- TẠI SAO PHẢI XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA:III. - CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA:IV.1 Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan MaxamvàWalter Gilbert):IV.2 Phương pháp dideoxy của F.Sanger (1977):a.Giới thiệu về phương pháp dideoxy của F.Sanger (1977): b. - Phương pháp:c.1).Tạo ra “defective” nucleotide:c.2). - Xác định trình tự DNA template:IV.3 Giải mã trình tự bằng hệ thống tự động:V. - ỨNG DUNG CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNAVI. - Trongsinh học, xác định trình tự DNA là công việc, đòi hỏi các phương phápthực nghiệm, đểxác định trình tựcủaDNA.. - Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nói riêng thìviệc giải trình tự nucleotide của một đoạn gen hay của cả bộ gen của một loài sinhvật là một kỹ thuật hết sức quan trọng.- Trongdi truyền họcvàhoá sinh, xác định trình tự có nghĩa là xác địnhcấu trúc chính(hay trình tự chính) của một biopolymer chưa được phân loại. - Xác định trình. - tự cho kết quả là mô tả tuyến tính một cách hình ảnh hay còn gọi là "chuỗi", tómtắt súc tích cấu trúc ở mức nguyên tử của phân tử vừa được xác định trình tự.- Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA là quá trình xác định trậttựnucleotidecủa một đoạnDNA. - Hiện nay, hầu hết mọi xác định trình tự DNA. - đều được thực thi dùng phương pháp phân tách trình tự(chain terminationmethod. - TẠI SAO PHẢI XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA. - Trình tự của DNA mã hóa các thông tin cần thiết để cho các cơ thể sống có thểtồn tại và tái sản sinh. - Việc xác định trình tự vì thế rất hữu ích với các nghiên cứu'thuần túy' để lí giải tại sao và bằng cách nào mà các cơ thể tồn tại, cũng như cácchủ đề mang tính ứng dụng.- Vì bản chất quan trọng của DNA đối với các sinh vật sống, hiểu biết về trình tựDNA có thể trở nên hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng. - LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN .1870 Mischer : Phát minh DNA..1940 Avery: DNA là “ chất liệu di truyền ”.1953 Watson & Crick: Cấu trúc xoắn kép của DNA.1965 Holley: Trình tự của tRNA mấm men.1977 Wu: Trình tự của đầu dính DNA trực khuẩn λ .1977 Sanger: Phương pháp xác định tình tự dideoxy.1977 Maxam & Gilbert: Xác định trình tự DNA bằng phương pháp hóa học.1980 Messing: Trọng dòng trong trực khuẩn M13.1986 Hood et al : Tự động hóa một phần.1986 Hood et al : Tự động hoá một phần.1990 Phân tích trình tự bằng chu trình nhiệt (PCR). - các enzyme được hoàn thiệnđể đọc trình tự. - CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA:IV.1 Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan MaxamvàWalter Gilbert. - Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học.- Các đoạn nucleotide giống nhau (ví dụ, dài 16 N) được đánh dấu đồng vị phóngxạ P 32 ở đầu 5. - Sau khi xử lý, mỗi hóm chứa một số đoạn nucleotide có chiều dài khác nhau.Bốn nhóm được đưa lên 4 bản gel acrylamide riêng ở phia cực âm, các đoạn ngắnhơn sẽ di chuyển xa hơn vè phía cực dương.- Dựa vào kết quả điện di có thể xếp các đoạn DNA theo thứ tự từ ngắn đến dài cóđiểm mốc chuẩn là đầu 5 ` mang dấu phóng xạ P 32 được phát hiện nhờ phương pháp phóng xạ đồ tự ghi (autoradiography) biểu hiện ở vệt đen trên giấy in ảnh.- Tổng hợp kết quả của 4 nhóm trên 4 bản điện di phản ánh đầy đủ trình tự của 16nucleotide của đoạn DNA kể từ đầu 5 ` .=>Hiện nay người ta không sử dụng rộng rãi phương pháp hoá học do độc tính củahoá chất. - IV.2 Phương pháp dideoxy của F.Sanger (1977): www.cbs.dtu.dk a.Giới thiệu về phương pháp dideoxy của F.Sanger (1977. - Đến thập niên 1970, Sanger đưa ra phương pháp để xác định chính xác trình tựchuỗi nucleotides trong một gene. - Phương pháp này dựa trên kết quả của Arthur Kornberg về quá trình tự nhân đôi của DNA (DNA replication. - =>Tóm lại:- phương pháp giải trình tự bằng hệ thống tự động cũng được dựa trên nguyên tắclàm gián đoạn chuỗi đang tổng hợp tại một điểm bất kỳ nào đó trên DNA khuôn bằng một loại nucleotide cải tiến thành dạng ddNTP.- Với kỹ thuật này thì primer hay các ddNTP được đánh dấu phóng xạ và các sản phẩm DNA được khuếch đại tương tự như trong kỹ thuật PCR. - ỨNG DUNG CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA.- Nghiên cứu sự đa dạng và tiến hoá của sinh vật.- Giải mã trình tự bộ gien người và vi sinh vật khác . - TÀI LIỆU THAM KHẢO.- Phạm thị anh thư : Laboratoire Ecophysiologie Moleùculaire, Universite Paris12.- phương pháp xác định trình tự DNA của PGS.TS
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt