolly. Khác biệt duy nhất chỗ thay vì sau đó cấy phôi tr lại tử cung mẹ, ngư i ta sẽ nuôi nó trong điều kiện in vitro đến giai đoạn phôi nang. Các tế bào phôi thai được thu nhận từ đó và đem nuôi cấy. - Cấy nhân tế bào ngư i vào noãn của một động vật có vú bất kỳ đã loại nhân. - Lập chương trình mới cho nhân của tế bào trư ng thành bằng cách kết hợp tế bào mầm phôi với nhân của một tế bào sinh dưỡng. Bên cạnh những triển vọng rất lớn, việc sử dụng mầm phôi ngư i cũng gợi ra nhiều vấn đề kỹ thuật, chủ yếu là: (1) phương pháp cho phép các tế bào mầm phôi ngư i biệt hóa theo hướng mong muốn, và (2) các nhân tố chỉ thị và phương pháp chọn lọc tế bào đích (target cells). Công nghệ tế bào 97 Những hiểu biết mới về cơ chế quá trình phát sinh cá thể cộng với việc phát hiện những protein cảm ứng của quá trình này có thể sẽ giải quyết được các vấn đề nêu trên. Gần đây, ngư i ta đã phân lập được một protein (đặt tên là Cerberus), protein này là tín hiệu đầu tiên trong chuỗi hiện tượng hình thành đầu phôi cóc (Xenopus laevis). Chính nó đã cảm ứng sự biệt hóa các tế bào lân cận ngoại bì thành não và mắt, các tế bào trung bì thành tim và tế bào nội bì thành gan. Phát hiện này góp phần m ra một triển vọng mới: sản xuất hàng loạt các cơ quan thay thế bằng cách nuôi cấy các tế bào mầm phôi với sự hiện diện của một protein cảm ứng đặc hiệu để hướng sự biệt hóa của chúng thành loại mô mong muốn. IX. Mô hình thực nghiệm Như chúng ta đã biết, một loại thuốc muốn dùng để điều trị bệnh trước khi được phép lưu hành phải trải qua nhiều thử nghiệm để đảm bảo hiệu quả tác dụng cũng như mức độ an toàn của nó, trong đó giai đoạn thử nghiệm bước đầu trên các động vật mô hình (model animal) có một ý nghĩa rất quan trọng. Thông thư ng, những thử nghiệm này đòi hỏi một th i gian dài và tốn kém, đồng th i không phải lúc nào cũng áp dụng được cho ngư i… Vì vậy, hiện nay xu hướng sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro làm mô hình thử nghiệm ngày càng phát triển, nhất là khi ngư i ta có khả năng nuôi cấy hầu như mọi loại tế bào nh vào các kỹ thuật hiện đại. Mô hình thử nghiệm trên tế bào đã được sử dụng trong các khảo sát về sự chuyển hóa các chất có nguồn gốc ngoại lai nh hệ enzyme nội bào. Loại tế bào được sử dụng thông dụng nhất là tế bào gan, do nó có một số ưu thế sau: (1) gan đóng vai trò chủ yếu trong chuyển hóa các hợp chất hóa học, đặc biệt là chất độc, (2) tế bào gan nuôi cấy vẫn giữ nguyên (trong vài gi đến vài ngày) các chức năng đặc trưng bao gồm cả enzyme chuyển hóa hiện diện với hàm lượng lớn. Việc nuôi cấy chung tế bào gan với tế bào biểu mô cho phép duy trì chúng sống trong nhiều tuần lễ. Đặc biệt, các tế bào gan đã được biến đổi di truyền để có thể sinh tổng hợp các cytochrome P450, đây là các enzyme then chốt trong chuyển hóa các chất ngoại lai, rất có ích để xác định loại cytochrome chịu trách nhiệm biến đổi một loại thuốc nhất định. Một ứng dụng khác của nuôi cấy tế bào động vật là khảo sát các độc tính đối với vật chất di truyền do các chất chuyển hóa trong tế bào gắn lên DNA. Ngư i ta có thể tạo ra các hư hỏng đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát hiện bào quan bị ảnh hư ng và xác định các cơ chế hóa sinh và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc. Loại tế bào thông dụng nhất Công nghệ tế bào 98 được sử dụng trong trư ng hợp này cũng là tế bào gan, nhưng hiện nay ngư i ta đã bắt đầu sử dụng tế bào thận và phổi để m rộng nghiên cứu. Nhìn chung, triển vọng của các mô hình tế bào động vật nuôi cấy rất lớn, đặc biệt là với sự phát triển của nhiều kỹ thuật hiện đại cho phép đảm bảo khả năng sống và chức năng ổn định cho tất cả các loại tế bào nuôi cấy, khả năng phục hồi và sửa chữa các hư hỏng của tế bào cũng như tự động hóa các thao tác. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Pham Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2001. Sinh học của sự sinh sản. NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh. 2. Bronzino JD. 1995. The Biomedical Engineering Handbook. CRC Press and IEEF Press, USA. 3. Fox SR, Patel UA, Yap MG and Wang DI. 2004. Maximizing interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells through temperature shift optimization: experimental and modeling. Biotechnol Bioeng. 85(2):177-84. 4. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 5. Lindner-Olsson E, Chatzissavidou N and Lüllau E. 2001. Animal Cell Technology: From Target to Market. Proceedings of the 17th ESACT Meeting, Sweden. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherland. 6. Pollard JW and Walker JM. 1997. Basic Cell Culture Protocols. Humana Press Inc. Totowa, New Jersey, USA. 7. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. nd 2 ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA. 8. Wurm FM. 2004. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotech. 22: 1393-1398. Công nghệ tế bào 99 Chương 7 Nuôi cấy tế bào thực vật I. Mở đầu Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học khác nhau rất có giá trị, chẳng h n các chất dùng làm dược liệu, các chất t o mùi, các chất dùng làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trong nông nghiệp (B ng 7.1). Những s n phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thư ng được s n xuất với một lượng rất nhỏ (d ng vết) trong thực vật và không có chức năng trao đổi chất rõ ràng1. Chúng dư ng như là s n phẩm của các ph n ứng hóa học của thực vật với môi trư ng chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trư ng hoặc là sự b o vệ hóa học chống l i vi sinh vật và động vật. Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đ t nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp (thư ng gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng h n, một số hỗn hợp phức t p như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được. Để s n xuất các s n phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực vật ngo i sinh (chẳng h n từ cây hoàn chỉnh) có thể được sử dụng để nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (cell suspension culture) trong điều kiện vô trùng. Cơ s khoa học của kỹ thuật này là dựa trên tính toàn thể hóa sinh (biochemical totipotency) duy nhất của tế bào thực vật. Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để s n xuất các chất thứ cấp có một số ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân t o mà không phụ thuộc vào th i tiết và địa lý. Không cần thiết để vận chuyển và b o qu n một số lượng lớn các nguyên liệu thô. Các chất sơ cấp được s n xuất với số lượng lớn hơn các chất thứ cấp và có các chức năng trao đổi đặc biệt. Các chất sơ cấp thu được từ thực vật bậc cao được sử dụng như là thực phẩm, các phụ gia thực phẩm, và các nguyên liệu thô trong công nghiệp như là các carbohydrate, dầu thực vật, protein và các acid béo. 1 Công nghệ tế bào 100 Bảng 7.1. Các s n phẩm tiềm năng của thực vật đang được quan tâm. Thực phẩm Dược liệu Chất màu Anthocyanin, betacyanin, saffron Chất mùi Chuối, mơ, táo, đào, nho, lê, dứa, qu mâm xôi, nho, măng tây, capsicum, cà chua, cần tây, vanilla, cocoa. Chất ngọt Miraculin, thaumatin Gia vị B ch đậu khấu, long não, cây hương th o, nghệ, ng i đắng Tinh dầu Tỏi, hoa nhài, chanh, hành tây, b c hà, hoắc hương, hoa hồng, vetiver Các alkaloid Ajmalacine, atropine, berberine, codein, hyoscyamine, morphine, scopolamine, vinblastine, vincristine, camptothecin, quinine, serpentine Các steroid Digitoxin, digoxin, diosgenin Các chất khác Ginsengoside, shikonin, ubiquinone-10, rosmarinic acid, diosgenin, L-Dopa, saponin monellin, stevioside, Các protein tái Kháng thể đơn dòng, các interleukin, tổ hợp GM-CSF, các enzyme khác Nông nghiệp Hóa chất Pyrethrin, rotenone, neriifolin, salannin, azadirachtin, các hóa chất alleopathic - Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của s n phẩm bằng cách lo i bỏ các tr ng i trong quá trình s n xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô s n xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và b o qu n. - Một số s n phẩm trao đổi chất được s n xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh. Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định cho phép nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đ t hiệu suất tối đa Công nghệ tế bào 101 cho sự tích lũy và s n xuất các chất thứ cấp. Điều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có s n lượng cao, xây dựng các công thức môi trư ng dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu qu . Chúng ta cũng có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức có được từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tế bào thực vật và vi sinh vật có một số đặc điểm khác nhau, vì thế cần ph i c i tiến và điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy cũng như cấu hình của nồi ph n ứng (reactor) để tìm được các yêu cầu đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật. Một số đặc điểm chính khác nhau giữa tế bào thực vật và vi sinh vật: - Tế bào thực vật lớn hơn tế bào vi khuẩn hoặc vi nấm từ 10-100 lần. - Sự trao đổi chất của tế bào thực vật chậm hơn vì thế đòi hỏi ph i duy trì một điều kiện vô trùng trong th i gian lâu hơn. - Tế bào thực vật có khuynh hướng kết thành một khối gây ra sự lắng đọng, có kh năng hòa trộn kém. - Các tế bào thực vật mẫn c m dễ biến d ng hơn tế bào vi sinh vật. - Quá trình s n xuất các chất thứ cấp tế bào thực vật phụ thuộc các cơ chế điều hòa phức t p hơn so với các tế bào vi sinh vật. - Các tế bào thực vật có độ ổn định di truyền thấp hơn tế bào vi sinh vật. II. Tế bào thực vật Hình nh tế bào thực vật được minh họa hình 7.1. Một tế bào đơn thực vật thư ng có đư ng kính kho ng từ 20-40 µm và dài 100-200 µm. Cấu trúc chính của tế bào thực vật tương tự các tế bào đặc trưng của eukaryote. Tuy nhiên, tế bào thực vật có một số đặc điểm riêng biệt như thành tế bào dày, không bào lớn và có lục l p. Tế bào thực vật được bọc chung quanh b i thành tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào chứa pectin để giúp nó liên kết với các tế bào bên c nh. Lớp trong của thành tế bào là màng tế bào. Màng tế bào hoàn toàn khác với thành tế bào về hình d ng, thành phần và chức năng. Trong khi thành tế bào cứng rắn, có cấu trúc tương đối dày thì màng tế bào chất l i mỏng (kho ng o 75 A ) và mềm dẻo. Màng tế bào bao gồm protein và lipid trong khi thành tế bào là carbohydrate tự nhiên. Thành tế bào có chức năng nâng đỡ cho cây trong khi màng tế bào điều hòa sự vận chuyển các chất đi vào và ra khỏi tế bào. Công nghệ tế bào 102 Chloroplast Thành tế bào Màng tế bào Tế bào chất Không bào Lưới nội sinh chất Ribosome Ty thể Nhân Bộ máy Golgi Hình 7.1. Minh họa một tế bào thực vật. Không bào (vacuole) có vai trò tiếp nhận các chất th i của sự trao đổi chất hoặc các chất thứ cấp của thực vật. các tế bào non không bào thư ng nhỏ và nhiều. Khi tế bào lớn dần và già hơn thì không bào cũng m rộng lên và kết thành một khối. các tế bào thực vật trư ng thành, không bào có thể chiếm tới 90% thể tích tế bào. Không bào được bọc chung quanh b i màng huyết tương (plasma). Thành phần chính của các không bào lớn là nước chứa các chất hòa tan như các ion vô cơ, các amino acid, các acid hữu cơ, các sắc tố hòa tan trong nước (anthocyanin) và các chất không hòa tan d ng tinh thể và hình kim. Ngoài ra, không bào cũng chứa các protein như các hydrolyse, catalase và photphatase. Phần bào tan muốn đề cập đến lipid chung quanh tất c các cấu trúc nổi giữa nhân và màng tế bào. Lục l p (chloroplast) là vị trí của quang hợp trong tế bào thực vật, nó chứa chlorophyll là sắc tố lục ph n ứng với ánh sáng để s n xuất các carbohydrate. Nhân (nuclear) là trung tâm điều khiển của tế bào chứa DNA để phiên mã và dịch mã thành protein. Các protein tổng hợp được sắp xếp và đóng gói trong các túi của bộ máy Golgi. Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) là m ng lưới của các ống nhỏ nối liền các phần khác nhau của tế bào. Ribosome được tập trung trên bề mặt của m ng lưới nội sinh chất và Công nghệ tế bào 103 tham gia vào ho t động sinh tổng hợp protein. Ty thể (mitochondrion) chứa vật liệu di truyền và nhiều enzyme quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào. III. Các loại nuôi cấy tế bào và mô thực vật Khái niệm nuôi cấy tế bào và mô thực vật thư ng được dùng như là một thuật ngữ chung để mô t tất c các lo i nuôi cấy thực vật điều kiện in vitro. Trong các quá trình nuôi cấy này thư ng xuất hiện hai kiểu sinh trư ng sau: 1. Sinh trưởng không phân hóa (undifferentiated growth) Sinh trư ng không phân hóa xuất hiện thư ng xuyên khi một mẫu mô của cây hoàn chỉnh được nuôi cấy in vitro. Mẫu mô sau đó đã làm biến mất mọi cấu trúc có thể nhận biết được của cây nguyên vẹn ban đầu. 1.1. Nuôi cấy callus Nuôi cấy callus cho phép các khối tế bào không có hình d ng nhất định tăng lên từ sinh trư ng không phân hóa của mẫu vật trên môi trư ng dinh dưỡng rắn vô trùng (Hình 7.2). Mẫu vật thư ng là các cơ quan tử nhỏ hoặc các mẫu mô. Các khối tế bào này không tương ứng với mọi cấu trúc mô đặc trưng của cây hoàn chỉnh. Thuật ngữ nuôi cấy callus được sử dụng do sự phân chia vô tổ chức của tế bào mà lúc đầu được nghĩ là nó c m ứng với sự tổn thương thực thể của thực vật trong quá trình tách ra khỏi cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sau đó ngư i ta nhận thấy nó được được c m ứng b i các chất điều hòa sinh trư ng thực vật (plant growth regulators) trong môi trư ng dinh dưỡng rắn. Hình 7.2. Nuôi cấy callus. Công nghệ tế bào 104 1.2. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trư ng phân tán trong môi trư ng lỏng (Hình 7.3 và 7.4). Thư ng được kh i đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trư ng lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới dịch huyền phù. Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc s n xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trư ng lỏng. 1.3. Nuôi cấy tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) đòi hỏi sự sinh trư ng của protoplast trên môi trư ng đặc hoặc lỏng. Protoplast có thể được chuẩn bị bằng phương pháp cơ học hoặc enzyme để lo i bỏ thành tế bào. Các protoplast được phân lập có thể được sử dụng để: (1) biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật, (2) t o ra cây lai vô tính thông qua dung hợp protoplast (protoplast fusion), (3) nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus thực vật và những vấn đề khác. Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy protoplast là vi nhân giống thực vật. Sau khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự phát triển callus và tiếp theo là cây hoàn chỉnh nh đó thực vật có thể được nhân lên nhiều lần. 2. Sinh trưởng có phân hóa (differentiated growth) Sinh trư ng có phân hóa xuất hiện khi các bộ phận của thực vật được chuyển lên môi trư ng nuôi cấy là nơi chúng có thể tiếp tục sinh trư ng với cấu trúc đã được duy trì từ trước. Các cơ quan thực vật được phân hóa có thể sinh trư ng trong quá trình nuôi cấy mà không bị mất sự toàn vẹn của mình còn gọi là nuôi cấy cơ quan (organ culture). 2.1. Nuôi cấy rễ tơ Nuôi cấy rễ tơ có thể được thiết lập từ đầu rễ tách ra nhiều loài thực vật khác nhau. Các nuôi cấy rễ sinh trư ng nhanh có thể thu được từ các loài cây hai lá mầm bằng cách gây nhiễm chúng với vi khuẩn đất Agrobacterium Công nghệ tế bào 105 rhizogenes. Các dòng rễ tơ (hairy root) được hình thành có thể dùng trong nuôi cấy để s n xuất các chất thứ cấp (Hình 7.5). A Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật B Bơm khí vô trùng, không khí ẩm Bình thu Bơm nhu động nhiều kênh Bioreactor Bình cơ chất được lắc liên tục Máy lắc Hình 7.3. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trên máy lắc. A: Nuôi trong bình tam giác có lắc để chuẩn bị tế bào. B: Nuôi trong hệ lên men lắc để s n xuất sinh khối. Hình 7.4. Hệ lên men có cánh khuấy (bình nuôi 5 L) dùng để nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật quy mô phòng thí nghiệm. Công nghệ tế bào 106 Hình 7.5. Nuôi cấy rễ tơ. 2.2. Nuôi cấy phôi Nuôi cấy phôi (embryo) có thể được thiết lập cho các phôi tách ra từ các h t vô trùng, các noãn hoặc qu . Các phôi được s n xuất từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào, được gọi là phôi vô tính (somatic embryo), có thể được phân lập và n y mầm cung cấp một cây trên một mẫu vật. Nuôi cấy phôi có thể được ứng dụng để s n xuất nhanh cây giống từ các h t có th i gian ngủ nghĩ dài. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn các hệ thống nhân giống truyền thống như là quá trình đồng nhất di truyền, s n xuất sinh khối và nhân giống các cây trồng s ch bệnh. IV. Môi trường nuôi cấy Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng của các lo i mô nuôi cấy là rất khác nhau nhưng môi trư ng nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng. Bao gồm các lo i muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium và sulfur. Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho sinh trư ng của thực vật bậc cao. - Các nguyên tố vi lượng. Bao gồm các lo i muối của sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum và cobalt d ng vết. - Các phụ gia hữu cơ. Một lượng nhỏ các lo i vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), các amino acid (thư ng cho phép bỏ qua nhưng trong một số trư ng hợp đặc biệt thì có thể dùng), và các phụ gia hữu cơ không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…). - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật. Thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết qu nuôi cấy là các chất điều hòa sinh Công nghệ tế bào 107 trư ng. Các auxin (IAA2 và các d ng tương tự được tổng hợp nhân t o như 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…), và các cytokinin (zeatin, 2i-P7 và các d ng tương tự được tổng hợp nhân t o như kinetin, BA8…) là những nhóm chất kích thích sinh trư ng và phát sinh hình thái chủ yếu trong nuôi cấy mô và cơ quan của thực vật. - Nguồn carbon. Thư ng sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon được thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp. Trong đa số các thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật đã mất kh năng quang hợp. Glucose cũng thư ng được đưa vào môi trư ng và cho hiệu qu tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu qu kém hơn. - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường. Thư ng sử dụng là agar, một lo i polysaccharide thu được từ một số loài t o thuộc ngành t o đỏ (Rhodophyta). Một số hợp chất khác cũng được thử nghiệm thành công như alginate, phytagel, methacel và gel-rite. Murasghige và Skoog (1962) đã xây dựng môi trư ng dinh dưỡng cơ b n (gọi là môi trư ng MS) thích hợp cho hầu hết các thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật. Thành phần môi trư ng nuôi cấy được trình bày b ng 7.2. V. Sản xuất các chất thứ cấp Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid có d ng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid9. Alkaloid có ho t tính sinh lý trên tất c động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid và được sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dung môi. Glycoside bao gồm các phenolic, tanin và flavonoid, saponin và các 2 IAA: indoleacetic acid 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 4 NAA: α-naphthaleneacetic acid 5 IBA: indole-3-butyric acid 6 NOA: 2-naphthoxyacetic acid 7 2-iP: 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine 8 BA: N6-benzyladenine hay 6-benzylaminopurine (BAP) 9 Tên alkaloid có nghĩa là giống như kiềm (alkali) 3 Công nghệ tế bào 108 cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm. Bảng 7.2. Thành phần môi trư ng Murashige và Skoog (1962). Thành phần 1. Các nguyên tố đa lượng MgSO4.7H2O KH2PO4 KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O 2. Các nguyên tố vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI Nồng độ (mg/L) 370 170 1900 1650 440 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 Thành phần Nồng độ (mg/L) FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 27,8 37,3 3. Nguồn carbon Sucrose 30000 4. Các phụ gia hữu cơ - Các vitamin Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid myo-inositol - Các chất khác Glycine 0,5 0,5 0,5 100 2 Một trong những nhân tố quan trọng nh hư ng đến việc s n xuất các chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều chất thứ cấp được s n xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào. Vì thế, chúng thư ng được tìm thấy trong các mô có tính đặc trưng cao như là rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trư ng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào, nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng t o thành trong nuôi cấy tế bào thực vật. Chỉ một số giới h n hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật là có thể s n xuất một lượng vừa ph i các chất thứ cấp, cho dù thực vật tự nhiên mà từ đó các tế bào được thu thập, là có thể s n xuất chúng. Công nghệ tế bào 109 Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy dịch huyền phù thư ng t o thành một khối kho ng vài trăm tế bào do tính chất dính nhớt của bề mặt tế bào, từ sự tiết ra của các polysaccharide cũng như mật độ cao của tế bào (Hình 7.6). Do gradient nồng độ và sự tương tác tế bào, các tế bào giữa khối sẽ được tiếp xúc với môi trư ng, điều đó khác với các tế bào bên ngoài. Do đó, sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để cho phép t o thành các chất thứ cấp. Hình 7.6. Sự kết khối trong nuôi cấy tế bào thực vật. Một số kết qu nghiên cứu cho rằng một số nuôi cấy dịch huyền phù có kh năng tổng hợp các s n phẩm đặc biệt có nồng độ cao hơn so với cây mà từ đó chúng bắt nguồn. Chẳng h n: Schulte và cs (1987) đã thông báo sự t o thành các anthraquinone trong các nuôi cấy tế bào (được tối ưu các điều kiện) đã vượt trội các cây sinh trư ng trong điều kiện tự nhiên (17/19 loài khác nhau) thuộc các chi Asperula, Galium, Rubia và Sherardia. Hiệu suất anthraquinone cao nhất là trư ng hợp của loài Galium verum (1,7 g/L) và nồng độ cao nhất là loài Rubia fruticosa (20% trọng lượng khô). Đã có những bằng chứng rõ ràng cho thấy có mối quan hệ ngược (feedback) giữa tốc độ sinh trư ng và kh năng s n xuất các chất thứ cấp. Khi tốc độ sinh trư ng cao, các quá trình sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và s n xuất sinh khối tế bào đã diễn ra m nh mẽ. Ngược l i, trong pha tĩnh khi sự sinh trư ng gi m đến mức tối thiểu, thì lúc này ho t động s n xuất và tích lũy các chất thứ cấp đã tăng lên. Thành phần môi trư ng cũng có nh hư ng một cách ý nghĩa đến số lượng các chất thứ cấp được s n xuất. Yêu cầu cơ b n khi thiết kế các công thức môi trư ng dinh dưỡng là đ m b o hoàn thành sự sinh trư ng của tế bào. Sau khi tế bào đ t đến một quần l c nhất định, sự thay đổi thành phần môi trư ng cũng có thể nh hư ng đến sự tích lũy s n phẩm. Chẳng h n, ngư i ta đã c i thiện s n lượng của shikonin có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của cây Lithospermum erythrorhizon bằng cách dùng môi trư ng s n xuất để thay cho môi trư ng sinh trư ng. Môi trư ng s n xuất Công nghệ tế bào 110 thư ng chứa nhiều sucrose hơn nhưng ít các thành phần vô cơ và vitamin hơn so với môi trư ng sinh trư ng. Tích lũy s n phẩm bằng nuôi cấy tế bào thực vật có thể được kích thích b i các elicitor sống hoặc không sống. Các elicitor sống là các hợp chất hoặc các chất có nguồn gốc từ vi sinh vật và các elicitor không sống là các tác nhân gây stress như chiếu x UV, sốc thẩm thấu, hoặc các ion kim lo i nặng. Các elicitor sống (biotic) thư ng được s n xuất bằng cách nghiền đồng thể hệ sợi nấm và vô trùng dịch thu được. nh hư ng của các biotic elicitor lên sự tích lũy của các chất thứ cấp tùy thuộc vào đặc trưng và nồng độ của elicitor, th i gian tiếp xúc elicitor, và giai đo n sinh trư ng của tế bào thực vật. 1. Các chất thứ cấp dùng trong thực phẩm 1.1. Các chất màu - Anthocyanin Các anthocyanin là các sắc tố tiêu biểu có trong các loài thực vật h t kín (angiosperms) và các loài thực vật có hoa (flowering plants) của các họ Poaceae, Fabaceae, Rosaceae, Cruciferae, Vitaceae và Solanaceae tập trung các bộ phận khác nhau như: rễ, lá, hoa và qu . Anthocyanin tách chiết từ nho là nguồn tiềm tàng nhất trên thế giới. Hiện nay, ngư i ta cũng đã tiến hành nuôi cấy tế bào của các loài Vitis vinifera, Daucus carota và Euphorbia millii để s n xuất anthocyanin. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là phương tiện lý tư ng để s n xuất anthocyanin với s n lượng cao từ 10-20% trọng lượng khô. S n xuất anthocyanin nói chung đ t cực đ i trong suốt pha tĩnh. Stress thẩm thấu được t o ra do sucrose và các tác nhân khác cho thấy có thể điều hòa quá trình s n xuất anthocyanin trong nuôi cấy tế bào V. vinifera. - Betalaine Các betalaine là các sắc tố tiêu biểu có trong các loài thực vật h t kín và các loài thực vật có hoa thuộc các họ Chenopodiaceae, Amaranthaceae và Phytolacaceae. Một số loài nấm ăn thuộc bộ Agaricinales cũng s n xuất betalaine. Nuôi cấy tế bào thực vật đã chứng minh được kh năng s n xuất betalaine. Giống như nhiều chất thứ cấp khác, betalaine trong nuôi cấy tế bào thực vật đ t nồng độ cực đ i trong pha tĩnh của sinh trư ng tế bào. Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào dịch huyền phù của Phytolacca americana l i cho Công nghệ tế bào 111 thấy betalaine đ t nồng độ cao nhất pha sinh trư ng hàm mũ (pha log). Tế bào cây Chenopodium rubrum nuôi cấy 15 ngày tuổi có thể s n xuất được 35-45 mg betalaine/L môi trư ng. Nuôi cấy tế bào và nuôi cấy rễ tơ của cây Beta vulgaris cũng được tiến hành để s n xuất betalaine. - Crocin và crocetin Crocus sativus (cây nghệ tây) là nguồn cung cấp crocin chủ yếu, một lo i sắc tố màu đỏ tươi được tìm thấy trong đầu nhụy của nó. Đầu nhụy cây nghệ tây (saffron) cũng s n xuất các crocetin. Crocin là một digentiobiocide ester của crocetin. Đây là lo i nguyên liệu có giá trị cao, do thực tế cây nghệ tây chỉ có thể sinh trư ng những vùng địa lý đặc biệt trên thế giới và đòi hỏi nhiều nhân công khi thu ho ch. Muốn thu ho ch 1 kg đầu nhụy nghệ tây (một lo i gia vị có giá trị) cần ph i có kho ng 150.000 hoa. Hiện nay, ngư i ta đã phát triển các phương pháp nuôi cấy tế bào của đầu nhụy cây nghệ tây trong điều kiện in vitro để s n xuất các gốc cơ b n của saffron. Mô nuôi cấy trong trư ng hợp này được c m ứng để s n xuất các callus có màu chứa crocin và các crocetin và cũng là safrana (gốc cơ b n của chất màu) của saffron. - Capsaicin và các capsaicinoid Capsaicin là gốc cay chủ yếu của ớt, các capsaicinoid chịu trách nhiệm cho vị cay là dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin, homocapsaicin và homodihydrocapsaicin. Capsaicinoid được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như một phụ gia. Ngoài ra, ngư i ta còn sử dụng capsaicin tinh khiết để bào chế dược phẩm điều trị chứng viêm khớp và làm thuốc gi m đau. Capsaicin có thể được s n xuất bằng nuôi cấy bất động tế bào của Capsicum frutescens. Các tế bào Capsicum bất động sẽ s n xuất capsaicin cao gấp vài lần so với tế bào dịch huyền phù tự do. Mô giá noãn (placenta) của Capsicum được bất động sẽ s n xuất lượng capsaicin cao hơn các tế bào bất động. 1.2. Các chất mùi - Vanilla Đây là nguyên liệu t o mùi phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất. Vanilla tự nhiên là thị trư ng rất hứa hẹn cho s n xuất chất mùi bằng phương pháp công nghệ sinh học. Nó là hỗn hợp phức t p của các thành Công nghệ tế bào 112 phần chất mùi chiết ra từ h t của Vanilla planifolia. Đây là hóa chất mùi phổ biến và được sử dụng rộng rãi cho nhiều lo i thực phẩm. Kho ng 12.000 tấn vanilla được tiêu thụ hằng năm, nhưng trong đó chỉ kho ng 20 tấn được tách chiết từ h t, phần còn l i được s n xuất bằng phương pháp tổng hợp hóa học, thư ng là từ các s n phẩm hóa dầu như guaiacol và một đôi khi từ lignin, một s n phẩm của bột giấy. S n xuất các hợp chất mùi vanilla bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây V. planifolia đã được chứng minh thành công. Nuôi cấy tế bào cây V. planifolia được kh i đầu bằng nuôi cấy các cơ quan khác nhau của cây như lá hoặc đo n thân bằng cách dùng các tổ hợp chất kích thích sinh trư ng khác nhau. Thông thư ng, kinetin được dùng để kh i động sự tổng hợp vanillic acid trong nuôi cấy dịch huyền phù của V. planifolia. S n xuất vanilla được c i thiện bằng cách bổ sung thêm than ho t tính vào môi trư ng nuôi cấy. S n lượng vanilla trong nuôi cấy tế bào thư ng là 2,2%. Một số c i tiến điều kiện nuôi cấy đã làm gi m th i gian nuôi cấy tế bào từ 160 gi còn 50 gi và s n lượng vanilla tăng từ 100 mg/L lên đến hơn 1.000 mg/L, tương đương 8% hàm lượng vanilla trên trọng lượng khô. - Garlic và onion Các chất mùi garlic và onion cũng được s n xuất trong nuôi cấy tế bào. Các chất mùi này phát triển từ các tiền chất (precusor) ngo i sinh trong quá trình xử lý sau thu ho ch. Nuôi cấy tế bào cây tỏi (Allium sativum) không phân hóa (hoặc các callus phân hóa có màu xanh lục) đã thu được một số lo i tiền chất amino acid (methyl, propyl, allyl và cysteine sulphoxides) và hai lo i hợp chất ninhydrin-positive không xác định. Chất mùi tổng số thu được trong callus hình cầu màu trắng (globular white callus) và callus màu xanh lục phân hóa chậm (semidifferentiated green callus) tương ứng là 4% và 13% so với cây trồng trong tự nhiên. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật của cây hành (Allium cepa) để s n xuất các chất mùi onion cũng đã được phát triển. Prince (1991) đã chứng minh sự tăng lên của các hợp chất mùi onion trong nuôi cấy rễ. Thông qua việc bổ sung các amino acid như cysteine, methionine và glutathione, nồng độ cuối cùng của s n phẩm có thể tăng lên rất lớn. 1.3. Các chất ngọt - Stevioside Stevioside tự nhiên ngọt hơn sucrose kho ng 300 lần. Dịch chiết từ cây hoàn chỉnh chứa kho ng 41% stevioside. Các kiểm nghiệm về độc chất Công nghệ tế bào 113 học cho thấy rằng stevioside hoàn toàn an toàn cho ngư i dùng. Hơn nữa, các nghiên cứu nha khoa gợi ý rằng các s n phẩm này có thể ức chế thực sự sinh trư ng của các vi sinh vật vùng miệng. S n xuất stevioside trong nuôi cấy callus của Stevia rebaudiana đã được nghiên cứu chi tiết. Những nuôi cấy chồi t o rễ đã cho vị ngọt, chứng minh rằng c hai: rễ và lá cần thiết cho sự tổng hợp stevioside. 2. Các chất thứ cấp dùng trong dược phẩm 2.1. Các alkaloid Ngư i ta có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây Coffea arabica, betalain trong callus củ c i đư ng, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này ph i trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hương liệu và trong y học. Chất reserpine có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối lo n tuần hoàn cũng được s n xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào của cây này trong 30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn có thể s n xuất được 3.500 kg reserpine, tương đương với lượng hàng năm của c thế giới thu được từ rễ cây đó. Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) đã s n xuất được lo i alkaloid là scopolamine từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy. Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao s n nh kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng (monoclonal variation) và kỹ thuật gen, ngư i ta đã tăng được s n lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần. Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thư ng. Một số nghiên cứu đã phân lập được các dòng tế bào Cantharanthus s n xuất serpentin và ajmalacine từ nuôi cấy in vitro. Bằng lo i môi trư ng s n xuất đặc biệt ngư i ta đã đưa được s n lượng alkaloid của hai dòng tế bào tốt nhất lên một mức cao hơn nữa, trong đó một dòng t o được 162 mg/L serpentin, còn dòng kia t o được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalacine. Mới đây, ngư i ta đã hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy tế bào của cây C. roseus để s n xuất viblastine và vincristine Công nghệ tế bào 114 là hai chất chống ung thư rất m nh, hiện đang có nhu cầu rất cao vì chúng được sử dụng để chữa ung thư máu. Sikuli và cộng sự (1997) sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy hàm lượng hyoscyamine rễ đ t cực đ i sau 6 tuần nuôi cấy < 100 mg/L. 2.2. Các steroid Trong lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid, các dòng tế bào có năng suất cao đã được Kaul và cs đề cập đến từ năm 1969. Họ đã nuôi cấy thành công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để s n xuất diosgenin, là nguyên liệu thô chủ yếu để s n xuất các steroid chống thụ thai và các hormone tuyến thượng thận. Quá trình chuyển hóa các hợp chất glycoside tim (cardiac) bằng nuôi cấy tế bào của cây Digitalis lanata cũng đã được nghiên cứu. Ngư i ta nhận thấy, mặc dù các tế bào Digitalis ngừng s n xuất glycoside tim nhưng chúng vẫn có kh năng hydroxyd hóa digitoxin nguyên tử C12 để t o ra digoxin. Digoxin là một hợp chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa x y ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu qu khi đưa vào môi trư ng nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày, ngư i ta đã thu được 4 g β-methyl-digitoxin trong một bình nuôi dung tích 20 L. 2.3. Một số chất khác Thí dụ điển hình nhất là công nghệ s n xuất shikonin, một lo i sắc tố đỏ có kh năng diệt khuẩn, có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon. Bình thư ng shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật đã t o được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có kh năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào s n xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu ho ch tới 5 kg ho t chất và giúp gi m rất nhiều giá thành của shikonin. Hàm lượng tương đối cao của ubiquinone-10 được tìm thấy trong tế bào thuốc lá nuôi cấy in vitro và của L-dopa trong môi trư ng nuôi cấy tế bào Mucuma pruriens. Nuôi cấy tế bào của cây Panax pseudoginseng đã cho hàm lượng saponin khá cao. Nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza glabra đã thu được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô. Công nghệ tế bào 115 Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào của cây Coleus blumei đó là chất rosmarinic acid chiếm 13-15% trọng lượng khô trong chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần so với hàm lượng trong cây trồng điều kiện tự nhiên. Trong những năm 1980, ngư i ta cũng đã s n xuất rất có hiệu qu ginsengoside là ho t chất chủ yếu của nhân sâm Panax ginseng. Các anthraquinone là một nhóm các s n phẩm tự nhiên quan trọng có vi khuẩn, nấm, địa y và thực vật bậc cao có các ho t tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, gi m huyết áp, gi m đau, chống sốt rét, chống oxy hóa, kháng bệnh b ch cầu và các chức năng đột biến. thực vật bậc cao, chúng đã được tìm thấy rất nhiều họ thực vật khác nhau, chẳng h n Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Leguminosae... Nuôi cấy tế bào các loài của họ Rubiaceae đã cho phép thu được một lượng lớn anthraquinone thậm chí trong một số trư ng hợp đã vượt quá hàm lượng anthraquinone cây bố mẹ. Công ty Escagenetics (California, Mỹ) đã thành công trong s n xuất taxol bằng nuôi cấy rễ tơ (hairy-root). Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được sử dụng hiệu qu trong điều trị nhiều lo i ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì b n thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể s n xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng. VI. Sản xuất các protein tái tổ hợp Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để s n xuất các s n phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để s n xuất các protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp (protein ngo i lai) là protein tự nhiên được sửa đổi bằng công nghệ gen nhằm nâng cao hoặc thay đổi ho t tính của chúng. Tương tự như các tế bào vi sinh vật, các tế bào thực vật rất thích hợp cho các nguyên liệu tái tổ hợp do chúng có thể sinh trư ng trên môi trư ng tương đối đơn gi n không cần bổ sung protein, nhưng do chúng là các sinh vật eukaryote bậc cao nên có thể tiến hành các biến đổi hậu dịch mã như trong tế bào của ngư i. Nếu protein ngo i lai được s n xuất trong nuôi cấy tế bào và được tiết ra trong môi trư ng, nhiều hơn phần được tích lũy trong tế bào, thì việc thu hồi và tinh s ch s n phẩm có thể được tiến hành mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các Công nghệ tế bào 116 protein có nguồn gốc thực vật an toàn cho ngư i hơn các protein có nguồn gốc từ tế bào động vật b i vì các chất nhiễm bẩn và virus thực vật không ph i là tác nhân gây bệnh ngư i. Ngoài ra, nuôi cấy tế bào thực vật cũng là một công cụ thực nghiệm thuận lợi cho việc kh o sát sự s n xuất protein ngo i lai trong cây hoàn chỉnh (whole plants) (B ng 7.3). Thực vật chuyển gen hiện nay được xem là hệ thống s n xuất rất kinh tế cho việc s n xuất các protein ngo i lai như kháng thể, enzyme và hormone. S n xuất thương m i một số protein của vi khuẩn và động vật đã được tiến hành bằng thực vật. Yếu tố quan trọng nh hư ng đến hiệu qu kinh tế của s n xuất protein dựa trên cơ s thực vật là hiệu suất của protein ngo i lai hoặc nồng độ của s n phẩm được tích lũy trong sinh khối. Theo đó, ngư i ta đã chú ý c i thiện sự biểu hiện gen ngo i lai trong cây chuyển gen thông qua việc phát triển các promoter tốt hơn, chọn lọc các dòng chuyển gen ổn định, và ức chế gen im lặng (silence gene). Tuy nhiên, một yếu tố quan trọng là sự đứt gãy protein ngo i lai đã làm gi m nồng độ của s n phẩm chức năng trong mô thực vật sau khi các phân tử được tổng hợp và lắp ráp. Sự đứt gãy protein ngo i lai đã làm bẩn s n phẩm với các đo n protein mất ho t tính, và ngư i ta cũng gặp khó khăn khi lo i bỏ các protein đứt gãy này trong các ho t động thu hồi protein chức năng s n xuất quy mô lớn. Tìm hiểu chi tiết về vị trí và cơ chế của sự đứt gãy nội và ngo i bào là rất cần thiết để có thể phát triển phương pháp sao cho gi m thiểu được sự tổn thất protein hậu sau dịch mã. 1. GM-CSF người GM-CSF ngư i (human granulocyte macrophage-colony stimulate factor), là một trong bốn glycoprotein đặc biệt kích thích quần l c đ i thực bào của tế bào b ch cầu h t tổ tiên s n sinh ra các b ch cầu h t, đ i thực khuẩn và hai lo i tế bào máu trắng quan trọng. GM-CSF ngư i được ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh gi m b ch cầu trung tính (neutropenia) và bệnh thiếu máu không tái t o (aplastic anemia). Sử dụng GM-CSF ngư i trong cấy ghép tủy xương đã gi m thiểu đáng kể nguy cơ nhiễm trùng do chúng kích thích tăng tổng số b ch cầu trung tính. GM-CSF ngư i đã được biểu hiện trong nhiều cơ thể vật chủ khác nhau như: E. coli, Công nghệ tế bào 117 nấm men, A. niger, tế bào động vật có vú và tế bào thực vật, và hiện nay được s n xuất để dùng trong lâm sàng. Bảng 7.3. Một số protein tái tổ hợp được s n xuất bằng nuôi cấy tế bào thực vật. Protein được biểu hiện Loài thực vật Nhân tố sinh trư ng biểu mô ngư i Nicotiana tabacum Hormone sinh trư ng N. tabacum ngư i Albumin huyết thanh ngư i N. tabacum, Solanum tuberosum Nhân tố sinh trư ng N. tabacum cá hồi α-interferon ngư i Oryza sativa Hirudin (chống đông máu) N. tabacum Erythropoietin ngư i N. tabacum α and β haemoglobin ngư i N. tabacum Human muscarinic cholinergic receptors N. tabacum GM-CSF chuột N. tabacum Interleukin-2 và Interleukin-4 ngư i N. tabacum Alkaline phosphatase nhau thai ngư i N. tabacum α1-antitrypsin ngư i O. sativa HBsAg N. tabacum, Glycine max GM-CSF ngư i N. tabacum, O. sativa, Lycopersicum esculentum Kháng thể đơn dòng (Mab) chống HBsAg N. tabacum Lysozyme ngư i O. sativa Mab chuỗi nặng N. tabacum IgG2b/κ chuột N. tabacum Đo n kháng thể scFv N. tabacum, O. sativa Đo n kháng thể biscFv N. tabacum IgG2b/κ kích thước hoàn chỉnh Chuỗi nặng γ đơn dòng của chuột N. tabacum Bryodin 1 N. tabacum Công nghệ tế bào N. tabacum 118 2. Kháng thể IgG1 của chuột Đã được s n xuất bằng cách nuôi cấy rễ tơ và tế bào dịch huyền phù của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) chuyển gen. Để thực hiện lắp ráp kháng thể hoàn chỉnh, từ 2 đến 4 đo n kháng thể nhỏ đã được tích lũy trong sinh khối tế bào. Các nhân tố ức chế protease, các tác nhân ổn định protein, các nhân tố ức chế N-glycosylation và sự tiết protein, các tác nhân tái ho t động glycan (polysaccharide) và các mẫu dò ái lực đã được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm của các đo n này, kh o sát các vị trí của chúng và cơ chế hình thành. Tất c các phân tử kháng thể đã được tiết ra trong môi trư ng nuôi cấy. 3. Interleukin Là thuật ngữ chung cho các cytokine được b ch cầu s n xuất (lymphokine), trong đó interleukin-2 là một cytokine quan trọng nhất đối với sự phát triển và đáp ứng miễn dịch thích ứng, được sử dụng để điều trị một số bệnh viêm nhiễm virus và bệnh ung thư. Interleukin-2 (IL-2) và interleukin-4 (IL-4) của ngư i được s n xuất và tiết ra môi trư ng nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây N. tabacum đã biến đổi di truyền. Sự tiết qua màng huyết tương và thành tế bào vào môi trư ng được thuận lợi nh trình tự leader tự nhiên của của động vật có vú. Nồng độ của IL-2 và IL-4 trong môi trư ng nuôi cấy tương ứng là 0,10 và 0,18µg/mL, mặc dù nồng độ của chúng bên trong các lymphokine là cao hơn (IL-2 kho ng 0,8 µg/mL và IL-4 kho ng 0,28 µg/mL). Phân tích Western blot10 cho thấy IL-4 được tiết ra môi trư ng nuôi cấy tế bào thực vật là hai chuỗi polypeptide nhỏ với trọng lượng phân tử kho ng 18-20 kDa. Ho t tính sinh học của IL-2 được xác định b i sự sinh s n tế bào của dòng tế bào CTLL-2 của chuột phụ thuộc IL-2 [CT.h4S] 10 Western blot: kỹ thuật phân tích protein dựa trên nguyên lý liên kết kháng nguyên-kháng thể để phát hiện protein đặc hiệu có b n chất kháng nguyên (thư ng được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi ch y điện di SDS-PAGE, và cố định đó). Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase hoặc horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để t o màu. Sự hiện diện của protein ngo i lai (s n phẩm dịch mã của gen ngo i lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nh sự xuất hiện màu của ph n ứng lai. Công nghệ tế bào 119 được chuyển nhiễm ổn định bằng receptor IL-4 của ngư i. Những khám phá này cho thấy rằng nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật có thể được sử dụng để s n xuất và tiết ra môi trư ng đủ lo i các protein động vật có vú có ho t tính sinh học dùng trong chẩn đoán và điều trị. VII. Chọn dòng tế bào biến dị soma Ngư i ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ba mức độ cấu trúc chính: callus, tế bào đơn (single cell) và tế bào trần. Trong ph m vi công nghệ (nuôi cấy) tế bào thực vật, ngư i ta thư ng tập trung các nghiên cứu cho mục đích chọn dòng tế bào s n xuất dư thừa (over production) các lo i s n phẩm chủ yếu là các amino acid và các hợp chất tự nhiên11. Nhìn chung, hiện tượng biến dị di truyền xuất hiện các tế bào không phân hóa (undifferentiation), các protoplast phân lập, các callus và các mô nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy tế bào thực vật có kh năng t o biến dị di truyền tương đối nhanh và không cần ph i ứng dụng các kỹ thuật phức t p khác. Các biến dị chọn lọc được trong nuôi cấy in vitro có nhiều cách gọi khác nhau như: dòng callus (calliclones-từ nuôi cấy callus) hoặc dòng protoplast (protoclones-từ nuôi cấy protoplast)... Tuy nhiên, thuật ngữ biến dị dòng soma (somaclonal variation) được sử dụng phổ biến nhất, hoặc biến dị dòng giao tử (gameclonal variation) để chỉ các dòng bị biến đổi di truyền phát triển từ các tế bào giao tử hoặc thể giao tử. Sự đa d ng của biến dị các dòng soma làm nổi bật một thực tế rằng biến dị dòng soma là một công cụ rất hữu hiệu cho việc c i thiện các đặc điểm di truyền của tế bào. VIII. Dung hợp protoplast hay lai vô tính tế bào thực vật Đặc trưng của tế bào thực vật là có thành cellulose bao quanh, sau đó đến màng nguyên sinh. Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình 11 Trong công tác giống cây trồng, chọn dòng tế bào biến dị soma có thể khái quát một số ứng dụng sau: - Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngo i c nh, ví dụ: chống chịu nóng, l nh, phèn, mặn, khô-h n... - Chọn dòng tế bào kháng các độc tố: độc tố do nấm bệnh tiết ra, các lo i kháng sinh… Các dòng tế bào mang các đặc tính mong muốn sau khi chọn lọc được sẽ được tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh để phát triển nguồn cây giống mới, thích hợp cho các điều kiện s n xuất nông nghiệp cụ thể. Công nghệ tế bào 120 dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh cho phép protoplast (tế bào đã được phá bỏ thành cellulose và chỉ còn l i màng sinh chất) có thể hấp thu vào tế bào các đ i phân tử (nucleic acid, protein) thậm chí c các cơ quan tử như lục l p, ty thể, nhân bào theo cơ chế của amip. Nếu để các protoplast c nh nhau, chúng có thể dễ hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell somatic hybridization). Kỹ thuật dung hợp protoplast cho phép m rộng nguồn gen của các loài thực vật, t o ra các dòng tế bào s n xuất mới12 mang các đặc tính di truyền ưu việt của c bố và mẹ. Một số kỹ thuật dung hợp protoplast như: - Dung hợp bằng hóa chất. Phương pháp này dùng NaNO3 hoặc polyethylene glycol (PEG) để kích thích dung hợp của hai protoplast. - Dung hợp bằng điện (electrofusion). Phương pháp này đơn gi n hơn, nhanh hơn và hiệu qu hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn c là dung hợp bằng điện không gây độc cho tế bào như thư ng thấy các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Cũng theo hướng này và gần đây đã được chứng minh, ngư i ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngo i lai vào trong tế bào thực vật. Trong dung hợp bằng điện, đầu tiên các protoplast được đưa vào trong ngăn dung hợp nhỏ có hai dây kim lo i song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp đó, sử dụng điện áp (voltage) thấp và trư ng AC dao động nhanh (rapidly oscillating AC field) để kích thích các protoplast sắp thành từng chuỗi tế bào (chuỗi ngọc trai-pearl chains) giữa các điện cực. Phương thức này cho phép các tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao (high-voltage DC pulses). Xung DC điện áp cao t o ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất (plasma membrane) vị trí tiếp xúc của các tế bào, t o ra sự dung hợp và tái tổ chức l i màng một cách hợp lý. Một quá trình hoàn chỉnh bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trư ng nuôi cấy, có thể được thực hiện trong năm phút hoặc ít hơn. 12 Hoặc các giống cây trồng mới cho s n xuất nông nghiệp. Công nghệ tế bào 121 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 2. Chia TF. 2003. Engineering Applications in Biology. Updated 1st ed. McGraw-Hill Education, Singapore. 3. Cutler SJ and Cutler HG. 2000. Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals. CRC Press LLC, USA. 4. Fischer R, Emans N, Schuster F, Hellwig S and Drossard J. 1999. Towards molecular farming in the future: using plant-cell-suspension cultures as bioreactors. Biotech Appl Biochem. 30: 109-112. 5. Hellwig S, Drossard J, Twyman RM and Fischer R. 2004. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nature Biotech. 22: 14151422. 6. Kieran PM, MacLoughlin PF and Malone DM. 1997. Plant cell suspension cultures: some engineering condiderations. J Biotech. 59: 39-52. 7. Klefenz H. 2002. Industrial Pharmaceutical Biotechnology. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany. 8. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 9. Ramawat KG and Merillon JM. 1999. Biotechnology: Secondary Metabolites. Science Publishers Inc. USA. 10. Roberts MF and Wink M. 1998. Alkaloids: Biochemistry, Ecology, and Medicinal Applications. Plenum Press, New York, USA. 11. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2nd ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA. Công nghệ tế bào 122 Chương 8 Công nghệ DNA tái tổ hợp Công cụ chính trong công nghệ sinh học hiện đ i là công nghệ DNA tái tổ hợp1 hay còn gọi là kỹ thuật di truyền. Công nghệ này cho phép thao tác trực tiếp trên các nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt. Bằng cách đưa các thông tin di truyền ngo i lai vào trong các cơ thể vi sinh vật, các tế bào động vật và thực vật sinh trưởng nhanh, chúng ta có thể s n xuất ra các s n phẩm của gen ngo i lai (các protein) với các tốc độ và hiệu suất cao hơn mà thường không thể thực hiện ở các hệ thống tế bào khác. Chương này trình bày những nét chính của các nguyên lý cơ b n trong kỹ thuật di truyền và các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào đã được chuyển gen ngo i lai. I. DNA và RNA Deoxyribonucleotide acid (DNA) là phân tử quan trọng nhất trong các tế bào sống và chứa tất c thông tin đặc trưng của tế bào. DNA và ribonucleotide acid (RNA) là các đ i phân tử2 polymer m ch thẳng được xây dựng trên các tiểu đơn vị riêng rẽ là các nucleotides. Một đơn vị monomer (nucleotide) có ba thành phần sau (Hình 8.1): - Đường năm carbon m ch vòng (pentose): deoxyribose cho DNA và ribose cho RNA. - Một nitrogen base của dẫn xuất hoặc purine hoặc pyrimidine liên kết đồng hóa trị với nguyên tử carbon thứ nhất của đường bằng liên kết kết Nglycoside (Hình 8.1). + Purine: adenine (A), guanine (G). + Pyrimidine: cytosine (C), thymine (T) cho DNA và uracil (U) chỉ cho RNA. - Một gốc phosphate gắn vào carbon vị trí thứ 5 của đường bằng liên kết phosphoester. 1 Xem chương 1 giới thiệu chung về công nghệ sinh học. Đ i phân tử (macromolecular): là một polymer được t o thành từ hơn 100 monomers. 2 Công nghệ tế bào 123 Phosphoric acid Đường Base deoxyribose Base ribose Hình 8.1. Cấu trúc của nucleotide. Các nucleotide của DNA được gọi là deoxyribonucleotide, vì chúng chứa đường deoxyribose, trong khi đó nucleotide của RNA được gọi là ribonucleotide vì chúng chứa đường ribose. Mỗi nucleotide chứa một vùng đặc trưng và một vùng không đặc trưng. Các nhóm đường và phosphate là phần không đặc trưng của nucleotide, trong khi các base purine và pyrimidine t o nên phần đặc trưng của nucleotide. Một nucleotide này sẽ được kết hợp với các nucleotide khác bằng một liên kết hóa học giữa các nguyên tử trong các vùng không đặc trưng t o ra các polynucleotide (Hình 8.2). Sự liên kết (được gọi là các liên kết phosphodiester) x y ra giữa một nhóm phosphate và một nhóm OH trên thành phần đường. Điểm đặc trưng nhất của DNA là nó thường bao gồm hai sợi bổ sung xoắn gần như song song xung quanh một trục chung t o thành một xoắn kép (double helix) tương tự như một cầu thang xoắn ốc (Hình 8.3). Mỗi sợi là một polynucleotide. Đường kính của xoắn (chiều ngang bậc thang) kho ng Công nghệ tế bào 124 o o 20 A , Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34 A , gồm 10 bậc thang nghĩa là mỗi vòng xoắn có 10 nucleotide trên mỗi sợi. đầu 5’ đầu 3’ Hình 8.2. Một phần của DNA. Hai sợi được kết hợp bằng liên kết hydrogen giữa các cặp base purine với pyrimidine3. Adenine (purine) luôn luôn bắt cặp với thymine (pyrimidine), và guanine (purine) với cytosine (pyrimidine). Kết qu phân tích hóa học về nồng độ phân tử của các base trong DNA đã cho thấy rằng lượng adenine luôn bằng thymine và lượng guanine luôn luôn bằng cytosine. Sự bắt cặp base này đặc trưng đến nỗi adenine chỉ liên kết với thymine và guanine chỉ liên kết với cytosine, nhờ đó đã t o ra một kh năng ổn định cao bởi liên kết hydrogen giữa các base bổ sung. Hơn nữa, đặc trưng của sự bắt cặp base này cho phép truyền thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Khi sự nhân đôi tế bào xuất hiện, xoắn kép của DNA tháo ra, và hai sợi DNA mới được t o thành bổ sung cho 3 Một liên kết hydrogen giữa hai sợi là một lực hút yếu giữa một nguyên tử hydrogen được liên kết đồng hóa trị (H-N) và một nguyên tử ketonic oxygen điện tích âm (C=O). Công nghệ tế bào 125 hai sợi gốc. Như vậy, mỗi tế bào mới chứa một sợi DNA gốc và một sợi DNA mới được tổng hợp trong xoắn kép của nó. o 20 A o 3,4 A Rãnh nhỏ o 34 A 5’ 3’ 3’ 5’ Trục đường-phosphate Rãnh chính Cặp base nitơ o 3,4 A Trục giữa Hình 8.3. Mô hình xoắn kép của phân tử DNA. Trình tự của các base (A, G, T và C) trong một sợi DNA đặc trưng cho một trình tự của các amino acid sẽ được lắp ráp để t o thành một phân tử protein. Mã di truyền là tập hợp các trình tự base tương ứng cho mỗi amino acid (codon). Vì chỉ có 4 base trong DNA và 20 amino acid trong protein, cho nên mỗi codon ph i chứa ít nhất 3 base4. Hai base không thể làm thành một codon bởi vì chỉ có 42 cặp hợp lý của 4 base. Nhưng 3 base thì có thể bởi vì sẽ có 43 = 64 bộ ba hợp lý. Vì số lượng bộ ba hợp lý lớn hơn 20, cho nên một vài codon chỉ định cùng một amino acid. Trong một nghĩa khác, mã di truyền là rất phức t p, ví dụ: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU và AGC đều cùng mã hóa cho serine (B ng 8.1). Hai mươi amino acid được tìm thấy trong các phân tử protein là: Alanine (Ala), Arginine (Arg), Asparagine (Asn), Aspartic acid (Asp), Cysteine (Cys), Glutamic acid (Glu), Glutamine (Gln), Glycine (Gly), Histidine (His), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Valine (Val). 4 Công nghệ tế bào 126 Bảng 8.1. Mã di truyền chung. Vị trí thứ nhất U C A G Vị trí thứ ba U Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser STOP STOP A U Leu Ser STOP Trp G C Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A C Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A G Val Ala Glu Gly G Vị trí thứ hai II. Tạo dòng gen T o dòng một gen là công việc trung tâm của công nghệ DNA tái tổ hợp. Gen là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của tế bào. Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và m nh nằm ở trong nhân, bao gồm chủ yếu là DNA. Thông tin di truyền được b o qu n trong một chuỗi trình tự của các base nucleotide, gồm có một đo n DNA. Mỗi gen ghi rõ cấu trúc của một s n phẩm gen đặc biệt, thường là một protein. 1. Các trình tự DNA Để thao tác gen, cần ph i biết về tất c các tổ chức của các trình tự DNA và các đơn vị chức năng của DNA tương tác với các các đơn vị khác trong tất c các đơn vị di truyền của cơ thể (genome) là như thế nào. Việc Công nghệ tế bào 127 phát hiện ra các enzyme h n chế (restriction endonucleases, RE) của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác dễ dàng hơn, vì nó có thể gi m chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đo n ngắn hơn. Các enzyme h n chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn c n DNA ngo i lai tiếp qu n bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được b o vệ khỏi tác dụng của enzyme h n chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bởi các enzyme h n chế. Mỗi enzyme h n chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA (Hình 8.4). Có hơn 500 enzyme h n chế khác nhau được tinh s ch từ kho ng 250 vi sinh vật khác nhau. Các enzyme h n chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 8.4: - Cắt trên một đường thẳng đối xứng để t o ra các phân tử đầu bằng. - Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để t o ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính). T G G A C C T G G A C C C C A G G T C C A G G T (a) T G G A C C T A C C C A G G T G G C G G C C A T (b) Hình 8.4. Hai kiểu cắt của enzyme h n chế. (a) t o ra đầu bằng, và (b) t o ra đầu so le Vì một enzyme h n chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đo n DNA được cắt bởi enzyme h n chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất c Công nghệ tế bào 128 các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đo n DNA từ một d ng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một d ng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA m ch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đo n DNA ngo i lai dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. 2. Sự kết hợp của các phân tử DNA Các phương thức cơ b n của công nghệ DNA tái tổ hợp là: (1) Kết hợp một đo n DNA vào một phân tử DNA (như là vector5) có thể tái b n, và (2) Cung cấp một môi trường cho phép sao chép phân tử DNA đã được kết hợp. Có ba lo i vector phổ biến được dùng để t o dòng các đo n DNA ngo i lai và tái b n (sao chép) trong E. coli. Đó là plasmid, bacteriophage λ và cosmid. Tất c những vector này ph i có một số tính chất cần thiết sau: - Có kh năng tự tái b n trong E. coli. - Chứa các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinh s ch vector của thể tái tổ hợp với các d ng khác. - Có các vùng DNA không cần thiết cho sự sinh s n trong vi khuẩn, vì thế DNA ngo i lai có thể được đưa vào trong các vùng này. - Có thể biến n p vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng. DNA plasmid có thể được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid bằng cách bổ sung chất tẩy (như là sodium dodecyl sulfate6) và bằng cách ly tâm sự sinh tan (lysate). Phức hợp nhiễm sắc thể vi khuẩn, lớn hơn plasmid nhiều, sẽ lắng xuống đáy của tube ly tâm, plasmid siêu xoắn và các đo n nhiễm sắc thể m ch thẳng giữ l i trong thể nổi. Plasmid siêu xoắn một lần nữa được phân tách bằng ly tâm sau khi xử lý với CsCl và EtBr. Vector là phân tử DNA được sử dụng để đưa DNA ngo i lai vào trong tế bào vật chủ. 6 Chất tẩy làm biến đổi bề mặt tế bào để gi i phóng các thành phần tế bào ra môi trường bên ngoài. 5 Công nghệ tế bào 129 Plasmid chứa các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ. Các plasmid mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, s n xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức t p, s n xuất các enzyme h n chế và enzyme biến đổi (modification enzymes). Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý sao cho tế bào có thể thấm qua nhất thời các phân tử DNA nhỏ. Quá trình này được biết như là sự biến n p (transformation). Vi khuẩn được biến n p thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, chẳng h n kh năng kháng các kháng sinh. Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số b n sao thấp (một hoặc một vài b n sao trên tế bào) do DNA plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần trước khi tế bào phân chia. Tuy nhiên, các plasmid khác tồn t i một số b n sao lớn hơn (10 tới 100 b n sao trên một tế bào) do DNA tái b n lặp l i cho đến khi đ t được số b n sao thích hợp. Các plasmid có số b n sao lớn được gọi là plasmid tái b n d ng lỏng lẽo (relaxed plasmid), và đây là một trong những tính chất hữu ích của vector t o dòng. Hình 8.5 trình bày một trong các vector plasmid d ng lỏng lẽo, pBR322 (thế hệ thứ hai), dài 4.363 bp, vector này chứa hai gen kháng kháng sinh là Ampicillin (Amp) và Tetracycline (Tet). Số thứ tự của các nucleotide trên vector được bắt đầu với vị trí EcoRI duy nhất: T đầu tiên trong chuỗi GAATTC được quy ước là nucleotide thứ nhất. Các số thứ tự sau đó được tiếp tục quanh phân tử vector theo hướng từ gen kháng Tet tới gen kháng Amp. Plasmid có thể được cắt ở một số thứ tự nào đó trong các vị trí xác định bằng enzyme h n chế. Vì thế, các đo n được t o ra có thể t o vòng bằng cách kết hợp các đầu kết dính bổ trợ. Hơn nữa, các đo n được t o ra bởi một enzyme đặc biệt ho t động trên một phân tử DNA sẽ có cùng đầu kết dính với đo n được t o ra bởi cùng một enzyme ho t động trên một phân tử DNA khác. Vì thế, các đo n từ hai phân tử DNA khác nhau từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đo n này được trộn l i. Nếu sự kết hợp được gắn l i sau khi bắt cặp, thì các đo n được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đo n này được thực hiện nhờ enzyme ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết đồng hóa trị các Công nghệ tế bào 130 phân tử tái tổ hợp bằng cách t o ra liên kết phosphodiester giữa đầu 5’-PO4 của một polynucleotide với đầu 3’-OH của polynucleotide khác. Hình 8.5. Plasmid vector pBR 322. Ampr và Tetr: gen kháng ampicillin và tetracycline, ori: trình tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE. Hình 8.6. trình bày toàn bộ phương thức s n xuất DNA tái tổ hợp (t o dòng gen). Plasmid được cắt ở các vị trí xác định bằng enzyme h n chế. DNA của một genome ngo i lai được cắt cùng một lo i enzyme, một số đo n trong đó có thể có gen quan tâm. Plasmid và các đo n của genome được phối trộn và kết hợp nhờ enzyme ligase. Các plasmid tái tổ hợp được biến n p vào vi khuẩn bằng đồng nuôi cấy plasmid và vi khuẩn. III. Khả năng ổn định của các vi sinh vật tái tổ hợp Khi các vi sinh vật tái tổ hợp được nuôi cấy để s n xuất protein tái tổ hợp, thì hiệu suất của s n phẩm protein có thể bị gi m do sự tổn thất của plasmid trong cơ thể khi chúng tr i qua nhiều lần sinh s n trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Kh năng mất ổn định có thể do: (1) Sự phân chia khiếm khuyết của plasmid trong quá trình phân chia của tế bào, hoặc (2) Mất kh năng ổn định cấu trúc t o ra các đột biến của DNA plasmid. Công nghệ tế bào 131 Để ổn định sự phân chia của plasmid, các tế bào cần được sao chép sao cho số lượng trung bình của các b n sao plasmid trên một tế bào được nhân gấp đôi chỉ trong một thế hệ, và các b n sao plasmid cần được phân phối bằng nhau tới các tế bào con khi phân chia tế bào. Một số kết qu nghiên cứu cho thấy sự không ổn định của plasmid đã được phát hiện trong các hệ thống cơ thể vật chủ như: E. coli, Bacillus subtilis cũng như nấm men. RE Cắt DNA ngoại lai và plasmid vector bằng một loại RE giống nhau RE RE Plasmid vector Gắn DNA DNA được tạo dòng Plasmid tái tổ hợp Biến nạp Tế bào vi khuẩn Sao chép vi khuẩn Sao chép vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn chứa một lượng lớn tế bào, sinh trưởng qua đêm ở 37oC sẽ sản xuất khoảng 109 tế bào/mL Hình 8.6. Phương thức cơ b n để t o dòng gen. Một bộ phận các tế bào mang plasmid trong quần thể tổng số được xem như là một hàm số lượng các thế hệ sinh trưởng. Vì thế, khi thể tích của hệ lên men tăng lên thì số lượng các thế hệ sinh trưởng (generation of Công nghệ tế bào 132 growth) cũng tăng, nhưng một bộ phận các tế bào mang plasmid và hiệu suất s n phẩm l i gi m. Sự không ổn định của plasmid sẽ tiếp tục nếu hệ lên men quy mô lớn được ho t động liên tục. 1. Động học lên men của các nuôi cấy tái tổ hợp Nếu gọi xác suất để các tế bào mang plasmid ( X + ) s n sinh ra các tế bào không mang plasmid ( X − ) sau một lần phân chia là p. Khi ấy với N tế bào mang plasmid, sau một lần phân chia sẽ s n sinh ra N(1-p) tế bào mang plasmid và Np tế bào không mang plasmid. Tổng số tế bào ( X + ) sẽ là N(2-p). Trong suốt thời kỳ sinh trưởng theo hàm mũ, tốc độ sinh trưởng của các tế bào mang plasmid sẽ được biểu diễn như sau: dC X + dt = (1 − p ) µ + C X + (8.1) Trong đó: µ + là tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào mang plasmid, C X + là số lượng các tế bào mang plasmid trên một đơn vị thể tích. Nếu khối lượng tế bào tương ứng xấp xỉ với số lượng tế bào, thì phương trình tốc độ sinh trưởng đã cho cũng có thể áp dụng được khi C X + là khối lượng tế bào trên một đơn vị thể tích. Mặt khác, tốc độ sinh trưởng của các tế bào không mang plasmid sẽ là: dC X − dt = pµ + C X + + µ − C X − (8.2) Trong đó: µ − là tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào không có plasmid, và C X − số lượng các tế bào không mang plasmid trên một đơn vị thể tích. Nếu chúng ta chấp nhận rằng µ + và p là hằng số, thì tích phân của phương trình (8.1) sẽ là: [ C X + = C X + exp (1 − p ) µ +t 0 ] (8.3) Trong đó: C X + là nồng độ ban đầu của các tế bào mang plasmid. 0 Công nghệ tế bào 133 Trong trường hợp các tế bào không mang plasmid, thay thế phương trình (8.3) vào (8.2) ta được: [ ] = pµ +C X + exp (1 − p ) µ +t + µ −C X − dC X − dt 0 (8.4) Gi i phương trình vi phân tuyến tính bậc một đã cho, ta có: CX − = pµ + C X + (1 − p ) µ + − µ − 0 {exp[(1 − p)µ t ] − exp(µ t )}+ C + − X 0− exp( µ − t ) (8.5) Vì vậy, các phương trình (8.3) và (8.5) dự báo sự thay đổi theo thời gian của C X + và C X − để đưa ra các giá trị của p, µ+ và µ -. Bộ phận các tế bào mang plasmid trong quần thể tổng số (f) có thể được định nghĩa như sau: f = CX+ CX + + CX − [ (8.6) ] Thay phương trình (8.3) và (8.5) vào phương trình (8.6) cho kết qu : f = [ ] C X + exp (1 − p ) µ + t + 0 C X + exp (1 − p ) µ + t pµ C X + + 0 (1 − p ) µ + − µ − 0 {exp[(1 − p)µ t ]− exp(µ t )}+ C + − X 0− exp( µ − t ) (8.7) Đây là phương trình chỉ ra sự thay đổi của bộ phận các tế bào mang plasmid theo thời gian trong suốt thời kỳ sinh trưởng hàm mũ của quá trình lên men mẻ. Điều này được quan tâm để xem f gi m như thế nào theo số lượng thế hệ. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng theo hàm mũ, số lượng thế hệ (n) của các tế bào mang plasmid có thể được tính toán từ mối quan hệ sau: n= µ +t (8.8) ln 2 Kết hợp các phương trình (8.7) và (8.8) sẽ có kết qu phương trình của f theo thế hệ thứ n như sau: f = [ 1−α − p 1 − α − p 2 n (α + p −1) ] (8.9) Trong đó, α là tỷ lệ của các tốc độ sinh trưởng đặc trưng: Công nghệ tế bào 134 µ+ α= − µ (8.10) Phương trình (8.9) có thể được dùng để dự báo sự thay đổi của f theo số thế hệ cho một lo t quá trình lên men mẻ, nếu chúng ta chấp nhận rằng các tế bào nhân lên theo hàm mũ trong khi nuôi cấy từng mẻ một. Hình 8.7 cho thấy nh hưởng của p và α lên f25 (f của 25 thế hệ), là thông số bị gi m khi tăng α và p. Khi p ≤ 0,01 và α < 1, thì f25 gần bằng 1, khi đó các tế bào mang plasmid rất ổn định. Tuy nhiên, khi α tiến tới 2, f25 cũng trở thành 0. Giá trị đặc trưng của α giao động từ 1 đến 2. 1,0 0,8 f25 p = 0,1 Hình 8.7. Bộ phận tế bào mang plasmid sau 25 thế hệ (f25) như là một hàm của α và p. p = 0,04 0,6 p = 0,01 p = 0,001 0,4 p = 0,0001 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 α Hình 8.8 cho thấy sự thay đổi của f như là một hàm của n và α. Giá trị p được đặt không đổi là 0,01. Giá trị của f gi m nhanh khi n và α tăng lên. Khi α bằng 1,4 tất c tế bào mang plasmid đã mất plasmid của chúng sau kho ng 33 thế hệ. α=0 1,0 1,0 0,8 f 0,6 Hình 8.8. Bộ phận tế bào mang plasmid (f) theo số lượng thế hệ n (p ≤ 0,01). 1,1 0,4 1,2 1,4 0,2 2,0 0,0 0 10 20 30 40 50 n Công nghệ tế bào 135 2. Nuôi cấy trong hệ thống lên men thùng khuấy liên tục (CSTF) Nói chung, chúng ta cần ph i kiểm tra kh năng ổn định của các tế bào tái tổ hợp trong hệ thống lên men thùng khuấy liên tục. Cân bằng nguyên liệu cho các tế bào mang plasmid chung quanh một CSTF s n xuất như sau: − DC X + + (1 − p ) µ + C X + = dC X + (8.11) dt Tương tự, cân bằng nguyên liệu cho các tế bào không mang plasmid đã được đưa ra như sau: − DC X − + pµ + C X + + pµ − C X − = dC X − (8.12) dt Cộng hai phương trình (8.11) và (8.12) sẽ được phương trình nồng độ tổng số của tế bào: ( µ + C X + + µ − C X − ) − D(C X + + C X − ) = d (C X + + C X − ) (8.13) dt Nếu CSTF được ho t động sao cho nồng độ tổng số của tế bào không đổi theo thời gian, thì: µ + (C X + αC X ) = D(C X + C X ) (8.14) µ+ = D (8.15) + − + − Nếu α = 1, thì phương trình (8.14) được đơn gi n hóa thành: Vì thế, tốc độ sinh trưởng đặc trưng của tế bào trong hệ lên men là không đổi và được xác định bằng tốc độ pha loãng. Thay phương trình (8.15) vào các phương trình (8.11) và (8.12) ta được: C X + = C X + exp(− pDt ) C X − = C X − + C X + [1 − exp(− pDt )] 0 0 0 (8.16) (8.17) Như vậy, trong suốt quá trình lên men liên tục, nồng độ của các tế bào mang plasmid sẽ bị gi m, trong khi đó nồng độ các tế bào không mang plasmid sẽ tăng lên. Công nghệ tế bào 136 Nếu α ≠ 1, thì µ+ không còn là hằng số đối với tốc độ pha loãng không đổi trong suốt sự ho t động ở tr ng thái ổn định của CSTF nữa nhưng vẫn phụ thuộc vào nồng độ tế bào ( C X + và C X − và α theo phương trình 8.14). Kết qu µ+ cũng thay đổi theo thời gian. Bằng cách gi i đồng thời các phương trình (8.11), (8.12) và (8.14), chúng ta có thể ước lượng C X + và C X − sẽ thay đổi theo thời gian như thế nào. Điều này có thể giúp kh o sát xem bộ phận tế bào mang plasmid sẽ gi m như thế nào theo thời gian. Thay phương trình (8.14) vào phương trình (8.11) và chia cho C X + và C X − ta có: df (1 − p) Df = − Df + α + (1 − α ) f dt (8.18) Gi i phương trình trên cho thấy giá trị f thay đổi theo thời gian. Giá trị lúc đầu của f dùng để gi i phương trình (8.18) có thể thu được từ phương trình (8.9). Hình 8.9 mô t sự thay đổi theo thời gian của bộ phận tế bào mang plasmid trong suốt sự ho t động ở tr ng thái ổn định của CSTF. Bộ phận tế bào mang plasmid bị gi m theo thời gian cùng với việc tăng tốc độ pha loãng lên. Khi p và D đủ thấp, và α gần tới 1, thì CSTF có thể ho t động một cách hiệu qu trong một thời gian dài. D = 0,1 1,0 0,2 0,8 0,6 p = 0,0001 n = 20 p = 0,0001 α = 1,2 n = 20 α=12 f 0,4 0,2 0,0 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0 20 40 60 80 100 t (giờ) Hình 8.9. nh hưởng của tốc độ pha loãng (D) lên bộ phận tế bào mang plasmid trong sự ho t động ở tr ng thái ổn định của CSTF. Giá trị ban đầu của f được tính toán bằng cách thừa nhận số lần sinh s n cần thiết cho bước tiếp mẫu và nuôi cấy mẻ ban đầu, và sự lên men liên tục ở tr ng thái không ổn định là 20. Công nghệ tế bào 137 Tuy nhiên, nếu α tăng lên đến 1,4 thì CSTF sẽ mất hầu như tất c các tế bào mang plasmid sau 100 giờ ho t động ở tr ng thái ổn định (Hình 8.10). α = 1,0 1,0 1,2 1,2 0,8 p = 0,0001 p =n 0,0001 = 20 -1 n =D20 = 0,2 giờ -1 D = 0 2 giờ 0,6 f 0,4 1,3 1,3 1,4 1,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 t (giờ) Hình 8.10. nh hưởng của α lên bộ phận của các tế bào mang plasmid trong sự ho t động ở tr ng thái ổn định của CSTF. Giá trị ban đầu của f được tính toán bằng cách thừa nhận số lần sinh s n cần thiết cho bước tiếp mẫu và nuôi cấy mẻ ban đầu, và sự lên men liên tục ở tr ng thái không ổn định là 20. 3. Các phương pháp ổn định Một số yêu cầu cần được lưu ý để đ m b o cho sự ổn định của hệ thống tái tổ hợp có khuynh hướng bị mất các plasmid của chúng như sau: - Xây dựng các công thức môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của các tế bào mang plasmid hơn qua các tế bào không mang plasmid. - Đặt các áp lực chọn lọc lên các tế bào không mang plasmid bằng cách dùng các đột biến quang tự dưỡng (auxotrophic mutants) hoặc các plasmid kháng kháng sinh. - Dùng plasmid hoặc chủng đột biến phụ thuộc nhiệt độ. - Dùng đối chứng biểu hiện gen phụ thuộc nhiệt độ. - Dùng các plasmid không chứa các nhân tố chuyển vị (transposon). Các nhân tố chuyển vị (còn gọi là gen nh y) là các đo n DNA có thể được chèn vào trong một vài vị trí trong bộ gen và có thể gây ra đột biến. - Dùng chủng tái tổ hợp không hoàn toàn. Công nghệ tế bào 138 IV. Biến đổi di truyền ở tế bào thực vật Mặc dù lợi ích của nuôi cấy tế bào thực vật quy mô lớn đã được thừa nhận, kỹ thuật này vẫn còn gặp một vài khó khăn khi ứng dụng công nghiệp để s n xuất các s n phẩm thứ cấp và sơ cấp. Việc sử dụng không đúng mức các kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật chủ yếu là do tốc độ sinh trưởng chậm của các tế bào thực vật so với tế bào vi sinh vật và s n lượng cũng thường thấp hơn. Những phát triển gần đây của công nghệ DNA tái tổ hợp cho thấy một hứa hẹn rất lớn trong việc gi i quyết vấn đề này. Các tế bào nuôi cấy sinh trưởng nhanh có thể được chọn lọc và biến đổi di truyền để t o ra các s n phẩm có giá trị thương m i ở nồng độ cao hơn hiệu suất bình thường của tế bào. Các s n phẩm nhiều tiềm năng của công nghệ DNA tái tổ hợp là các protein ngo i lai và các chất trao đổi thứ cấp. S n xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật biến đổi di truyền có thể tăng s n lượng một cách sâu sắc và thương m i hóa nhanh chóng các nuôi cấy thực vật ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các gen cần thiết cho sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp có giá trị kinh tế quan trọng đến nay vẫn chưa được phân lập. Bởi vì các chất trao đổi thứ cấp thường được sinh tổng hợp thông qua ho t động kết hợp của nhiều s n phẩm gen, nhiều gen được yêu cầu cho mỗi phương thức sinh tổng hợp để dẫn tới s n xuất các chất trao đổi thứ cấp. Trong khi đó, các gen mã hóa cho các protein có giá trị kinh tế quan trọng được nhận d ng và biến n p thành công vào các vi sinh vật bởi vì các protein là các s n phẩm gen trực tiếp. Kỹ thuật biến n p gen ngo i lai vào trong tế bào thực vật cũng được phát triển cho các ứng dụng nông nghiệp của nuôi cấy tế bào thực vật. Vì thế, s n xuất protein ngo i lai từ các tế bào thuốc lá được biến đổi di truyền có thể đ t được nhiều thành qu . Dưới đây là các ưu điểm tiềm tàng của việc ứng dụng tế bào thực vật như là các tế bào vật chủ cho các s n phẩm ngo i lai: - Các s n phẩm protein từ các tế bào thực vật tái tổ hợp có thể là các dược phẩm có hiệu lực và chức năng hơn các s n phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật bởi vì sự biến đổi hậu dịch mã là có thể x y ra trong các tế bào thực vật. Công nghệ tế bào 139 - Môi trường (chủ yếu là nguồn carbon) nuôi cấy tế bào thực vật được xác định tốt và không đắt tiền, trong khi các tế bào động vật đòi hỏi bổ sung huyết thanh rất đắt tiền trong môi trường dinh dưỡng của chúng. - Các tế bào dịch huyền phù thực vật có thể đ t đến mật độ tế bào rất cao (60% trọng lượng tươi hoặc 2,4% trọng lượng khô). Kết qu này cao hơn kết qu mà các kiểu nuôi cấy khác có thể đ t được. - Sự nhiễm bẩn bởi vi khuẩn và nấm dễ dàng được kiểm soát trong nuôi cấy mô thực vật. Hơn nữa các tác nhân nhiễm bẩn này thường không ph i là các tác nhân gây bệnh cho người. Hiatt và cộng sự (1989) đã cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc s n xuất các protein ngo i lai từ thực vật bằng cách chứng minh sự s n xuất immunoglobulin và lắp ráp các kháng thể chức năng trong cây thuốc lá được biến đổi di truyền. Họ đã biến n p vào m nh lá thuốc lá các DNA bổ sung (cDNA) tổng hợp từ mRNA của hybridoma chuột và đã tái sinh m nh lá thành cây hoàn chỉnh. Các thực vật biểu hiện các chuỗi immunoglobulin γ hoặc κ riêng rẽ được lai để s n xuất con cháu trong đó c hai chuỗi được biểu hiện đồng thời. Một kháng thể chức năng tích lũy tới 1,3% protein lá tổng số trong các thực vật biểu hiện các cDNA hoàn chỉnh chứa các chuỗi leader. 1. Kỹ thuật gen Một gen ngo i lai (của vi khuẩn hoặc động vật) cần ph i được sửa đổi để biểu hiện tính chất của chúng trong các tế bào thực vật. Điều này cho thấy rằng thông tin di truyền được yêu cầu cho sự biểu hiện gen, như là s n xuất mRNA từ gen và dịch mã mRNA thành protein, là hoàn toàn khác giữa thực vật và các cơ thể sống khác. Để có kết qu tốt nhất, c hai vùng ngược hướng (promoter) và cùng hướng (terminator) của gen cấu trúc (gen mã hoá cho s n phẩm protein mong muốn-coding gene) ph i được thay thế bằng một chuỗi DNA của thực vật chứa thông tin thích hợp như trình bày ở hình 8.11. 1.1. Promoter Promoter thực vật có thể phân chia thành hai lo i, cấu trúc và c m ứng. Các promoter cấu trúc có chức năng trong hầu hết tất c các mô. Các Công nghệ tế bào 140 promoter c m ứng thường là im lặng cho đến khi chúng được c m ứng nhờ các nhân tố môi trường hoặc nhân tố phát triển. Chẳng h n, các promoter cho quang hợp, các cơ chế b o vệ và phát triển hoa được c m ứng chỉ dưới một điều kiện nhất định. Chọn một promoter thực vật tùy thuộc vào b n chất của s n phẩm mong muốn. Đối với hầu hết các trường hợp, một promoter cấu trúc m nh là nguồn tốt nhất để s n xuất một s n phẩm ngo i lai. Tuy nhiên, nếu s n phẩm ngo i lai là bất lợi đối với sinh trưởng của thực vật, thì cần thiết sử dụng một promoter c m ứng sao cho s n phẩm sẽ được tổng hợp chỉ dưới các điều kiện mong muốn. Các promoter cho quang hợp được c m ứng nhanh nhờ ánh sáng trắng và tắt trong suốt thời gian tối. Các gen tiểu đơn vị nhỏ của ribulose1,5-biphosphate carboxylase và các gen protein light-harvesting được biểu hiện nhiều nhất trong mô xanh. Vì thế, promoter từ các gen này có kh năng là nguồn tốt nhất cho các biểu hiện c m ứng với ánh sáng. Các promoter cho quang hợp được phân lập từ các nguồn thực vật khác nhau và dùng cho sự biểu hiện của một gen vi khuẩn. Gen ngoại lai Pngoại lai T ngoại lai Vị trí tạo dòng P thực vật T thực vật Km pGA482 Tc Hình 8.11. Sơ đồ biểu hiện gen ngo i lai trong thực vật. P: promoter, T: terminator, pGA482: vector t o dòng thực vật, Km: gen kháng kanamycin, Tc: gen kháng tetracycline. Km Tc 1.2. Terminator Người ta biết rất ít về terminator của thực vật và chưa chứng minh được là liệu terminator của động vật có chức năng trong thực vật hay không. Công nghệ tế bào 141 Cho tới khi điều này được làm rõ, thì để an toàn hơn nên sử dụng một terminator thực vật để biểu hiện cực đ i một gen ngo i lai. Terminator nos (nopaline synthase) được dùng thường xuyên nhất mặc dù một số terminator khác của thực vật cũng đã được phân lập. 1.3. Các chuỗi tín hiệu Không nên có tín hiệu khởi đầu dịch mã (ATG) ở giữa chuỗi promoter và gen cấu trúc vì trình tự ATG này sẽ làm gi m một cách ý nghĩa hiệu suất dịch mã. Kho ng cách giữa các vùng điều hòa (promoter và terminator) và gen cấu trúc ph i không được quá dài. Nếu không thì mRNA được s n xuất sẽ kém ổn định. Một trong những nhân tố quan trọng xét về thực tế thao tác gen là vị trí cuối cùng của protein. Các protein ngo i lai được s n xuất có thể được duy trì trong tế bào chất, được chuyển vào trong một cơ quan tử, hoặc được tiết ra ngoài tế bào. Hầu hết protein thực vật phân bố trong tế bào chất, để nó được chuyển vào trong cơ quan tử của tế bào chất hoặc ra ngoài màng tế bào thì một tín hiệu đặc trưng (polypeptide) ph i được gắn vào đầu tận cùng amino của protein mong muốn. Chuỗi peptide tín hiệu này được tách ra trong giai đo n sớm của sự vận chuyển và chỉ một protein chức năng hoàn chỉnh được gi i phóng tới nơi đến cuối cùng. Điều này chưa được hiểu đầy đủ không biết liệu chỉ một mình chuỗi peptide tín hiệu có đủ cho sự vận chuyển đúng cách hay không. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự vận chuyển của protein ngo i lai vào trong chloroplast chỉ yêu cầu một peptide tín hiệu. Tuy nhiên, cơ chế vận chuyển vào trong các cơ quan tử khác hoặc trong môi trường ngo i bào là rất khác nhau. Nếu thông tin bổ sung trong thể protein chủ yếu cũng cần thiết, thì sẽ cực kỳ khó khăn khi thiết kế cho một protein ngo i lai được vận chuyển mà không có sự thay đổi về cấu trúc protein để khỏi làm hỏng chức năng của protein. Nhiều protein được tổng hợp trong các tế bào được biến đổi di truyền. Ví dụ: carbohydrate thường được gắn với các protein tìm thấy trên màng tế bào. Một số protein được phosphoryl hóa. Những biến đổi như thế hoặc gây ho t động hoặc làm bất ho t chức năng của protein. Vì vậy, một gen ngo i lai ph i được thao tác thích hợp cho một biến đổi hậu dịch mã chính xác. Ví dụ, nếu muốn gắn carbohydrate vào protein, thì có thể thiết kế một quá trình để tiết protein ra ngoài màng tế bào. Trong phương thức này protein có thể được biến đổi cho phù hợp. Tuy nhiên, các cơ chế biến đổi như thế có thể Công nghệ tế bào 142 khác nhau trong mỗi cơ thể sống. Vì thế, chọn lọc cẩn thận dòng tế bào thích hợp là rất cần thiết. 2. Biến nạp gen Có nhiều kỹ thuật khác nhau được dùng để biến n p gen vào tế bào thực vật, chẳng h n biến n p gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens, biến n p gen trực tiếp bằng vi đ n (microprojectile) nhờ súng bắn gen (gene gun) hoặc hệ thống dội bom (bombardement), xung điện (electroporation), vi tiêm (microinjection), sóng siêu âm (ultrasonic), tinh thể silicon carbide, PEG (polyethylene glycol)... Tuy nhiên, kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để biến n p một chuỗi DNA mới vào thực vật là dựa trên cơ sở Ti-plasmid của A. tumefaciens. Trong thời gian ủ tế bào thực vật với vi khuẩn đất, thì một chuỗi đặc biệt được gọi là DNA vận chuyển (T-DNA) của Ti-plasmid được chuyển từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Nếu gen ngo i lai được xâm nhiễm có trong TDNA, thì gen có thể được chuyển vào trong nhiễm sắc thể thực vật cùng với T-DNA. T-DNA tự nhiên mang các gen s n xuất phytohormone dẫn đến t o thành khối u ở các tế bào bị xâm nhiễm. Để tránh hiện tượng t o khối u và t o điều kiện cho việc chọn lọc nhanh các thể biến n p, các marker (gen chỉ thị) kháng của thực vật đã được phát triển bằng cách dung hợp gen kháng kháng sinh của vi khuẩn với các vùng điều hòa của thực vật như đã mô t ở phần trước. Theo phương thức này các marker kháng kanamycin và marker kháng chloramphenicol đã được xây dựng và sử dụng để thay thế các gen phytohormone trên vùng T-DNA. Do Ti-plasmid tự nhiên khó thao tác trực tiếp in vitro bằng các phương pháp DNA tái tổ hợp vì kích thước lớn của chúng (kho ng 200 kb), vì thế người ta đã phát triển các hệ thống đơn gi n hơn. Phương pháp hiệu qu nhất đã được sử dụng đó là hệ thống binary vector. Một trong các binary vector được trình bày ở hình 8.11. Hệ thống này phụ thuộc vào một vector nhỏ mang các yếu tố được yêu cầu tối thiểu trong d ng cis. Các chức năng khác cần cho cơ chế chuyển gen được giao cho một helper plasmid riêng biệt, Ti-plasmid. Những phương thức này cho phép đưa vào và duy trì một cách dễ dàng DNA ngo i lai chứa trong một gen đã được thao tác di truyền. Các tế bào thực vật có thể biến n p với một gen ngo i lai bằng phương pháp đồng nuôi cấy. Trong phương pháp này, các vi khuẩn A. tumefaciens chứa binary vector và một helper Ti-plasmid được trộn l i với các tế bào Công nghệ tế bào 143 nuôi cấy có ho t tính sinh trưởng hoặc m nh cắt của thực vật (m nh lá). Sau khi ủ hỗn hợp này kho ng hai ngày. Các tế bào biến n p được chọn lọc trên môi trường agar có kháng sinh thích hợp. Thể biến n p có thể được phát hiện bằng mắt thường sau khi đồng nuôi cấy từ 2-3 tuần. Một vài tế bào trong m nh lá đã được biến n p sẽ được tái sinh thành cây. Các cây chuyển gen này sau đó sẽ được sử dụng để t o callus dùng trong nuôi cấy dịch huyền phù tế bào ở các hệ lên men quy mô lớn. V. Biến đổi di truyền ở tế bào động vật Biến đổi di truyền các tế bào động vật có thể được ứng dụng để s n xuất một protein đặc trưng hoặc c i thiện đặc điểm của một dòng tế bào s n xuất. Cũng tương tự như ở thực vật, hiện nay có nhiều phương pháp đưa DNA ngo i lai vào tế bào động vật có vú để biến đổi di truyền, ví dụ: chuyển nhiễm (transfection) hay còn gọi là hóa biến n p, lipofection (DNA được đưa vào thông qua liposome), xung điện, vi tiêm DNA trực tiếp vào tế bào, bắn gen, dung hợp (fusion) tế bào động vật có vú với protoplast của vi khuẩn mang DNA hoặc các hệ thống viral vector (kể c các tiểu phần phage)... Các dòng tế bào chuyển nhiễm sẽ biểu hiện DNA ngo i lai ổn định chỉ khi nó được hợp nhất trong genome. Ngược với cơ thể vi sinh vật, sự hợp nhất của DNA ngo i lai hầu hết là không tương ứng (non-homologous). Vì thế, gen mã hóa s n phẩm protein có thể được hợp nhất trong các vùng của genome, mà vùng đó không thuận lợi cho việc biểu hiện hiệu qu của gen. 1. Kỹ thuật gen Một số gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) cho các tế bào động vật có vú là có sẵn. Các marker trội (có thể được dùng bất chấp dòng tế bào vật chủ) hầu hết liên quan với tính kháng thuốc. Các marker lặn (được sử dụng trong sự kết hợp với đặc điểm di truyền của tế bào vật chủ) có thể bao gồm các enzyme của sự chuyển hóa purine và pyrimidine, tính kháng thuốc hoặc chuyển hóa amino acid. Hai hệ thống thành công nhất là hệ thống glutamine synthetase (GS) và hệ thống dihydrofolate reductase (DHFR). Enzyme GS (được tổng hợp nhờ gen gs) xúc tác cho sự t o thành glutamine từ glutamate và các ion ammonium. Gen gs có thể được dùng như là một marker chọn lọc trong các tế bào hybridoma và myeloma hoặc các tế Công nghệ tế bào 144 bào không có gs khác. Các tế bào được chuyển nhiễm ổn định sẽ biểu hiện gen gs và sinh trưởng ổn định trên môi trường không có glutamine. Enzyme DHFR (được tổng hợp nhờ gen dhfr) dùng cho dòng tế bào CHO dhfr-. Dòng tế bào dfhr- không ổn định để tổng hợp tetrahydrofolate một cofactor cần thiết trong chuyển hóa một carbon (one-carbon). Các dòng tế bào dfhr- chỉ sinh trưởng ổn định trên môi trường chứa thymidine và hypoxanthine và các tiền chất (precursors) cần thiết để vượt qua sự khiếm khuyết này. Các tế bào chuyển nhiễm biểu hiện gen dhfr có kh năng sinh trưởng ổn định trên môi trường không bổ sung các chất nói trên. Biến đổi di truyền của các tế bào động vật có vú để c i thiện dòng tế bào chưa được phát triển rộng rãi nhưng cũng đã tăng lên đáng kể. Các lĩnh vực đang được quan tâm là kéo dài sự sống của các tế bào s n xuất, sinh trưởng trong môi trường không có huyết thanh, gi m sự t o thành các s n phẩm phụ và các đặc tính glycosylation. Apoptosis, yếu tố xuất hiện trong hầu hết các nuôi cấy tế bào động vật có vú, có thể bị nh hưởng nhờ việc đưa vào gen bcl2, một gen kháng apoptosis. Phương thức này sẽ kéo dài sự sống của tế bào và liên quan pha s n xuất của quá trình nuôi cấy. 2. Biến nạp gen Chọn phương pháp biến n p gen phụ thuộc vào mức độ biểu hiện gen được mong đợi, biểu hiện trong thời gian ngắn hoặc biểu hiện ổn định; lo i tế bào đích như tế bào dịch huyền phù hoặc tế bào dính bám, các dòng tế bào thích nghi hoặc phân hóa. Mỗi phương pháp đều đòi hỏi sự tối ưu cao, bao gồm các yếu tố như: số lượng tế bào, nồng độ DNA và vector biểu hiện. 2.1. Phương pháp chuyển nhiễm Dùng calcium phosphate kết tủa DNA, có ph m vi hiệu qu từ 1-104 khuẩn l c/106 tế bào/µg. Sự hợp nhất DNA ngo i lai trong DNA tế bào mang tính ngẫu nhiên. DNA chuyển nhiễm thường tái tổ hợp trước khi hợp nhất làm cho thể hội nhập mang nhiều b n sao DNA trong tế bào. Hiệu qu chuyển n p có thể tăng ở một vài dòng tế bào được xử lý dimethyl sulfoxide (DMSO) hoặc glycerol trong một thời gian ngắn (4-6 giờ) sau khi chuyển nhiễm. Xử lý sốc sau chuyển nhiễm bằng chloroquin diphosphate gây độc cao. Mức độ độc thay đổi giữa các dòng tế bào, đặc biệt các tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và các tế bào phân hóa ở giai đo n cuối. Khi thay calcium Công nghệ tế bào 145 phosphate bằng DEAE-dextran thì chuyển nhiễm DNA có thể ít độc hơn với mọi xử lý sốc sau chuyển nhiễm ở tế bào nuôi cấy dịch huyền phù và tế bào phân hóa. 2.2. Phương pháp lipofection Phương pháp này sử dụng các lipid trung tính hoặc mang cation để t o thành liposome. Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích DNA dính bám vào trong phần bào tan. Phương pháp này cho hiệu suất chuyển nap cao hơn hóa biến n p. Tính đồng nhất của thành phần lipid giữa màng tế bào vật chủ và lipofectant làm tăng hiệu qu dung hợp và tăng kh năng xâm nhập của DNA gắn kèm. Các liposome mang cation (lipofectin) thích hợp cho chuyển gen in vitro với hiệu suất trên 90% ở một số lo i tế bào nuôi cấy. Lipofectin được sử dụng để bọc các virus. Việc t o ra các liposome chứa protein virus trong lớp lipid đã c i thiện hiệu qu gắn của vector với các tế bào đặc biệt, như là tế bào ung thư gan. Chỉ có một số phương pháp thích hợp để chuyển DNA qua màng huyết tương bằng thực ẩm bào (endocytosis) và đẩy m nh các quá trình nội thể gây thoái biến và sắp xếp l i DNA. Liposome được dùng để phân phối in vivo và ex vivo các gen người tới tế bào đích thích hợp. 2.3. Phương pháp chuyển gen bằng xung điện Phương pháp này yêu cầu nghiêm ngặt các thông số của thiết bị điện xung liên quan đến hiệu suất xâm nhập của DNA. Dòng điện được sử dụng để t o ra ở các tế bào treo trong dung dịch DNA các lỗ thủng trên màng huyết tương và thông qua đó DNA theo grandient mật độ chui vào trong phần bào tan. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy dịch huyền phù lymphocyte (lympho bào). Chuyển n p gen bằng xung điện có khuynh hướng t o ra các thể hội nhập mang b n sao DNA đơn và thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào mầm phôi (embryonic stemES). Việc chuyển n p gen thông qua điện trường ở các tế bào t o máu (hematopoietic cells) và các thế hệ tổ tiên của chúng là phương thức thích hợp cho các virals vector đòi hỏi hệ thống đóng gói phức t p. Các tế bào tủy xương tổ tiên (bone marrow progenitor cells) được nuôi trong môi trường có cytokine, interleukin 3, sẽ tăng tần số chuyển nhiễm và biểu hiện gen ở các tế bào t o b ch cầu h t (granulopoietic) và thể hồng cầu (erythroid) tổ tiên. Các marker chọn lọc trội như là pSVNeo ghi mã cho một gen của prokaryote, neomycin phosphotransferase (neo) mang gen khởi động Công nghệ tế bào 146 (promoter) và gen tăng cường (enhancer) của Simian Virus 40 (SV 40), cho phép phân lập các tế bào kháng neomycin bằng cách dùng một d ng đồng đẳng của neomycin, G418, trong môi trường bổ sung. Chuyển n p gen pSVNeo bằng xung điện vào trong tế bào mầm tủy xương cho kết qu tốt, và có thể ứng dụng để chuyển n p cDNA của yếu tố đông máu (factor IX) vào trong tế bào đệm (stromal cells) có nguồn gốc tủy xương. 2.4. Phương pháp vi tiêm Là phương pháp chuyển DNA trực tiếp nhất và có hiệu qu cao. Tuy nhiên, số lượng tế bào thí nghiệm bị giới h n chỉ trong vài trăm. Kỹ thuật tinh xão và thiết bị đắt tiền của vi tiêm đã h n chế sử dụng rộng rãi phương pháp này. Tiến bộ lớn nhất của phương pháp vi tiêm là kh năng gi m sát biểu hiện của DNA ngo i lai ở các tế bào riêng rẽ. Hơn nữa, trong khi chuyển nhiễm và chuyển gen bằng xung điện có thể vô cùng độc, thì vi tiêm phân phối DNA trực tiếp vào trong nhân tế bào mà không gây nguy hiểm đến sự nguyên vẹn của tế bào. Để gi m độc tính tới mức tối thiểu, thể tích DNA ph i được h n chế nhỏ hơn 10% thể tích nhân. Đặc trưng của vi tiêm là cung cấp phương thức để t o ra các động vật được chuyển gen, đánh giá biểu hiện gen được t o dòng trong các tế bào phôi, cung cấp phương pháp trực tiếp để t o các đột biến chèn đo n (insertional mutants), xác định các nhân tố điều hòa biểu hiện gen đặc trưng mô và đặc trưng tế bào, và phân lập các dòng provirus nguyên vẹn của các retrovirus để tiến hành phân tích bệnh lý học. 2.5. Phương pháp dùng súng bắn gen Phương pháp này sử dụng các h t kim lo i như là tungsten hoặc vàng làm vi đ n. Vi đ n được bọc bằng DNA và được bắn đi với một vận tốc thích hợp để xâm nhập vào tế bào đích. Hiệu qu của phương pháp này tương đương với phương pháp chuyển nhiễm. Sự biểu hiện thành công của DNA ngo i lai trong tế bào chuột NIH 3T3, tế bào khỉ COS 7 và một dòng đ i thực bào (macrophage) đã được thông báo. Súng bắn gen và phương pháp tiêm trực tiếp DNA trần của plasmid bị h n chế đối với tim và các tế bào cơ xương của động vật. Chỉ có 1-3% tế bào nhận DNA và s n xuất một lượng nhỏ protein được ghi mã. Các phương tiện hiện hành hầu hết đều thích hợp cho các chiến lược vaccine trong đó với một lượng nhỏ protein là đủ để t o ra một ph n ứng miễn dịch. Công nghệ tế bào 147 2.6. Viral vector Các viral vector là các cấu trúc tái tổ hợp trong đó một hoặc nhiều gen virus được thay thế bởi DNA t o dòng. Chuyển n p gen đặc trưng mô hoặc tế bào được thực hiện bằng cách chọn lọc các điểm thụ c m của tế bào đặc hiệu virus. Virus mang DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào đích đặc trưng và phân phối t i trọng di truyền vào trong chúng. Một đặc điểm hấp dẫn của viral vector là điều hòa biểu hiện gen khi có mặt promoter và enhancer của virus. Các viral vector có nguồn gốc từ hầu hết các virus DNA, bao gồm SV 40, các virus t o u d ng nhú (papilloma virus) ở người và bò, nhóm virus DNA của parvoviridae (adeno-associated virus, AAV), adenoviruses (các virus mang DNA sợi kép), các virus bệnh mụn giộp (herpes) và virus bệnh đậu mùa (vaccinia). Kích thước của các đo n chèn (insert DNA) thay đổi từ 2-3 kb ở các papovavirus tới > 50 kb ở vaccinia. Các viral vector có thể cho phép biểu hiện trong thời gian ngắn và hầu như 100% ở điều kiện in vitro. DNA của provirus được s n xuất nhờ phiên mã ngược RNA của retrovirus (nhóm virus mang RNA sợi đơn) hợp nhất như là một b n sao đơn trong nhiễm sắc thể vật chủ, gi m tới mức tối thiểu sự phiên mã gen. Các viral vector đặc biệt được thiết kế để phân phối DNA ngo i lai vào trong các tế bào phân hóa, các tế bào mầm phôi, và các lymphocyte. Mặc dù các retrovirus đã được sử dụng để chuyển gen, nhưng cũng có một vài khó khăn do provirus của nó thiếu kh năng hợp nhất vào các tế bào thụ động, bởi vì DNA chỉ hợp nhất khi tế bào tr i qua thời kỳ phân bào. Điều này dẫn tới thất b i khi biểu hiện ở mức độ cao các gen chuyển n p. Để có kh năng tái tổ hợp, kích thước tối đa của đo n chèn DNA kho ng 7 kb. Tóm l i, chọn lựa một phương pháp chuyển n p gen thích hợp phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm và các tế bào đích (tế bào dính bám hay tế bào dịch huyền phù), chúng là những tế bào sơ cấp hay đã thích nghi, đã phân hóa hay có nhiều tiềm năng. Thử nghiệm biểu hiện của DNA chuyển nhiễm có thể là t m thời (trong thời gian ngắn) hoặc bền vững (ổn định) với các mức độ biểu hiện cơ b n hoặc có thể suy diễn. Các dòng tế bào dính bám dễ thao tác bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau với thử nghiệm thành công biểu hiện gen sau đó. Khi độc tính của phương pháp chuyển nhiễm lo i trừ kh năng biểu hiện gen, thì một trong các phương pháp khác có thể cho phép thiết kế thí nghiệm thành công. Khi phương pháp chuyển nhiễm, xung điện, và viral vector thất b i thì phương pháp vi tiêm có thể sẽ thích hợp. Chuyển n p gen trong các tế bào không dính bám khó thực hiện nhưng sử dụng viral vector và chuyển nhiễm DEAE, cũng như Công nghệ tế bào 148 liposome có thể là gi i pháp hợp lý. Có kh năng vi tiêm các tế bào không dính bám nhưng cần sự dính kết hóa học của tế bào với cơ chất. Nồng độ DNA dùng trong thí nghiệm chuyển gen thay đổi từ 1ng đến 10 µg cho 105-106 tế bào nhận. Trong vi tiêm, một vài trăm tế bào được tiêm trực tiếp DNA nồng độ từ 1 pg đến 1 µg/µl tương đương với 1-102 b n sao của cấu trúc tái tổ hợp. Số lượng b n sao đưa vào trong các tế bào nhận vật chủ tỷ lệ với kích thước vector, đo n chèn (insert DNA) và nồng độ DNA. Các cấu trúc m ch thẳng hợp nhất thông qua tái tổ hợp cao hơn kho ng 10 lần các cấu trúc m ch vòng. Chuyển nhiễm thông qua liposome trở thành một kỹ thuật phổ biến nhờ độc tính thấp hơn và hiệu qu chuyển n p cao. Trong khi phương pháp xung điện đòi hỏi một số lượng lớn DNA (10-40µg) và trung bình sẽ giết chết một nửa tế bào nhận. VI. Các ký hiệu C CX + nồng độ, số lượng tế bào/m3 hoặc kg/m3 số lượng các tế bào mang plasmid trên một đơn vị thể tích CX + nồng độ ban đầu của các tế bào mang plasmid CX − số lượng các tế bào không mang plasmid trên một đơn vị thể tích CX − nồng độ ban đầu của các tế bào không mang plasmid D tốc độ pha loãng, s-1 f số tế bào mang plasmid trong quần l c tế bào tổng số, thông số không có thứ nguyên số tế bào mang plasmid trong quần l c tế bào tổng số sau n thế hệ, thông số không có thứ nguyên số thế hệ, thông số không có thứ nguyên xác suất xuất hiện số tế bào không có plasmid trong một thế hệ thời gian, s tỷ lệ của các tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ-/µ+), thông số không có thứ nguyên tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào mang plasmid, s-1 0 0 fn n p t α µ+ µX+ X− tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào không có plasmid, s-1 tế bào mang plasmid tế bào không mang plasmid Công nghệ tế bào 149 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 2. Bains W. 2003. Biotechnology from A to Z. Oxford University Press, Inc. New York, USA. 3. Chia TF. 2003. Engineering Applications in Biology. Updated 1st ed. McGraw-Hill Education, Singapore. 4. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 5. Old RW and Primrose. 1989. Principles of Gene Manipulation. Blackwell Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK. 6. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 7. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. nd 8. Singleton P and Sainsbury D. 2001. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. 3rd ed. John Wiley & Sons, Ltd. UK. 9. Walker JM and Rapley R. 2002. Molecular Biology and Biotechnology. 4 ed. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. th Công nghệ tế bào 150 Chương 9 Tiệt trùng Hầu hết các quá trình lên men công nghiệp được tiến hành như các nuôi cấy thuần khiết trong đó chỉ có các chủng chọn lọc được phép sinh trư ng. Nếu một cơ thể vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trư ng hoặc trong bất kỳ một bộ phận thiết bị nào đó, thì chúng sẽ làm nhiễm bẩn môi trư ng, sản xuất ra các sản phẩm có hại có thể hạn chế sinh trư ng của các cơ thể được sản xuất. Vì thế, trước khi bắt đầu quá trình lên men, môi trư ng và các thiết bị lên men phải được tiệt trùng để loại bỏ tất cả các nguy cơ gây nhiễm và các điều kiện vô trùng này phải được duy trì trong suốt quá trình lên men. I. Các phương pháp tiệt trùng Tiệt trùng môi trư ng lên men hoặc các thiết bị có thể thực hiện bằng cách phá hủy tất cả các cơ thể sống hoặc bằng phương thức nhiệt (ẩm hoặc khô), hoặc các tác nhân hóa học, chiếu xạ (tia cực tím hoặc tia X) và bằng các phương pháp cơ học (siêu âm hoặc sóng âm thanh). Một hướng khác là loại các cơ thể sống bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm tốc độ cao. 1. Nhiệt Nhiệt là phương thức được sử dụng rộng rãi nhất để tiệt trùng, có thể sử dụng cho cả hai loại môi trư ng đặc và lỏng. Nó có thể được ứng dụng dưới dạng nhiệt khô hoặc ẩm (hơi nước). Nhiệt ẩm thư ng hiệu quả hơn nhiệt khô, do khả năng kháng nhiệt bên trong của các tế bào vi khuẩn được tăng lên mạnh trong trạng thái khô hoàn toàn. Kết quả là tỷ lệ chết của tế bào khô thấp hơn nhiều so với tế bào ẩm. Sự dẫn nhiệt trong không khí khô cũng có tốc độ kém hơn trong không khí ẩm. Vì thế, nhiệt khô chỉ được dùng để tiệt trùng dụng cụ thủy tinh hoặc các vật liệu rắn chịu nhiệt. Bằng cách tăng áp suất lên bình nuôi cấy, nhiệt độ hơi nước có thể tăng lên một cách ý nghĩa trên cả điểm sôi của nước. Nồi tiệt trùng áp suất (autoclave) phòng thí nghiệm thư ng được hoạt động áp suất hơi nước khoảng 15 psi tương ứng với 121oC, các bào tử vi khuẩn bị giết nhanh 121oC. Công nghệ tế bào 151 2. Hóa chất Các tác nhân hóa học có thể được dùng để giết vi sinh vật bằng khả năng oxy hóa hoặc alkyl hóa. Tuy nhiên, chúng không được dùng để tiệt trùng môi trư ng b i vì các hóa chất này có thể ức chế sinh trư ng của các cơ thể lên men. Các tác nhân hóa học được sử dụng thư ng xuyên cho việc xử lý để loại bỏ hoặc làm giảm mức độ nguy hại của các tác nhân gây bệnh. Một số tác nhân hóa học kháng khuẩn chính là: phenol và các hợp chất phenol (phenol, cresol, orthophenylphenol), alcohol (ethyl, methyl), các halogen (iodine, hypochlorite, chloramine), các chất tẩy, thuốc nhuộm, các hợp chất ammonium bậc bốn, các acid, kiềm và các tác nhân gây vô sinh dạng khí (ethylene oxide, β-propiolactone, formadehyde). 3. Tia cực tím Nhiều nguyên liệu tế bào hấp thụ ánh sáng cực tím, dẫn đến gây nguy hiểm cho gen và sau đó giết chết tế bào. Bước sóng khoảng 256 nm có hiệu quả diệt khuẩn cao nhất. Tuy nhiên, tia cực tím có rất ít khả năng xuyên qua vật chất. Vì thế, việc sử dụng chúng bị hạn chế đối với việc làm giảm quần thể vi sinh vật trong phòng nơi mà điều kiện vô trùng cần thiết được duy trì thư ng xuyên, chẳng hạn như các phòng mổ của bệnh viện hoặc các buồng làm việc sạch trong phòng thí nghiệm. Tia X gây chết cơ thể vi sinh vật và có khả năng xuyên qua vật chất. Tuy nhiên, chúng không thực tế như các công cụ tiệt trùng khác do chi phí đắt cũng như sự lo lắng về an toàn lao động. 4. Sóng siêu âm Sóng âm thanh hoặc siêu âm có cư ng độ đủ mạnh cũng có thể phá vỡ và giết chết tế bào. Kỹ thuật này thư ng được sử dụng để phá vỡ tế bào nhằm tách chiết các thành phần của nội bào (protein, enzyme...) hơn là để tiệt trùng. 5. Lọc Là kỹ thuật được sử dụng hiệu quả nhất trong việc loại bỏ các vi sinh vật trong không khí hoặc trong các loại khí khác. Trong trư ng hợp dung dịch lỏng, nó được dùng cho các sản phẩm hoặc các loại môi trư ng không bền nhiệt, dễ dàng bị phá hủy như các huyết thanh ngư i và động vật, các loại enzyme. Công nghệ tế bào 152 Trong số các kỹ thuật được giới thiệu trên, nhiệt ẩm có hiệu quả và kinh tế nhất cho các yêu cầu tiệt trùng nói chung của hệ lên men. Vì thế, các phần sau đây chỉ mô tả động học của hiện tượng chết tế bào và các hoạt động tiệt trùng bằng nhiệt ẩm. II. Động học của hiện tượng chết do nhiệt Hiện tượng chết do nhiệt của vi sinh vật, một nhiệt độ đặc trưng, có thể mô tả bằng phương trình động học bậc một: dn = −k d n dt (9.1) Trong đó: kd là tốc độ chết đặc trưng, giá trị của nó phụ thuộc không chỉ vào loài mà còn vào dạng sinh lý của tế bào. Ví dụ: giá trị kd của bào tử vi khuẩn 121oC là 1 phút-1, trong khi đó giá trị này của các tế bào sinh dưỡng khác nhau từ 101 phút-1 đến 1010 phút-1 tùy thuộc vào từng cơ thể đặc biệt. Tích phân của phương trình (9.1) cho kết quả: n = − ∫ k d dt n0 0 t ln hoặc: (9.2) ⎛ t ⎞ n = n0 exp⎜⎜ − ∫ k d dt ⎟⎟ ⎝ 0 ⎠ (9.3) Phương trình (9.3) cho thấy sự suy giảm theo hàm mũ của quần lạc tế bào. Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của tốc độ chết đặc trưng kd có thể được thừa nhận theo phương trình Arrhenius: ⎛ E ⎞ k d = k d 0 exp⎜ − d ⎟ ⎝ RT ⎠ Trong đó: k d 0 là hệ số Arrhenius bằng 5,7×1039 gi (9.4) -1 , R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, Ed là năng lượng hoạt động có thể thu được từ độ dốc của đồ thị ln(kd) theo 1/T. Ví dụ: năng lượng hoạt động của E. coli là 127 kcal/gmol và của Bacillus stearothermophilus (chủng Fs 7954) là 68,7 kcal/gmol. Công nghệ tế bào 153 III. Tiêu chuẩn thiết kế Từ phương trình (9.2) và (9.4) tiêu chuẩn thiết kế cho sự tiệt trùng (∇) có thể được định nghĩa như sau (Deindoerfer và Humphrey 1959): ∇ = ln t t n ⎛ E ⎞ = ∫ k d dt = k d 0 ∫ exp⎜ − d ⎟dt n0 0 ⎝ RT ⎠ 0 (9.5) ∇ cũng được xem như là yếu tố Del, là thước đo quy mô của công việc được hoàn thành. Yếu tố Del tăng lên khi số tế bào cuối cùng giảm. Ví dụ: Khi giảm số tế bào trong hệ lên men từ 1010 cơ thể có thể sinh trư ng được xuống còn 1 thì yếu tố Del sẽ bằng: ∇ = ln 1010 = 23 1 (9.6) Việc giảm số lượng tế bào từ 1010 xuống còn 1 dư ng như rất ấn tượng. Tuy nhiên, thậm chí nếu 1 cơ thể còn sống thì toàn bộ hệ lên men vẫn bị nhiễm. Vì thế, tất cả các vi sinh vật còn sống phải được đào thải. Khi giảm số lượng tế bào tới 0 thì yếu tố Del bằng ∞, điều đó có nghĩa là về mặt lý thuyết không có khả năng phá vỡ tất cả cấu trúc của các tế bào sống. Vì thế, số lượng tế bào cuối cùng cần thiết được biểu hiện như là phân số của 1, bằng với xác suất của sự nhiễm bẩn. Ví dụ: n = 0,001 nghĩa là cơ hội cho một nhân tố gây nhiễm bẩn sống sót khi bị tiệt trùng là 1/1000. Nhân tố Del làm giảm số lượng tế bào trong hệ lên men từ 1010 cơ thể sống xuống còn 0,001 là: ∇ = ln 1010 = 30 0,001 (9.7) Dựa trên cơ s tiêu chuẩn tiệt trùng đã được tính toán, chúng ta có thể thiết kế một thiết bị tiệt trùng tối ưu. IV. Tiệt trùng từng mẻ Tiệt trùng môi trư ng trong hệ lên men có thể tiến hành từng mẻ bằng cách phun hơi nước (steam sparging) trực tiếp, bằng các bộ phận đun nóng bằng điện, hoặc bằng áp lực tuần hoàn không đổi làm ngưng tụ hơi nước thông qua cuộn dây đốt. Các chu kỳ tiệt trùng được sắp xếp theo thứ tự đun Công nghệ tế bào 154 nóng, giữ nóng và làm lạnh. Vì thế, yếu tố Del toàn phần (total) sẽ bằng tổng số yếu tố Del đun nóng (heat), giữ nóng (hold) và làm lạnh (cool): ∇ total = ∇ heat + ∇ hold + ∇ cool (9.8) Giá trị của ∇ heat và ∇ cool được xác định bằng các phương pháp dùng cho quá trình đun nóng và làm lạnh. Giá trị của ∇ hold được xác định bằng chiều dài của th i gian giữ nóng. Phương thức thiết kế để đánh giá th i gian giữ nóng như sau: - Tính toán tiêu chuẩn tiệt trùng toàn phần. - Xác định profile của nhiệt độ theo th i gian trong suốt các chu kỳ đun nóng, giữ nóng và làm lạnh của quá trình tiệt trùng. Nếu các phép đo thực nghiệm không tiến hành được, thì các phương trình lý thuyết cho việc làm nóng và lạnh có thể được sử dụng, đó là những phương trình đư ng thẳng, hàm mũ hoặc hyperbolic tùy thuộc vào kiểu làm nóng và lạnh. Các phương trình được gợi ý cho các quá trình làm nóng và lạnh khác nhau như sau (Deindoerfer và Humphrey 1959): + Đun nóng từng mẻ bằng cách phun hơi nước trực tiếp vào môi trư ng, phương trình dạng hyperbolic: T = T0 + Hms t c( M + m s t ) (9.9) Trong đó: T là nhiệt độ tuyệt đối (oK), T0 là nhiệt độ tuyệt đối ban đầu của môi trư ng (oK), H là enthapy của hơi nước liên quan với nhiệt độ của môi trư ng chưa nấu chín (J/kg), ms là tốc độ dòng chảy của khối hơi nước (kg/s), t là th i gian (s), c là nhiệt đặc trưng của môi trư ng (J/kgoK), và M là khối lượng ban đầu của môi trư ng trong nồi tiệt trùng mẻ (kg). + Đun nóng từng mẻ bằng tốc độ không đổi của dòng nhiệt, như đun nóng bằng nhiệt, phương trình dạng đư ng thẳng: T = T0 + qTt cM (9.10) Trong đó: q là tốc độ truyền nhiệt (J/s). + Đun nóng từng mẻ bằng nguồn đẳng nhiệt, như tuần hoàn hơi nước thông qua cuộn dây đốt, phương trình dạng hàm mũ: ⎛ UAt ⎞ T = TH + (T0 − TH ) exp⎜ − ⎟ ⎝ cM ⎠ Công nghệ tế bào (9.11) 155 Trong đó: TH là nhiệt độ tuyệt đối của nguồn nhiệt (oK), U là hệ số chuyển nhiệt toàn phần (J/s m2oK), và A là diện tích mặt cắt của sự chuyển nhiệt xuất hiện trong khi tiệt trùng (m2). + Làm lạnh từng mẻ bằng cách dùng bể không đẳng nhiệt liên tục, như cho nước lạnh chảy qua nh ống làm lạnh xoắn, phương trình dạng hàm mũ: ⎧⎪ ⎡ ⎛ UA ⎞⎤ mc t ⎫⎪ ⎟⎟⎥ T = TC0 + (T0 − TC0 ) exp⎨− ⎢1 − exp⎜⎜ − ⎬ ⎪⎩ ⎣ ⎝ mc c ⎠⎦ M ⎪⎭ (9.12) Trong đó: TC 0 là nhiệt độ tuyệt đối ban đầu của bồn nhiệt (oK), mc là tốc độ dòng chảy của khối chất lỏng làm nguội (kg/s). - Vẽ giá trị của kd như là một hàm th i gian. - Lấy tích phân các diện tích dưới đư ng cong kd theo th i gian cho các quá trình làm lạnh và làm nóng để đánh giá tương ứng ∇ heat và ∇ cool. Nếu sử dụng các phương trình lý thuyết, thì lấy tích phân phương trình (9.5) sau khi thay thế các profile nhiệt độ thích hợp. Sau đó, th i gian giữ nóng có thể được tính toán từ phương trình: t hold = ∇ total ∇ heat +∇ hold + ∇ cool = kd kd (9.13) V. Tiệt trùng liên tục Tiệt trùng được tiến hành trong kiểu liên tục hiệu quả hơn kiểu từng mẻ. Tiệt trùng liên tục có một số ưu điểm sau: - Lập kế hoạch sản xuất đơn giản, cho phép sử dụng tối đa thiết bị và sự giảm thiểu sự chậm trễ. - Cung cấp các điều kiện tái sản xuất. - Có thể hoạt động nhiệt độ cao (140oC, chẳng hạn 121oC trong tiệt trùng từng mẻ), vì thế th i gian tiệt trùng có thể rút ngắn (th i gian giữ chỉ từ 1-2 phút). - Cần ít hơi nước bằng cách thu hồi nhiệt từ môi trư ng được tiệt trùng. Kết quả là nó cũng cần ít nước làm lạnh. - Dễ dàng hơn trong tự động hóa quá trình, nh vậy cư ng độ lao động ít hơn. Công nghệ tế bào 156 Một thiết bị tiệt trùng liên tục bao gồm ba bộ phận chính: đun nóng, giữ và làm lạnh. 1. Bộ phận đun nóng Phương pháp đun nóng có thể chia làm hai loại: phun hơi nước trực tiếp và làm nóng gián tiếp trong các thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống (shell-and-tube) hoặc có khung đĩa (plate-and-frame). Làm nóng trực tiếp hiệu quả hơn gián tiếp do không có vật cản (barrier) giữa môi trư ng và nguồn nhiệt. Dụng cụ phun hơi nước làm nóng nhanh môi trư ng tới một nhiệt độ tiệt trùng tối đa. Vì thế, sự tiệt trùng trong suốt th i gian đun nóng là đáng kể. Đối với làm nóng gián tiếp, bộ phận trao đổi nhiệt có khung đĩa thư ng hiệu quả hơn loại truyền nhiệt ống lồng ống. Tuy nhiên, bộ phận đầu bị hạn chế đối với các áp lực thấp (thư ng dưới 20 atm) do cư ng lực cấu trúc yếu của nó so với bộ phận sau. Loại có khung đĩa cũng thuận lợi cho các hệ thống có độ nhớt cao. Sự thay đổi nhiệt độ liên quan với th i gian lưu trung bình ( τ heat) khi môi trư ng đi qua nguồn đẳng nhiệt có thể được tính gần đúng như sau (Deindoerfer và Humphrey 1959b): ⎛ UAτ heat ⎞ TC2 = TH - (TH -TC1 ) exp⎜ − ⎟ cW ⎠ ⎝ (9.14) Với W là khối lượng môi trư ng trong hệ thống tiệt trùng. Trư ng hợp đun nóng bằng cách dùng nguồn nhiệt dòng nước ngược có tốc độ dòng chảy và công suất nhiệt tương đương, thì ta có phương trình sau: TC2 = TC1 − ∆TUAτ heat cW (9.15) 2. Bộ phận giữ nóng Môi trư ng được đun nóng đi qua bộ phận giữ nhiệt bao gồm một ống dài. Bộ phận giữ được duy trì trong các điều kiện đoạn nhiệt. Nếu nhiệt mất trong bộ phận này là không đáng kể, thì nhiệt độ có thể được thừa nhận là hằng số. Th i gian lưu trung bình trong bộ phận giữ là: Công nghệ tế bào 157 τ hold = L u (9.16) Trong đó: L là chiều dài bộ phận giữ, u là tốc độ trung bình. Từ đó yếu tố Del được tính như sau: ∇ hold = ln no ⎛ E ⎞ = k d τ hold = k d 0 exp⎜ − d ⎟τ hold n ⎝ RT ⎠ Với n0 là số lượng tế bào (9.17) th i điểm bắt đầu của bộ phận giữ. Nếu môi trư ng trong bộ phận giữ chạy như một dòng nút lý tư ng (ideal plug flow), thì th i gian lưu của môi trư ng trong phần này là giống với tất cả các môi trư ng khác. Vì vậy, mức độ tiệt trùng không thay đổi. Tuy nhiên, việc không giữ đúng mục tiêu do bản chất nhớt của chất lỏng, sự ma sát của thành ống, các xoáy nước bất thư ng của chất lỏng chảy đã gây ra sự phân chia dòng nút lý tư ng. Kết quả là profile tốc độ có giá trị cực đại giữa đư ng ống và giá trị tối thiểu vùng lân cận thành ống. Sự phân chia của dòng nút lý tư ng do sự trộn lẫn quanh trục có thể được mô tả bằng mô hình phân tán (Levenspiel 1972). Hình 9.1 trình bày yếu tố vi sai với độ dày dx trong ống giữ. Sự cân bằng nguyên liệu cơ bản cho các tế bào lơ lững trong môi trư ng là: Vào – Ra – Giết chết bằng tiệt trùng = Tích lũy Dòng chảy khối Độ phân tán u Cn S + u Cn S − DS − DS dC n dx (9.18) d (u C n ) Sdx dx dCn d ⎛ dC ⎞ + ⎜ − DS n ⎟dx dx dx ⎝ dx ⎠ dx Hình 9.1. Các cân bằng nguyên liệu quanh bộ phận sơ cấp trong ống giữ. trạng thái ổn định, giới hạn tích lũy bằng không. Sự đi vào và đi ra khỏi môi trư ng của tế bào nh một dòng chảy khối và một điều kiện Công nghệ tế bào 158 khuếch tán (độ phân tán) quanh trục. Số lượng tế bào đi vào trừ cho những tế bào r i đi bằng dòng chảy khối là: d (u C n ) ⎤ ⎡ u C n S − ⎢u C n S + Sdx ⎥ dx ⎦ ⎣ (9.19) Trong đó: Cn là mật độ số lượng tế bào, S diện tích mặt cắt của ống. Tương tự với sự khuếch tán phân tử, dòng chảy hướng trục x của tế bào lơ lững trong môi trư ng do sự phân tán quanh trục có thể được biểu diễn như sau: J n = −D dC n dx (9.20) Trong đó: D là hệ số phân tán quanh trục được mô tả bằng mức độ trộn ngược (backmixing) trong dòng chảy. Nếu D bằng 0, thì sự phân phối tốc độ hướng tới dòng chảy nút lý tư ng. Nếu D bằng ∞, thì dòng chảy trong ống sẽ phối trộn tốt giống như một cái bình được trộn hoàn toàn. Đối với dòng chảy xáo trộn hỗn loạn, thì hệ số phân tán tương quan như là một hàm của số Reynolds (Hình 9.2). 10,0 D udt 1,0 0,1 1,0×103 1,0×104 N Re = Hình 9.2. Tương quan cho Công nghệ tế bào d t uρ 1,0×105 1,0×106 µL D như là một hàm của số Reynolds. ud t 159 Số lượng các tế bào đi vào và đi ra nh sự phân tán quanh trục là: dC ⎞ ⎤ dC dC n ⎡ d ⎛ − ⎢− DS n + ⎜ − DS n ⎟dx ⎥ dx ⎠ ⎦ dx dx ⎝ dx ⎣ − DS (9.21) Số lượng các tế bào bị giết khi tiệt trùng là kdCnSdx. Vì thế, bằng cách thay thế phương trình (9.19), (9.21) vào trong phương trình (9.18) và đơn giản hóa, ta được: d ⎛ dC n ⎞ d (u C n ) − kd Cn = 0 ⎜D ⎟− dx dx ⎝ dx ⎠ (9.22) Đối với hằng số D và ū, phương trình (9.22) có thể được biến đổi trong dạng không có thứ nguyên: d 2Cn, dCn, k L N − − N Pe d Cn, = 0 Pe ,2 , dx dx u (9.23) Trong đó: C n, = Cn C n0 x, = N Pe = x L uL D NPe được biết như là số Péclet. Khi NPe = ∞ thì nó là dòng nút lý tư ng. Các điều kiện cho việc giải phương trình (9.23) là: dCn, + N Pe (1 − Cn, ) = 0 , dx x’ = 0 (9.24) dCn, =0 dx, x’ = 1 Giải phương trình (9.23) ta được: ⎛N ⎞ 4ϕ exp⎜ Pe ⎟ ⎝ 2 ⎠ Cn, x , =1 = ⎛ ϕN Pe ⎞ ⎛ ϕN ⎞ ⎟ (1 + ϕ ) 2 exp⎜ Pe ⎟ − (1 − ϕ ) 2 exp⎜⎜ − 2 ⎟⎠ ⎝ 2 ⎠ ⎝ Công nghệ tế bào (9.25) 160 Trong đó: ϕ = 1+ 4k d L / u N Pe (9.26) 3. Bộ phận làm lạnh Đối với bộ phận làm lạnh, dùng một buồng làm mát có khả năng loại nhiệt là rất hiệu quả. Một kỹ thuật khác là đưa môi trư ng nóng qua một van m rộng vào trong buồng chân không được xem là quá trình làm lạnh nhanh (flash cooling). Cả hai kỹ thuật này ít tốn th i gian, vì thế th i gian làm lạnh trong suốt quá trình tiệt trùng được cho là không đáng kể. Bộ phận trao đổi nhiệt ống lồng ống và có khung đĩa cũng có thể được dùng để làm lạnh bằng cách dùng bồn đẳng nhiệt là: ⎛ UAτ cool ⎞ TH 2 = TC − (TC − TH 1 ) exp⎜ ⎟ ⎝ cW ⎠ (9.27) Trong đó: TC là nhiệt độ tuyệt đối của bồn nhiệt. Trư ng hợp làm lạnh bằng cách dùng bồn nhiệt dòng nước ngược có tốc độ dòng chảy và khả năng nhiệt bằng nhau, thì ta có phương trình sau: TH 2 = TH 1 − ∆TUAτ cool cW (9.28) 4. Tiệt trùng không khí Đối với lên men hiếu khí (aerobic fermentations), thì cần cung cấp không khí liên tục. Tốc độ sục khí đặc trưng cho lên men hiếu khí khoảng 0,5-1,0 vvm (thể tích khí/thể tích chất lỏng/phút). Điều này đòi hỏi một lượng lớn không khí. Vì thế, không chỉ môi trư ng mà không khí cũng phải vô trùng. Tất cả những kỹ thuật vô trùng dùng cho môi trư ng cũng có thể áp dụng cho không khí. Tuy nhiên, tiệt trùng theo phương thức nhiệt không thực tế về mặt kinh tế và cũng không hiệu quả do hiệu suất truyền nhiệt thấp của không khí so với chất lỏng. Kỹ thuật tiệt trùng có hiệu quả nhất cho không khí là phương pháp lọc bằng cách dùng bộ lọc màng (membrane filter) hoặc bộ lọc sợi (fibrous filter). Nút bông, thư ng được dùng như là nắp đậy cho ống nghiệm hoặc bình tam giác đựng dung dịch vô trùng, là một ví dụ tốt để loại vi sinh vật ra Công nghệ tế bào 161 khỏi không khí bằng sợi lọc. Một bộ lọc đơn giản được làm bằng cách nhồi bông trong cột. Tuy nhiên, với các bộ lọc làm bằng bông thì sự giảm áp lớn và sự ẩm ướt có thể là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm bẩn. Vì thế, các sợi thủy tinh thích hợp khi lọc môi trư ng do chúng tạo ra một sự giảm áp thấp hơn và ít có khả năng ẩm ướt hoặc cháy. Hệ thống lọc hiện đại bằng sợi là các ống hình trụ làm từ các vi sợi borosilicate liên kết, chúng được bao bọc trong mạng lưới đã gia cố polypropylene. Loại thiết kế này có thể phân phối hơn 3 m3/s không khí vô trùng sự giảm áp suất 0,1 bar. Với các bộ lọc sợi, các tiểu thể trên không đã được thu thập bằng các cơ chế đóng chặt (impaction), ngăn chặn (interception) và khuếch tán (diffusion). 4.1. Đóng chặt Khi dòng khí mang các phần tử chảy quanh ống góp (collector), thì các phần tử này sẽ theo luồng không khí cho tới khi chúng rẽ ra quanh ống góp. Các tiểu thể nh khối lượng của chúng sẽ có động lượng (sức đẩy tới) đầy đủ để tiếp tục chuyển động hướng tới ống hình trụ và chọc thủng dòng khí (Hình 9.3). Hiệu suất thu gom bằng cơ chế đóng chặt (ηimp ) theo quán tính là một hàm của số Stokes và Reynolds như sau: η imp ⎛ C f ρ p d p2ν 0 Dcν 0 ρ ⎞ ⎟ = f ( N St , N Re ) = ⎜ , ⎟ ⎜ 18µDc µ ⎠ ⎝ (9.29) ⎡ d p ⎞⎤ ⎛ ⎟⎥ ⎢1,257 + 0,400 exp⎜⎜ − 1,10 2λ ⎟⎠⎥⎦ ⎢⎣ ⎝ (9.30) Trong đó: NSt là số Stokes, ρ mật độ, ρp mật độ các phần tử, dp đư ng kính phần tử, Dc đư ng kính ống góp, ν0 tốc độ chất lỏng ngược hướng không bị xáo trộn, µ độ nhớt lưu chất (nước và khí), Cf là yếu tố hiệu chỉnh Cunningham. Giá trị của Cf có thể được ước lượng từ sự hiệu chỉnh theo kinh nghiệm được phát triển b i Davis (Strauss 1975): C f = 1+ 2λ dp Trong đó: λ là đư ng đi tự do trung bình của các phân tử khí dựa trên phương trình Chapman-Enskog: ⎛ µ ⎞ πM w ⎟⎟ λ = ⎜⎜ ⎝ 0,499 ρ ⎠ 8 RT (9.31) Với Mw trọng lượng phân tử của các phân tử khí. Công nghệ tế bào 162 Hình 9.3. Kiểu luồng khí quanh sợi hình ống, cho thấy hướng đi của các phần tử được thu thập b i sự đóng chặt theo quán tính. Hiệu suất ηimp được định nghĩa là phần tử nhỏ tiếp cận với ống góp đóng chặt. η imp = N St3 N St3 + 0,77 N St2 + 0,22 cho N Re c = 10 (9.32) Trong đó: N Re c là số Reynolds của ống góp. Một tương quan khác được đề xuất b i Friedlander (1967) là: ηimp = 0,075NSt1, 2 (9.33) Như vậy, hiệu suất tăng lên với việc tăng đư ng kính phần tử hoặc tốc độ dòng khí. 4.2. Ngăn chặn Mô hình đóng chặt theo quán tính thừa nhận các phần tử có khối lượng, và vì thế có quán tính, nhưng không có kích thước. Một cơ chế ngăn chặn được xem như là đó các phần tử có kích thước, nhưng không có khối lượng, và vì thế chúng có thể theo dòng khí chuyển động quanh ống góp. Nếu dòng khí đi qua gần đủ bề mặt của sợi, thì các phần tử sẽ tiếp xúc với sợi và bị loại bỏ (Hình 9.4). Hiệu suất ngăn chặn (ηint) phụ thuộc vào tỷ lệ của đư ng kính phần tử với đư ng kính của ống góp ( κ = d p / Dc ): Công nghệ tế bào 163 ηint = ⎡ κ (2 + κ ) ⎤ 1 (1 + κ ) ln(1 + κ ) − ⎢ 2,002 − ln N Re c ⎣ 2(1 + κ ) ⎥⎦ (9.34) η int được phát triển bằng cách dùng phương trình tốc độ dòng chảy của Langmuir (Strauss 1975). Tỷ lệ κ được xem như là thông số ngăn cản. Hiệu suất thu gom bằng ngăn chặn tăng lên cùng với việc tăng kích thước của các phần tử. Hình 9.4. Kiểu luồng khí quanh sợi hình ống, cho thấy cơ chế thu thập ngăn chặn. 4.3. Khuếch tán Các phần tử có đư ng kính nhỏ hơn khoảng 1 micron (µm) biểu lộ một sự chuyển động Brown có cư ng độ đủ để tạo ra sự khuếch tán. Nếu dòng chảy chứa các phần tử này tới gần ống góp thì các phần tử này sẽ va trúng ống góp và bị loại bỏ. Ngược với hai cơ chế trước, hiệu suất thu gom bằng khuếch tán tăng lên cùng với việc giảm kích thước phần tử hoặc tốc độ không khí. Kích thước đặc trưng của các phần tử được thu gom bằng cơ chế này là nhỏ hơn 0,5 µm. Hiệu suất thu gom bằng khuếch tán (ηdif) có thể ước lượng bằng một phương trình tương tự phương trình Langmuir như sau (Strauss 1975): ηdif = 1 2,002 − ln N Re c ⎡ Z (2 + Z ) ⎤ ⎢(1 + Z ) ln(1 + Z ) − 2(1 + Z ) ⎥ ⎣ ⎦ (9.35) Trong đó: Z là thông số khuếch tán, được định nghĩa như sau: ⎡ D ⎤3 Z = ⎢2,24(2,002 − ln N Re c ) Br ⎥ νDc ⎦ ⎣ 1 Công nghệ tế bào (9.36) 164 Với DBr là sự khuếch tán do chuyển động Brown. Friedlander (1976) đã gợi ý sự tương quan sau: η dif = 1,3 N Pe-2/3 + 0,7κ 2 (9.37) Trong đó: NPe là số Péclet, một thông số không có thứ nguyên quan trọng trong lý thuyết khuếch tán đối lưu. Nó được định nghĩa như sau: N Pe = ν 0 Dc DBr = N Re N Sc (9.38) Với NSc là số Schmidt, được định nghĩa như sau: N Sc = µ ρDBr (9.39) Sự khuếch tán nh chuyển động Brown cho các phần tử có kích thước nhỏ hơn micron (submicron) có thể được ước lượng từ biểu thức: DBr = C f kT 3πµd p (9.40) Trong đó: k là hằng số Boltzmann (1,38054×10-23 J/oK). 4.4. Cơ chế kết hợp Hiệu suất thu gom tổng số của bộ lọc sợi thu được từ hiệu quả phối hợp của ba cơ chế có trước. Một phương thức đơn giản để phối hợp hiệu suất thu gom của các cơ chế khác nhau là bổ sung chúng cùng với nhau. Nhưng điều này đã gợi ý là các phần tử có thể được thu gom không chỉ một lần. Một hướng tốt hơn là dùng mối tương quan sau: ηc = 1 − (1 − ηimp )(1 − ηint )(1 − η dif ) (9.41) Đây là yếu tố chỉ cho phép các phần tử không được thu gom bằng cơ chế này thì được thu gom bằng cơ chế khác. Thay thế phương trình (9.32), (9.34) và (9.35) vào phương trình (9.41) sẽ cho kết quả trong mối tương quan đối với hiệu suất thu gom bằng các cơ chế kết hợp (combined mechanism, ηc ). Pasceri và Friedlander (1960) đã hiệu chỉnh hiệu suất thu gom kết hợp như sau: Công nghệ tế bào 165 ηc = 6 0,5 + 3κ 2 N Re 0,5 c N N Re c 2/3 Sc (9.42) Như đã đề cập, với việc tăng tốc độ dòng khí bề mặt thì η imp và η int tăng trong khi η dif giảm. Vì thế, hiệu suất thu gom phối hợp thư ng giảm tới một điểm tối thiểu và sau đó tăng cùng với việc tăng tốc độ dòng khí bề mặt. VI. Các ký hiệu A diện tích mặt cắt của sự chuyển nhiệt xuất hiện trong khi tiệt trùng, m2 Cf yếu tố hiệu chỉnh Cunningham, không có thứ nguyên Cn mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào/m3 c nhiệt đặc trưng của môi trư ng, J/kgoK D hệ số phân tán quanh trục DBr sự khuếch tán do chuyển động Brown, m2/s Dc đư ng kính ống góp, m dp đư ng kính phần tử, m dt đư ng kính ống, m Ed năng lượng hoạt động cho sự tiêu diệt tế bào bằng nhiệt trong phương trình Arrhenius, J/kmol H enthapy của hơi nước liên quan với nhiệt độ của môi trư ng chưa nấu chín, J/kg Jn luồng tế bào do sự phân tán quanh trục, m-2s-1 k hằng số Boltzmann: 1,38054×10-23 J/oK hoặc 1,38054×10-16 erg/oK kd tốc độ chết đặc trưng, s-1 hoặc kg/m3/s L chiều dài của bộ phận giữ, m M khối lượng ban đầu của môi trư ng trong nồi tiệt trùng mẻ, kg Mw trọng lượng phân tử của các phân tử khí, kg/kmol ms tốc độ dòng chảy của khối hơi nước, kg/s mc tốc dòng chảy của khối chất lỏng làm nguội, kg/s Công nghệ tế bào 166 NPe số Péclet (ūL/D hoặc ν0Dc/DBr), không thứ nguyên NRe N Rec số Reynolds (dtuρ/µL), không thứ nguyên số Reynolds của ống góp (Dcν0ρ/µ), không thứ nguyên NSc NSt số Stokes (Cfρpdp2ν0/18 µDc), không thứ nguyên n số tế bào trong hệ thống q tốc độ truyền nhiệt, J/s số Schmidt (µ/ρDBr), không thứ nguyên R hằng số khí: 8,314×103 J/kmoloK hoặc 8,314×107 erg/moloK S diện tích mặt cắt của ống, m-2 T nhiệt độ tuyệt đối, oK T0 nhiệt độ tuyệt đối ban đầu của môi trư ng, oK TC nhiệt độ tuyệt đối của bồn nhiệt, oK TCo nhiệt độ tuyệt đối ban đầu của bồn nhiệt, oK TH nhiệt độ tuyệt đối của nguồn nhiệt, oK t th i gian, s U hệ số chuyển nhiệt toàn phần, J/s m2oK u tốc độ, m/s ū tốc độ trung bình, m/s ν ν0 tốc độ chất lỏng trong phạm vi không gian trống của bộ lọc, m/s tốc độ chất lỏng ngược hướng không bị xáo trộn, m/s W khối lượng môi trư ng trong hệ thống tiệt trùng, kg x khoảng cách định hướng-x, m Z thông số khuếch tán được định nghĩa trong phương trình (9.36), không thứ nguyên η κ λ µ µL hiệu suất thu gom, không thứ nguyên tỷ lệ của phần tử và đư ng kính ống góp (dp/Dc), không thứ nguyên đư ng đi tự do trung bình của các phân tử khí, m độ nhớt lưu chất (nước và khí), kg/m s độ nhớt chất lỏng, kg/m s Công nghệ tế bào 167 ρ ρp τ ∇ mật độ, kg/m3 mật độ các phần tử, kg/m3 th i gian lưu trung bình, s tiêu chuẩn thiết kế cho sự tiệt trùng, không thứ nguyên Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc. New York, USA. 2. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 3. Chia TF. 2003. Engineering Applications in Biology. Updated 1st ed. McGraw-Hill Education, Singapore. 4. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 5. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 6. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. nd 7. Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 168 Chương 10 Khuấy trộn và thông khí I. Mở đầu Một trong những nhân tố quan trọng cần được lưu ý khi thiết kế hệ lên men đó là khả năng khuấy trộn thích hợp các thành phần của nó. Các vấn đề chính của sự khuấy trộn trong hệ lên men là sự phân tán của các bong bóng khí, tạo huyền phù các cơ thể vi sinh vật (hoặc tế bào thực vật và động vật) và tăng cư ng sự chuyển nhiệt và chuyển khối trong môi trư ng. Nói chung, hầu hết các chất dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, do đó trong th i gian lên men nếu chỉ để phân bố đều môi trư ng khi các tế bào tiêu thụ chất dinh dưỡng thì sự khuấy trộn không thật cần thiết. Tuy nhiên, trư ng hợp oxygen hòa tan thì ngư i ta lại rất mong muốn có một sự khuấy trộn tốt vì khả năng hòa tan của nó trong môi trư ng lên men là rất kém, trong khi yêu cầu oxygen cho sự sinh trư ng của các vi sinh vật hiếu khí (hoặc tế bào thực vật và động vật) lại rất cao. Ví dụ: khi oxygen được cung cấp từ không khí, nồng độ cực đại đặc trưng của nó trong dung dịch nước là từ 6-8 mg/L. Nhu cầu oxygen của tế bào, mặc dù có thể phụ thuộc rất lớn vào loại tế bào, thư ng là khoảng 1 g/L gi . Ngay cả khi môi trư ng lên men được bão hòa hoàn toàn với oxygen, thì oxygen hòa tan sẽ được cơ thể tiêu thụ ít hơn một chút nếu như nó không được cung cấp liên tục. quy mô phòng thí nghiệm, sự khuấy trộn được tạo ra nh máy lắc (shaker) là thích hợp để nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh hoặc ống nghiệm. Các máy lắc vòng hoặc lắc ngang tạo ra một sự phối trộn nhẹ và trao đổi khí bề mặt rất hiệu quả. Trư ng hợp lên men quy mô pilot hoặc quy mô sản xuất, sự khuấy trộn thư ng được tạo ra bằng cách khuấy cơ học có hoặc không có sục khí. Phổ biến nhất là sử dụng loại cánh khuấy (impeller) tạo ra dòng chảy tỏa tròn với sáu cánh khuấy mỏng được gắn vào trong một đĩa, gọi là turbine đĩa có cánh khuấy mỏng (flat-blade disk turbine) hoặc Rushton turbine (Hình 10.1 và 10.2). Các cánh khuấy dòng tỏa tròn (các mái chèo và turbine) tạo ra dòng chảy tỏa tròn từ cánh của turbine hướng tới vách ngăn của bình nuôi (vessel), trong đó dòng chảy chia ra theo hai hướng: một hướng đi lên dọc Công nghệ tế bào 169 theo vách, rồi đi tr vào vùng trung tâm theo bề mặt chất lỏng, và đi xuống vùng cánh khuấy dọc theo trục khuấy. Một hướng khác đi xuống dọc theo vách và đáy, sau đó đi vào vùng cánh khuấy. Hình 10.1. Sơ đồ Rushton turbine. 4 x vách ngăn Rushton turbine Bộ phận phun khí Hình 10.2. Sơ đồ bình lên men có cánh khuấy. Mặt khác, các cánh khuấy dòng chảy theo trục (cánh quạt và các mái chèo không bằng phẳng) tạo ra dòng chảy đi xuống đáy bình, sau đó đi lên dọc theo vách và quay xuống vùng trung tâm của cánh khuấy. Vì thế, các turbine đĩa có cánh khuấy mỏng có ưu điểm hạn chế đoản mạch (short- Công nghệ tế bào 170 circuiting) của khí dọc theo trục truyền động (drive shaft) nh sự nén khí, đưa vào từ phía dưới, dọc theo hướng vào trong vòi thoát (discharge jet). 1. Con đường chuyển khối Con đư ng của các chất khí từ một bong bóng vào một cơ quan tử trong tế bào có thể được phân chia trong một vài bước như sau: a. Chuyển từ khí nén (bulk gas) trong một bong bóng tới một lớp khí tương đối nguyên chất (relatively unmixed gas layer). b. Khuếch tán thông qua lớp khí tương đối nguyên chất. c. Khuếch tán thông qua lớp chất lỏng tương đối nguyên chất quanh bong bóng. d. Chuyển từ lớp chất lỏng tương đối nguyên chất tới khối chất lỏng nén (bulk liquid). e. Chuyển từ khối chất lỏng nén tới một lớp chất lỏng tương đối nguyên chất quanh một tế bào. f. Khuếch tán thông qua lớp chất lỏng tương đối nguyên chất. g. Khuếch tán từ bề mặt của một tế bào tới một cơ quan tử mà trong đó oxygen đã bị tiêu hao. Các bước c và e là chậm nhất. Sự khuấy trộn và thông khí sẽ tăng cư ng tốc độ chuyển khối trong các bước này và tăng diện tích tương tác giữa khí và chất lỏng. Chương này trình bày một số mối tương quan khác nhau đối với sự chuyển khối lỏng-khí, diện tích tương tác, kích thước bong bóng, sự tắc nghẽn khí, sự tiêu thụ công suất khuấy và hệ số thể tích chuyển khối, đó là những công cụ quan trọng để thiết kế và hoạt động các hệ lên men. Sự tới hạn đối với việc tăng quy mô sản xuất và sự khuấy trộn nhạy cảm với lực trượt cũng được trình bày. Đầu tiên, chúng ta tìm hiểu các khái niệm cơ bản của sự chuyển khối mà quan trọng là hiểu được sự chuyển khối lỏng-khí trong hệ lên men. II. Các khái niệm cơ bản về chuyển khối 1. Sự khuếch tán phân tử trong chất lỏng Khi nồng độ của một thành phần biến thiên từ một điểm này đến một điểm khác, thì thành phần này có xu hướng chảy theo hướng làm giảm những sự khác biệt cục bộ trong nồng độ. Công nghệ tế bào 171 Dòng phân tử của cấu tử A liên quan với vận tốc phân tử trung bình của tất cả cấu tử JA là tỷ lệ với gradient nồng độ dC A / dz khi: J A = − D AB dC A dz (10.1) Phương trình (10.1) là định luật thứ nhất của Fick được viết cho chiều z. Ký hiệu DAB trong phương trình (10.1) biểu diễn khả năng khuếch tán cấu tử A vào B, tức là giá trị đo độ chuyển động khuếch tán của nó. Dòng phân tử của A liên quan với tọa độ cố định (stationary coordinate) NA là bằng: NA = dC A CA ( N A + N B ) − D AB dz C (10.2) Trong đó: C là nồng độ tổng số của các cấu tử A và B, và NB là dòng phân tử của B liên quan với tọa độ cố định. Đối với dung dịch loãng của cấu tử A thì: NA ≈ JA (10.3) 1.1. Sự khuếch tán Lý thuyết động học chất lỏng không có nhiều ưu điểm so với chất khí. Vì thế, mối tương quan cho khả năng khuếch tán trong chất lỏng là không rõ rệt như trong các chất khí. Trong số những mối tương quan đã được đề cập, thì tương quan Wilke-Chang (1955) được sử dụng rộng rãi nhất cho các dung dịch loãng của các chất không điện phân: D o AB 1,173 × 10 −16 (ξM B ) 0,5 T = µVbA0, 6 (10.4) Khi các dung môi là nước, Skelland (1974) đã giới thiệu sử dụng mối tương quan được phát triển b i Othmer và Thakar (1953): D Công nghệ tế bào o AB 1,112 × 10 −13 = µ 1,1VbA0, 6 (10.5) 172 Hai mối tương quan cho trước không phù hợp về thứ nguyên, vì thế các phương trình sử dụng đơn vị SI như sau: o DAB khả năng khuếch tán của A trong B, trong một dung dịch rất loãng, m2/s MB khối lượng phân tử của cấu tử B, kg/kmol T nhiệt độ, oK µ tốc độ hòa tan, kg/m/s VbA thể tích phân tử hòa tan điểm sôi bình thư ng, m3/kmol (0,0256 m3/kmol cho oxygen) yếu tố kết hợp đối với dung môi: 2,26 đối với nước; 1,9 đối với ξ methanol; 1,5 đối với ethanol; 1,0 các dung môi không kết hợp như benzene và ethyl ether. 2. Hệ số chuyển khối Dòng chảy khối (mass flux), tốc độ chuyển khối qG trên đơn vị diện tích, tỷ lệ với sự chênh lệch nồng độ. Nếu một chất hòa tan chuyển từ pha khí vào pha lỏng, thì dòng chảy khối của nó từ pha khí tới bề mặt chung NG là: NG = qG = kG (CG − CGi ) A (10.6) Trong đó: C G và CGi là nồng độ khí mặt biên (gas-side concentration) tương ứng phần chính và vùng phân giới (bề mặt chung) (Hình 10.3). kG là hệ số chuyển khối riêng rẽ cho cho pha khí và A là diện tích vùng phân giới. Tương tự, dòng chảy khối của pha lỏng mặt biên (liquid-side phase) NL là: NL = qL = k L (C Li − C L ) A (10.7) Trong đó: kL là hệ số chuyển khối riêng rẽ đối với pha lỏng, qL là tốc độ hấp thụ khí. Do lượng chất hòa tan được chuyển từ pha khí tới vùng phân giới phải bằng lượng chất hòa tan từ vùng phân giới tới pha lỏng, nên: Công nghệ tế bào 173 (10.8) NG = NL Khí CG k L / kG CG C Gi Lỏng C Li CL C Gi CL Hình 10.3. Profile nồng độ trạng thái cân bằng. C Li gần vùng phân giới khí-lỏng và một đư ng cong Thay phương trình (10.6) và (10.7) vào trong phương trình (10.8) ta được: CG − CGi C L − C Li =− kL kG (10.9) Phương trình (10.9) có độ dốc của đư ng cong kết nối ( C L , C G ) và (C Li , C Gi ) như trình bày hình 10.3. Sử dụng phương trình (10.6) hoặc (10.7) để xác định hệ số chuyển khối gặp nhiều khó khăn do chúng ta không thể đo nồng độ của vùng phân giới C Li hoặc C Gi . Vì thế, để thuận lợi cho việc xác định toàn bộ hệ số chuyển khối có thể dùng phương trình sau: N G = N L = K G (C G − C G* ) = K L (C L* − C L ) Trong đó: C G* là nồng độ khí (10.10) mặt biên sẽ cân bằng với nồng độ khí hiện diện trong pha lỏng. Tương tự, C L* là nồng độ chất lỏng mặt biên sẽ cân bằng với nồng độ chất lỏng hiện diện trong pha khí. Những thông số này dễ dàng đọc từ đư ng cong trạng thái cân bằng trình bày hình 10.4. KG và KL được định nghĩa lại là các hệ số chuyển khối toàn bộ tương ứng cho các mặt biên của khí và lỏng. Công nghệ tế bào 174 CG CGi Hình 10.4. Đư ng cong trạng thái cân bằng giải thích ý nghĩa của C G* và C L* . CG* CL CLi C L* 3. Cơ chế của chuyển khối Một vài cơ chế khác nhau đã được đưa ra cung cấp cơ s cho lý thuyết chuyển khối gian kỳ (interphase). Ba cơ chế tốt nhất được biết là: thuyết hai màng (two-film), thuyết thấm qua (penetration) và thuyết phục hồi bề mặt (surface renewal). 3.1. Thuyết hai màng Thuyết này giả thiết rằng đặc tính khó di chuyển hoàn toàn được bao gồm trong hai màng giả bên này hoặc bên kia vùng phân giới, trong đó sự di chuyển xảy ra nh khuếch tán phân tử. Mô hình này dẫn đến kết luận rằng hệ số chuyển khối kL tỷ lệ với khả năng khuếch tán DAB và tỷ lệ nghịch với độ dày của màng zf như sau: kL = D AB zf (10.11) 3.2. Thuyết thấm qua Thuyết này thừa nhận rằng xoáy nước hỗn loạn đi từ phần chính của pha tới vùng phân giới, đó chúng duy trì một th i gian phơi không đổi te. Chất hòa tan được thừa nhận là thấm vào trong xoáy nước có sẵn vùng phân giới b i một quá trình khuếch tán phân tử trạng thái không ổn định. Mô hình này dự báo rằng hệ số chuyển khối tỷ lệ trực tiếp với căn bậc hai của khả năng khuếch tán phân tử: Công nghệ tế bào 175 ⎛D k L = 2⎜⎜ AB ⎝ πt e ⎞ ⎟⎟ ⎠ 1/ 2 (10.12) Trong đó: π là áp suất tuyệt đối. 3.3. Thuyết phục hồi bề mặt Thuyết này đề xuất rằng có một giới hạn th i gian vô tận cho các nhân tố bề mặt và hàm phân bố tuổi bề mặt (surface age). Lý thuyết này dự báo một lần nữa hệ số chuyển khối tỷ lệ với căn bậc hai của khả năng khuếch tán phân tử: k L = ( sD AB )1 / 2 (10.13) Trong đó: s là tốc độ phân đoạn của sự phục hồi bề mặt. Tất cả lý thuyết nói trên đòi hỏi phải biết một số thông số chưa xác định như: độ dày màng có thật zf, th i gian phơi te hoặc tốc độ phân đoạn của sự phục hồi bề mặt s. Nói chung, những tính chất này ít được biết đến, đến mức cả ba lý thuyết là không hoàn chỉnh. Tuy nhiên, những lý thuyết này giúp chúng ta hình dung cơ chế chuyển khối vùng phân giới và cũng biết sự phụ thuộc hàm mũ của khả năng khuếch tán phân tử trên hệ số chuyển khối. III. Xác định vùng phân giới Để tính toán tốc độ hấp thụ khí qL của phương trình 10.7, chúng ta cần biết diện tích vùng phân giới khí-lỏng là thông số có thể đo được bằng cách ứng dụng một vài kỹ thuật như là chụp ảnh, truyền sáng và quang phổ laser. Diện tích vùng phân giới (a) trên một đơn vị thể tích có thể được tính toán từ đư ng kính trung bình Sauter D32 (m) và phân đoạn thể tích của pha khí H, như sau: a= 6H D32 (10.14) Đư ng kính trung bình Sauter, một giá trị trung bình của bề mặt thể tích, có thể được tính toán bằng cách đo các kích thước giọt trực tiếp từ các hình ảnh của độ phân tán theo phương trình sau: Công nghệ tế bào 176 ∑n D n D32 = i =1 n i 3 i i =1 i 2 i (10.15) ∑n D Xác định kích thước các giọt bằng hình ảnh là phương pháp dễ làm trong số nhiều kỹ thuật xác định do nó không đòi hỏi sự định cỡ trước (calibration). Tuy nhiên, để chụp một bức ảnh rõ ràng có thể là rất khó khăn và đọc các bức ảnh này là một công việc đơn điệu tẻ nhạt, tốn nhiều th i gian. Các bức ảnh có thể chụp thông qua chân đế hoặc thành bên của bình lên men. Để loại bỏ tình trạng không rõ ràng do bề mặt bị cong của thành bình, bình lên men có thể được cho ngập chìm trong một cái thùng hình chữ nhật hoặc một túi nước được gắn trên thành. Nhược điểm của phương thức này đó là việc đo kích thước giọt bị hạn chế đối với những vùng gần thành bình, là nơi không thể đại diện cho toàn bộ sự phân tán trong hệ lên men. Sự phân bố kích thước giọt có thể được đo gián tiếp bằng cách dùng kỹ thuật truyền sáng. Khi một chùm sáng đi qua một vùng có độ phân tán khí-lỏng, thì ánh sáng được tỏa ra b i các bong bóng khí. Ngư i ta nhận thấy rằng đồ thị của tỷ lệ dập tắt (hàm thuận nghịch của độ truyền sáng 1/T) dựa theo diện tích vùng phân giới trên một đơn vị thể tích của độ phân tán a, tạo ra một đư ng thẳng, như sau: 1 = m1 + m 2 a T (10.16) Về lý thuyết, m1 là phần tử đơn vị, còn m2 là một hằng số độc lập của sự phân bố kích thước giọt với điều kiện là tất cả các bong bóng khí gần như hình cầu. Kỹ thuật truyền sáng được sử dụng thư ng xuyên nhất cho việc xác định kích thước trung bình của bong bóng khí trong sự phân tán khí-lỏng. Kỹ thuật này có một số ưu điểm như đo nhanh và hoạt động trực tuyến. IV. Tắc nghẽn khí Tắc nghẽn khí là một trong những thông số quan trọng nhất mô tả thủy động học của hệ lên men. Tắc nghẽn khí tùy thuộc chủ yếu vào vận tốc bề mặt của khí và sự tiêu thụ công suất, và thư ng là rất nhạy cảm với các Công nghệ tế bào 177 tính chất vật lý của chất lỏng. Tắc nghẽn khí có thể được xác định dễ dàng bằng cách đo mức độ chất lỏng được thông khí trong suốt th i gian hoạt động (ZF) và mức độ chất lỏng sạch (ZL). Như vậy, việc tắc nghẽn khí trung bình tiểu phần H được tính theo công thức sau: H= ZF − ZL ZF (10.17) 1. Phun khí (sparging) bằng khuấy trộn không cơ học Đối với một hệ thống hai pha, trong đó pha liên tục duy trì chỗ thích hợp của nó, thì sự tắc nghẽn khí sẽ liên quan với vận tốc khí bề mặt Vs và vận tốc tăng bong bóng khí Vt: H= Vs Vs + Vt (10.18) Akita và Yoshida (1973) đã đặt mối tương quan tắc nghẽn khí đối với việc hấp thụ oxygen các dung dịch nước khác nhau trong cột bong bóng như sau: ⎛ gDC2 ρ c H = 0,20⎜⎜ (1 − H ) 4 ⎝ σ ⎞ ⎟ ⎟ ⎠ 1/ 8 ⎛ gDC3 ⎜ 2 ⎜ v ⎝ c ⎞ ⎟ ⎟ ⎠ 1 / 12 ⎛ Vs ⎜ ⎜ gD C ⎝ ⎞ ⎟ ⎟ ⎠ (10.19) Trong đó: g là gia tốc do trọng lực, Dc là đư ng kính cột bong bóng, và σ là áp lực bề mặt, νc là thể tích chất lỏng của pha liên tục, và ρc là mật độ của pha liên tục. 2. Phun khí bằng khuấy trộn cơ học Calderbank (1958) đã đặt mối tương quan tắc nghẽn khí đối với việc phân tán lỏng-khí được khuấy trộn bằng turbine dạng đĩa có cánh khuấy mỏng như sau: ⎛V H ⎞ H = ⎜⎜ s ⎟⎟ ⎝ Vt ⎠ 1/ 2 ⎡ ( P / v) 0, 4 ρ c 0 , 2 ⎤⎛ Vs + (2,16 × 10 ) ⎢ m ⎥⎜⎜ σ 0, 6 ⎥⎦⎝ Vt ⎢⎣ −4 ⎞ ⎟⎟ ⎠ 1/ 2 (10.20) Trong đó 2,6×10-4 có đơn vị (m) và Vt = 0,265 m/s khi kích thước bong bóng trong khoảng 2-5 mm đư ng kính, Pm là công suất bị tiêu hao Công nghệ tế bào 178 do cánh khuấy trong sự phân tán chất lỏng được thông khí, và v là thể tích chất lỏng. Trư ng hợp vận tốc khí bề mặt cao (Vs > 0,02 m/s), thay Pm và Vt của phương trình (10.20) bằng cách đưa vào công suất hiệu quả Pe và Vt + Vs tương ứng. V. Xác định tốc độ hấp thụ oxygen Để ước lượng các thông số thiết kế đưa oxygen vào hệ lên men, chúng ta có thể sử dụng các mối tương quan được trình bày trong các phần trước đây, ứng dụng cho một phạm vi rộng các hệ thống khí-lỏng bổ sung vào hệ thống nước-không khí. Tuy nhiên, phương thức tính toán này dài dòng và các giá trị dự báo từ những mối tương quan này có thể thay đổi rất nhiều. Cũng có trư ng hợp chúng ta cũng không thể tìm thấy các mối tương quan thích hợp để áp dụng cho kiểu và thể tích của hệ lên men muốn sử dụng. Trong những trư ng hợp như thế, chúng ta có thể tự đo tốc độ chuyển oxygen hoặc dùng các mối tương quan dựa trên những thí nghiệm này. Tốc độ hấp thụ oxygen trên một đơn vị thể tích qa/v có thể được ước lượng nh phương trình: qa = K L a(C L* − C L ) = k L a (C L* − C L ) v (10.21) Do oxygen là loại khí ít hòa tan, nên hệ số chuyển khối toàn bộ KL bằng hệ số chuyển khối riêng rẽ kL. Mục tiêu của chúng ta trong thiết kế hệ lên men là cực đại hóa tốc độ chuyển oxygen với sự tiêu thụ công suất tối thiểu cần thiết để khuấy trộn chất lỏng và cũng giảm thiểu lưu tốc khí. Để cực đại hóa tốc độ hấp thụ oxygen, chúng ta phải cực đại hóa kL, a, C L* − C L . Tuy nhiên, sự khác biệt nồng độ được hạn chế hoàn toàn b i vì giá trị C L* được giới hạn b i khả năng hòa tan cực đại rất thấp của nó. Vì thế, các thông số quan tâm chính trong thiết kế là hệ số chuyển khối và diện tích vùng phân giới. Bảng 10.1 liệt kê khả năng hòa tan của oxygen 1 atm trong nước dưới các nhiệt độ khác nhau. Các giá trị thu được là nồng độ oxygen cực Công nghệ tế bào 179 đại trong nước khi nó trong sự cân bằng với oxygen tinh khiết. Khả năng hòa tan này giảm khi có bổ sung acid hoặc muối như trình bày bảng 10.2. Bảng 10.1. Khả năng hòa tan oxygen trong nước Nhiệt độ o 1 atm. Khả năng hòa tan ( C) mmol O2/L mg O2/L 0 2,18 69,8 10 1,70 54,5 15 1,54 49,3 20 1,38 44,2 25 1,26 40,3 30 1,16 37,1 35 1,09 34,9 40 1,03 3,0 Bảng 10.2. Khả năng hòa tan của oxygen trong dung dịch muối hoặc acid Nồng độ 25oC. Khả năng hòa tan (mmol O2/L) (mol/L) HCl H2SO4 NaCl 0,0 1,26 1,26 1,26 0,5 1,21 1,21 1,07 1,0 1,16 1,12 0,89 2,0 1,12 1,02 0,71 Thông thư ng, chúng ta sử dụng không khí để cung cấp nhu cầu oxygen cho hệ lên men. Nồng độ cực đại của oxgen trong nước trong sự cân bằng với C L* không khí áp suất khí quyển là khoảng một phần mư i lăm của khả năng hòa tan đã được liệt kê, theo định luật Henry: Công nghệ tế bào 180 C L* = pO2 (10.22) H O2 (T ) Trong đó: p O2 là áp suất từng phần (partial pressure) của oxygen và H O2 (T ) là hằng số oxygen của định luật Henry nhiệt độ T. Giá trị của hằng số định luật Henry có thể thu được từ các khả năng hòa tan được liệt kê bảng 10.2. Ví dụ: 25oC, C L* là 1,26 mmol/L và p O2 là 1 atm do nó là oxygen tinh khiết. Bằng cách thay thế các giá trị này vào trong phương trình (10.22), chúng ta thu được H O2 (T ) là 0,793 atm L/mmol. Vì thế, nồng độ oxygen cân bằng cho sự tiếp xúc nước-khí C L* = 25oC sẽ là: 0,209 atm = 0,264 mmol O 2 /L = 8,43 mg/L 0,793 atm L/mmol Theo điều kiện lý tư ng, tốc độ chuyển oxygen phải được đo trong hệ lên men chứa môi trư ng dinh dưỡng và tế bào trong suốt quá trình lên men thực tế. Tuy nhiên, điều này khó tiến hành do bản chất phức tạp của môi trư ng và sự thay đổi lưu biến học (rheology) trong suốt quá trình sinh trư ng của tế bào. Phương thức chung là sử dụng một hệ thống tổng hợp xấp xỉ như các điều kiện của quá trình lên men. 1. Phương pháp oxy hóa sodium sulfite Phương pháp oxy hóa sodium sulfite dựa trên nguyên tắc oxy hóa sodium sulfite thành sodium sulfate với sự có mặt của chất xúc tác (Cu2+ hoặc Co2+) như sau: Cu2+ hoặc Co2+ Na2SO3 + 1/2O2 Na2SO4 (10.23) Phản ứng này có các đặc điểm sau, đáp ứng đủ cho việc đo tốc độ chuyển oxygen: - Tốc độ phản ứng độc lập với nồng độ của sodium sulfite trong khoảng 0,04 đến 1 N. - Tốc độ phản ứng nhanh hơn nhiều so với tốc độ chuyển oxygen. Vì thế tốc độ oxy hóa được điều chỉnh chỉ b i tốc độ chuyển khối. Công nghệ tế bào 181 Để đo tốc độ chuyển oxygen trong hệ lên men, làm đầy hệ lên men bằng dung dịch sodium sulfite 1 N chứa ít nhất 0,003 M Cu2+. M bộ phận sục và bắt đầu bấm gi khi bong bóng khí đầu tiên xuất hiện trong hệ lên men từ bộ phận sục khí. Cho phép sự oxy hóa tiếp tục từ 4-20 phút, sau đó dừng dòng khí, bộ phận khuấy trộn và timer cùng một th i gian, rồi lấy mẫu. Trộn mỗi mẫu với một lượng dư thuốc thử iodine chuẩn bằng pipette sạch. Chuẩn độ bằng dung dịch sodium thiosulfate chuẩn (Na2S2O3) tới điểm cuối của chất chỉ thị tinh bột. Một khi oxygen đưa vào được đo, thì hệ số thể tích chuyển khối kLa có thể được tính toán bằng cách dùng phương trình (10.21), trong đó CL là bằng 0 và C L* là nồng độ oxygen trạng thái cân bằng. Kỹ thuật oxy hóa sodium sulfite có hạn chế của nó vì trong thực tế dung dịch không thể xấp xỉ với các tính chất vật lý và hóa học của môi trư ng lên men. Thêm một vấn đề nữa là kỹ thuật này đòi hỏi các nồng độ ion cao (1-2 mol/L), sự có mặt của các ion này có thể ảnh hư ng đến diện tích vùng phân giới và, trong một mức độ thấp hơn, đến hệ số chuyển khối. Tuy nhiên, kỹ thuật này hữu ích khi so sánh với hiệu suất của các hệ lên men và nghiên cứu ảnh hư ng của sự phát triển quy mô sản phẩm và các điều kiện hoạt động. 2. Kỹ thuật tách không khí Kỹ thuật này giám sát sự thay đổi nồng độ oxygen trong một chất lỏng giàu oxygen được khử oxygen bằng cách cho nitrogen đi qua nó. Điện cực của phép đo cực phổ (polarography) thư ng được dùng để đo nồng độ. Cân bằng khối trong một bình nuôi cho ra: [ dC L (t ) = k L a C L* − C L (t ) dt ] (10.24) Lấy tích phân phương trình đã cho giữa t1 và t2 cho kết quả: ⎡ C L* − C L (t1 ) ⎤ ln ⎢ * ⎥ C L − C L (t 2 ) ⎦ ⎣ kLa = t 2 − t1 Công nghệ tế bào (10.25) 182 Từ phương trình trên kLa có thể được tính toán dựa trên các giá trị đo được CL(t1) và CL(t2). 3. Xác định trực tiếp Trong kỹ thuật này, chúng ta đo trực tiếp hàm lượng oxygen của dòng khí đi vào và đi ra khỏi hệ lên men bằng cách sử dụng thiết bị phân tích oxygen không khí. Sự hấp thụ oxygen có thể được tính toán như sau: qa = Qin CO 2 , in − Qout CO 2 , out (10.26) Trong đó: Q là tốc độ dòng khí. Một khi oxygen hấp thụ được đo, thì kLa có thể được tính toán bằng cách dùng phương trình (10.21), trong đó CL là nồng độ oxygen của chất lỏng trong hệ lên men và CL* là nồng độ của oxygen sẽ trạng thái cân bằng với dòng khí. Nồng độ oxygen của chất lỏng trong hệ lên men có thể được đo bằng một bộ cảm biến oxygen trực tuyến (on-line oxygen sensor). Nếu thể tích của hệ lên men là khá nhỏ (< 50 L), thì sự biến thiên của (CL* − CL ) trong hệ lên men cũng khá nhỏ. Tuy nhiên, nếu kích thước của hệ lên men là rất lớn, thì sự biến thiên có thể có ý nghĩa. Trong trư ng hợp này, giá trị trung bình logarithm (CL* − CL ) của dòng khí chảy vào và chảy ra có thể được sử dụng, khi đó: (C − C L ) LM * L (C L* − C L ) in − (C L* − C L ) out = ln (C L* − C L ) in /(C L* − C L ) out [ ] (10.27) 4. Kỹ thuật động lực học Bằng cách sử dụng kỹ thuật động lực học chúng ta có thể ước lượng giá trị kLa đối với sự chuyển oxygen trong suốt quá trình lên men thực tế với các tế bào và môi trư ng nuôi cấy thực sự. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của sự cân bằng oxygen của nguyên liệu trong một hệ lên men mẻ hiếu khí trong lúc các tế bào đang hoạt động sinh trư ng khi: dC L = k L a (CL* − CL ) − rO 2 C X dt Công nghệ tế bào (10.28) 183 Trong đó: rO 2 là tốc độ của hô hấp tế bào (g O2/g tế bào gi ). Trong khi nồng độ oxygen hòa tan của hệ lên men là ổn định, nếu đột nhiên chúng ta ngắt sự cung cấp không khí, thì nồng độ của oxygen sẽ bị giảm (Hình 10.5) với tốc độ như sau: dC L = rO 2 C X dt (10.29) Vì kLa trong phương trình (10.28) là bằng 0. Vì thế, bằng cách đo độ dốc của đư ng cong CL theo t, chúng ta có thể ước lượng rO 2 C X . Nếu chúng ta m dòng khí thêm một lần nữa, thì nồng độ oxygen hòa tan sẽ được tăng lên theo phương trình (10.28), phương trình này có thể được sắp xếp lại để cho một mối quan hệ tuyến tính như sau: C L = C L* − 1 ⎛ dC L ⎞ + rO 2 C X ⎟ ⎜ k L a ⎝ dt ⎠ (10.30) Ngắt không khí dCL dt CL Hình 10.5. Kỹ thuật động học cho việc xác định kLa. t Đồ thị của CL theo độ dốc − dC L + rO 2 C X sẽ cho kết quả một đư ng thẳng có dt 1 và mặt phẳng y của C L* . kLa VI. Các ký hiệu A a diện tích vùng phân giới, m2 diện tích vùng phân giới khí-lỏng trên một đơn vị thể tích của sự phân tán cho các số Reynolds của cánh khuấy thấp, m-1 Công nghệ tế bào 184 C DAB nồng độ, kmol/m3 khả năng khuếch tán của cấu tử A vào B, tức là giá trị đo của độ chuyển động khuếch tán, m2/s o D AB khả năng khuếch tán của cấu tử A trong một dung dịch B rất loãng m2/s JA dòng phân tử của cấu tử A liên quan với vận tốc phân tử trung bình của tất cả cấu tử, kmol/m2s K hệ số chuyển khối toàn phần, m/s k hệ số chuyển khối riêng rẽ, m/s k La hệ số thể tích chuyển khối g gia tốc do trọng lực, m/s2 H tiểu phần thể tích (phân đoạn) của pha khí trong sự phân tán, không có thứ nguyên NA, NB dòng khối của A và B liên quan với tọa độ cố định, kmol/m2s NG, NL dòng khối từ pha khí tới pha lỏng và từ pha lỏng đến pha khí, tương ứng, kmol/m2s P áp suất tổng số, N/m2 Pe công suất hiệu quả được đưa vào nh phun khí và khuấy cơ học, W Pm công suất bị tiêu hao do cánh khuấy trong sự phân tán chất lỏng được thông khí, W q tốc độ chuyển khối, kmol/s Q tốc độ dòng khí, m3/s s tốc độ phân đoạn của sự phục hồi bề mặt, s-1 te th i gian phơi cho lý thuyết thấm qua, s Vs vận tốc khí bề mặt, m/s Vt vận tốc tăng bong bóng khí, m/s v thể tích chất lỏng, m3 vc thể tích chất lỏng của pha liên tục ZF, ZL mức độ chất lỏng được sục khí trong suốt th i gian hoạt động, m zf độ dày của màng trong lý thuyết hai màng, m độ nhớt, kg/m s µ π ρ áp suất tuyệt đối, N/m2 mật độ, kg/m3 Công nghệ tế bào 185 ρc σ mật độ của pha liên tục áp lực bề mặt kg/s2 Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc. New York, USA. 2. Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. 3. Chia TF. 2003. Engineering Applications in Biology. Updated 1st ed. McGraw-Hill Education, Singapore. 4. Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. 5. Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. 6. Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2 ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey, USA. nd 7. Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. Công nghệ tế bào 186 Phụ lục Một số thuật ngữ cơ bản Agrobacterium tumefaciens. Là loại vi khuẩn đất gây bệnh cho thực vật hai lá mầm được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai (foreign gene) vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình thành ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA), có chứa các gen sản xuất ra auxin và cytokinin, xâm nhập vào hệ gen (genome) của cây bị bệnh. Agrobacterium rhizogenes. Cũng là một loại vi khuẩn đất gây bệnh cho thực vật hai lá mầm. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây cũng tương tự như A. tumefaciens, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản xuất ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh. Amino acid. Là một phân tử nhỏ có chứa một nhóm carboxyl (-COOH) và một nhóm amine (-NH3) cùng nối với một nguyên tử carbon. Amino acid là đơn vị cơ s của protein. Apoptosis. Chết theo chương trình là một hình thức chết tự nhiên của tế bào theo một chương trình được kích hoạt nội tại. Đặc điểm của apoptosis là sự phân hủy nhân tế bào và ngưng tụ nhân, trong đó các mảnh nhân được bao bọc b i các màng chứa cả tế bào chất, sau đó được các đại thực bào tiêu hóa Bất động tế bào (cell immobilization). Các kỹ thuật gắn tế bào với các phần tử lớn hoặc trên các bề mặt được phân tách dễ dàng khỏi dòng sản phẩm. Phương pháp này đảm bảo hoạt động liên tục của hệ lên men (fermenter/bioreactor) không bị nguy cơ rửa trôi tế bào. Sự bất động cũng có thể cung cấp các điều kiện có lợi cho sự phân hóa tế bào và sự truyền đạt thông tin giữa các tế bào, bằng cách ấy đã thúc đẩy sản phẩm có sản lượng các chất trao đổi thứ cấp cao. Một số phương pháp bất động tế bào thư ng Công nghệ tế bào 187 được sử dụng đó là: gắn lên bề mặt, tạo thể xốp, sử dụng bao vi thể và tự kết khối. Biến dị dòng soma (somaclonal variation). Hiện tượng biến dị di truyền xuất hiện các tế bào soma không phân hóa (undifferentiation), các protoplast phân lập, các callus và các mô nuôi cấy in vitro. Nguyên nhân của biến dị chủ yếu là do những thay đổi về số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể. Biến đổi hậu dịch mã (post-translational modification). Là những biến đổi sau quá trình dịch mã, thay đổi các liên kết hóa trị xảy ra trong chuỗi polypeptide, sau khi chuỗi polypeptide tách khỏi ribosome và trước khi tr thành protein hoạt động thực sự. Biến nạp (transformation). Quá trình đưa vào và dung nạp một cách chắc chắn DNA ngoại lai trong tế bào thực vật bất luận bằng cách gì để có được một biến đổi di truyền thì đều được coi là biến nạp thành công. Biến nạp gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediate transformation). Kỹ thuật này được thiết kế dựa theo phương thức gây bệnh cây hai lá mầm của vi khuẩn A. tumefaciens để chuyển DNA ngoại lai vào mô thực vật bằng cách đồng nuôi cấy (co-cultivation) vi khuẩn tái tổ hợp với mô nuôi cấy của cây hai lá mầm hoặc cây một lá mầm. Biến nạp gen bằng vi đạn (microprojectile). Là kỹ thuật chuyển gen nh súng bắn gen (gene gun, bombardement). Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các viên đạn vàng hoặc tungsten có kích thước hiển vi (1-1,5 µm). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quanh vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ vừa khít với nòng súng. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra đến đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hợp nhất với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gen. Biến nạp gen bằng vi tiêm (microinjection). Là kỹ thuật sử dụng phổ biến trong công nghệ tế bào động vật (animal cell biotechnology). Trên hiển vi trư ng, DNA plasmid có thể được tiêm vào protoplast và thực hiện biến nạp gen thành công khá nhiều đối tượng thực vật. Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới Công nghệ tế bào 188 kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên. Biến nạp gen nhờ xung điện (electroporation). Thiết bị điện xung (electroporator) là thiết bị có khả năng tạo ra các xung điện trong th i gian rất ngắn (5-6 phần nghìn giây) và điện thế (pulse strenght) chính xác (500 V/cm) với th i gian tắt dần (decay time) 20 ms. Protoplast được đặt giữa hai tấm kim loại cách nhau từ 1-4 mm trong một cuvette bằng nhựa. điện thế cao, xung điện tạo các lỗ tạm th i (cỡ 30 nm) trên màng protoplast và DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh. Biến nạp gen nhờ siêu âm (ultrasonic). Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm có sự hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm sẽ giúp DNA đi vào tế bào và biểu hiện. Biến nạp gen nhờ silicon carbide. Tinh thể silicon carbide có độ cứng rất cao, khi lắc với tế bào chúng có tác dụng như các mũi kim nhỏ đâm thủng thành tế bào giúp DNA ngoại lai xâm nhập vào bên trong tế bào. Biểu hiện gen (gene expression). Quá trình phiên mã và dịch mã để tạo ra sản phẩm protein của gen. Cảm ứng (induction). Hormone gây tạo một loại cấu trúc, bộ phận hay một quá trình nào đó trong điều kiện in vitro. Cặp base (base pair, bp). Hai nucleotide hai chuỗi khác nhau của trên một phân tử DNA mạch kép bổ sung với nhau b i những liên kết hydrogen: A-T hoặc G-C và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử DNA. Cầu disulfide (disulfide bridge). Một liên kết đồng hóa trị tạo thành giữa hai chuỗi polypeptide qua trung gian của một gốc cystine. Cấy chuyển (passage hoặc subculture). Chuyển tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy sang bình nuôi có chứa môi trư ng mới pha kết hợp với tách nhỏ hoặc làm loãng mật độ để nhân số lượng. cDNA (complementary DNA). Một phân tử DNA sợi đơn bổ sung cho một phân tử mRNA, được tổng hợp từ khuôn mẫu mRNA này nh enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Sau đó mRNA trong thể lai mRNA-DNA bị phân hủy bằng enzyme RNase H, còn sợi DNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu để tổng hợp nên một sợi DNA khác nh enzyme DNA polymerase. Hai sợi DNA này sẽ bắt cặp với nhau để tr thành phân tử cDNA sợi đôi. Công nghệ tế bào 189 Chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites). Dư ng như đây là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trư ng chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trư ng hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Các chất này được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong thực vật và không có chức năng trao đổi chất rõ ràng. Chủng tế bào (cell strain). Chủng tế bào gồm những tế bào có đặc điểm riêng biệt được chọn từ nuôi cấy kh i sinh hay dòng tế bào có trước. Thư ng phải nêu rõ nguồn gốc của chủng tế bào trong các công bố khoa học nhất là khi các chủng đó có nguồn gốc từ các phòng thí nghiệm khác. Chủng phụ (substrain). Được tách và nhân từ một nhóm tế bào của một chủng với những tính trạng mà chủng bố mẹ đó không có. Cosmid. Là các vector đặc biệt được xây dựng b i plasmid và đầu cos của bacteriophage λ, dùng để tạo dòng các đoạn DNA có kích thước lớn (trên 45 kb) của eukaryote. Các thành phần cơ bản của các vector cosmid bao gồm: một marker kháng kháng sinh và một trình tự kh i đầu sao chép của plasmid (ori), đoạn DNA mang đầu kết dính (cos) của phage λ. Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology). Hệ thống các phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ một sinh vật để ghép nối vào DNA của một sinh vật khác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Phân tử này được đưa vào các sinh vật khác nhau để tạo ra những giống chủng vi sinh vật, thực vật và động vật mới, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản xuất và đ i sống con ngư i. Công nghệ này có ứng dụng rộng rãi trong y học, dược học, nông nghiệp và nhiều ngành công nghiệp. DNA (deoxyribonucleic acid). Gồm hai chuỗi polynucleotide xoắn lại với nhau tạo nên chuỗi xoắn kép, có một trình tự đặc trưng của các deoxyribonucleic mang thông tin di truyền cho tất cả các tế bào và vi virus chứa DNA. DNA polymerase. Enzyme xúc tác cho sự tổng hợp sợi DNA mới từ những deoxyribonucleoside 5’-triphosphate trên cơ s một khuôn mẫu DNA. DNA replicase. Toàn bộ phức hợp enzyme và protein đặc hiệu cần thiết cho sự tái bản DNA (DNA replication). DNA siêu xoắn (DNA supercoiling). DNA xoắn lại trên bản thân nó, thư ng là kết quả của sự gấp khúc, m xoắn hoặc xoắn lại của chuỗi xoắn kép DNA. Công nghệ tế bào 190 Dịch mã (translation). Quá trình tổng hợp phân tử protein từ khuôn mẫu mRNA. Dòng (clone). Tập hợp các phân tử, tế bào hoặc cá thể giống hệt nhau cùng bắt nguồn từ một phân tử, tế bào hay cá thể ban đầu. Dòng giao tử (gametoclone). Những thực vật được tạo ra từ giao tử, bào tử giảm nhiễm hoặc thể giao tử. Dòng tế bào (cell line). Khái niệm để chỉ sự nuôi cấy của những tế bào có nguồn gốc chung từ lần cấy chuyển đầu tiên. Dung hợp tế bào (cell fusion). Kỹ thuật làm cho hai hay nhiều tế bào dung hợp với nhau thành một tế bào. Dung hợp protoplast (protoplast fusion). Kỹ thuật làm cho hai hay nhiều tế bào trần (tế bào thực vật đã phá bỏ thành cellulose) dung hợp với nhau thành một tế bào. Điện di (electrophoresis). Điện di là kỹ thuật phân chia các phân tử như protein hoặc các đoạn nucleic acid trên cơ s khối lượng và điện tích thực của chúng bằng sự dịch chuyển khác nhau thông qua giấy, hoặc thông qua gel trong điện trư ng. Nói cách khác, điện di là sự dịch chuyển trong điện trư ng của những phân tử tích điện trong dung dịch. Kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose gel và polyacrylamide) được sử dụng rộng rãi cho DNA, RNA và protein. Độ hấp thụ ánh sáng (absorbency). Hiện tượng một chùm ánh sáng khi đi qua một môi trư ng có thể bị giảm về cư ng độ do hấp thụ và do hiệu ứng tán xạ. Động học enzyme (enzyme kinetics). Là vận tốc phản ứng enzyme được biểu diễn bằng lượng cơ chất bị chuyển hóa (mol) hoặc lượng sản phẩm được tạo thành (mol) trong một đơn vị th i gian (giây). Động học tế bào (cell kinetics). Là kết quả của hệ thống các phản ứng hóa sinh và các quá trình vận chuyển phức tạp, bao gồm nhiều pha và các hệ thống nhiều thành phần. Trong suốt th i gian sinh trư ng, hỗn hợp không đồng nhất của các tế bào già và non thay đổi liên tục và tự thích nghi với môi trư ng dinh dưỡng là yếu tố cũng thay đổi liên tục trong các điều kiện vật lý và hóa học. E. coli (Escherichia coli). Vi khuẩn thư ng có trong ruột non của động vật có xương sống. E. coli được coi như sinh vật mẫu cho việc nghiên cứu hoạt động của tế bào. Công nghệ tế bào 191 Enzyme gắn DNA (DNA ligase). Một enzyme tạo ra một liên kết phosphodieste giữa đầu 3’-OH của một đoạn DNA và đầu 5’-PO4 của một đoạn DNA khác. Đoạn nối liền được kết hợp bổ sung đôi base với sợi DNA khuôn mẫu. Enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). Các enzyme hạn chế được phân lập từ prokaryote, chúng có khả năng phân hủy DNA phage, hạn chế khả năng sinh trư ng của phage trong vi khuẩn bằng cách cắt phân tử DNA. Hiện nay, có khoảng 500 loại RE khác nhau. Các enzyme này cắt DNA sợi đôi các vị trí nhận biết đặc biệt của chúng gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi). Exon. Các đoạn DNA trong gen có chức năng phiên mã. Exon tồn tại cả sinh vật prokaryote lẫn eukaryote. eukaryote, các exon nằm xen kẽ với các đoạn intron chiếm tới 90% tổng số DNA của tế bào và không có chức năng phiên mã. Gen (gene) hay cistron. Đơn vị cơ bản của di truyền, là một đoạn nhiễm sắc thể mã hóa một chuỗi polypeptide hoặc một phân tử RNA. Gen bao gồm các vùng nằm trước và sau vùng mã hóa và cả những trình tự (intron) nằm giữa các phần mã hóa (exon). Gen kháng apoptosis (antiapoptosis gene). Là gen kháng lại hiện tượng chết tự nhiên đã được chương trình hóa (apoptosis) để tạo ra các vật chủ siêu sản xuất (superior production hosts). Gen chọn lọc (selector) hay gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker). Là các gen chỉ thị được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào được biến nạp và không biến nạp. Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trên môi trư ng nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lập các tế bào tái tổ hợp sống sót. Gen điều hòa (regulatory gene). Một gen mà sản phẩm của nó tham gia vào sự điều hòa biểu hiện của một gen khác. Ví dụ: gen mã hóa một protein kìm hãm. Gen khởi động (promoter). Một trình tự trên phân tử DNA mà đó RNA polymerase có thể kết hợp được để kh i đầu sự phiên mã. Gen nhảy hay nhân tố chuyển vị (transposon). Một đoạn DNA nh có cấu trúc đặc biệt nên có khả năng di chuyển từ một vị trí này đến một vị trí khác trên phân tử DNA hay từ một nhiễm sắc thể này sang một nhiễm sắc thể khác trong tế bào lưỡng bội. Gen nhảy chỉ chuyển đến những vị trí xác Công nghệ tế bào 192 định trong genome. Trong nhiều trư ng hợp gen nhảy có thể gây đột biến tại vị trí nó di chuyển đến. Gen nhảy có thể dùng làm phương tiện để gây đột biến định hướng. Gen tăng cường (enhancer). Một trình tự dạng cis, có khả năng đẩy mạnh việc sử dụng một số promoter eukaryote, có thể hoạt động theo cả hai hướng bất kỳ vị trí nào so với promoter để kích thích sự phiên mã của một gen nhất định. Gen tiền ung thư (proto-oncogene). Tìm thấy trong genome eukaryote, là thành phần tương ứng của các gen ung thư tìm thấy trong các retrovirus. Gen ung thư (oncogene). Gen mã hóa cho những sản phẩm có khả năng biến tế bào eukaryote thành tế bào ung thư. Ghép nối (splicing). Sự loại bỏ các intron và nối liền các exon mRNA trong quá trình hoàn thiện sau phiên mã. Glycosyl hóa (glycosylation). Là quá trình bổ sung một hoặc nhiều phân tử carbohydrate (gốc đư ng) vào một phân tử protein (glycoprotein) sau khi nó được tổng hợp nh ribosome. Helper plasmid. Plasmid trợ giúp mang vùng vir (virulence) và ori được sử dụng trong giao phối bộ ba (triparental matting): Agrobacterium không có plasmid, E. coli có helper plasmid và E. coli có binary vector mang gen ngoại lai để tạo thành một Agrobacterium tái tổ hợp có binary vector được dùng cho việc biến nạp vào tế bào và mô thực vật. Hệ gen (genome). Trình tự DNA toàn phần của một sinh vật, chứa toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể. Hệ lên men (fermenter) hay nồi phản ứng sinh học (bioreactor). Là loại thiết bị mà trong nó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành b i các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào in vivo (enzyme). Ba kỹ thuật lên men cơ bản là: lên men mẻ, lên men mẻ có cung cấp dinh dưỡng và lên men liên tục. Các hệ lên men được thiết kế dựa trên cơ s của ba kỹ thuật này nhưng được cải tiến cho từng trư ng hợp cụ thể để tăng hiệu suất nuôi cấy. Hiệu suất bám (attachment efficiency). Phần trăm số tế bào bám được lên bề mặt môi trư ng nuôi cấy trong một th i gian nhất định. Hiệu suất nuôi trải (plating efficiency). Khái niệm này đồng nghĩa với hiệu suất tạo dòng, nói lên phần trăm số tế bào phát triển thành dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trư ng. Công nghệ tế bào 193 Hiệu suất tạo dòng (cloning efficiency). Phần trăm số tế bào đã tạo được dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trư ng. Hybridoma. Dòng tế bào được hình thành từ sự phối hợp một tế bào ung thư và một tế bào bạch cầu lymphocyte B. Hybridoma có khả năng sản sinh các kháng thể (immunoglobulin) một cách vĩnh viễn. Intron. Là một đoạn DNA được phiên mã nhưng bị loại bỏ trong quá trình hoàn thiện của mRNA, không có mặt phân tử mRNA hoàn chỉnh. In vitro. Dùng để chỉ một quá trình xảy ra trong dịch chiết tế bào không chứa tế bào nguyên vẹn, hay để chỉ các tế bào nuôi cấy trong môi trư ng nhân tạo. In vivo. Dùng để chỉ các hiện tượng xảy ra trong tế bào nguyên vẹn hay trong cơ thể. Kháng nguyên (antigen). Phân tử có khả năng kích thích sản sinh một kháng thể khi xâm nhập vào một cơ thể sống. Kháng thể (antiboby). Một protein (immunoglobulin) do tế bào bạch cầu lymphocyte B sản sinh, có khả năng nhận biết một kháng nguyên lạ đặc trưng và lúc đó sẽ kh i đầu một đáp ứng miễn dịch. Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody). Được sản sinh từ một dòng hybridoma, vì mỗi dòng hybridoma phát xuất chỉ từ một tế bào bạch cầu lymphocyte B nên toàn bộ các phân tử kháng thể sản sinh ra đều y hệt nhau. Không bào (vacuole). Có vai trò tiếp nhận các chất thải của sự trao đổi chất hoặc các chất thứ cấp của thực vật. các tế bào non không bào thư ng nhỏ và nhiều, khi tế bào lớn dần và già hơn thì không bào cũng m rộng lên và kết thành một khối. các tế bào thực vật trư ng thành, không bào có thể chiếm tới 90% thể tích tế bào. Không bào được bọc chung quanh b i màng huyết tương (plasma). Thành phần chính của các không bào lớn là nước chứa các chất hòa tan như các ion vô cơ, các amino acid, các acid hữu cơ, các sắc tố hòa tan trong nước (anthocyanin) và các chất không hòa tan dạng tinh thể và hình kim. Ngoài ra, không bào cũng chứa các protein như các hydrolyse, catalase và photphatase. Phần bào tan muốn đề cập đến lipid chung quanh tất cả các cấu trúc nổi giữa nhân và màng tế bào. Kilobase (Kb). Một nghìn cặp base của một phân tử DNA. Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique). Qui trình ngăn ngừa sự nhiễm nấm, vi khuẩn, siêu vi khuẩn hoặc các loại vi sinh vật khác đối với nuôi cấy mô và tế bào. Công nghệ tế bào 194 Lai tế bào (cell hybridization). Sự dung hợp hai hay nhiều tế bào không giống nhau để tạo một thể tế bào hỗn hợp. Lần cấy chuyển (passage number). Số lần tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy được cấy chuyển, qua đó có thể tính tuổi và hệ số đẳng trương của chúng. Lục lạp (chloroplast). Là vị trí của quang hợp trong tế bào thực vật, nó chứa chlorophyll là sắc tố lục phản ứng với ánh sáng để sản xuất các carbohydrate. Lưới nội sinh chất (endoplasmic reticulum). Một bào quan có trong tế bào chất của những sinh vật eukaryote, là một phức hợp mạng có hai màng, liên quan đến quá trình tổng hợp và vận chuyển protein. Màng tế bào (cell membrrane). Là lớp trong của thành tế bào. Màng tế bào bao gồm protein và lipid, nó có chức năng điều hòa sự vận chuyển các chất đi vào và ra khỏi tế bào. Mã di truyền (genetic code). Tất cả những bộ ba nucleotide DNA (hoặc mRNA) mã hóa đặc hiệu 20 amino acid khác nhau của protein. Mã kết thúc (termination codon). UAA, UAG và UGA là những mã kết thúc hoặc còn gọi là mã dừng (stop codon), là những tín hiệu kết thúc tổng hợp protein. Mật độ quần lạc (population density). Số lượng tế bào trên đơn vị diện tích nuôi cấy hay trên đơn vị thể tích nuôi cấy. Mẫu vật (explant). Mô được tách từ nguyên liệu ban đầu dùng để duy trì hoặc nuôi cấy. Methyl hóa (methylation). Mục đích bảo vệ DNA của các đoạn palindrome, nghĩa là gắn gốc methyl (CH3) vị trí cần thiết nên không bị enzyme hạn chế cắt. Khi có sự methyl hóa thì enzyme không nhận biết được vị trí cắt hạn chế và do đó DNA không bị cắt, DNA của phage không có gắn gốc methyl sẽ bị cắt. Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, enzyme methyl hóa được gọi là methylase enzyme. Methylase được dùng để bảo vệ đoạn DNA cần gắn vào. Tất cả các chủng E. coli đều chứa hai enzyme methyl hóa DNA là: dam-methylase và dcm-methylase. Môi trường nhân tạo (chemically difined medium). Dung dịch dinh dưỡng dùng để nuôi cấy chỉ chứa những thành phần mà cấu trúc hóa học đã được biết. Mô sẹo (callus). Khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia, được phát sinh từ các tế bào đã phân hóa ít nhiều. Công nghệ tế bào 195 Khi thực vật bị thương tổn thư ng tạo loại mô này trên vết sẹo, vì thế có tên gọi là mô sẹo. Nhân (nuclear). Là trung tâm điều khiển của tế bào chứa DNA để phiên mã và dịch mã thành protein. Các protein tổng hợp được sắp xếp và đóng gói trong các túi của bộ máy Golgi. Nhân dòng (clonal propagation). Nhân giống vô tính những dòng thực vật có nguồn gốc từ một cá thể hay một mảnh cắt duy nhất, đảm bảo hoàn toàn đồng nhất về di truyền. Nhân giống in vitro (in vitro propagation). Nhân giống một loài thực vật trong ống nghiệm (bình thủy tinh, bình plastic, hộp plastic...) trên môi trư ng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Đồng nghĩa với khái niệm vi nhân giống (micropropagation). Nucleic acid. Những polynucleotide sinh học tự nhiên trong đó những đơn vị nucleotide được kết hợp với nhau b i những liên kết phosphodieste thành trình tự riêng biệt: DNA và RNA. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension culture). Phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) trạng thái lơ lửng trong môi trư ng lỏng trong bình tam giác trên máy lắc (shaker) hoặc trong các hệ lên men chìm (fermenter/bioreactor) để thu sinh khối tế bào (cell biomass) hoặc dịch nuôi cấy (borth), phục vụ cho việc tách chiết các hợp chất có hoạt tinh sinh học từ tế bào (đối với các hợp chất nội bào) hoặc tinh sạch chúng từ dịch nuôi cấy (đối với các hợp chất ngoại bào). Nuôi cấy mô (tissue culture). Duy trì và sinh trư ng các loại mô trong điều kiện in vitro nhằm điều khiển phân hóa về hình thái và chức năng của chúng. Nuôi cấy mô thực vật (plant tissue culture). Duy trì và nuôi dưỡng tế bào, mô, cơ quan hay cây hoàn chỉnh của thực vật trong điều kiện in vitro. Nuôi cấy khởi đầu hay nuôi cấy sơ cấp (primary culture). Nuôi cấy đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu tính đến lần cấy chuyển đầu tiên từ đó sẽ thu được dòng tế bào. Nuôi cấy phôi (embryo culture). Duy trì và phát triển phôi non hoặc đã trư ng thành được phân lập từ hạt. Nuôi cấy tế bào (cell culture). Khái niệm chỉ những nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) của những tế bào kể cả tế bào đơn không phân hóa thành mô. Công nghệ tế bào 196 Pha lag (lag phase). Là pha tĩnh kh i đầu hoặc tiềm tàng. Đây là th i kỳ kh i đầu của quá trình nuôi cấy, trong suốt th i kỳ này sự thay đổi số lượng tế bào là bằng không hoặc không đáng kể. Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên, nhưng tế bào có thể sinh trư ng bằng cách tăng kích thước trong suốt th i kỳ này. Pha log (logarithm phase). Là pha sinh trư ng theo hàm mũ. các cơ thể đơn bào (vi sinh vật) hoặc tế bào động-thực vật, sự nhân đôi tăng dần số lượng tế bào cho kết quả tốc độ sinh trư ng tăng lên liên tục trong quần thể giai đoạn này. Pha tĩnh (stationary phase). Là giai đoạn mà sự sinh trư ng của quần thể tế bào thư ng bị hạn chế hoặc do sử dụng hết toàn bộ các chất dinh dưỡng có sẵn hoặc do sự tích lũy các sản phẩm độc của sự trao đổi chất. Kết quả là tốc độ sinh trư ng giảm và sự sinh trư ng cuối cùng đã dừng lại. Pha chết (death phase). Là giai đoạn tiếp theo của pha tĩnh mà trong đó các cơ thể trong quần thể bị chết. Sự chết xuất hiện hoặc do sự suy yếu của việc bảo quản năng lượng của tế bào, hoặc do sự tích lũy các sản phẩm độc tố. Giống như sự sinh trư ng, sự chết là một hàm mũ. Trong một số trư ng hợp, cơ thể không chỉ chết mà còn phân hủy (quá trình phân giải). Phân hóa hay biệt hóa (differentiation). Một khía cạnh của sự phát triển bao gồm sự hình thành các loại tế bào, các loại mô, các loại cơ quan khác từ một hợp tử ban đầu dưới sự điều khiển đặc biệt của các gen. Phiên mã (transcription). Sự tổng hợp mRNA từ khuôn mẫu DNA. Phiên mã ngược (reverse transcription). Sự tổng hợp DNA từ khuôn mẫu mRNA nh enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Phóng xạ tự ghi (autoradiography). Kỹ thuật phát hiện các phân tử có đánh dấu phóng xạ thông qua hiệu ứng tạo ảnh của các phân tử này trên phim X-quang. Phương trình Monod (Monod equation). Là một trong những phương trình được sử dụng rộng rãi nhất thể hiện ảnh hư ng của nồng độ cơ chất (chất dinh dưỡng) lên tốc độ sinh trư ng đặc trưng của tế bào (µ): µ= µ max C S K S + CS Trong đó: C S là nồng độ của cơ chất giới hạn (limiting substrate) trong môi trư ng và K S là hệ số hệ thống. Giá trị của K S tương đương với Công nghệ tế bào 197 nồng độ của chất dinh dưỡng khi tốc độ sinh trư ng đặc trưng bằng một nữa giá trị cực đại của nó ( µ max ) . Plasmid. Một phân tử DNA mạch vòng ngoài nhiễm sắc thể, sao chép độc lập, không phụ thuộc vào DNA của nhiễm sắc thể. Protein. Một phân tử lớn gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi có một trình tự amino acid nhất định, khối lượng phân tử của protein từ vài nghìn đến vài triệu. Ribosome. Được tập trung trên bề mặt của mạng lưới nội sinh chất và tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein. RNA thông tin (messenger RNA, mRNA). Một trong ba loại RNA tham gia vào tổng hợp protein. Loại này có mang thông tin được mã hóa trong trình tự các nucleotide để xác định trình tự amino acid của polypeptide. RNA vận chuyển (transfer RNA, tRNA). Một trong ba loại phân tử RNA được sinh ra b i quá trình phiên mã và tham gia vào việc tổng hợp protein: RNA vận chuyển đưa amino acid đến ribosome vào đó chúng ghép với thông tin trên mRNA. Sắc ký (chromatography). Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tích sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh trạng thái rắn. Ngư i ta thư ng chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học. Sinh khối (biomass). Tổng khối lượng khô của tất cả các chất sống trong một đơn vị diện tích hoặc thể tích. Sinh trưởng cân bằng (balanced growth). Là sự sinh trư ng mà trong suốt quá trình đó sự nhân đôi sinh khối xảy ra cùng với sự nhân đôi của tất cả các đặc tính xác định khác của quần thể như là protein, DNA, RNA và nước nội bào. Sự tái bản hay sao chép (replication). Sự tổng hợp một phân tử DNA xoắn kép giống với phân tử DNA mẹ. Tạo dòng gen (gene cloning). Còn gọi là nhân dòng hay tách dòng gen, là sự sản sinh nhiều bản sao của một phân tử DNA, thư ng là phân tử DNA tái tổ hợp, bằng cách sao chép phân tử đó trong một vật chủ thích hợp. Công nghệ tế bào 198 Tái tổ hợp (recombination). Quá trình trong đó nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt ra rồi các phần đứt được nối lại theo một tổ hợp mới. Quá trình này có thể xảy ra trong tế bào sống (qua sự trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm) hay trong ống nghiệm nh các enzyme cắt và nối DNA. Tầng nuôi dưỡng (feeder layer) hay tế bào nuôi dưỡng (nurse cells). Lớp tế bào có thể đã bị chiếu xạ làm mất khả năng phân bào được trải bên dưới để cung cấp một số chất cần thiết cho lớp tế bào khác nuôi bên trên. Tế bào lai (hybrid cell). Là tế bào có một nhân được hình thành sau khi dung hợp hai tế bào dẫn đến sự hình thành một nhân hỗn hợp. Tế bào mầm phôi (embryonic stem cell). Tế bào phôi chưa biệt hóa, có thể được nuôi cấy trong một th i gian dài mà vẫn giữ được tính đa thể (nghĩa là khả năng biệt hóa theo nhiều hướng khác nhau). Thành tế bào (cell wall). Được cấu tạo b i các carbohydrate tự nhiên (cellulose và hemicellulose). Lớp ngoài của thành tế bào chứa pectin để giúp nó liên kết với các tế bào bên cạnh. Thành tế bào có chức năng nâng đỡ cho cây. Thể ổn định hóa tính (chemostat). Trong hệ lên men liên tục tốc độ dòng chảy dinh dưỡng được cài đặt một giá trị đặc biệt và tốc độ sinh trư ng của nuôi cấy sẽ điều chỉnh tốc độ dòng chảy này, như vậy sẽ duy trì được nồng độ môi trư ng dinh dưỡng thích hợp với mật độ tế bào. Thể ổn định độ đục (turbidostat). Được sử dụng khi hệ lên men liên tục tiến hành các tốc độ pha loãng cao gần với điểm rửa trôi (washout point), khi ta có thể ngăn cản sự rửa trôi bằng cách điều hòa tốc độ dòng chảy trong trư ng hợp thất thoát tế bào thông qua dòng chảy ra ngoài vượt quá sự sinh trư ng tế bào trong hệ lên men. Thời gian gấp đôi quần thể (population doubling time). Th i gian mà số lượng tế bào của dòng hay chủng nuôi cấy tăng đến gấp đôi kể từ khi bắt đầu nuôi. Thực khuẩn thể (bacteriophage). Một virus có thể tái bản trong một tế bào vi khuẩn. Tiếp mẫu (inoculation). Bước đưa mẫu vào trong nuôi cấy kh i đầu (initiation culture). Tính toàn thể (totipotency). Một đặc tính của tế bào là có khả năng phát triển thành mọi kiểu tế bào có trong cơ thể trư ng thành mà từ đó nó được tách ra, tức là có khả năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh. Công nghệ tế bào 199 Tốc độ phân chia tế bào (cell division rate). Sự phân chia tế bào trên một đơn vị th i gian. Tốc độ phân chia là hằng số trong suốt th i gian sinh trư ng (theo hàm mũ) của tế bào. Tốc độ sinh trưởng tế bào (cell growth rate). Sự thay đổi số lượng tế bào theo th i gian. Tốc độ sinh trư ng không phải là một hằng số trong suốt th i gian sinh trư ng (theo hàm mũ) của tế bào. Tốc độ sinh trưởng đặc trưng của tế bào (cell specific growth rate). Sự thay đổi theo logarithm tự nhiên của số lượng tế bào theo th i gian. Trình tự cis. Trình tự trên một phân tử DNA có tác động (điều hòa) đến các trình tự khác trên cùng phân tử DNA đó. Các trình tự cis không mã hóa cho protein. Tuổi thế hệ tế bào (cell generation time). Th i gian giữa hai lần phân chia của tế bào. Khái niệm này không đồng nghĩa với th i gian gấp đôi quần thể. Ty thể (mitochondrion). Chứa vật liệu di truyền và nhiều enzyme quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào. Vector. Là các phân tử DNA được sử dụng trong tạo dòng gen và nhân bản chúng trong tế bào vật chủ (E. coli hoặc nấm men). Có ba nhóm vector chính gồm: (1) Nhóm plasmid, (2) Nhóm phage/phagemid, và (3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). Ý tư ng về vector chuyển gen bắt nguồn từ các plasmid của vi khuẩn. Vector chuyển gen là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được các gen cần chuyển. Vector hai nguồn (binary vector). Là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, các plasmid trong trư ng hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Virus. Phần tử có mang nucleic acid (DNA hoặc RNA) nằm trong một vỏ bọc protein, có khả năng sao chép trong tế bào chủ và lan truyền từ tế bào nọ sang tế bào kia. Xoắn kép (double helix). Cấu trúc ba chiều tự nhiên của hai chuỗi DNA bổ sung, đối song và xoắn với nhau. Công nghệ tế bào 200