Professional Documents
Culture Documents
Sàng Lọc Hợp Chất Có Tác Dụng Ức Chế Enzym Tyrosinase Bằng
Sàng Lọc Hợp Chất Có Tác Dụng Ức Chế Enzym Tyrosinase Bằng
Sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase bằng
phương pháp in silico - in vitro
Phạm Thế Hải1,*, Ninh Bảo Yến1, Đỗ Thị Nguyệt Quế1, Lê Thị Thu Hường2,
Nguyễn Thị Hương Giang2, Vũ Đức Lợi2, Bùi Thanh Tùng2
1
Đại học Dược Hà Nội, 13-15 Lê Thánh Tông, Hà Nội, Việt Nam
2
Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam
Nhận ngày 27 tháng 3 năm 2016
Chỉnh sửa ngày 20 tháng 4 năm 2016; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 6 năm 2017
Tóm tắt: Tyrosinase là một đích phân tử quan trọng tham gia vào quá trình hình thành các sắc tố
melanin. Ức chế enzym tyrosinase có thể làm hạn chế việc sản sinh quá nhiều các sắc tố melanin
từ đó giúp điều trị các rối loạn liên quan đến tăng sắc tố da. Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất có tác
dụng ức chế enzym này có ý nghĩa lớn trong khoa học y dược và mỹ phẩm. Trong nghiên cứu này
chúng tôi tích hợp phương pháp tính toán lý thuyết (in silico) và thực nghiệm in vitro nhằm tìm
kiếm hợp chất có tác dụng ức chế tyrosinase từ cơ sở dữ liệu hóa học Spectrum Collection. Cụ thể,
sau khi sàng lọc in silico tìm được19 hợp chất dự đoán có tác dụng ức chế tyrosinase. Dựa trên kết
quả này, 4 hợp chất hóa học bao gồm dibenzoylmethan, 2,2’,4’-trihydroxychalcon, 3,4-
dimethoxycinnamic acid và acetosyringon được lựa chọn nhằm sàng lọc và đánh giá tác dụng ức
chế tyrosinase in vitro. Kết quả thu được 3,4-dimethoxycinnamic acid có hoạt tính mạnh nhất và
ức chế tyrosinase theo cơ chế không cạnh tranh.
Từ khóa: Tyrosinase; in silico; in vitro; QSAR; Docking phân tử.
xác định cơ chế ức chế tyrosinase của một số thống này bao gồm nhiều phễu lọc cho phép
hợp chất tiềm năng nhất. sàng lọc được những cơ sở dữ liệu lớn (hàng
nghìn hợp chất) nhằm ưu tiên một tập hợp nhỏ
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu các hợp chất tiến hành các thí nghiệm in vitro.
Đầu tiên, tính toán các tham số phân tử đặc
2.1. Nguyên liệu trưng cho cấu trúc phân tử của mỗi hợp chất
Cơ sở dữ liệu Spectrum Collection bao gồm cho từng phễu lọc. Ở phễu lọc giống thuốc
2560 hợp chất có hoạt tính sinh học được nhóm druglinkess, các tham số phân tử là khối lượng
các nghiên cứu viên của MicroSource phân tử (MW), hệ số phân bố dầu/nước (LogP),
Discovery Systems Inc. thu thập và công bố số các nguyên tử cho các liên kết hydro
(http://www.msdiscovery.com/index.html). (nHBDon), nhận các liên kết hydro (nHBAc) và
Thành phần của cơ sở dữ liệu này bao gồm: Các số liên kết có thể quay được (nRotB) được tính
thuốc đang được sử dụng (khoảng 60%) phần toán. Sau đó, các hợp chất thỏa mãn các tính
lớn là các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hoặc chất này: MW≤ 500 g/mol, LogP≤ 5, nHBDon≤
bán tổng hợp (khoảng 5% có nguồn gốc tự 5, nHBAc≤ 10 và nRotB ≤ 10 sẽ được giữ lại
nhiên); hợp chất có nguồn gốc tự nhiên (khoảng cho các phễu lọc tiếp theo. Tiếp theo các hợp
25%) hay các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chất trải qua phễu lọc tìm kiếm sự tương đồng
được phân lập và xác định cấu trúc với các hợp chất ức chế mạnh tyrosianse. Các
(khoảng15%). hợp chất được lựa chọn có hoạt tính mạnh sử
2.2. Hóa chất và thuốc thử dụng trong tìm kiếm cấu trúc tương đồng được
trình bày ở bảng 1. Các hợp chất nằm trên cùng
Enzym tyrosinase (5771 U/mg), cơ chất L- của dãy (sau khi được sắp xếp) sẽ được giữ lại
tyrosin, hydroquinon (Sigma Aldrich). Hóa chất cho phễu lọc tiếp theo. Sau đó, các hợp chất
để pha dung dịch đệm kali phosphat: kali được dự đoán khả năng ức chế tyrosinase và
dihydro phosphat; dikali hydro phosphat, kali các hợp chất được dự đoán là có khả năng ức
hydroxyd (Sigma Aldrich). Chất thử chế tyrosinase sẽ được dự đoán khả năng ức chế
dibenzoylmethan; 2,2’,4’-trihydroxychalcon; (độ mạnh yếu) sử dụng các hệ thống phân loại
acid 3,4-dimethoxycinnamic; acetosyringon kết hợp các mô hình QSAR đã được công bố
(Sigma Aldrich). Dung môi dimethylsulfoxide trước đây [3]. Các hợp chất được xác định là có
(DMSO) (Sigma Aldrich). khả năng ức chế mạnh tyrosinase sẽ được giữ
2.3. Phương pháp nghiên cứu lại và tiến hành nghiên cứu Docking để đánh
giá mức độ tương tác và ái lực liên kết với
2.3.1. Sàng lọc các hợp chất ức chế
enzym. Quy trình tiến hành trên phần mềm
tyrosinase sử dụng mô hình in silico
Chúng tôi định hướng phát triển hệ thống ICM 3.8 (Molsoft LCC.) dựa trên nghiên cứu
sàng lọc ảo theo các bước giống hình 1. Hệ của Senol et al [4].
h
Hình 1. Mô phỏng hệ thống sàng lọc in silico lựa chọn hợp chất ức chế enzym tyrosinase.
14 P.T. Hải và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 12-18
Bảng 1. Danh sách các hợp chất có hoạt tính mạnh sử dụng trong tìm kiếm cấu trúc tương đồng
2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase enzym tyrosinase 100U/ml được thay bằng
in vitro của một số hợp chất đã sàng lọc được 100μl dung dịch đệm kali phosphat.
bằng mô hình in silico Phần trăm ức chế enzym tyrosinase được
* Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tính theo công thức sau:
tyrosinase in vitro (C D) 10
Tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro
0
0 Inhibition 100
A B
được đánh giá theo phương pháp của Mashuda
Trong đó (A: mật độ quang trung bình của
và cộng sự với một số thay đổi nhỏ [5]. Các
mẫu chứng; B: mật độ quang trung bình của
bươc tiến hành như sau:
mẫu trắng chứng; C: mật độ quang trung bình
Chuẩn bị mẫu thử: Các hợp chất được hòa
của mẫu thử; D: mật độ quang trung bình của
tan trong dung dịch DMSO để được dung dịch
mẫu trắng thử).
gốc có nồng độ là 10mM. Dung dịch gốc tiếp
* Phương pháp xác định cơ chế ức chế
tục được pha loãng bằng đệm kali phosphat
tyrosinase của hợp chất tiềm năng nhất
thành các dung dịch có nồng độ 50μM; 100μM
Ta tiến hành xác định sơ bộ cơ chế tác dụng
và 500μM để thực hiện các phản ứng ức chế
của hoạt chất tiềm năng nhất dựa trên việc xây
enzym.
dựng đồ thị Lineweaver - Burk với nồng độ cơ
Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase
chất thay đổi [5]. Thí nghiệm được tiến hành
in vitro trên đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar
như phần phương pháp đánh giá tác dụng ức
3596 (Corning, Mỹ), tiến hành đo độ hấp thụ ở
chế tyrosinase in vitro nhưng nồng độ cơ chất
490nm trên hệ thống máy đọc ELISA kèm theo
thay đổi từ 100μM - 500μM.
bộ ủ ấm (xMark, Bio-Rad). Chất chứng dương
Từ kết quả đo mật độ quang của mẫu thử và
ở đây sử dụng hydroquinon
mẫu chứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau ta
Hỗn hợp phản ứng gồm: 30μl dung dịch
vẽ đồ thị thể hiện mỗi quan hệ giữa nồng độ cơ
đệm kaliphosphat; 50μl dung dịch cơ chất L-
chất và tốc độ phản ứng (tốc độ phản ứng ở đây
tyrosin 2mM; 20μl dung dịch mẫu thử ở các
được thể hiện thông qua mật độ quang). Dựa
nồng độ khác nhau. Sau khi ủ đĩa 96 giếng bằng
vào điểm giao nhau của đồ thị đường thẳng thể
máy ủ elisa trong vòng 3-5 phút ở nhiệt độ 370C
hiện mỗi quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc
bổ sung 100μl dung dịch enzym tyrosinase
độ phản ứng khi có mặt và không có mặt chất
100U/ml (pha trong dung dịch đệm kali
ức chế để kết luận chất thử ức chế tyrosinase
phosphat 0,1M ngay trước khi sử dụng) và lắc
theo cơ chế nào. Lehninger và Michael xác định
30 giây trong máy elisa. Cuối cùng ủ đĩa 96
có bốn cơ chế ức chế tyrosinase là: cạnh tranh,
giếng trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 370C và
không cạnh tranh, cơ chế hỗn hợp và hỗn hơp
tiến hành đo quang ngay ở bước sóng 490nm.
không cạnh tranh (non-competitive inhibitor) [6].
Mẫu chứng có các thành phần tương tự như
* Xử lý kết quả
mẫu thử nhưng dung dịch mẫu thử được thay
Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm
bằng dung dịch đệm kali phosphat. Song song
Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm SPSS
với mẫu chứng và mẫu thử ta làm mẫu trẵng
20.0. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị
chứng và trắng thử nhưng 100μl dung dịch
trung bình ± độ lệch chuẩn
P.T. Hải và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 12-18 15
(Xtb ± SD). So sánh giá trị trung bình của các mẫu 1394 hợp chất có đặc điểm giống thuốc, qua
bằng one-way ANOVA với test hậu kiểm Dunnet phễu lọc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc
để so sánh giá trị trung bình giữa các mẫu. Sự tương đồng với các chất có hoạt tính ức chế
khác biệt có ý nghĩa thống kê nếu p< 0,05. tyrosinase đã biết thu được 109 hợp chất. Áp
dụng mô hình QSAR để sàng lọc 109 hợp chất
đã qua phễu lọc tìm kiếm đồng dạng thu được
3. Kết quả và bàn luận 25 hợp chất được dự đoán là có hoạt tính ức chế
tyrosinase mạnh. Tiến hành docking phân tử
3.1. Sàng lọc các hoạt chất có tác dụng ức chế trên 25 hợp chất này thu được 19 hợp chất có
tyrosinase bằng mô hình in silico khả năng gắn kết với trung tâm hoạt động của
tyrosinase. Danh sách 19 hợp chất này được liệt
Tiến hành sàng lọc cơ sở Spectrum kê ở bảng 1.
Collection qua qua phễu lọc thứ nhất thu được
Bảng 2. Kết quả sàng lọc in silico trên cơ sở dữ liệu Spectrum Collection
Hình 2. Tương tác giữa các hợp chất sàng lọc được với các acid amin trong trung tâm hoạt động của tyrosinase.
16 P.T. Hải và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 12-18
Nhìn chung cả bốn hợp chất đều được dự 50μM; 100μM và 500μM. Mỗi nồng độ được
đoán là có hoạt tính mạnh, có ái lực liên kết tốt tiến hành thử trên 3 giếng. Thí nghiệm được lặp
với đích phân tử. Phân tích kết quả docking lại 3 lần. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
(Hình 2) cho thấy cả bốn hợp chất đều có khả Theo đó, ở nồng độ 50μM chỉ có acid 3,4-
năng đi sâu vào khoang gắn kết và đều tạo được dimethoxycinnamic thể hiện tác dụng ức chế
phức chelat với 2 ion Cu2+ nằm ở sâu trong tyrosinase với % ức chế là 13,3% tuy nhiên tác
trung tâm hoạt động của enzym. Đây được xem dụng ức chế không mạnh (0,01 < p < 0,05).
là cơ chế quan trọng gây ức chế hoạt động của Những hợp chất còn lại đều không thể hiện tác
tyrosinase [7]. Bên cạnh đó, các hợp chất này dụng ức chế tyrosinase hoặc tác dụng ức chế rất
đều tương tác mạnh với enzym thông qua nhiều yếu. Ở nồng độ 100μM dibenzoylmethan và
liên kết hydro với các acid amin His61, His259, 2,2’,4’-trihydroxychalcon không thể hiện tác
His263 và His296 ở đáy khoang, đồng thời dụng ức chế tyrosinase (p > 0,05). Hợp chất
tương tác kỵ nước (π-π, π-alkyl) với các acid acetosyringon và acid 3,4- dimethoxycinnamic
amin Phe264, Val283, Met280 và Ala286 ở đều thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase với %
miệng khoang. Như vậy, xét ở mức độ phân tử, ức chế lần lượt là 15,36% và 32,33%. Ở nồng
các hợp chất có cấu dạng hoàn toàn phù hợp và độ 500μM thì hoạt chất dibenzoylmethan có
ổn định trong trung tâm hoạt động của hiện tượng kết tủa lại khi pha loãng với dung
tyrosinase và được dự đoán là ức chế enzym dịch đệm từ dung dịch gốc là DMSO (có thể do
này theo cơ chế cạnh tranh. dibenzoylmethan ở nồng độ cao không tan
trong đệm kali phosphat). Chính vì thế không
3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in
đánh giá được tác dụng ức chế của
vitro của một số hợp chất đã sàng lọc được
dibenzoylmethan ở nồng độ này. Các hợp chất
bằng mô hình in silico
2,2’,4’-trihydroxychalcon; acetosyringon; acid
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế 3,4-dimethoxycinnamic còn lại đều thể hiện tác
tyrosinase in vitro. dụng ức chế tyrosinase với % ức chế tương ứng
Mỗi hợp chất được tiến hành đánh giá tác là 29,72%; 59,82% và 96,74% (p < 0,01).
dụng ức chế tyrosinase ở 3 nồng độ khác nhau:
Bảng 3. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro của 4 hợp chất được chọn
3.2.2. Kết quả xác định sơ bộ cơ chế ức chế nồng độ 200μM với nồng độ cơ chất thay
tyrosinase của hợp chất tiềm năng nhất (100μM-500μM). Đo mật độ quang
Chúng tôi tiến hành xác định sơ bộ cơ chế ức L-DOPAquinon tạo thành ở các nồng độ cơ chất
chế tyrosinase của acid 3,4- dimethoxycinnamic ở thay đổi. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.
P.T. Hải và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 12-18 17
Bảng 4. Kết quả đo mật độ quang ở các nồng độ cơ chất khác nhau
tyrosinase mới chỉ từ cấu trúc phân tử. Tạp chí subelliptica. Bioscience biotechnology and
Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc. Số 1 biochemistry. 69 (2005) 197.
(2015) 6. [6] DN. Lehninger và MC. Michael, Principle of
[4] FS. Senol, et al., In Silico Approach to biochemistry 4ed, W.H Freeman and Company,
Inhibition of Tyrosinase by Ascorbic Acid New York (2005) 202.
Using Molecular Docking Simulations. Current [7] Y-D. Park, et al., Complex Inhibition of
Topics in Medicinal Chemistry. 14 (2014) Tyrosinase by Thiol-Composed Cu2+ Chelators:
1469-1472. A Clue for Designing Whitening Agents. Journal
[5] T. Masuda, et al. Screening for tyrosinase of Biomolecular Structure and Dynamics. 24
inhibitors among extracts of seashore plants and (2006) 131.
identification of potent inhibitors from Garcinia
Pham The Hai1, Ninh Bao Yen1, Do Thi Nguyet Que1, Le Thi Thu Huong2,
Nguyen Thi Huong Giang2, Vu Duc Loi2, Bui Thanh Tung2
1
Hanoi University of Pharmacy, 13-15 Le Thanh Tong, Hanoi, Vietnam
2
VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam