- PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH CÓ TÍNH KHÁNG KHUẨN TRONG CÂY CỎ HÔI (Ageratum conyzoides L.). - Từ khóa: Ageratum conyzoides, Bacillus amyloliquefaciens, kháng khuẩn, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans, vi khuẩn nội sinh.. - Cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) được biết đến như một loại dược liệu quý có tính kháng khuẩn mạnh, nhưng các nghiên cứu trước đây chỉ sử dụng dịch trích mà chưa quan tâm nhiều đến tập đoàn vi khuẩn nội sinh trong cây. - Việc tìm nguồn kháng sinh tự nhiên mới thay thế kháng sinh tổng hợp trở nên cấp bách hơn bao giờ hết, khi nhiều loại kháng sinh tổng hợp tạo ra vi khuẩn kháng sinh. - Chính vì vậy, việc phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh có tính kháng khuẩn trong cây cỏ hôi được thực hiện. - Từ năm mẫu cỏ hôi thu tại tỉnh Sóc Trăng đã phân lập được 45 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc.. - Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que, Gram âm và có khả năng di động. - Khảo sát khả năng kháng với 3 loài vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán qua giấy lọc. - Điều đáng ngạc nhiên là, có đến 20 dòng kháng được cả ba loài vi khuẩn gây bệnh và 12 dòng kháng được hai trong số ba loài gây bệnh được khảo sát. - Qua nghiên cứu cũng xác định mật số kháng khuẩn hiệu quả của một số loài triển vọng. - Gần đây, Tây y cũng phát hiện ra nhiều tác dụng quý của nó như khả năng kháng khuẩn, tiêu diệt ký sinh trùng, chống ung thư.. - Nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cho cây. - Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng và đồng hóa tốt. - Ngoài ra, chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên. - Bên cạnh đó, vi khuẩn nội sinh cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở nhóm cây dược liệu, chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008). - Chính vì vậy, trong nghiên cứu này việc phân lập, tuyển chọn và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) ở tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn cao được thực hiện.. - Vi khuẩn E. - Vi khuẩn A. - Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh là môi trường PDA.. - Phân lập vi khuẩn nội sinh: Mẫu được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ phần đất bám vào rồi tách rời từng bộ phận rễ, thân và lá. - Vi khuẩn được phân lập sau này sẽ là vi khuẩn nội sinh. - Nếu quan sát thấy xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (vòng pellicle) bên dưới, cách bề mặt môi trường PDA bán đặc trong ống nghiệm khoảng 2-5 mm, đó là dấu hiệu chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh Hút lấy 50 µL phần dịch từ vòng pellicle, trải lên đĩa Petri có chứa môi trường PDA đặc để phân lập cho đến khi ròng. - Kiểm tra độ ròng (độ thuần) của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. - Khi vi khuẩn đã ròng, tiến hành nhuộm Gram và cấy chuyển từng dòng vi khuẩn sang ống nghiệm chứa môi trường PDA đặc tương ứng để trữ ở 4 o C.. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn phân lập được: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng PDA lỏng có bổ sung yeast (đạt mật số 10 9 CFU/mL), dùng giấy thấm có đường kính 6 mm đã được khử trùng nhúng vào phần dịch vi khuẩn. - Sau đó, đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường dinh dưỡng PDA đặc đã trải vi khuẩn gây bệnh từng dòng riêng biệt (E. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn ở các mật số khác nhau của một số dòng triển. - vọng: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng PDA lỏng có bổ sung yeast (đạt mật số 10 9 CFU/mL), xác định mật số bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt dựa trên sự tạo thành khuẩn lạc trong 1ml canh khuẩn, mẫu phải được pha loãng theo thang bậc 10 (pha loãng ra dãy mật số CFU/mL). - Dùng giấy thấm có đường kính 6 mm đã được khử trùng nhúng vào phần dịch vi khuẩn. - Nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng bằng kỹ thuật Sinh học phân tử: Tiến hành chiết tách DNA, sau đó tiến hành phản ứng PCR vùng gene 16S-rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R (Lane, 1991) với trình tự như sau: 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’);. - Sử dụng công cụ BLAST N để so sánh trình tự DNA của các dòng vi khuẩn triển vọng với trình tự DNA của bộ gene các loài vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu NCB (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để nhận diện vi khuẩn đến cấp loài, có kết hợp với các đặc điểm về mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa đã được xác định.. - Kết quả phân lập vi khuẩn Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập trên môi trường PDA đặc.. - Các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả trong rễ, thân và lá của cây cỏ hôi. - Trong 45 dòng vi khuẩn đã được phân lập, trong đó 10 dòng từ rễ, 18 dòng từ thân và 17 dòng từ lá. - Các dòng được ký hiệu là HRx, HTx, HLx với HR, HT, HL lần lượt là các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ, thân, lá và x là số thứ tự từng dòng vi khuẩn. - Khi được cấy trong môi trường PDA bán đặc, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (vòng sáng màu trắng đục) cách bề mặt môi trường từ 2-5 mm. - Các dòng vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian quan sát được khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 24 giờ. - phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, một số ít khuẩn lạc có dạng không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài, độ nổi phẳng, màu trắng trong, nâu đỏ và vàng. - Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có kích thước dao động từ 0,5 - 8 mm sau khi cấy trên môi trường PDA đặc và ủ ở 30 o C khoảng từ 12 – 24 giờ.. - Một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn hội sinh phân lập được. - Đặc điểm tế bào vi khuẩn. - Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập đều có dạng hình que và có khả năng chuyển động, Một số dòng có dạng hình cầu. - Chiều dài vi khuẩn dao động trong khoảng µm, chiều rộng khoảng 0,50-1,61 µm.. - Kết quả nhuộm gram có 34/45 dòng vi khuẩn Gram âm chiếm dòng vi khuẩn Gram dương, chiếm 24,44%.. - Khả năng kháng khuẩn. - Từ 45 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được, qua kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn cho thấy có 31/45 dòng vi khuẩn kháng vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật, dòng HT18 có đường kính vòng vô khuẩn kháng E. - Có 30/45 dòng vi khuẩn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh viêm da, trong đó dòng HR10 có đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 9,00 mm và 29/45 dòng vi khuẩn kháng được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ ở cá, dòng HL2 và dòng HL1 có đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất đạt lần lượt là 22,67 mm và 16,67 mm (Bảng 1, 2 và 3).. - So sánh khả năng kháng A. - hydrophila của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng. - STT Dòng vi khuẩn. - So sánh khả năng kháng E. - coli của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng. - So sánh khả năng kháng S. - aureus của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng STT Dòng. - vi khuẩn. - hydrophila cao nhất đạt 22,00 mm, tuy nhiên ở dòng này khả năng duy trì vòng kháng rất yếu giảm mạnh theo thời gian. - Nghiên cứu của Lê Minh Học và Nguyễn Hữu Hiệp (2017) phát hiện vòng vô khuẩn cao nhất của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cỏ hôi ở tỉnh Bạc Liêu đối với vi khuẩn A. - (2015) vi khuẩn nội sinh trong cỏ hôi được chứng minh là có khả năng kháng E.coli với vòng vô khuẩn cao nhất là 11,92 mm.. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn ở các mật số khác nhau của một số dòng triển vọng. - aureus (mật số 10 7 CFU/mL) đường kính vòng kháng khuẩn biến thiên phụ thuộc vào mật số của vi khuẩn nội sinh. - Mật số càng cao thì đường kính vòng vô khuẩn càng lớn và đường kính vòng vô khuẩn giảm dần khi mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ mật số CFU/mL. - Điều này làm cho đường kính vòng kháng khuẩn có sự chênh lệch gần như tỷ lệ thuận với mật số vi khuẩn.. - Khi khảo sát khả năng kháng ở các mật số khác nhau với A. - So sánh khả năng kháng khuẩn ở các mật số khác nhau với A. - hydrophila ở các mật số khác nhau. - Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 10 9 đến 10 5. - So sánh khả năng kháng khuẩn ở các mật số khác nhau với Escherichia coli STT Dòng vi khuẩn. - coli ở các mật số khác nhau Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 10 9 đến 10 5 Khi khảo sát khả năng kháng ở các mật số khác nhau với E. - So sánh khả năng kháng khuẩn ở các mật số khác nhau với S. - số khác nhau (Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 10 9 đến 10 5. - Khi khảo sát khả năng kháng ở các mật số khác nhau với S. - Qua nghiên cứu này, cho thấy vi khuẩn S. - aureus khá mạnh nên muốn kháng tốt phải sử dụng vi khuẩn nội sinh ở mật số cao khoảng 10 9 CFU/ml.. - Định danh các dòng vi khuẩn có tính kháng khuẩn triển vọng. - Từ kết quả nghiên cứu trên, 3 dòng vi khuẩn kháng khuẩn triển vọng được chọn để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi là 27F và 1495R. - Ba dòng HR10, HT18 và HL1 được giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen mã hóa 16S-rRNA và so sánh trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI kết hợp một số test sinh hóa như nhuộm Gram, khả năng kháng khuẩn,… quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc nên cho kết quả định danh như sau: Dòng HR10 có tổng cộng 1451 nucleotides của vùng gene 16S rDNA được giải trình tự 1451bp có độ đồng hình 95,19% với trình tự DNA của là Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535, dòng HT18 có tổng cộng 1442 nucleotides của vùng gene. - Chúng có khả năng sinh chất kháng sinh kháng lại các loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm gây bệnh trên người như S. - kháng khuẩn. - Hoạt chất Pyocianin tiết ra từ Pseudomonas aeruginosa được biết đến như chất ức chế nhiều loài vi khuẩn. - pseudomonic acid, 1-hydroxyphenazine, PCA và PCN được tiết ra từ Pseudomonas aeruginosa cũng có khả năng kháng Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium botiulinum, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis và cả kháng nấm.. - Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cỏ hôi ở tỉnh Sóc Trăng trên môi trường dinh dưỡng PDA đặc (pH=6,5). - Các dòng vi khuẩn có tính kháng khuẩn triển vọng này cần được tiếp tục khảo sát thêm khả năng kháng khuẩn đối với một số loài vi khuẩn và nấm gây bệnh khác.. - Phân lập, tuyển chọn và định danh được một số dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) có khả năng kháng khuẩn tại tỉnh Bạc Liêu.. - Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt