Nghiên cứu phát triển KIT chẩn đoán virus viêm gan B

- NGUYỄN NGỌC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM GAN B CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS.
- TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2017 NGUYỄN THỊ HƯƠNG QUẢN TRỊ KINH DOANH 2012A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn của tôi.
- Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào.
- Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.
- Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Ngọc Phương Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.
- Trương Quốc Phong – Trưởng phòng thí nghiệm Proteomic ( Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) đã tận tình định hướng, hướng dẫn và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
- Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên công tác tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã góp những ý kiến quý báu cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp.
- Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu.
- Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Ngọc Phương Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AuNPs : Gold nanoparticle BSA : Bovine Albumine Serum cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxyribonucleic Acid ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Ig : Immunoglobulin HBV : Hepatitis B virus HBcAg : Hepatitis B core antigen HBeAg : Hepatitis B viral protein HBsAg : Hepatitis B surface antigen mRNA : Messenger RNA NSP : Non-Structural Protein PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid RIA : Radio Immuno Assay WHO : World Health Organization Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc tính kháng nguyên HBV Bảng 1.2: Tình hình nhiễm HBV ở các Châu lục Bảng 1.3: Tỷ lệ người mang HBsAg trong cộng đồng người Việt Nam Bảng 1.4: Tỷ lệ viêm gan B trong số bệnh nhân viêm gan B cấp ở một số bệnh viện trong nước Bảng 1.5: Đặc tính của các vật liệu chế tạo miếng cộng hợp Bảng 3.1: Bảng công thức đệm tạo cộng hợp Bảng 3.2: Đặc tính các loại vật liệu được sử dụng làm miếng cộng hợp………………..53 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Virus viêm gan B dưới kính hiển vi điện tử Hình 1.2: Cấu trúc virus viêm gan B Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen virus viêm gan B Hình 1.4: Nguyên lý xác định kháng nguyên HBsAg Hình 1.5: Nguyên lý xác định kháng thể HBsAb Hình 1.6: Nguyên lý phương pháp ELISA sandwich Hình 1.7: Nguyên lý phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang Hình 1.8: Nguyên tắc kỹ thuật PCR Hình 1.9: Nguyên tắc khuyếch đại tín hiệu bởi bDNA Hình 1.10: Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus viêm gan B theo nguyên lý sắc ký miễn dịch Hình 3.1: Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu……………...46 Hình 3.2: Xác định giá trị pH thích hợp cho phản ứng tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng Hình 3.3: Xác định lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng Hình 3.4: Xác định thời gian thích hợp tạo cộng hợp Hình 3.5: Xác định nhiệt độ thích hợp tạo cộng hợp Hình 3.6: Ảnh hưởng của đệm tạo cộng hợp đến tín hiệu que thử Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp………..54 Hình 3.8: Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp Hình 3.9: Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp Hình 3.10: Xác định hàm lượng kháng thể thích hợp cố định lên màng nitrocellulose...57 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Hình 3.11: Kết quả thử nghiệm các loại đệm khác nhau cố định kháng thể lên màng…58 Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian sấy đến tín hiệu que thử Hình 3.13: Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose Hình 3.14: Ảnh hưởng của miếng thấm mẫu đến tín hiệu que thử Hình 3.15: Kết quả thử nghiệm các dung dịch ly giải mẫu khác nhau Hình 3.16: Kết quả kiểm tra ngưỡng phát hiện của que thử Hình 3.17: Thử nghiệm que thử với 5 tác nhân lây bệnh qua đường máu………………64 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A MỤC LỤC MỞ ĐẦU.
- 3 1.1 Đặc điểm virus viêm gan B.
- 3 1.1.1 Lịch sử virus viêm gan B.
- 3 1.1.2 Cấu trúc virus viêm gan B.
- 4 1.1.2.3 Cấu trúc bộ gen HBV.
- 7 1.1.2.4 Các protein cấu trúc của virus viêm gan B.
- Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt ( Anti- HBs.
- Kháng thể kháng kháng nguyên lõi ( anti- HBc.
- Kháng thể kháng kháng nguyên e ( anti-HBe HBV- DNA Đặc điểm lý hóa Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus HBV Mối liên quan giữa cấu trúc và sự xâm nhiễm của HBV vào tế bào gan Cơ chế xâm nhiễm và tái bản của HBV Tấn công Thâm nhập Quá trình phiên mã các gen của HBV.
- Quá trình dịch mã Tổng hợp genome virus Lắp ráp tạo hạt virus hoàn chỉnh Giải phóng Các con đường lây truyền của viêm gan B Tình hình nhiễm virus viêm gan B trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới Tại Việt Nam Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 1.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán viêm gan B.
- 22 1.2.1 Phương pháp miễn dịch Phương pháp dựa trên nguyên lý sắc kí miễn dịch (que thử Phương pháp ELISA sandwich Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang ( ECLIA Phương pháp miễn dịch phóng xạ(Radio Immuno Assay-RIA Phương pháp miễn dịch huỳnh quang Phương pháp sinh học phân tử Kỹ thuật PCR Phương pháp lai thấm điểm Khuyếch đại tín hiệu bởi bDNA Phương pháp lai chéo dưới tác dụng của tia UV Phương pháp giải trình tự gene Nguyên lý của que thử.
- 31 1.3.1 Nguyên lý Đặc tính các thành phần của que thử Hạt nano vàng (AuNPs Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng.
- Miếng thấm mẫu (Sample pad Miếng cộng hợp.
- 39 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- 39 2.1.1 Hóa chất và kháng thể Các vật liệu chế tạo que thử.
- Phƣơng pháp nghiên cứu.
- 40 2.2.1 Phương pháp gắn kháng thể kháng virus HBV lên bề mặt hạt nano vàng.
- Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 2.2.1.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng.
- Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng.
- Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể đa dòng dê phun lên màng.
- Phương pháp cố định kháng thể lên màng.
- Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của que thử.
- 46 3.1 Thiết lập điều kiện tạo que thử.
- 46 3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng.
- Xác định giá trị pH thích hợp tạo cộng hợp .
- Tối ưu nồng độ kháng thể chuột tạo cộng hợp với hạt nano vàng Thời gian tạo cộng hợp Nhiệt độ tạo cộng hợp Tối ưu đệm cộng hợp Nghiên cứu điều kiện tối ƣu tạo miếng cộng hợp chứa phức kháng thể và hạt nano vàng (conjugate pad.
- 53 3.3.1 Lựa chọn vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai.
- 57 3.4.1 Xác định hàm lượng kháng thể dê thích hợp cố định lên màng nitrocellulose Lựa chọn đệm hòa tan kháng thể cố định trên màng.
- Tối ưu thời gian sấy màng nitrocellulose Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose Tối ƣu vật liệu làm miếng thấm mẫu.
- 62 3.7 Đánh giá que thử.
- Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 3.7.3 Độ nhạy và độ đặc hiệu CHƢƠNG IV.
- 69 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 1 MỞ ĐẦU Theo WHO có 5 loại virus viêm gan đó là Virus A,B,C,D,E, trong đó có virus B và virus C là nguy hiểm nhất.Trên thế giới có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B và trong đó khoảng 400 triệu người nhiễm mãn tính.
- HBV gây ra những hậu quả nặng nề về thể xác, tinh thần, ảnh hưởng không nhỏ tâm lý, sinh hoạt của người dân trong cộng đồng .Hằng năm trên thế giới có khoảng 10- 30 triệu người nhiễm mới và 2 triệu người nhiễm virus viêm gan B mạn tử vong do hai biến chứng là xơ gan và ung thư gan nguyên phát[1].
- Hiện nay, nhiễm virus viêm gan B đã chở thành một vấn đề sưc khỏe mang tính chất toàn cầu và là một trong những nguyên nhân gây bệnh và tử vong phổ biến trên thế giới.Tỉ lệ nhiễm HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý dân cư, tập quán sinh hoạt, ý thức của người dân, điều kiện kinh tế.
- Việt Nam có tần suất nhiễm virus viêm gan B rất cao và là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao nhất trên thế giới với khoảng 10 -20 % dân số.
- Viêm gan virus B chủ yếu lây truyền theo đường máu, nhưng người được truyền máu hoặc sản phẩm máu sẽ bị nhiễm virus viêm gan B nếu máu và sản phẩm máu có vi-rus viêm gan B.
- Một đường lây truyền quan trọng nữa, là đường lây truyền từ mẹ sang, ở nước ta số phụ nữ mang thai bị nhiễm virus viêm gan B có tỷ lệ từ 10-12%, như vậy hàng năm số trẻ sinh ra khoảng 1,6 triệu cháu do các bà mẹ có nhiễm virus viêm gan, số trẻ em này được phân làm 2 nhóm, nhóm 1 là những bà mẹ chưa có viêm gan(60.
- 10 % số trẻ này có thể bị viêm gan virus(khoảng 6.600 trẻ).
- nhóm 2 số trẻ sinh ra từ các bà mẹ bị viêm gan (40.
- 90% số trẻ này có thể bị viêm gan.
- Số bệnh Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 2 nhân bị viêm gan virus trên 8 triệu người so với số bệnh nhân nhiễm HIV-AIDS 210.000 người (năm 2012) con số tử vong liên quan đến virus viêm gan do xơ gan, ung thư gan, viêm gan virus cấp và mạn tính phối hợp với bệnh lao phổi, đái đường, tăng huyết áp, suy thận… đã gây ra cái chết cho hơn 10 vạn người mỗi năm[3].
- Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phát hiện sự có mặt virus HBV trong mẫu máu bệnh nhân đã được WHO khuyến cáo.
- Do việc xét nghiệm đòi hỏi phải được thực hiện nhanh, đơn giản với số lượng mẫu lớn nên thực tế hiện nay các cơ sở xét nghiệm đều dùng dạng que thử nhanh.
- Việc nhập khẩu dẫn đến một số vấn đề: không chủ động nguồn sinh phẩm, giá thành cao… Do đó, việc tạo được que thử nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành phải chăng, phù hợp với thu nhập của người dân là việc làm cần thiết và thực sự có ý nghĩa thực tiễn.Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài.
- Nghiên cứu phát triển kit chẩn đoán virus viêm gan B ” với mục tiêu: Xác lập một số điều kiện thích hợp tạo que thử phát hiện nhanh virus viêm gan B từ mẫu máu( huyết tương hoặc huyết thanh) Nội dung nghiên cứu đề tài.
- Thiết kế que thử phát hiện kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B  Nghiên cứu các điều kiện tối ưu chế tạo một số thành phần que thử: cộng hợp Ab – AuNPs.
- miếng cộng hợp chứa Ab – AuNPs.
- màng cố định kháng thể.
- Tạo và nghiên cứu một số đặc tính que thử.
- Khảo sát ứng dụng thử nghiệm que thử.
- Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử virus viêm gan B Vào những năm 1800, Lurman lần đầu tiên phát hiện một đại dịch gây ra bởi virus viêm gan B.
- Sau vài tuần đến tám tháng sau đó, 191 công nhân chủng ngừa bị bênh vàng da và được chẩn đoán là viêm gan huyết thanh.
- Với nhận xét này, người ta tin rằng bệnh viêm gan có thể lây qua đường máu.
- Trong huyết tương của một số bệnh nhân viêm gan lây qua đường máu, người ta phát hiện được một kháng nguyên đặc biệt (Antigen, viết tắt là Ag), mà sau này gọi là HBsAg.
- Rồi vào những năm 1970, virus viêm gan B được nhận diện dưới kính hiển vi điện tử bởi nhà khoa học Dane.
- Phân tử này với kích thước là 42nm, có một vỏ bên ngoài chứa kháng nguyên HBsAg và một nhân bên trong gồm DNA cả virus viêm gan B và core protein.
- Và khám phá này đã đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng trong việc định bệnh viêm gan.
- Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 4 Hình 1.1: Virus viêm gan B dƣới kính hiển vi điện tử (http://www.ungthu.org/cacbenhungthu/ut_gan/hep_b.asp) 1.1.2 Cấu trúc virus viêm gan B 1.1.2.1 Danh pháp và phân loại học - Nhóm: Nhóm VII ( dsDNA-RT.
- Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 5 Hình 1.2: Cấu trúc virus viêm gan B (http://study.com/academy/lesson/hepatitis-b-virus-structure-and-function.html) Gồm 3 phần

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt