- PTN Chất lượng Thực phẩm PHẦN I: ĐẠI CƯƠNG VỀ VI SINH VẬT HỌC Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH 1. - Môi trường , pha chế và chuẩn bị môi trường 1.1. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy hay bảo quản giống vi sinh vật, người ta phải sử dụng các môi trường dinh dưỡng đặc (hoặc lỏng). - Môi trường dinh dưỡng không chỉ chứa các thành phần cần cho sự phát triển của ví sinh vật mà còn phải đảm bảo các điều kiện lý hóa thích hợp cho sự trao đổi chất của vi sinh vật với môi trường bên ngoài. - Vì vậy, để thiết lập môi trường cần phải biết rõ nhu cầu của vi sinh vật về các chất dinh dưỡng và các đặc điểm trao đổi chất của chúng. - Cần lưu ý là nồng độ các chất hòa tan trong môi trường phải cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào vi sinh vật thì mới đảm bảo được sự phát triển tối ưu của chúng Môi trường thường đặt tên theo người đã sáng tạo ra chúng (ví dụ môi trường Kzapek, môi trường Hansen) hay theo các thành phần dinh dưỡng đặc trưng của môi trường đó (ví dụ môi trường dịch trích giá đậu, khoai tây) 1.2. - Nguyên tắc pha chế môi trường: Nguyên tắc cơ bản nhất để pha chế môi trường là phải đảm bảo các nhu cầu cơ bản của vi sinh vật (nguồn C, N và các khoáng). - Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp: Nếu muốn nuôi cấy vi sinh vật để quan sát hình thái thì phải nuôi cấy trên môi trường đặc Nếu muốn tìm hiểu sự trao đổi chất của vi sinh vật thi dùng môi trường lỏng Môi trường chỉ chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh b. - Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt của vi sinh vật để bổ sung thành phần khác nhau nào đó: Cần nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi trường Cần nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung các hợp chất chứa N vào môi trường Hay bổ sung các kháng sinh vào môi trường nhằm nuôi cấy các vi sinh vật có khả năng kháng lại kháng sinh 1.3. - Phân loại môi trường i. - Dựa vào thành phần Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường là các hợp chất tự nhiên như: khoai tây, cám gạo, bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữa…thành phần môi trường thường phức tạp và không ổn định Môi trường tổng hợp: sử dụng các loại hóa chất hữu cơ hoặc vô cơ tinh khiết để pha chế môi trường với tỷ lệ chính xác Môi trường bán tổng hợp: sử dụng cả các hóa chất tinh khiết lẫn các thành phần tự nhiên. - Dựa vào tính chất vật lý Môi trường lỏng Môi trường rắn: thường có từ 1,5Z2% agar hoặc gelatine Môi trường bán lỏng: có khoảng 0,3Z0,7% agar iii. - Dựa vào công dụng: Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: môi trường có chứa một thành phần đặc biệt chỉ phù hợp với 1 hoặc 1 nhóm vi sinh vật nào đó. - Ví dụ môi trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân… Môi trường kiểm định: dùng để xác định một tính chất nào đó của vi sinh vật. - Người ta thương bổ sung một hợp chất đặc biệt có sự biến đổi có thể nhìn thấy được trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật như các chất chỉ thị màu. - Cách pha chế môi trường Pha chế môi trường là một khâu quan trọng do vậy cần phải chính xác. - Gồm các bước sau: Cân các thành phần môi trường Nếu là môi trường lỏng: pha các thành phần vào nước, chú ý thứ tự pha chế Nếu là môi trường đặc: hòa tan các thành phần vào nước rồi thêm 1,5Z2% agar và đun đến khi agar tan chảy. - Lọc: thường lọc môi trường qua vải hoặc bông Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật hoặc yêu cầu nghiên cứu, thường điều chỉnh pH phù hợp. - Thường dùng các loại hóa chất như: H2SO4, H3PO4, KOH, NaOH… Phân phối vào dụng cụ chứa: nếu là bình chứa thì cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, nếu là làm môi trường thạch dĩa thì cho vào khoảng 10Z15ml/dĩa, nếu làm thạch nghiêng thì cho vào 1/4Z1/5 chiều cao ống nghiệm. - Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu là nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC, 1atm) nhằm tiêu diệt tất cả các bào tử cũng như các vi sinh vật không mong muốn có sẵn trong môi trường . - Thực hiện pha chế môi trường Mỗi nhóm thực hành pha chế hai môi trường dùng để nuôi cấy vi sinh vật như sau: Z Môi trường 1 (môi trường dịch trích giá đậu. - Giá đậu: 200g + Glucose: 10g + Trypton: 5g + Yeast extract: 1g + Agar: 15g + H2O: đủ 1000 ml Z Môi trường 2 (Môi trường dịch trích khoai tây. - Các dụng cụ sử dụng trong vi sinh vật học 2.1. - Dụng cụ dùng cấy chuyền Các loại dụng cụ được sử dụng cấy chuyền đều nhằm mục mục đích chuyển vi sinh vật từ môi trường cũ sang một môi trường mới cho các nhu cầu khác nhau: cấy chuyền, nhân giống, phân lập vi sinh vật. - Tất cả các dụng cụ dùng cấy chuyền đều phải đảm bảo được vô trùng bằng nhiều cách khác nhau, nhằm tránh việc đưa vào môi trường những vi sinh vật không mong muốn. - Các dụng cụ kể trên đều chủ yếu dùng chuyển đổi vi sinh vật từ một môi trường lỏng sang môi trường khác. - Để chuyển vi sinh vật từ môi trường rắn sang môi trường khác, người ta chủ yếu sử dụng que cấy vòng/ thẳng hoặc que cấy móc. - Các phương pháp phân lập và cấy chuyền vi vi sinh vật: Phân lập vi sinh vật là việc phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau. - Để phân lập vi sinh vật, người ta thường tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường chọn lọc nhằm ưu tiên sự phát triển của một loại vi sinh vật nào đó. - Nếu như không có được môi trường đặc trưng thì thường người ta sẽ nuôi vi sinh trên các môi trường rắn và làm cách nào đó tách rời các tế bào vi sinh vật và cho chúng phát triển riêng rẽ trên môi trường rắn để tạo thành khuẩn lạc (colony) với hình dáng đặc trưng và việc chọn lựa sẽ được tiến hành trên các khuẩn lạc này. - Một số hình dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn: hàng 1 (nhìn từ trên xuống), hàng 2 (nhìn ngang), hàng 3 (dạng rìa khuẩn lạc) Các phương pháp cấy Cách cấy trong ống thạch nghiêng Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy vòng Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que trãi Các thao tác chính khi cấy ví sinh vật Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ chọn lựa Thực hành: Sử dụng môi trường đã pha chế ở phần trên, tiến hành làm các dạng môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng và tiến hành cấy một số giống vi sinh vật do phòng thí nghiệm cung cấp. - Bài 2:KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Một kính hiển vi tốt là một dụng cụ rất quan trọng trong phòng thí nghiệm vi sinh. - Chúng phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ bé như vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà chúng ta không thể nhìn thấy bằng mắt thường. - Nếu sử dụng thành thạo kính hiển vi, sinh viên có thể thu nhận được những thông tin chính xác và hữu ích về các tiêu bản hoặc mẫu nuôi cấy vi sinh vật. - Ghi nhận lại ảnh quan sát được bằng cách vẽ vào trong một hình tròn một số tế bào vi sinh vật mà sinh viên nhìn thấy. - Sử dụng các vi sinh vật sau trong thí nghiệm a. - Đưa phiến kính hình chữ nhật (depression slide) úp lên phiến kính hình vuông (coverslip), sao cho chỗ lõm của phiến kính hướng xuống dưới và giọt huyền phù vi sinh vật nằm lọt vào chỗ lõm. - Vi sinh vật di chuyển trong dịch lỏng bởi chuyển động Brown hay tự chuyển động nên rất khó khăn trong việc quan sát. - Chúng ta có thể thấy được hình dạng và hoạt động của vi sinh vật nhưng không thể xác định chính xác hình thái của chúng (đặc biệt là nhóm vi khuẩn). - Do vậy, để xác định chính xác hình thái của vi sinh vật người ta thường sử dụng phương pháp nhuộm màu (quan sát vi sinh vật chết) Vi khuẩn có thành tế bào vững chắc để duy trì hình dạng của mình. - Nếu tạo vết bôi từ môi trường rắn thì cho một giọt nước vào giữa phiến kính và dùng que cấy thẳng cho một lượng nhỏ sinh khối vào giọt nước. - Có thể sử dụng ba loại phẩm nhuộm khác nhau với cùng một loại vi sinh vật để có sự so sánh. - Tạo vết bôi vi sinh vật Hình dạng cơ bản và sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn. - (c) Micrococcus luteus (x 1000) Một số hình dạng thông thường của vi khuẩn Bài 6: NHUỘM GRAM Vào năm 1884, Christian Gram, một nhà nghiên cứu bệnh học người Đan Mạch, đã khám phá ra một phương pháp nhuộm vi sinh vật bằng phẩm nhuộm pararosaniline. - Nhuộm Gram là một trong số các công cụ hữu dụng nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh và được sử dụng rất thường xuyên. - Sử dụng các vi sinh vật sau để thí nghiệm Staphylococcus sp. - Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật iii. - Một số sai sót khác là: (a) que cấy quá nóng, (b) hơ nóng quá mức khi cố định vi sinh vật trên phiến kính. - Bào tử tạo thành do môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển, do thiếu chất dinh dưỡng, do độ ẩm thấp…. - Khi môi trường trở nên thích hợp thì bào tử lại hồi sinh và tế bào lại có thể tiếp tục phân chia. - Bào tử có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, hóa chất mà các tế bào sinh dưỡng không thể tồn tại được. - Rửa phiến kính bằng nước trong 30 giây Bào tử và sự hình thành nội bào tử ở vi khuẩn Qui trình nhuộm bào tử theo phương pháp SchaefferdFulton PHẦN 2: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM Bài 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1. - Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng trong một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng một đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit, CFU), trong 1 đơn vị khối lượng thực phẩm. - Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (TotalViable Count, TPC), tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC) Qui trình phân tích bao gồm các bước cân mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân, chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng phương pháp trãi hộp (spread plate) hay đổ hộp (pour plate). - Phương pháp đổ hộp được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh. - Môi trường Môi trường sử dụng là Plate Count Agar (PCA) có pH 7.0 ± 0.2. - Môi trường được pha chế, phân phối vào các bình thủy tinh và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. - Các bình hoặc ống nghiệm chứa môi trường chưa sử dụng phải được bảo quản trong tủ lạnh 2 – 8oC. - Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn đđịnh ở 45 Z 50oC. - Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường. - Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút). - Nấm men và nấm mốc là các vi sinh vật dị dưỡng, chúng tiêu thụ nguồn carbon hữu cơ được cung cấp từ môi trường bên ngoài tế bào. - Hầu hết nấm men và nấm mốc phát triển trong môi trường có hoạt độ nước từ 85% trở lên, một số ít loài có thể tăng trưởng trong môi trường có hoạt độ nước 60 – 70%. - Mật độ nấm mốc và nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng số nấm men và nấm mốc bằng các kỹ thuật pha loãng, trải đĩa và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar, hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). - Môi trường Dichloran Glycerol Agar được sử dụng cho các loại thực phẩm có hàm lượng nước thấp (thực phẩm khô, ngũ cốc, tiêu…, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường/muối cao). - Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao (sữa, các sản phẩm từ sữa, đồ hộp, các loại rau quả. - Đối với các mẫu có mật độ nấm mốc thấp, các môi trường thường được sử dụng là Malt Extract Agar (MEA), Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm chloramphenicol hay chlotetraciline. - Đổ môi trường vào trong đĩa petri (khoảng 15ml). - Chờ cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút. - Trải mẫu vi sinh vật sao cho mẫu dàn đều khắp bề mặt môi trường thạch. - Đọc kết quả từ ngày 5 – 7 Lưu ý: trong thời gian ủ, nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy, tạo thành khuẩn lạc mới. - Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để tránh sự phát tán của bào tử vào không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. - Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt. - Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay có loại môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. - Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. - Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. - Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi ủ ở 44oC trong môi trường lỏng EC. - Coliforms phân (faecal coliforms hay E.coli giả định)là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44.5oC trong môi trường lỏng Trypton. - Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. - Qui trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10Z1, 10Z2, 10Z3). - Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml, MPN/1 g mẫu. - Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp. - Ví dụ, môi trường BGBL ở 37oC có thể định lượng nhóm coliforms, cùng môi trường này ở 45oC cho phép định lượng coliforms phân hoặc môi trường Mannitol Salt Broth có thể dùng để định lượng Staphylococcus… 3. - Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10Z1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml môi trường LST và ống Durham úp ngược. - Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LST dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL và ủ ở 37oC trong 48 giờ. - Ghi nhận số ống dương tính ứng với mỗi độ pha loãng Lưu ý: cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham sau khi tiệt trùng môi trường. - Các ống có khả năng hiện diện của Coliforms là các ống dương tính ở cả môi trường LST lẫn BGBL. - kết quả trang bảng x f/10 f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n) Ví dụ Bảng tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP TẾ BÀO VI SINH VẬT 1. - Định lượng trực tiếp tế bào bằng buồng đếm Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc…với độ phóng đại x100 đến x400. - Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật sao cho trong mỗi ô lớn chỉ từ 10 – 50 tế bào). - PHẦN 3: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM Bài 1: LÊN MEN RƯỢU VANG QUẢ 1. - Bổ sung môi trường chứa huyền phù Saccharomyces oviformis đã qua nhân giống trong 30oC /48 giờ với thể tích phù hợp 8. - MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG Z M1 (môi trường giá đậu đường) Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước. - Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hoà tan (đối với môi trường Potato dextrose salt: chuẩn bị như môi trường M5 rồi thêm: 7.5% NaCl) Chất chiết khoai tây 20% (v/v) Dextrose 2% Agar 2% Nước đủ 1000ml % M6 (môi trường thạch malt) Lấy 250g malt, nghiền nhỏ, hoà vào 1000ml nước cất. - Cho môi trường thạch vào các dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 121oC / 15 phút. - Z M7 (môi trường BGBL 2% Broth – dạng pha sẵn) Peptic digest of animal tissue 1% Lactose 1% Oxygall 2% Brilliant green 0.0133g/L Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để pha thành 1000ml môi trường. - Z M8 (môi trường Plate Count Agar – ATCC medium ml Agar 150 g Yeast extract 2.5 g Trypton 5g Glucose 1.0g Z M9 (môi trường LST Z Lauryl Sufate Broth/Lauryl Trypton Broth): 1000ml Trypton 20 g Lactose 5g NaCl 5g K2HPO4 2.75 g KH2PO4 2.75 g Sodium lauryl sufate 0.1 g pH 6.8 ± 0.2 Nước Đủ 1000ml % M10 (Môi trường VRBLZ Crystal Violet neutral Red Bile Lactose agar): Pepton 7g Neutral Red 0,03g Yeast Extract 3g Crystal Violet 0,002g Lactose 10g Agar 15g NaCl 5g Nước đến 1000 ml Muối mật 1,5g Hòa tan các thành phần trên trong nước, để yên vài phút, đặt lên bếp đun sôi và khuấy đều, để sôi 2Z5 phút. - Chú ý: Không để sôi quá lâu Không được tiệt trùng môi trường Pha chế xong sử dụng ngay trong vòng 3 giờ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. - Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm – Trần Linh Thước – Nhà xuất bản Giáo dục, 2003 2. - Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm – Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương – Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 4