Chng 2 - PHNG PHP NGHIN CU

2.1. Vt liu nghin cu 2.1.1. i tng nghin cu - Chng vi khun c cung cp t ti cp nh nc thuc chng trnh cng ngh sinh hc "To ch phm vi sinh c tnh khng vi khun gy bnh gan thn m (Edwardsiella ictaluri) trn c tra nui (Pangasianodon hypophthalmus)" ang thc hin ti Vin nghin cu nui trng thu sn II trong 3 nm 2010 - 2012. Bng 2.1. Danh sch cc chng vi khun sng lc kh nng i khng vi vi khun E. ictaluri STT 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 K hiu B20.1 B4.2.2 LA111 LA108 B3 G4.AG22.3 (14) G4.AG21 (61) T.VT1.1 (72) G4.VL21.2 (58) T.DT.1.4.1 (114) N6.1 N10.2 N19.2 B4 N26.3 Loi vi khun Bacillus subtilis Bacillus subtilis Weisella paramesenteroides Lactobacillus plantarum B. circulans Pediococcus pentosaceus Pediococcus acidilactici Lactobacillus fermentum Lactococcus brevis Pseudomonas aeruginosa Bacillus amyloliquefaciens Bacillus cereus Bacillus pumilus B. thuringenesis Bacillus subtilis Ngun gc Bn ao nui c tra Bn ao nui c tra H tiu ho c tra ging H tiu ho c tra ging Bn ao nui c tra H tiu ho c tra ging H tiu ho c tra ging H tiu ho c tra tht H tiu ho c tra ging H tiu ho c tra tht Nc ao nui c tra Nc ao nui c tra Nc ao nui c tra Bn ao nui c tra Nc ao nui c tra

20

- Chng vi khun gy bnh: Chng Edwardsiella ictaluri Gly 09M nhn t Trung Tm Quc Gia Quan Trc Cnh Bo Mi Trng v Phng Nga Dch Bnh Thy Sn Khu Vc Nam B, Vin nghin cu nui trng Thy Sn II. - C tra (Pagasianodon hypophthalmus) c mua t Trung Tm Quc Gia Ging Thy Sn Nc Ngt Nam B. C c kch c ng u, khe mnh, khng try xc, khng d hnh, trng lng trung bnh 5 - 20g/con. 2.1.2. Dng c, thit b - Cn in t bn s l (Precisa XB 220A) - Micropipetter (100-10000l, 20- 200l, 10-100l) - My lc (Orbital incubator SI 50) - My x l mu (Stomacher 40 shimadzo) - T cy v trng (Microflow) - T lnh (SANYO) - T lnh su -800C (SANYO) - T m (Memmert) - T sy (Memmert) - My ly tm lnh (HERMLE) - My ng kh (Christ) - My o OD my UV/VIS Spectrometer Lambda EZ 210 - Ni ln men 5 lt Bioflo 110 - My o pH bn (Thermo Orion) - Ni hp v trng (HIRAYAMA) - My ct nc hai ln (Hammilton). - Lame, lamelle, ng ong, ng nh git, pipet, ng chch, khu trang, cc loi u tp, kim tim cc loi, gng tay, chai chu nhit, n cn, bnh xt cn, que cy, cc thy tinh, b ko nhp tiu phu, a Petri, ng nghim, khay nha, bt sp (PAP), li 100l, khn giy, l nha, khun inox, du soi knh, knh hin vi, my nh, microplate 96 ging, microplate 12 ging.

21

2.1.3. Ha cht, mi trng Mi trng - Mi trng dinh dng thng thng: Nutrient agar (NA), Brain Heart Infusion agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Trypton soya agar (TSA), Trypton soya broth (TSB), Lactobacillus MRS Broth, Lactobacillus MRS agar, Skim milk, peptone. Mi trng BA (Blood agar) b sung 5% mu cu. Ha cht Dung dch thu nhn bch cu T trng HBSS 10X Percoll Nc ct (37%) 1 ml 3.7 ml 5.3 ml (51%) 1 ml 5.1 ml 3.9 ml

HBSS 10X (Hanks' Balanced Salt Solution 10X) Hot ng bng n h hp (O-2) Dung dch Modified Hanks balanced salt (McHBSS) CaCl2: 10 mM MgCl2: 3 mM MgSO4: 5 mM Dung dch Poly-L-lysine (0.2%) Poly-L-lysine: 100 mg Nc ct: 50 ml Dung dch Zymozan (0.1%) Zymosan: 15 mg McHBSS: 15 ml Dung dch Nitroblue tetrazolium (0.3%) Nitroblue tetrazolium : 0.3 g Nc ct: 100 ml Methanol (100%), Methanol (70%)

22

KOH

2M

Hot ng thc bo Dung dch PBS KCl: 0.2 g KH2PO4: 0.2 g NaCl: 8 g NaH2PO4.7 H2O: 1.56 g Hoc (NaH2PO4.12 H2O): 2.08 g Dung dch Formaldehyde 10% Propidium iodine (Sigma): Hot ng lysozyme Pha m PB : Na2HPO4 . 6H2O 0,05M NaH2PO4 0,05M Mirococcus lysodeikticus solution Mirococcus lysodeikticus (Sigma): 0.2 mg m PB (50 mM, pH 6.2): 1ml Lysozyme lng trng trng g (Sigma): 16 g/ml 10mg/10ml ca PBS

23

2.2. Phng php nghin cu 2.2.1. B tr th nghim

Vi khun phn lp t h tiu ho, nc v bn ao nui c tra Kho st kh nng i khng E. ictaluri ca cc chng vi khun C tra c cho n thc n b sung vi khun phn lp c mt : 2x107 cfu/g, thi gian 28 ngy LD50 Cm nhim E. ictaluri Vi khun tuyn chn

LD50

Cm nhim E. ictaluri

p ng min dch t nhin

* Min dch t bo - Hot ng thc bo (Phagocytosis activity) - Hot ng h hp cp (Respiratory burst)

* Min dch dch th - Hot tnh lysozyme

S 2.1. S b tr th nghim 2.2.2. Kho st kh nng i khng ca cc chng vi khun phn lp vi Edwardsiella ictaluri trong iu kin in vitro Nguyn tc: Khi mt chng vi khun sn xut ra mt hp cht ngoi bo, c tnh cht c ch mt chng vi khun khc v hot tnh ny s c th hin thng qua vic c ch s tng trng ca vi khun khc trong mi trng nui. Kh nng khng ca cc chng vi khun phn lp vi vi khun gy bnh E. ictaluri c xc nh da vo ng knh vng v khun xut hin xung quanh l thch. Cc chng

24

vi khun to vng khng khun c ng knh d 12mm c cho l i khng mnh (+++) ; 7mm d < 12mm : i khng trung bnh (++) ; 0< d < 7mm: i khng yu (+); d = 0mm: khng i khng (-) [30]. Tin hnh: Chng vi khun Edwardsiella ictaluri bo qun -800C, c cy chuyn sang a thch BA v 280C trong 28- 32 gi to ging cp mt. Chn 1 khun lc Edwardsiella ictaluri trn a BA huyn ph trong mi trng BHI broth nui cy lc qua m 280C. Ht 50 l dch vi khun E. ictaluri nh ln a BHI agar/ MRS agar c hp kh trng, tri bng que thy tinh cho kh v dng ng st hnh tr c tit trng c 3 l trn mi a thch c ng knh 8 mm. Vi khun c phn lp c hot ha chng cp 1, chn 1 khun lc nui trong mi trng BHI broth/ MRS broth nui lc qua m 300C. Huyn ph vi khun phn lp c nui cho vo cc l thch vi th tch 50 l v cc a thch c 280 C trong 24 gi. ng knh vng khng khun s c o v xc nh kh nng khng khun ca cc chng vi khun phn lp vi vi khun gy bnh Edwardsiella ictaluri.
Vi khun sng lc (-800C) E. ictaluri (-800)

Cy ria ln BHIA/MRSA

Cy ria ln BA

Chn 1 khun lc, tng sinh trn BHI/MRS broth

Chn 1 khun lc, tng sinh trn BHI broth Ht 50 l tri trn BHIA, kh 15 pht v c l 8 mm (3 l/a)

Ht 50 l dch khun nh vo ging

280C, 24 gi o kch thc ng knh

S 2.2. S kim tra hot tnh khng khun bng phng php ging khuch tn [30]

25

2.2.3. Kho st kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m ca cc chng vi khun phn lp
C tra ging (20g/con) Thun ha 2-4 tun trong b composite 20m3, thc n Green Fish (28% m) Th nghim sng lc 15 chng vi khun (3 t) c kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m - Mt vi khun kho st: 2x107 cfu/g thc n - 15 con/b, mi nghim thc lp li 3 ln - Lng thc n: 3% trng lng thn, 2 ln/ngy - Thi gian cho n: 28 ngy - Thay nc 30%/tun, tun hon v sc kh T 1 (5 chng vi khun) B20.1 B4.2.2 LA111 LA108 B3 T 2 (4 chng vi khun) N10.2 N19.2 B4 N26.3 T 3 (3 chng vi khun) LA14 LA61 LA72

Chn ra cc chng vi khun c kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m Th nghim p ng min dch t nhin Th nghim cm nhim

S 2.3. B tr th nghim sng lc cc chng vi khun c kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m.
28

Th nghim cm nhim c tin hnh trong 3 t nhm chn ra cc chng vi khun c kh nng bo v c tra (cho t l sng cao khc bit c ngha so vi i chng). Cc chng tuyn chn c kho st kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m v gy p ng min dch t nhin. 2.2.3.1 Chun b vi khun Chng vi khun tuyn chn c hot ha cp 1 trn mi trng BHIA hay MRSA. Chn mt khun lc em tng sinh trong BHI broth (i vi Bacillus) hay MRS broth (i vi vi khun lactic) 300C trong 24 - 48 gi ly tm thu sinh khi v tin hnh ng kh bng cht mang c b sung skim milk 20% (w/v). Sau xc nh mt vi khun sau ng kh bng phng php m khun lc[10]. Mt b sung vi khun 2x107 cfu/g vic s dng liu ny da trn c s xc nh nghin cu trc y ca tc gi ti [86]. 2.2.3.2 Chun b thc n th nghim Thc n tng hp Green Fish (28% protein) c s dng lm thc n cho th nghim cm nhim. Cc chng vi khun kho st (ng kh trong skim) ha tan trong nc mui sinh l NaCl 0,85%, vottex cho u, sau b sung vo thc n sao cho t mt cui l 2x 107 cfu/g thc n. Sau thc n c o mt lp du mc (5 % v/w lng thc n), sau kh t nhin khong 15 pht. Thc n i chng s dng du mc vi lng th tch tng ng vi thc n th nghim. Thc n chun b c gi trong t lnh 4oC s dng trong vng 3 ngy. Cho c n trong 28 ngy sau tin hnh cm nhim vi E. ictaluri [28].

Hnh 2.1. Thc n v vi khun ng kh

29

2.2.3.3. Phng php gy bnh thc nghim Chng vi khun Edwardsiella ictaluri bo qun -800C, c cy chuyn sang a thch BA v 280C trong 28- 32 gi to ging cp mt. Chn 1 khun lc Edwardsiella ictaluri trn a BA huyn ph trong mi trng BHI broth 5ml nui cy lc qua m 280C. Tin hnh ln men dch vi khun ny vi th tch 5 lt mi trng BHI broth ( c hp kh trng 1210C trong 15 pht). Cc thng s ln men nh nhit 280C, pH = 7, sc kh 0,5 vvm, tc khy 200 rpm, thi gian ln men 24 36 gi. o OD600nm v xc nh mt vi khun thng qua ng chun tuyn tnh. T iu chnh mt vi khun Edwardsiella ictaluri thch hp (liu ngm 2x LD50) tin hnh cm nhim cho c tra cc nghim thc sau 28 ngy cho n thc n b sung vi khun. C tra c nui trong cc b vi mc nc ban u 60 lt sau h mc nc xung cn 20 lt trong cc b. B sung dch vi khun Edwardsiella ictaluri vo cc b mt cm nhim 2xLD50 ngm c tra cc nghim thc b sung vi khun v nghim thc dng ring nghim thc m b sung BHI broth. Sau , bm nc vo b n th tch ban u l 60 lt. Hng ngy m s c cht trong mi b, th nghim kt thc khi c trong cc b nghim thc khng cht trong vng 3 ngy lin tc th nghim gy nhim kt thc[26]. 2.2.4. Xc nh liu gy cht 50% (LD50) ca E. ictaluri trn c tra ging Th nghim kho st mt vi khun gy cht 50% (LD50) c thc hin theo phng php ca Reed v ctv (1938) [74] Nguyn tc: c lng c tnh cp ca mt chng vi khun gy bnh cho vt ch th nghim, tin hnh kho st c tnh ca chng vi khun liu cao v tng dn xc nh liu LD50, l liu gy cht mt na s vt ch th nghim. Tin hnh: C ging c thun trong b composite 20m3 trong 2- 4 tun, sau chuyn 15 con vo b knh 150 lt v nui thun trong 2 tun cho c quen iu kin b v n bnh thng. Nc nui c c lc v sc kh lin tc, thay nc tun/ 1 ln, mi nghim thc lp li 3 ln. B tr th nghim xc nh LD50 gm 4 nghim thc: 1x105 cfu/ml, 1x106cfu/ml, 1x107cfu/ml v 1x108 cfu/ml v cho n thc n tng hp Green Fish. Sau 28 ngy bt u cm nhim E. ictaluri Gly 09M

30

bng phng php ngm v cho c nhn i trong 12 gi, sau cho n li bnh thng. Ghi nhn s c cht hng ngy cho n khi c ngng cht lin tc trong 3 ngy. Xc nh mt vi khun gy cht 50% (LD50) c tnh da vo cng thc ca Reed v ctv (1938), th nghim xc nh liu LD50 tin hnh qua 3 t th nghim. Gi tr LD50 c tnh theo cng thc:
T l nhim cht > 50% - 50% PD =

TT l nhi m ch t >50% -TT l nhi m ch t << 50% l nhi m ch t >50% l nhi m ch t 50% LD50=10(ly tha ca nng gy cht trn 50% nh nht PD)

Hnh 2.2. B tr th nghim LD50 trong b knh 150 lt bao gm 1x105 cfu/ml, 1x106cfu/ml, 1x107cfu/ml v 1x108 cfu/ml 2.2.5. Th nghim cm nhim sng lc 15 chng vi khun phn lp Nguyn tc: nh gi xem 15 chng vi khun c kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m sau 28 ngy cho n cm nhim bng phng php ngm E. ictaluri Tin hnh: C c trng lng 15-20 g/con c thun trong b composite 3m3, cho n bng thc n Green Fish trc khi tin hnh th nghim cm nhim 2 tun. Th nghim cm nhim tin hnh trong b knh 150 lt, mi b cha 15 con/b, mi nghim thc lp li 3 ln. Th nghim cm nhim c tin hnh 3 t: a) t 1: Kho st 5 chng vi khun gm c: nghim thc i chng m v

31

nghim thc i chng dng (thc n khng b sung vi khun), 5 nghim thc b sung vi khun (B20.1, B4.2.2, LA111, LA108, B3) vo thc n vi mt 2x107 cfu/g thc n. C c nui trong iu kin nhit 28oC, pH, cho n 3% trng lng thn/ngy, thay nc 30%/tun, nc tun hon v sc kh 24 gi/ngy. Sau khi c c cho n 28 ngy, tin hnh gy nhim thc nghim vi E. ictaluri bng phng php ngm vi liu 2xLD50 nghim thc cho n thc n b sung vi khun v nghim thc dng, ring nghim thc i chng m b sung BHI broth. Hng ngy m s c cht trong mi b v thu mu c va cht kim tra vi khun gy bnh trong thn, gan. Th nghim kt thc khi c trong cc nghim thc khng cht trong vng 3 ngy lin tc. T xc nh chn ra chng vi khun c t l sng ca c tra cao c ngha thng k so vi i chng (p<0,05) [4], [43]. b) t 2: B tr th nghim t 2 c nghim thc i chng m v nghim thc i chng dng (thc n khng b sung vi khun), 4 nghim thc b sung vi khun (N10.2, N19.2, B4 v N26.3) cho c tra n sau 28 ngy gy nhim nh t 1. c) t 3: B tr th nghim t 3 c nghim thc i chng m v nghim thc i chng dng (thc n khng b sung vi khun), 3 nghim thc b sung vi khun (LA14, LA61, LA72) cho c tra n sau 28 ngy gy nhim nh t 1 2.2.6. Th nghim kho st kh nng bo v v gy p ng min dch ca c tra t cc chng vi khun tuyn chn T kt qu th nghim cm nhim sng lc 12 chng vi khun trn, tin hnh chn ra cc chng vi khun c t l sng cao khc bit c ngha thng k. Dng cc chng vi khun ny kho st kh nng bo v c tra khng bnh gan thn m v kh nng gy p ng min dch t nhin trn c tra. Nguyn tc: Chn ra chng vi khun gy p ng min dch t nhin khi c kh nng bo v c tra. Tin hnh: C c trng lng 19 g/con c thun trong b composite 3m3, cho n bng thc n Green Fish trong 2 tun. Th nghim cm nhim v gy p ng min dch c tin hnh trong b knh 150 lt, mi b cha 25 con/b, mi nghim thc lp li 3 ln. B sung vi khun mt 2x107 cfu/ml cho n trong 28
32

ngy. Trc khi b tr th nghim tin hnh bt ngu nhin 6 con c thu mu mu v thn c tra. Mu mu thu nhn huyt thanh dng phn tch hot tnh lysozyme (lysozyme activity). T bo bch cu c phn lp t thn trc (head kidney) dng phn tch cc ch tiu nh kh nng hot ng thc bo (phagocytic activity), ch s thc bo (phagocytic index), hot ng sn sinh oxy hot ha (peroxide anion production). B tr th nghim: Nghim thc i chng (thc n khng b sung vi khun), nghim thc cc chng vi khun qua sng lc c t l sng cao (thc n b sung vi khun tuyn chn vi mt 2x107 cfu/g thc n). C c nui trong iu kin nhit 28oC, pH, cho n 3% trng lng thn/ngy, thay nc 30%/tun, nc tun hon v sc kh 24 gi/ngy. Sau khi c c cho n 28 ngy, ly ngu nhin 6 con/ mi b ca nghim thc tin hnh thu mu mu, thn ca c tra. Mu mu thu nhn huyt thanh dng phn tch hot tnh lysozyme (lysozyme activity). T bo bch cu c phn lp t thn trc ca c (head kidney) dng phn tch cc ch tiu nh hot ng thc bo (phagocytic activity), ch s thc bo (phagocytic index) hot ng sn sinh oxy hot ha (peroxide anion production). Sau tin hnh gy nhim thc nghim vi E. ictaluri bng phng php ngm vi liu 2xLD50. Hng ngy m s c cht trong mi b v thu mu c va cht kim tra vi khun gy bnh trong thn v gan. Th nghim kt thc khi c trong cc nghim thc khng cht trong vng 3 ngy lin tc. T xc nh c chng vi khun no c t l sng cao v c kh nng gy p ng min dch t nhin so vi nghim thc i chng. Xc nh t l sng tng i RPS (relative percentage of survival) theo cng thc sau: RPS = [1 (s c cht nghim thc cho n thc n th nghim/s c cht nghim thc cho n thc n i chng)] x 100 [73]. 2.2.6.1. Thu mu mu v huyt thanh c Trc khi tin hnh b tr th nghim thu mu mu c v thu sau 28 ngy cho n thc n b sung vi khun (2x107 cfu/g), mi nghim thc bt ngu nhin 6 con

33

c. Tin hnh gy m c trc khi ly mu ng mch ch ui ca c bng ng tim 1ml v trng v mi con c ch ly mu mt ln trnh nh hng kt qu th nghim. Mu mu thu ti hin trng, gi lnh 40C trc khi a v phng th nghim tin hnh ly tm 1500 rpm trong 10 pht 40C. Huyt thanh c thu t cc mu mu c gi -200C cho n khi tin hnh th nghim o hot tnh lysozyme.

Hnh 2.3. ng mch ch ui c v gii phu thu thn c 2.2.6.2. Thu nhn bch cu t thn trc ca c Qu trnh thu mu v phn lp i thc bo t thn trc ca c da theo phng php ca Yeh v ctv (2008). Sau khi ly mu c tin hnh gii phu c thu thn trc c gi trong L-15 (ha cht v dng c phi c tit trng trc khi ly mu). Bch cu thu nhn t thn trc ca c, thn thu nhn t c s ct ra thnh nhng ming nh v ra 1ml mi trng L-15 hai ln. Dch thu c lc qua li c mt li 100 m v cho thm 3ml mi trng L-15. Dch lc tin hnh phn lp c thc hin trong ng falcon di 15 ml cha 37/51% Percoll (sigma) nh s khc bit t trng, sau ng tube 15 ml em ly tm 400 rpm trong 30 pht 40C. Nhng t bo nm dy bng 37/51% Percoll c thu nhn v ra hai ln vi mi trng L-15, sau ly tm 400 rpm trong 10 pht 40C. Kim tra lng bch cu sng/cht bng dung dch trypan blue, sau cc t bo bch cu c pha long v mt 2 x 106 t bo/ml trong mi trng L-15 nh gi cc thng s min dch [98].

34

Hnh 2.4. T bo bch cu nm xen gia hai lp percoll 37% v 51% 2.2.6.3. Phng php xc nh s lng t bo bch cu Nguyn tc: bit c s lng t bo bch cu ta dng m trc tip mt th tch nht nh bch cu trn mt bung m bit trc th tch vi knh hin vi quang hc. T suy ra s lng t bo bch cu c trong 1mm3 Tin hnh: Gn lame ln bung m dng pipetman cho 20 l dung dch bch cu t nghing mt gc 450 cho vo gia bung m v lame. bch cu chy t t vo bung m n khi lan ta khp lame v hi tha quanh b. t bung m ln bn knh hin vi, 2 - 3 pht cho bch cu lng u. Ly vi trng bng vt knh 10 kim tra xem bch cu tri u cha v m bch cu. m cc khu m bch cu ca bung m Neubauer: m 4 khu bch cu trn 4 gc, mi khu c th tch 1/10 mm3, 4 khu = 4/10 mm3. mi khu s m cc bch cu nm trong k cn cc bch cu nm trn ng cnh cc hnh vung th ch m cc bch cu cnh trn v cnh tri. Tnh kt qu Tng s bch cu = N x 4 x 104 N: s lng bch cu m c 4 ca bung m Neubauer [7]. 2.2.6.4. Phng php xc nh hot ng thc bo Nguyn tc: m s lng i thc bo bng knh hin vi gm 2 ch tiu: (1) m s lng i thc bo bng cch m ngu nhin 4 vng ca vng trn quan st tnh c t l ca i thc bo so vi bch cu. (2) m s lng v tnh t l phn trm i thc bo c s hin din ca vi khun so vi tng s i thc bo. Tin hnh: Hot ng thc bo c xc nh da vo phng php m t bi

35

Yeh v ctv (2008), c tin hnh nh sau: Dch bch cu (thu t thn trc pha long mt v 2 x 106 t bo/ml trong mi trng L-15) cho vo microplate 12 ging (500 l /1 ging) c t vo a v trng 60 pht 280C trong mt bung m. Ra ging 2 ln vi dung dch L-15 nhm loi b nhng t bo khng c nh trn ging. Sau thm tip 500 l ht hunh quang dng huyn ph cho vo nhng ging trong ti 2 gi 280C, loi b thuc nhum tha bng dung dch PBS. Tip tc cho vo 500 l dung dch formalin/ging trong ti 30 pht, sau nhum mu vi iod trong 10 pht, ra cc ging bng PBS lp li ln 2 v kh nhit phng. Tin hnh m s lng i thc bo bng knh hin vi (Olympus IX 50, Tokyo, Japan). Hot ng thc bo c nh ngha nh l s phn trm t bo thc bo c s lng 100 t bo m c v ch s thc bo l s lng trung bnh cc ht c thc bo trn mi t bo thc bo [98]. 500 l dch bch cu (2x106 tb/ml trong mi trng L-15) cho vo microplate 12 ging

Ra 2 ln L-15 v thm 500 l ht hunh quang 28oC / 60 pht Ra ging bng PBS v cho 500 l dung dch formalin trong ti 30 pht ti 28oC trong 2 gi Nhum mu vi iot 0.1% trong 10 pht Ra ging 2 ln bng PBS m s lng i thc bo bng knh hin vi hunh quang Tnh kt qu PA v PI S 2.4. Quy trnh xc nh hot ng thc bo

36

T bo thc bo

Hnh 2.5. Hot ng thc bo ca t bo bch cu ca c: Nghim thc i chng (A), nghim thc b sung vi khun (B) 2.2.6.5. Phng php xc nh sn sinh oxy hot ha ( O 2 ) Hot ng sn sinh oxy hot ha O 2 c to ra t t bo bch cu thn trc ca c c phn tch theo phng php ca Cook v ctv (2001), c tin hnh nh sau: Ly 100 l dung dch poly-L-lysine c ha tan (0,2%) cho vo 96 ging yn t 30 - 60 pht cho t bo kt dnh. Sau cc ging c ra mt ln vi 100 l L-15 v cho vo 100 l bch cu bch cu t thn trc 2x 106 t bo/ml trong mi trng L-15 em nhit phng 30 pht. Cc ging c ly tm 400 rpm trong 25 pht 40C loi b cc t bo khng dnh v ra sch 2 ln vi L-15. Cc ging c cho vo 100 l Zymosan nhit phng 30 pht. Sau cc ging c ra 2 ln vi 100 l McHBSS, cho vo 100 l nitroblue tretrazolium (NBT) 30 pht nhit phng. Phn ng c ngng li bng cch thm vo 100 l methanol cn tuyt i v cc bch cu c ra 3 ln vi 100 l methanol (70%). Cc ging kh t nhin, sau thm vo 120 l KOH v 140 l dimethylsulfoxide (DMSO) trong 2 pht. Hot ng sn sinh oxy hot ha (O-2) c biu th bng lng gim c cht NBT c o bc sng 630 nm [32].

37

96 ging vi 100 l poly-L- lysine 30 pht, ra 1 ln L-15

100 l dung dch bch cu cho vo ging (2x106 tb/ml) nhit phng 30 pht, ly tm 400rpm 25 pht B dch ni, ra 2 ln L-15 v 100 l Zymozan (0,1%)

B dch ni, ra 3 ln vi McHBSS v 100 l NBT (0,3%) 30 pht 370C

100 l methanol (100%) v ra 3 ln 100 l methanol (70%)

120 l KOH v 140 l DMSO

Sau 2 pht c Elisa 630 nm S 2.5. Quy trnh xc nh hot ng sn sinh oxy hot ha ( O 2 ) 2.2.6.6. Phng php xc nh hot tnh lysozyme Nguyn tc: Da trn ly gii vi khun gram dng Micrococcus luteus (sigma) nhy cm vi lysozyme do vi khun tit ra trong qu trnh sinh trng v pht trin. Tin hnh: Hot tnh lysozyme trong huyt thanh c o theo phng php ca Ellis v ctv (1990), c tin hnh nh sau: dng ng chun lysozyme c cc nng nh sau: 16 g/ml pha long bc 2 c cc nng 8, 4, 2, 0 g/ ml t dch lng trng trng g trong dung dch m PB. Ht 10 l dch t cc nng pha long cho vo micoarray 96 ging, tip theo cho 200 l/ging vi khun Micrococcus luteus dch huyn ph l 0,2 mg /ml trong dung dch m PB. i vi mu huyt thanh c ht 10 l cho vo micoplate 96 ging thm 200 l/ging vi khun Micrococcus luteus (0,2 mg /ml) hn hp c nhit 27oC. Sau o nhanh c cc ging bc sng 530 nm trong 1 pht v 6 pht. Mt n v

38

hot tnh ca lysozyme c nh ngha l s lng enzym sn xut gim trong s hp th ca huyt thanh/pht/ml c xc nh thng qua ng chun lysozyme [36]. 2.2.7. Phng php x l s liu S liu c x l thng k bng phn mm SPSS 13.0. Multiple comparation (Tukeys) c s dng kim tra s khc bit c ngha gia cc nghim thc. Mc khc bit c ngha thng k c ngh l p<0,05. S liu phn trm c chun ha bng hm Arcsin. th c v bng phn mm Microsoft Exel phin bn 2007.

39