Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen germi (O-methtrasferase) sinh dẫn xuất kháng sinh demethyl - dihydrochalcomycin từ chủng streptomyces SP. KCTC 0041BP

- Nguyễn Thị Phương Thảo Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp.
- Tạ Thị Thu Thủy Hà Nội – Năm 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Phương Thảo Đề tài luận văn: “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp.
- Bổ sung tổng quan về gen gerMI - Bổ sung cơ chế tiếp hợp vi khuẩn, xạ khuẩn - Chỉnh sửa lại phần phương pháp nghiên cứu - Bổ sung trình tự DNA các đoạn gen vào phần Phụ lục - Chỉnh sửa các lỗi chính tả, một số thuật ngữ Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2017 Giáo viên hướng dẫn GS.
- Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Thị Phương Thảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin Apr Apramycin bp Base paire C Carbon CKS Chất kháng sinh Cm Chloramphenicol DHC Dihydrochalcomycin DMI Downstream MI DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotides ORFs Open reading frames RNA Ribonucleic Acid Gr+ Gram dương Gr- Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh Kb Kilobase Neo Neomycin Neor Gen kháng neomycin PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate Tet Tetracycline TLC Thin layer chromatography IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside UMI Upstream MI DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Cấu trúc của DHC.
- Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh DHC.
- Cơ chế của quá trình trao đổi chéo của xạ khuẩn.
- Kết quả kiểm tra tách DNA tổng số xạ khuẩn.
- PCR nhân đoạn UMI, DMI từ DNA tổng số xạ khuẩn.
- 48 Hình 3.10.
- 49 Hình 3.11.
- 49 Hình 3.12.
- 50 Hình 3.13.
- Quy trình tạo vector đột biến gen gerMI.
- 51 Hình 3.14.
- 52 Hình 3.15.
- 52 Hình 3.16.
- 53 Hình 3.17.
- 54 Hình 3.18.
- 56 Hình 3.19.
- 56 Hình 3.20.
- 57 Hình 3.21.
- 59 Hình 3.22.
- KCTC 0041BP và chủng đột biến M1-5-14.
- 60 Hình 3.23.
- Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
- KCTC 0041BP ban đầu và chủng đột biến M1-5-14.
- 61 Hình 3.24.
- Các mẫu kháng sinh sau khi chạy cột sắc ký với tỷ lệ Methanol:Chloroform từ 1:99 đến 10:90.
- 62 Hình 3.25.
- 63 Hình 3.26.
- 63 Hình 3.27.
- 64 Hình 3.28.
- Phân tích HPLC và MS sản phẩm kháng sinh từ chủng đột biến S.sp.ΔM1-5.
- Thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp.
- Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng đột biến M1-5-14 và chủng wild type.
- Xạ khuẩn.
- Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên.
- Xạ khuẩn Streptomyces sp.
- Kháng sinh DHC.
- Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh.
- Vector tách dòng và vector đột biến.
- Vector đột biến.
- Tiếp hợp và đột biến gen ở xạ khuẩn.
- Cơ chế đột biến gen của xạ khuẩn.
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Các phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp thiết kế mồi.
- Phương pháp PCR.
- Phương pháp tạo tế bào khả biến.
- Phương pháp chuyển gen vào tế bào vi khuẩn.
- Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn.
- Phương pháp điện di trên gel agarose.
- Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose.
- Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn.
- Phương pháp nối DNA.
- 33 2.2.10.Phương pháp tiếp hợp.
- 34 2.2.11.Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc sau tiếp hợp.
- 35 2.2.12.Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ xạ khuẩn.
- 36 2.2.13.Phương pháp tách chiết kháng sinh thô.
- 37 2.2.14.Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh.
- 37 2.2.15.Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC.
- 38 2.2.16.Phương pháp sắc ký cột.
- 39 2.2.17.Phương pháp LC-MS.
- Tách chiết DNA tổng số xạ khuẩn Streptomyces sp.
- Tạo vector đột biến gen gerMI trong vector pKC1139.
- Biến nạp vector đột biến gen gerMI vào E.
- Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền.
- Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp.
- KCTC 0041BP đột biến.
- Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
- Phân tích hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC và phủ thạch.
- Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh bằng sắc ký.
- Điều kiện thích hợp thu nhận dẫn xuất kháng sinh.
- Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin – chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941- penicillin mới chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu.
- Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình.
- Trong số hơn 10.000 CKS được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp trên 80% [13].
- Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng.
- Việc sử dụng một số chất kháng sinh để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả như mong muốn.
- Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng.
- 2 Dihydrochalcomycin (DHC) là kháng sinh thuộc nhóm macrolide 16C, được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp.
- Nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội của nó như ít độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, đặc biệt có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc.
- DHC là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
- Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DHC, gen gerMI được dự đoán có chức năng mã hóa cho enzyme O-methyltransferase xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C3 của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc kháng sinh DHC.
- Trên cơ sở đó, nhằm tìm ra con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất kháng sinh này ứng dụng trong chữa bệnh, em đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp.
- Tạo chủng đột biến gen gerMI từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
- KCTC 0041BP bằng phương pháp tiếp hợp, chủng đột biến có khả năng sinh tổng hợp dẫn xuất của Dihydrochalcomycin.
- Tách chiết dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn đột biến.
- Chứng minh chức năng gen gerMI tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh DHC.
- Tách dòng đoạn UMI (upstream MI), DMI (downstream MI) từ DNA tổng số xạ khuẩn Streptomyces sp.
- Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI, DMI và gen Neor - Tạo vector đột biến gen gerMI trong vi khuẩn Escherichia coli ET12567/ pUZ8002 - Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền - Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn đột biến - Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến bằng sắc ký 4 CHƯƠNG 1.
- Xạ khuẩn 1.1.1.
- Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên.
- Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.
- Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS.
- Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [2].
- Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều CKS có giá trị đang dùng trong y học như gentamycine, tobramycine, vancomycine, rovamycine.
- Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh.
- Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững trong đất như cenlulose, tinh bột, chất mùn kitin, keratin…góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên.
- Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12).
- Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men do xạ khuẩn sinh ra nhiều như

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt