- PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ gRNA CHỈNH SỬA PROMTER OsSWEET13 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH BẠC LÁ. - Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Trong nghiên cứu này, promoter OsSWEET13 đã được phân lập từ DNA tổng số của giống lúa BT7. - Kết quả cho thấy trình tự DNA phân lập được dài 640 bp, giống lần lượt 99,38 và 92,3 so với OsSWEET13 của lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) và Indica Shuhui498 (CP018168.1), chứa trình tự bám cho protein độc TAL (transcription activator-like) PthXo2(A) của Xoo. - Dựa trên trình tự DNA phân lập được, hai cấu trúc gRNA đã được thiết kế với mục đích chỉnh sửa vị trí bám đặc hiệu của PthXo2(A) trên promoter OsSWEET13 và bất hoạt hoàn toàn gen OsSWEET13 bằng công nghệ CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9), hướng tới mục tiêu tạo giống lúa BT7 năng suất cao có khả năng kháng bệnh bạc lá trong tương lai.. - Từ khóa: Chỉnh sửa gen, bạc lá, CRISPR/CAS9, OsSWEET13, TAL effector, Xanthomonas oryzae.. - Chính vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá cho giống Bắc thơm 7 sẽ giúp ổn định sản xuất lúa gạo, đảm bảo an ninh lương thực quốc gia.. - Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đột biến xuất hiện tại vị trí EBE trên vùng promoter của các gen “nhiễm” này có thể giúp cây lúa chống lại sự xâm nhiễm của các chủng Xoo tương ứng . - Nghiên cứu của Zhou (2015) cũng đã cho thấy OsSWEET13 là một đối tượng tiềm năng cho mục đích nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá [27].. - CRISPR/CAS9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) là công cụ chỉnh sửa gen được sử dụng. - Vì vậy, công nghệ CRISPR/CAS9 có tiềm năng ứng dụng rất lớn cho các nghiên cứu cải tiến tính trạng cây trồng.. - Trong nghiên cứu này, đã tiến hành phân lập và phân tích một đoạn trình tự promoter/gen OsSWEET13 của lúa Bắc thơm 7 (gọi tắt là SW13- BT ) rất mẫn cảm với bệnh bạc lá nhằm thiết kế gRNA cho hệ thống chỉnh sửa promoter/gen SW13- BT . - Kết quả thu được là tiền đề cho nghiên cứu tạo giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) có khả năng kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/CAS9.. - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. - Các oligonucleotide dùng cho PCR nhân bản SW13-BT được thiết kế dựa trên trình tự đã được công bố trên GenBank (AP014968.1) và đặt mua từ Hãng Sigma (Mỹ).. - Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. - Phân lập promoter SW13-BT. - Promoter của gen SW13-BT được phân lập từ DNA tổng số của cây lúa bằng kỹ thuật PCR [23], sử. - Nhân dòng promoter SW13-BT. - Promoter SW13-BT nhân bản bằng PCR được nhân dòng bằng bộ kit pGEM-T Easy theo quy trình đi kèm của Hãng Promega. - Phân tích trình tự SW13-BT. - Trình tự DNA được xác định bằng thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI3100 theo phương pháp của Smith et al. - sử dụng hai mồi T7 và SP6 cho phản ứng PCR giải trình tự. - Kết quả giải trình tự được xử lí bằng phần mềm BioEdit 4.0. - Trình tự DNA sau khi xử lí được so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank và phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0.. - Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu cho SW13-BT. - Trình tự gRNA đặc hiệu cho chỉnh sửa SW13-BT được thiết kế bằng phần CRISPR-P v2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2. - Trình tự hệ gen lúa được tham chiếu từ cơ sở dữ liệu trên ngân. - Đoạn gRNA đặc hiệu được lựa chọn dựa trên vị trí trên SW13-BT , điểm đặc hiệu, hàm lượng GC, khả năng hình thành và duy trì cấu trúc bậc II, số lượng và vị trí đoạn DNA tương đồng xuất hiện trong hệ gen lúa, vị trí và số lượng nucleotide sai khác trên gRNA [16].. - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. - Trong nghiên cứu này, để phân tích đặc điểm trình tự của promoter SW13-BT phục vụ mục đích thiết kế gRNA chỉnh sửa EBE và/hoặc bất hoạt gen SW13-BT , đoạn DNA nằm từ vị trí [-632]. - Kết quả PCR đã thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 0,64 kb tương ứng với kích thước lí thuyết của đoạn trình tự SW13-BT cần phân lập (640 bp) (Hình 1, giếng 2). - Sản phẩm PCR được tinh sạch và nhân dòng để phục vụ giải trình tự nucleotide và cho các nghiên cứu chức năng của OsSWEET13 sau này.. - Phân lập SW13-BT từ hệ gen lúa BT7 bằng kĩ thuật PCR. - Trong nghiên cứu này, một đoạn trình tự promoter và một phần mã hoá trên OsSWEET13 của. - giống lúa BT7 đã được phân lập bằng PCR từ DNA tổng số để phân tích trình tự nucleotide nhằm dự đoán vai trò của OsSWEET13 đối với tính mẫn cảm với bệnh bạc lá của lúa BT7, đồng thời phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen OsSWEET13 sau này.. - Nhân dòng SW13-BT vào vector pGEM-T Sản phẩm PCR nhân bản trình tự SW13-BT từ DNA tổng số được tinh sạch và ghép nối vào vector nhân dòng pGEM-T. - Kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM/SW13-BT.. - giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/SW13- BT. - giếng 2: vector pGEM/SW13-BT nguyên bản. - Kết quả điện di trên gel agarose 1 trên hình 2 cho thấy sản phẩm PCR từ plasmid với cặp mồi Sw13- Fw/Sw13-Rv đặc hiệu cho đoạn promoter/gen SW13- BT cho một băng DNA có kích thước khoảng 0,64 kb (Hình 2A, giếng 1). - Các kết quả thu được này cho phép khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công trình tự SW13-BT vào vector pGEM-T.. - Nhiều nghiên cứu về promoter trước đây cũng thực hiện phân lập và nhân dòng đoạn DNA quan tâm vào vector nhân dòng trước khi đưa vào vector biểu hiện nhằm phục vụ việc nghiên cứu chức năng [8, 18]. - Trong nghiên cứu này, đoạn DNA nằm từ vị trí [-632] đến [+8] của OsSWEET13 đã được nhân bản từ DNA tổng số của giống lúa BT7 và dòng hóa vào vector pGEM-T. - Sản phẩm nhân dòng là nguồn nguyên liệu cho toàn bộ các thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm chức năng của OsSWEET13 sau này.. - Đoạn promoter/gen SW13-BT được xác định. - trình tự nucleotide trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động và phân tích bằng phần mềm BioEdit. - Kết quả phân tích cho thấy đoạn DNA phân lập được từ giống lúa BT7 có chiều dài 640 nucleotide, giống lần lượt 99,38 và 92,3 so với trình tự tương ứng của giống lúa Japonica Nipponbare (AP014968.1) và giống lúa Indica Shuhui498 (CP018168.1) đã được công bố trên GenBank (Hình 3). - Trình tự phân lập được bao gồm vùng promoter dài 441 bp và một đoạn dài 199 bp mang trình tự Exon I của OsSWEET13 . - Đoạn SW13-BT phân lập được chứa trình tự hộp TATA đặc trưng và đặc biệt có chứa trình tự DNA (yếu tố điều hòa cis ) tương đồng với trình tự EBE được nhận biết bởi protein TAL PthXo2 của nhiều chủng vi khuẩn Xoo châu Á [20, 26]. - Tuy nhiên có sự sai khác giữa trình tự EBE này của lúa BT7 so với hai giống lúa tham chiếu (24 Nu so với 25 Nu, thiếu một Adenine ở vị trí thứ 8) (Bảng 1).. - Phân tích trình tự SW13–BT7. - Vị trí PthXo2(A)-EBE và Exon I được đánh dấu bằng mũi tên. - Vị trí cắt trên PthXo2(A)-EBE và Exon I được đánh số từ 1-5.. - Nghiên cứu gần đây của Oliva (2019) đã chỉ ra rằng họ protein TAL PthXo2 bên cạnh thành viên được phát hiện đầu tiên, còn có nhiều biến thể khác như PthXo2(A), PthXo2B và PthXo2C. - Kết quả phân tích trình tự cho thấy trên SW13-BT có chứa EBE liên kết với biến thể PthXo2(A) (gọi tắt là PthXo2(A)-EBE ) (Bảng 1).. - Trình tự EBE trên promoter của Bắc thơm 7 và một số giống lúa. - Giống lúa Vùng trình tự EBE TAL. - Dựa trên dữ liệu đầy đủ về trình tự nucleotide của promoter gen mục tiêu trên BT7, việc sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 gây đột biến tại vị trí PthXo2(A)-EBE có thể ngăn chặn/giảm độc tính của vi khuẩn Xoo trên giống lúa BT7. - Ngoài ra, việc gây đột biến trên vùng Exon I để bất hoạt (knock-out) hoàn toàn OsSWEET13 cũng là một hướng nghiên cứu để tạo ra giống lúa BT7 kháng bạc lá.. - Thiết kế cấu trúc gRNA chỉnh sửa SW13-BT bằng công nghệ CRISPR/CAS9. - trình tự dài ~20 nucleotide (gRNA) trên phân tử sgRNA [4]. - Để gây đột biến chỉnh sửa SW13-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9, các trình tự gRNA được thiết kế bằng phần mềm CRISPR-P v2.0. - Trình tự đích được xác định nằm xung quanh vị trí PthXo2 - EBE và gần mã mở đầu (ATG) của Exon I (Hình 3, bảng 2).. - Điều kiện cần đối với một trình tự gRNA nhất định bao gồm (i) đầu 3’ phải nối tiếp với trình tự bảo thủ PAM (NGG), (ii) có độ dài 19 – 22 Nu và (iii) vị trí cắt DNA nằm trên trình tự đích. - Bằng phần mềm CRISPR-P v2.0, các trình tự gRNA chỉnh sửa các trình tự đích liên quan tới cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Xoo trên vùng promoter OsSWEET13 của lúa BT7 đã được thiết kế. - Kết quả thu được cho thấy 18 trình tự gRNA đã được xác định đáp ứng đầy đủ 3 tiêu chuẩn. - Trong đó, 11 trình tự gRNA có điểm cắt tại vị trí PthXo2(A)-EBE , 7 trình tự gRNA có điểm cắt tác động đến Exon I (Bảng 2).. - Trình tự gRNA chỉnh sửa SW13-BT Tên Trình tự gRNA-PAM (5'-3’) Kích. - 1 PthXo2(A)- EBE gRNA-2. - 3 PthXo2(A)- EBE gRNA-3. - 2 PthXo2(A)- EBE gRNA-4. - 3 PthXo2(A)- EBE gRNA-5. - 2 PthXo2(A)- EBE gRNA-6. - 1 PthXo2(A)- EBE gRNA-7. - 3 PthXo2(A)- EBE gRNA-8. - 2 PthXo2(A)- EBE. - 1 PthXo2(A)- EBE gRNA-10. - 3 PthXo2(A)- EBE gRNA-11. - (PthXo2) EBE trên promoter SW13-BT. - Trình tự PAM được in đậm.. - Để đảm bảo khả năng duy trì hoạt tính và tính đặc hiệu của phức hệ CRISPR/CAS9 trong nhân tế bào, gRNA phải có hàm lượng GC trong trình tự gRNA từ 30-80 , có khả năng hình thành cấu trúc bậc II ổn định (duy trì cầu trúc vòng loop RAR - repeat and anti-repeat, SL2 - stem loop 2 và SL3 - stem loop 3), tổng số cặp bazơ (TBP - total base pairs) <. - Đối với đích tác động là vùng mã mở đầu trên Exon I, trình tự gRNA-14 và gRNA-15 có điểm On-score cao nhất (0,1933 và 0,3765) tương ứng với mỗi vị trí cắt ( 4 Exon I và 5 Exon I) (Bảng 2) được lựa chọn để tiếp tục phân tích.. - Hạn chế lớn nhất của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/CAS9 so với các hệ thống chỉnh sửa gen khác (TALEN, ZFN. - đó là tính đặc hiệu của gRNA, do gRNA chỉ nhận biết ~20 nucleotide và Cas9 vẫn có thể hoạt động dù trình tự DNA đích có một vài nucleotide sai khác so với gRNA [4]. - Nhằm giảm thiểu khả năng nhận biết sai vị trí (off-target) của phức hệ CAS9-gRNA, trình tự của các gRNA tiếp tục được phân tích bằng phần mềm CCTop (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) để tìm ra các đoạn DNA tương đồng với các gRNA có trong hệ gen lúa (http://plants.ensembl.org. - số trình tự DNA tương đồng trong hệ gen lúa (Bảng 3. - Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ gen lúa. - Trong khi tất cả các trình tự tương đồng với gRNA-6 và gRNA-15 đều nằm cách xa vùng mã hóa (Exon) của gen chức năng (Bảng 3). - một trình tự tương đồng nằm trên Exon của một gen mã hóa protein nên có khả năng gây ảnh hưởng đến hoạt động chức năng của tế bào nếu xảy ra đột biến sai vị trí mong muốn (off-target).. - Các trình tự DNA tương đồng với gRNA trong hệ gen lúa Tên Trình tự DNA tương đồng Vị. - thể hiện trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) của gRNA. - Như vậy, tổng hợp các kết quả phân tích dự đoán cấu trúc và tính đặc hiệu có thể xác định các gRNA có thể sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh sửa SW13-BT theo cơ chế ghép nối điểm cuối không tương đồng (Non-homologous end joining) [19, 24]. - bằng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 [4], bao gồm gRNA-6 chỉnh sửa PthXo2(A)-EBE và gRNA-15 gây đột biến bất hoạt hoàn toàn OsSWEET13 của BT7. - Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho nghiên cứu chức năng của OsSWEET13 sau này, đồng thời phục vụ mục tiêu tạo ra dòng lúa BT7 kháng bệnh bạc lá bằng công nghệ chỉnh sửa gen.. - Promoter/gen SW13-BT liên quan đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá Xoo trên giống lúa BT7 đã được phân lập và giải trình tự đầy đủ. - Vùng trình tự đã phân lập chứa PthXo2(A)-EBE và một phần Exon I đã được chọn để thiết kế 2 cấu trúc gRNA phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter/gen SW13-BT bằng công nghệ CRISPR/CAS9. - Kết quả của nghiên cứu góp phần làm phong phú dữ liệu ngân hàng gen lúa Việt Nam đồng thời đặt nền móng cho định hướng tăng cường khả năng kháng bệnh bạc lá của giống lúa chủ lực BT7 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen.. - Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Ứng. - dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá thuộc Chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp - Thủy sản của Bộ Nông nghiệp và PTNT.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt